实验 1 特殊显微镜结构及操作技术
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实验 1 特殊显微镜结构及操作技术. 【 目的 】 了解 TE2000-U 型倒置显微镜的基本组件、原理,掌握其基本操作。 【 材料 】 1 .高等动、植物各类组织永久制片; 2 .培养皿(瓶)中的活细胞或微生物; 3 .口腔上皮细胞的临时装片。. 【 实验用品 】. 1 .试剂: 10μg/mL 罗丹明 123 的磷酸缓冲液( PBS )荧光染料。 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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实验 1 特殊显微镜结构及操作技术
【目的】 了解 TE2000-U 型倒置显微镜的基本组件、
原理,掌握其基本操作。【材料】 1 .高等动、植物各类组织永久制片; 2 .培养皿(瓶)中的活细胞或微生物; 3 .口腔上皮细胞的临时装片。
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【实验用品】
1 .试剂: 10μg/mL 罗丹明 123 的磷酸缓冲液( PBS )荧光染料。
2 .器材:倒置显微镜,相差显微镜附件(相差物镜、转盘聚光器、对中环形光阑和绿色滤色镜等),微分干涉显微镜附件(起偏镜、检偏镜和渥拉斯顿棱镜等),荧光显微镜附件(荧光发射器、激发滤片和阻断滤片等),载玻片,盖玻片,牙签,滤纸条,擦镜纸,镊子,滴管。
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【实验原理和方法】
倒置显微镜是一种用于生物组织细胞离体培养观察的光学显微装置,能直接对培养皿、培养瓶的标本进行显微观察。由于它的物镜、物体和光源位置刚好与立式显微镜颠倒,被称为倒置显微镜。倒置显微镜的物镜在下,聚光器在上,被观察样品置于位于上方的聚光器之下,聚光器具有远大于物镜的工作距离。因此,适应于培养皿或培养瓶中样品的观察。高档倒置显微镜可根据不同观察要求,增加相差、微分干涉反差物镜或荧光发射装置,构建成相差显微镜、微分干涉显微镜或荧光显微镜。
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一、倒置显微镜的构造与使用
(一)倒置显微镜的构造 倒置显微镜由目镜、透射照明器、聚光器、载
物台、物镜和显微镜机体等部件构成,以TE2000-U 显微镜为例介绍。
TE2000-U 显微镜配有: T-DH 100W 透射照明器、 LHS-H100P-1 12V100W 灯室、 12V100W 卤素灯、 TE2-PS100W 电源、 T-SR 矩形载物台、 T-TD 双目镜筒 D 、CFI 10X 目镜、 T-N6 六孔物镜转换器,系统聚光器、物镜、电源线等。
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1. 目镜筒及目镜 A: 屈光度调节环 B: 目镜 C: 目镜筒转盘 O: 开 B: 勃氏镜 ( 带有聚焦螺钉 ) C: 关 ( 光闸 ) M:2.5 倍放大
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2. 显微镜机体
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3. 透射照明器 : 透射照明器必须根据规定使用灯泡 (12V100W 或 6V30W) 。 T-DH 100W 透射照明器需灯室。
A : 视场光阑调节杆 B : 滤色片滑片C : 聚光器再聚焦制动器 D : 聚光器调焦旋钮E : 聚光器固定螺钉 F : 聚光器安装定位孔G : 聚光器安装定位槽 H : 聚光器转动指紧螺钉I : 聚光器调中螺钉 J: 聚光器安装 ( 可转动 ) 支架K : LHS-H100P-1 12V100W 灯室 L : 灯室固定螺
钉M : 灯室盖指紧螺钉 N : 聚光器支架 ( 可移动 )
O : 聚光器支架指紧螺钉 P : 灯室线Q : 聚光器支架下降定位螺钉
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T-DS 30W 透射照明器 A : 防尘滑片 ( 可移动 ) B : F 堵口滑片 ( 可移动 ) C : 聚光器安装支架 D : 6V30W 灯室 E : 滤色片滑片 F : 安装附加装置 M4 螺纹孔
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系统聚光器
T-DH 100W 透射照明器 A : 聚光器孔径光阑B : 聚光器模块C : 聚光器模块固定螺钉D : 聚光镜 ( 有三种可选:ELWD 、 LWD 、 HMC)E : 环形光阑调中螺钉 (仅用于相差模块中 )
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T-DS 30W 透射照明器 (霍夫曼观察 )
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ELWD-S 聚光器
A :调中杆指紧螺钉B :调中杆 C :转盘
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SLWD 聚光器
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T-SR 矩形载物台
A :载物环湾
B :载物台 Y 轴方向移动控制旋钮
C :载物台 X 轴方向移动控制旋钮
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(二)由 TE2000-U , 100W 透射照明器,系统聚光器,以及 T-TD 目镜筒 D 组成的显微镜系统。
明视场 (BF) 镜检关键点: 从光路中卸下其它形式观察需要
的所有光学组件,聚光器调节好(调节聚焦和对中),转动孔径光阑调节好像的清晰度。
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1. 复位
1 ) 逆时针转动,松开透射照明器中的“聚光器再聚焦指紧螺钉”。
2 ) 把“目镜筒转盘”设置到< O>位。3 ) 把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度
盘”打到< 1X>。4 ) 逆时针转动,松开显微镜右侧粗∕微
调旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”
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2. 打开透射照明器
1 ) 把电源后部的“外部开关”打到开的位置;
2 ) 把电源“电源开关”打开。 (把开关拨至│ ) ;
3 ) 按下显微镜左侧的“照明器开关”接通灯泡。
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3. 调节灯泡亮度保证色彩真实。
1 ) 把显微镜左侧的“亮度调节盘”设置成< 12V100W>;
2 ) 把透射照明器中的“ NCB11 滤色片”插入光路中;
3 ) 把透射照明器中的“ ND4 滤色片”插入光路中。
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4. 调节光路
1 ) 把 10X 物镜转到光路中。2 ) 把显微镜右侧的“光路转换盘”转到< 1 >
的位置。( 100% 光到观察口)3 ) 向上推透射照明器上的“视场光阑杆”完全打开视场光阑。4 ) 将系统聚光器上的“孔径光阑杆”转至右侧极限处把“孔径光阑”完全打开。5 ) 转动聚光器调焦旋钮把聚光器调至最低位置。
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5. 明视场观察时对显微镜的调整
把“聚光器转盘”转到< A >位置。
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6 .调节视度及瞳距
1 )将显微镜前部的“摄影取景框转盘”逆时针旋转,使摄影取景框进入光路。
2 )用左眼对着左侧目镜,转动目镜 “屈光度调节环”,使取景框中的双十字线清晰成像。
3 )用右眼对着右侧目镜,转动目镜 “屈光度调节环”,使取景框中的双十字线清晰成像。4 )将显微镜前部的“摄影取景框转盘”顺时针
旋转,使其退出光路。5 )调节目镜瞳距,将两目镜视场所见的影像重合在一起。
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7. 调焦
1 )将样品放置载物台中。2 )转动同轴粗微调旋钮,将标本对好焦。
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8. 聚光器中心调节
1 )确信 10X 物镜在光路中。2 )将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光
阑像。3 )转动“聚光器调焦钮”升降聚光器,使视场光阑像清晰地成象在标本面上。
4 )转动两个“聚光器中心调节螺钉”,使视场光阑像在视场中心。
5 )更换 40X 物镜。6 )调节“视场光阑调节杆”,使视场光阑的象与视场大致相同。
7 )转动两个“聚光器中心调节螺钉”,使视场光阑像在视场正中。
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9. 进行观察
1 )选择要使用的物镜2 )移动系统聚光器上的“孔径光阑调节杆”,使孔径为物镜数值孔径的 70 - 80% 。(“把目镜筒转盘”设到< B>位置,转动勃氏镜调焦螺钉使其聚焦,当观察到物镜的出瞳和孔径光栏的象时,调节其大小。)
3 )调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视场相大致相同。4 )把透射照明器里的“ ND 减光片”进入或退出光路以调节视场亮度。
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10. 更换样品
利用显微镜主体上的“物镜再聚焦定位环”,照明器上的“倾斜装置”,“聚光器再聚焦指紧螺钉,可容易更换样品。
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11. 显微镜操作结束后
1) 关闭电源开关 ( 开关拨至 O)2) 灯室冷却后,把显微镜上的聚乙烯防尘罩盖好。
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相差( PH )显微术
观察透明细胞或其他透明样品,需配相衬聚光器、相衬物镜、相衬环等附件。相衬板将衍射光推迟 1/4波长,振幅相减,样品暗,背景亮,称正反差或暗反差,分正低( DL )、正低低( DLL )和中型暗相差( DM )。折光率较强的样品用后者。相衬板将直射光推迟1/4波长,振幅相加,样品亮,背景暗,称负反差或明反差,分负中( NM )和负高( NH )。折光率较小的样品用后者。
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关键点:将有 ph 标记的物镜与物镜相同 ph 标记的聚光器模块一起送入光路,在进行显微术前,校正 ( 对中 ) 物镜里的相差板及聚光器模块里的环形光阑。
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1. 用明视场( BF )显微术对样品聚焦。2. 相差观察时对显微镜的调整。
1) 将 ph 物镜转入光路。2) 转动“聚光器转盘”,使其与在光路中
的物镜 (步骤 1 中所安置的 ) 具有相同的 ph 标记。
3) 向右转动聚光器上的“孔径光阑调节杆”,完全打开孔径光阑。
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3. 对中环形光阑
1) 把“目镜筒转盘”设到<B> 位置,转动勃氏镜聚焦螺钉,使环形光阑像清晰。
2) 用六角起子转动聚光器模块中的两个“环形光阑对中螺钉”,使环形光阑像与物镜中的相差板环形像同心。
3) 把目镜筒转盘位置再转到<O> 上。调中心手轮
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4. 进行观察
1) 把聚光器“孔径光阑”完全打开。2) 移动透射照明器上的“视场光阑调节杆”,使视场光阑像大小与视场大小接近。
3) 把透射照明器上的“ NCB11 滤色片”从光路中移开,把“ GIF 滤色片”移进光路。 (提高反差 )
4) 可通过把“ ND 滤色片”移进或移出光路来调节视场亮度。
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5. 使用不同放大倍数的物镜进行观察
1) 把所需放大倍数的相差物镜移入光路。2) 转动“聚光器转盘”,使其与在光路上
物镜(步骤 1 中所安置的)具有相同的ph 标记。
3) 调节放入光路中的环形光阑中心。 (见程序 3)
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6. 更换样品 利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦
定位环”,透射照明器上的“倾斜”装置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”,可容易更换样品。
7. 显微镜操作结束后与明视场显微术步骤相同。
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微分干涉( DIC )显微术
可观察到样品的立体感,适用于显微操纵等,彩色图像。因塑料培养皿的不均衡张力在 DIC下呈现干涉条纹、 DIC 不宜用于普遍使用的塑料培养皿。 DIC 的光通亮大,可用到 100 倍物镜。需配 DIC 聚光器等附件,使用明场物镜。
1 .用明场找到视野2 .压入起偏器,选择相应模块3 .调节孔径光栅至最佳效果。
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荧光( E )显微术
适用于本身属于或被染色后形成荧光体的样品。荧光体在一定波长光(紫外或可见)的激发下发光(即荧光,波长长于激发光)。需配荧光附件和滤光器等。前者主件为激发光源,一般分汞灯系统和卤灯系统,汞灯既适用于紫外光激发也适用于可见光激发,且能量较高;后者只适用于可见光激发。(此处插入拍摄图片)
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1. 操作之前要求:
( 1 )检查荧光装置的工作时间,如荧光灯的工作时间超过使用寿命,应予以更换。
( 2 )使用物荧光载波片( 3 )每次使用之间必须间隔 20 分钟。
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2. 用明场找到视野。3. 关闭明场光源,打开荧光电源预热 5
分钟。4. 开启荧光盘,并根据要求选择荧光通
道。5. 激发荧光发生器,打开光闸,即可进
行观察。