张晓辉 10808040

生物去污：通过途径工程净化环境

途径工程 (Pathway Engineering) 途径工程 (Pathway engineering) ，被称为

第三代基因工程，改变代谢流向，开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。

途径工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过 DNA 重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。途径工程在分析代谢途径的基础上，定性地改变细胞内代谢流走向，调整原有代谢网络，进而提高特定代谢物的产量。外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线，以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特征。

生物去污的优点： 1 ）条件温和； 2 ）成本低； 3 ）有一定的专一性和可选择性； 4 ）比较彻底，几乎无二次污染； 5 ）可以解决传统方法无法解决的污染； 。。。。。。。。。。。

许多微生物天生就具有这种降解、转化，或者螯合各种毒性化学药物的能力，但效率都比较低。所以有必要通过途径工程对这些微生物进行操作或改造，提高其去污的能力，进而实现去污的目的。

Pathway engineering for enhancedbioremediation

Inorganic pollutant removal

1 、一些重金属污染的生物去除 当遇到重金属时，大多数微生物都会做出反

应产生金属鳌合肽 ，比如植物螯合肽（ PCs ）和金属硫蛋白（ MTs ）

植物螯合素的化学结构示意图 金属硫蛋白（ MT ）生命蛋

在大肠杆菌里使负责 PC 合成的拟南芥植物螯合肽合成酶（ AtPCS ）过表达，使金属堆积提高到 20 倍。

类似成就还有在共生根瘤菌细菌中。

但合成 PC 的前体物质谷胱甘肽（ GSH）的限制成了重金属的堆积的瓶颈。

解决方法： 1 ）共表达负责产生 GSH的酶，结果 PC 的

合成增加了 10 倍 ； 2 ）通过在能够提供足够的 GSH的啤酒酵母中表达 PC 合酶 。

另外， MTs 和 PCs 的一个特点是非选择性结合各种重金属。

解决方法： 1 ）改造特定重金属的转运体 2 ）提高吸收的能力 3) 利用在特定的金属污染场所自然突变的

金属结合 MTs

金属调节蛋白在去除重金属污染中也发挥着重要的作用，通过设计提高其高亲和性和自然选择性，并应用到汞和砷的特异聚集中。

2 、放射性污染的生物去除

自然存在的高耐受放射的细菌是提高放射 性污染净化的理想代谢设计候选对象 。

Brim等第一次报道使用极端放射耐受和嗜热细菌 Deinococcus geothemalis 通过编码表达大肠杆菌里的mer 操纵子实现对 Hg2+的还原。这种工程菌能够在较高温度和电离辐射下还原汞。而其还能还原 Fe(Ⅲ) ， U(Ⅵ)和 Cr(Ⅵ) 。

在 P. aeruginosa中通过多聚磷酸激酶和外切聚磷酸酶的过表达，聚磷酸酯也能使放射物以金属磷酸盐的形式凝结

最近一种非特异磷酸酯酶 phoN 在放射耐受性细菌 D. radiodurans中获得表达，使铀从稀释的核废料中生物凝结 。

定向诱导也被用来改善铬酸盐和铀酰还原酶的酶效率。

Engineered microbes for organic chemicalremoval

有机化合物的去除之改造微生物

磷酸二乙硝苯酯 硝苯硫酸酯 甲基硝苯硫酸酯磷酸二乙硝苯酯 硝苯硫酸酯 甲基硝苯硫酸酯

二苯酰硫胺素二苯酰硫胺素

1 、有机磷酸盐（ OPs ）的生物去除 有机磷酸酯水解酶（ OPH）具有降解 Ops

的能力。 OPH能够催化 P-O 键的水解，释放p- 硝基酚基团。

因为磷酸酯的水解可以显著地减少Ops 的毒性，许多研究人员就把注意力集中到了OPH的最初水解上。

可以应用基因工程技术如 DNA同源重组技术，定向诱导，或者错位 PCR技术来提高OPH的催化活性和底物专一性。

运用 DNA同源重组技术分别获得了甲基硝苯硫酸酯（杀虫剂）和氯螨硫磷（杀虫剂）的 25 倍和 725 倍的高水解效率的突变体。

另外，运用细胞表面酶的易位，并通过解除Ops 通过细胞膜的转换瓶颈增强生物解毒的效率。

运用 Lpp(lipoprotein脂蛋白 )–OmpA (outer membrane protein A 外膜蛋白 A) 系统将OPH释放到大肠杆菌表面，使硝苯硫酸酯的降解比 OPH在细胞内表达要快 7倍。目前，探索OPH分泌到细胞膜间隙的工作也已开展，以全面提高其水解效率。

尽管一些 Ops 能够初始水解转化成一些低毒的 p- 硝基苯 (PNP) 和二烃基磷酸盐，但这些降解产物依然含有毒性，抵抗生物降解。

一种能够水解硝苯硫酸酯和二乙基硫代硫酸酯的改造的大肠杆菌和具有天然降解 PNP的 Pseudomonas putida恶臭假单胞菌结合培养能够顺利分解硝苯硫磷酯，且没有 PNP 的积累。

改造的 Moraxella sp摩拉克式菌属或者 P. putida （ Pseudomonas putida恶臭假单胞菌）也能自然地降低 PNP 。在前者中，OPH在细胞表面被表达，并证明能够同时降解硝苯硫磷酯，甲基硝苯硫磷酯和二乙硝苯磷酸酯，且它们的水解产物都是 PNP 。在后者中，运用了一个 P. putida 菌株，其包含一个固有的 PNP 降解操纵子。

在 P. putida 菌株中引入一个表达 OPH，磷酸二酯酶（ Pde ）和碱性磷酸酶（ PhoA ）的合成操纵子能够水解 Ops 和矿化二乙基磷酸盐，分别在 24小时， 78小时和 142小时能完全降解二乙硝苯磷酸酯， PNP 和DEP 。

2 、有机硫化合物的生物去除 有机硫化合物中二苯酰硫胺素（ DBT ）是最多的一种分子

传统的加氢脱硫工艺，不能满足需求，也不能有效地将 DBT从矿质燃料中去除 。

最近在脱硫作用的研究主要关注在运用微生物的生物改造方面 。

DBT 的生物脱硫作用需要一系列的酶

限速步骤

可以通过改造 DszB基因 5‘非编码区获得DszB的高表达。这种合成的突变体的脱硫作用效率相对 DszB在细胞自然表达提高了9倍。

Li等报道了另一项关于 DszB改良的研究。正常的dsz 操纵子表现特征显示 dszA, dszB和 dszC 的mRNA 比率是 11:3.3:1 ，但是 DszB的酶水平最低。这是由于 DszA 的终止密码子和 DszB的起始密码子交错重叠所致。为了获得稳定的 DszB的表达，插入含有可能的核糖体结合位点的序列对这种酶进行重新设计，结果，改造操纵子的细胞的表达是没改造操纵子的 5 倍高，整个脱硫的活性提高了 12倍。

3 、硝基芳香族化合物的生物去除 Nitroaromatic（硝基芳香族）化合物如硝

基苯和硝基甲苯 大部分微生物通过氧化还原酶使 Nitroarom

atic化合物转化成胺。 酶活性的合理设计已经被用来提高 nitroaromatic化合物的降解。

1,2-dioxygenase （ 1 ， 2- 双加氧酶） , 它能催化硝基苯转化成邻苯二酚和亚硝酸盐。对这种酶活性位点附近部分 293 (F293Q) 进行氨基酸取代扩展了酶的底物专一性，结果对 2 ， 6二硝基甲苯的氧化作用速率快了 2.5倍。

同样的方法还用在 2- 硝基甲苯双加氧酶，这种酶负责氧化硝基甲苯成 3- 甲基邻苯二酚和亚硝酸盐。活性位点 258 (N258V)附近区域选择性定向诱变和取代很显著地改变底物专一性。

2 ， 4-二硝基甲苯双加氧酶 (DNTDO) 是另外一种酶，分解代谢 2 ， 4-二硝基甲苯成4- 甲基 -5- 硝基邻苯二酚和亚硝酸盐。对 DNTDO的 I204位置进行突变扩大了其底物特异性。通过饱和诱变，获得了针对二硝基甲苯 (DNTs) 如 2,3-DNT, 2,5-DNT, 2,6-DNT,2NT 和 4NT 的显著的改良。

DNT 降解的起始产物 4- 甲基 -5- 硝基邻苯二酚，通过 MNC双加氧酶（如图）的作用转变成 2- 羟基 -5- 甲基苯醌。 MNC双加氧酶具有较窄的底物特异性，只能结合 MNC 和 4- 硝基邻苯二酚。通过设计得到 (M22L/L380I)两个区域的突变体，结果能够转化 4- 硝基邻苯二酚和 3- 甲基 -4- 硝基邻苯二酚，对 4- 硝基邻苯二酚的降解效率比野生型酶高出 11 倍。

基因组重排技术也被用来探索另外一种重要的杀虫剂五氯苯酚（ PCP ）的生物降解。其中，获得的一些突变菌株能够完全降解 PCP 。

另外，全面的基因组技术像全功能基因组学，生理学分析和模型建立能够获得增强型微生物，在多重水平上拥有最优的生物降解途径能力。

目前。寻找新的有毒化学物的降解酶及其降解途径非常热门，炸药降解 P450 系统在降解高毒性炸药 hexa-hydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine(RDX)中显示出了其特征性。新发现的 XplA 和 XplB，在 Arabidopsis中高表达时，使得 RDX快速地被移除。

另外一种感兴趣的方法是从 Sphingomonas sp. A1中开发专一性的膜结构“高通道”，增强污染物的吸收。在 S. wittichii RW1 降解二噁英和在 S. subarctica IFO 16058T 降解聚丙烯乙二醇中这些高通道的引入导致生物去污能力实质性增强。

Conclusion

各种分子，基因和代谢工程方法的研究加速了生物去污的发展，产生各种用于生物净化进程的专一性设计的微生物。基于生物去污途径，关键酶的结构及功能知识，以及自然解毒微生物多方面分子鉴定等知识库的扩展将会进一步促进设计一种新的生物去污方法的进程。