Κεφ. 20Γ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC)

Μ. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ

Ανιχνευτές (1)• Κρίσιμο στοιχείο του συστήματος HPLC

– Κάνει ορατό το διαχωρισμό που γίνεται στηστήλη

– Επιτρέπει την αξιοποίηση του διαχωρισμούστην ανάλυση

• Χαρακτηριστικά ιδανικού ανιχνευτή1. Αποκρίνεται σε όλα τα συστατικά του

μείγματος (γενικός ανιχνευτής) ή να έχειγνωστή εκλεκτικότητα αποκρίσεως (ειδικόςανιχνευτής)

Ανιχνευτές (2)• Χαρακτηριστικά ιδανικού ανιχνευτή

2. Επιτρέπει χαμηλά όρια ανίχνευσης (ng-μg)3. Να μην αποκρίνεται στην κινητή φάση4. Παρέχει γραμμική απόκριση στην περιοχή

συγκεντρώσεων των διαχωριζόμενων συστατικών(χρήση στην ποσοτική ανάλυση)

5. Να μην επηρεάζεται από μεταβολές θερμοκρασίαςκαι ταχύτητας ροής κινητής φάσης

6. Έχει αμελητέο νεκρό όγκο, δεν συμμετέχει στηδιεύρυνση ζώνης συστατικών και της κορυφής του

Ανιχνευτές (3)Κυριότεροι Ανιχνευτές HPLC

1. Διαφορετικός ανιχνευτής δείκτη διάθλασης2. Ανιχνευτής υπεριώδους – ορατού3. Ανιχνευτές φθορισμού4. Ανιχνευτής υπερύθρου5. Ηλεκτροχημικός (αμπερομετρικός ανιχνευτής)6. Φασματόμετρο μαζών7. Εξατμιστικός ανιχνευτής σκέδασης

ακτινοβολίας

Διαφορικός Ανιχνευτής ΔείκτηΔιάθλασης

• Μετρά διαφορές δείκτη διάθλασης μεταξύκινητής φάσης και διαχωριζόμενων συστατικών

• Σημαντικό πλεονέκτημα: αποκρίνεται σε όλεςσχεδόν τις ουσίες (γενικός ανιχνευτής)

• Μειονεκτήματα:– Σχετικά μικρή ευαισθησία (κατάλληλος για περιοχή 1-

10 μg/mL)– Αδυναμία χρήσεως σε βαθμιδωτή έκλουση

(χρησιμοποιείται μόνο στην ισοκρατική έκλουση γιατίστη βαθμιδωτή αλλάζει ο δείκτης διάθλασης κινητήςφάσης)

– Ευαισθησία σε μεταβολές θερμοκρασίας

6

Διαφορικός Ανιχνευτής ΔείκτηΔιάθλασης (τύπου εκτροπής)

Φως

Κυψελίδα δείγματος

Κυψελίδααναφοράς

Μονάδα λήψεωςφωτός

7

Οπτικό Σύστημα Ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης(τύπου εκτροπής)

Λυχνία W Σχισμή

Κυψελίδα δείγματοςΚυψελίδα αναφοράς

Φωτοδίοδος

ΤοΤο είδωλοείδωλο τηςτης σχισμήςσχισμήςμετακινείταιμετακινείται ότανόταν οο δείκτηςδείκτηςδιάθλασηςδιάθλασης μέσαμέσα στηνστην

κυψελίδακυψελίδα ροήςροήςμεταβάλλεταιμεταβάλλεται

Ανιχνευτής UV-Vis (1)• Φασματοφωτόμετρο με μικροκυψελίδα

ροής στο τέλος της στήλης• Υγρό εκλούσεως διαβιβάζεται μέσα από

μικροκυψελίδα ροής 5-10 μL• Τύποι ανιχνευτή UV-Vis:

1. Σταθερού μήκους κύματος- απλό φωτόμετρο φίλτρου, μετρά απορρόφηση σε

σταθερό μήκος κύματος της ακτινοβολίας UV συνήθως στα 254 nm (γραμμή εκπομπήςλυχνίας Hg)

Ανιχνευτής UV-Vis (2)• Τύποι ανιχνευτή UV-Vis:

2. Πολλαπλών σταθερών μηκών κύματος– Με βοήθεια φίλτρων δυνατότητα επιλογής

περισσότερων μηκών κύματος UV-Vis3. Μεταβαλλόμενου μήκους κύματος– Πλήρες φασματοφωτόμετρο με μονοχρωμάτορα για

την επιλογή οποιουδήποτε μήκους κύματος στο UV-Vis

4. Σειράς φωτοδιόδων (Photo-Diode-Array, PDA)– Δυνατότητα λήψεως φάσματος απορροφήσεως

κάθε εξερχόμενου συστατικού– Δυνατότητα προσδιορισμού καθαρότητας κορυφής

(peak purity)

Ανιχνευτής UV-Vis (3)• Ευαισθησία ανιχνευτή UV-Vis εξαρτάται

από μοριακή απορροφητικότητασυστατικών

• Συνήθως χρησιμοποιείται στην περιοχή0,01 μg/mL

• Αδιάφορος σε μεταβολές θερμοκρασίας• Σχετικά φθηνός (οι πρώτοι δύο τύποι)• Μπορεί να εφαρμοσθεί και στη

βαθμιδωτή έκλουση

Ανιχνευτής UV-Vis (4)• Αποκρίνεται σε μεγάλο αριθμό οργανικών

ενώσεων (περισσότερο χρησιμοποιούμενοςανιχνευτής, στο 80% των αναλύσεων HPLC)

• Με ανιχνευτή PDA, λαμβάνεται το φάσμα κάθεεκλούμενου συστατικού

• Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με διαλύτεςκινητής φάσης που απορροφούν ισχυρά στοUV

• Δεν μπορούν να χρησιμοποιηθεί σεδιαχωρισμούς συστατικών που δεναπορροφούν στο UV, εκτός και εάνσχηματισθούν παράγωγα

12

Ανιχνευτής Απορρόφησης UV-VIS

A = ε·C·b = –log (P / Po)

b

C: Συγκέντρωση

(A: Απορρόφηση, ε: συντελεστής απορρόφησης)

Κυψελίδα ανίχνευσης

Po P

AC

13

Οπτικό Σύστημα ΑνιχνευτήΑπορρόφησης UV-VIS

Κυψελίδα δείγματος

Κυψελίδα αναφοράς

Φωτοδίοδος

Φωτοδίοδος

Po

PoPo

Φράγμα

ΛυχνίαD2 / W

Pλ

14

Φάσμα και επιλογή μήκουςκύματος ανίχνευσης

200 250 300 350Μήκος κύματος [nm]

Το μεγαλύτερο λ είναιπερισσότερο εκλεκτικό

15

Οπτικό Σύστημα Ανιχνευτή ΣειράςΦωτοδιόδων (PDA)

Κυψελίδα δείγματος

ΣειράΣειρά φωτοδιόδωνφωτοδιόδων

Φράγμα

ΛυχνίαD2 / W

Μια φωτοδίοδος μετρά τηναπορρόφηση στο αντίστοιχομήκος κύματος με διακριτικήικανότητα περίπου 1 cm

16

Δεδομένα από Ανιχνευτή ΣειράςΦωτοδιόδων

Χρόνοςανάσχεσης

Μήκος κύματος

Απορρόφηση

Χρωματογράφημα

Φάσμα

Ανιχνευτές Φθορισμού

• Χρησιμοποιούνται μόνο για φθορίζουσεςουσίες (ειδικός ανιχνευτής)

• Ευαισθησία πολύ μεγαλύτερη απόανιχνευτή UV-Vis

18

Ανιχνευτής Φθορισμού

+ hv1*

Μήκος κύματος διέγερσης

Μήκος κύματος εκπομπής

ΦθορισμόςΦθορισμός

* hv2 +

hv1hv2

Διεγερμένη κατάσταση

Οιονεί (Quasi)-διεγερμένη κατάσταση

Θεμελιώδηςκατάσταση

19

Οπτικό Σύστημα Ανιχνευτή Φθορισμού

Λυχνία Xenon

Φράγμα Διέγερσης ΑκτινοβολίαΔιέγερσης

Φθορισμός

Φράγμα Φθορισμού

Κυψελίδα Δείγματος

Φωτοπολλαπλασιαστής

20

Αντιδραστήρια ΠαραγωγοποίησηςΦθορισμού

• Αντιδραστήριο OPA (Αντιδρά με πρωτοταγείςαμίνες)

o-phthalaldhyde(OPA)

+ R-NH2 N-R

S-R’

R’-SH

CHN2

9-anthryldiazomethane(ADAM)

+ R-COOH

CH2OCOR

CHO

CHO

l Αντιδραστήριο ADAM (Αντιδρά με λιπαρά οξέα)

Ανιχνευτής Υπερύθρου (IR)

• Δεν είναι ευαίσθητος• Έχει μικρή εκλεκτικότητα, οι διαλύτεςκινητής φάσης απορροφούν στο IR

• Με επιλογή κατάλληλης συχνότητας, χαρακτηριστικής μιας ομάδας, ηεκλεκτικότητα αυξάνεται σημαντικά

Ηλεκτροχημικός (αμπερομετρικός) ανιχνευτής

• Παρακολουθείται η ένταση ρεύματος (i) μικρούηλεκτρολυτικού στοιχείου ροής, διαφόρωνμορφών, με εφαρμογή επιλεγόμενου σταθερούδυναμικού (Ε)

• Χρησιμοποιείται σε διαχωρισμούςηλεκτρενεργών ουσιών (ικανών να αναχθούν ήοξειδωθούν) στο ηλεκτρόδιο εργασίας, στηνεπιλεγόμενη τιμή δυναμικού

• Εξαιρετική ευαισθησία• Εφαρμογή σε ενώσεις βιοχημικού καιφαρμακολογικού ενδιαφέροντος– Π.χ. ιχνοποσότητες κατεχολαμινών στον εγκέφαλο

23

Ανιχνευτής ΗλεκτρικήςΑγωγιμότητας

Καθαρό Νερό ΥδατικόΔιάλυμα NaCl

Na+Cl-

Ο λαμπτήρας δεν ανάβει Ο λαμπτήρας ανάβει εάν υπάρχουν ιόντα

24

Αρχή Ανιχνευτή Ηλεκτρικής Αγωγιμότητας

L Ηλεκτρόδια

VI

A A

kLA

EIK •==

KALk •=

K: Ηλεκτρική αγωγιμότητα [S]I: Ηλεκτρικό ρεύμα [A]E: Δυναμικό [V]A: Εμβαδόν επιφάνειας ηλεκτροδίου [cm2]L: Απόσταση μεταξύηλεκτροδίων [cm]k: Ειδική ηλεκτρική αγωγιμότητα [S•cm-1]

25

Περιοριστική Ισοδύναμη ΙοντικήΑγωγιμότητα, λ [S•cm2/mol], σε υδατικό

διάλυμα (25ºC)

Cation λ Anion λH+ 349.8 OH– 198.3Li+ 38.6 F– 55.4Na+ 50.1 Cl– 76.3K+ 73.5 Br– 78.1NH4

+ 73.5 NO3– 71.4

(CH3)3NH+ 47.2 CH3COO– 40.9Mg2+ 53.0 C6H5COO– 32.3Ca2+ 59.5 SO4

2– 80.0

26

Ηλεκτροχημικός Ανιχνευτής

RHO

HO

RO

O

+ 2H+

2e2e--

Electrode

27

Δομή Κυψελίδας ΗλεκτροχημικούΑνιχνευτή (Αμπερομετρικού Τύπου)

Ηλεκτρόδιο Εργασίας(υαλώδης άνθρακας)

Ζεύγοςηλεκτροδίων

Ηλεκτρόδιο Αναφοράς(Ag/AgCl)

Έκλουσμα

Φασματόμετρο Μαζών (MS) (1)

• Συνδυασμένη τεχνικήυγροχρωματογραφίας και φασματομετρίαςμαζών– LC-MS: χρήση απλού τετραπόλου– LC-MS/MS: χρήση τριπλού τετραπόλου– LC-Ion-Trap/MS: χρήση φασματομέτρουπαγίδας ιόντων

– LC-TOF/MS: χρήση φασματομέτρου χρόνουπτήσεως

Φασματόμετρο Μαζών (MS) (2)

• Χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εκλεκτικότητα και αξιοπιστία

• Κατά την ανάπτυξή της αντιμετωπίσθηκε τοσοβαρό πρόβλημα εκδίωξης της μεγάληςπερίσσειας κινητής φάσης πριν την είσοδο στημονάδα MS

• Αποτελεί σήμερα την πλέον αξιόπιστη τεχνικήταυτοποίησης ουσιών (ναρκωτικών, φαρμάκων, ουσιών doping) στα πολύπλοκα βιολογικάδείγματα

• Υψηλό κόστος ανέφικτη αγορά από εργαστήριαρουτίνας

30

Φασματόμετρο Μαζών (LC/MS)

API probe

Ατμοσφαιρικήπίεση Υψηλό κενό

RP TMP1 TMP2(Αντλίες υψηλού κενού)

Σωλήναςηλεκτρονοπολ-λαπλασιαστή

Τετραπολικός αναλυτής MS

31

Ιονισμός Ατμοσφαιρικής Πίεσης(API)

Ιονισμός Ηλεκτροψεκασμού (ESI)

Χημικός Ιονισμός Ατμοσφαιρικής Πίεσης (APCI)

High Voltage

3) Coulon Exclusion

Ion Evaporation

2) Evapolation

of Solvent

1) Charged Droplet

Liquid SamplesNeburaizing Gas

+ - + -+-

+-

+ -++

+

-

- +-+++-+-+-+++-+-

++

++

+

+

Υγρό δείγμαΑέριοεκνέφωσης

2) ΕξάτμισηΔιαλύτη

3) Coulomb Exclusion

Ion Evaporation

1) Φορτισμένο

Σταγονίδιο

Υψηλόδυναμικό

Liquid SamplesNeburaizing Gas

HeaterColona Discharge

Nnndle

Αντίδραση μοριακούιόντος

Υγρό δείγμαΑέριοεκνέφωσης

Corona Discharge Needle

Θερμαντήρας

32

Πλεονεκτήματα LC/MS (1)

• Ποσοτική ανάλυση με εξαιρετική εκλεκτικότητα(TIC: total ion chromatogram)

A:100

D:150B:100C:150

m/zm/z=150=150

TIC TIC

m/zm/z=100=100A

B

C D

33

Πλεονεκτήματα LC/MS (2)

• Οι κορυφές μπορούν να ταυτοποιηθούν με ταφάσματαMS.

M/Z

M/Z

M/Z

Εξατμιστικός Ανιχνευτής Σκέδασης Ακτινοβολίας(Evaporative Light Scattering Detector)

• Το έκλουσμα μετά την έξοδο από τη στήληεξατμίζεται με τη βοήθεια ρεύματος αζώτου καιθέρμανσης

• Τα παραμένοντα σωματίδια των εξερχόμενωνσυστατικών προκαλούν σκέδαση ακτινοβολίαςπηγής ορατού και παρέχουν κορυφή σήματος

• Είναι γενικός ανιχνευτής και αξιοποιείταισυνήθως για διαχωρισμό / ανάλυση ουσιών πουδεν απορροφούν στο UV (σάκχαρα, λιπίδια, διάφορα μεγαλομοριακά έκδοχα, κλπ)

• Χαρακτηρίζεται από σχετικά μικρή ευαισθησία

35

Εξατμιστικός Ανιχνευτής Σκέδασης ΦωτόςEvaporative Light Scattering Detector (ELSD)

Το έκλουσμα από τη στήλη εξατμίζεται και τοσκεδαζόμενο φως από τα σωματίδια μη πτητικών ουσιών

ανιχνεύεται

Σωλήναςθέρμανσης

Εκνεφωτής

Έκλουσμα απόστήλη

Αέριοεκνέφωσης Απόβλητα Βοηθητικό

αέριο

Ανιχνευτής φωτός

Πηγή φωτός

36

Σύγκριση Ανιχνευτών HPLC

Σημείωση: Γενικά χαρακτηριστικά. Υπάρχουν εξαιρέσεις.

Εκλεκτικότητα ΕυαισθησίαΔυνατότηταΒαθμιδωτήςΈκλουσης

Απορρόφησης Ουσίες που απρροφούνακτινοβολία ng Δυνατή

Φθορισμού Φθορίζουσες ουσίες pg Δυνατή

Διαφορικόςδείκτη διάθλασης Καμμία µg Αδύνατη

Εξατμιστικόςσκέδασης φωτός Μη πτητικές ουσίες µg Δυνατή

Ηλεκτρικήςαγωγιμότητας Ιοντικές ουσίες ng Μερικώς δυνατή

Ηλεκτροχημικός Οξειδοαναγωγικέςουσίες pg Μερικώς δυνατή

Σύστημα Επεξεργασίας –Παρουσίασης Αποτελεσμάτων

• Απλούστερος και φθηνότερος τρόπος παρουσίασηςχρωματογραφήματος είναι ο καταγραφέας

– Πρέπει να χαρακτηρίζεται από ταχεία απόκριση– Να έχει δυνατότητα ενίσχυσης σήματος

• Ολοκληρωτής – καταγραφέας:– Έχει δυνατότητα ολοκλήρωσης του εμβαδού των κορυφών του

χρωματογραφήματος• Σύγχρονα συστήματα HPLC διαθέτουν

μικροϋπολογιστές για:– Έλεγχο λειτουργίας όλων των μονάδων HPLC– Συλλογή, αποθήκευση, επεξεργασία των σημάτων των

ανιχνευτών– Παρουσίαση αποτελεσμάτων

38

Χρωματογράφημα

tR

t0

Έντασησήματοςανίχνευσης

Χρόνος

Κορυφή tR : Χρόνος ανάσχεσης

hA

t0 : Νεκρός χρόνος

A : Εμβαδόν κορυφήςh : Ύψος κορυφής

Διασύνδεση Μονάδων HPLC

• Λαμβάνεται φροντίδα για τηνελαχιστοποίηση των «νεκρών όγκων»μεταξύ:– βαλβίδας εισαγωγής δείγματος και εισόδουστήλης

– εξόδου στήλης και ανιχνευτή• Μείωση διεύρυνσης ζωνών συστατικών• Αύξηση διαχωριστικότητας

40

Συνδετήρες

• Αρσενικό περικόχλιο (Male

nut)Φερρούλιο (στεφάνη)– Στεγανοποίηση μέχρι 40

MPa

• Αρσενικό περικόχλιο (PEEK)

– Συνδέεται χωρίς εργαλεία– Ανθεκτικό σε πίεση μέχρι

25 MPa

Male nut

Ferrule

Male nut (PEEK)

41

Νεκρός Όγκος(Επιπλέον Όγκος Στήλης)

• Νεκρός όγκος μπορεί να προκαλέσει διεύρυνσηκορυφών

Σωλήνας

Αρσενικόπερικόχλιο

ΝεκρόςΝεκρός ΌγκοςΌγκος

Εξαιρετική σύνδεση Φτωχή σύνδεση

Σχηματισμός παραγώγων (1)• Για την αύξηση της ευαισθησίας HPLC, ειδικά για ουσίεςπου δεν απορροφούν στο UV

• Χρήση ειδικών αντιδραστηρίων για παραγωγήπαραγώγων που μπορούν να ανιχνευθούν απόανιχνευτές υπεριώδους και φθορισμού σε πολύ χαμηλέςσυγκεντρώσεις

• Παράδειγμα: σχηματισμός φθοριζόντων παραγώγωναμινοξέων με αντιδραστήριο δανσυλοχλωρίδιο

• Αντίδραση σχηματισμού παραγώγων:– Προ στήλης (pre-column) παραγωγοποίηση, στο διάλυμα τουδείγματος πριν την εισαγωγή στη στήλη

– Μετά-στήλη (post column) παραγωγοποίηση, μετά την έξοδοσυστατικών από τη στήλη και πριν την είσοδο στον ανιχνευτή

43

Προ-στήληςΠαραγωγοποίηση

• Αντιδραστήριο OPA (Αντιδρά με πρωτοταγείςαμίνες)

o-phthalaldhyde(OPA)

+ R-NH2 N-R

S-R’

R’-SH

NO2

2,4-dinitrophenylhydrazine(2,4-DNPH)

+

CHO

CHO

l 2,4-DNPH (Αντιδρά με αλδεϋδες και κετόνες)

O2N

NHNH2

C=OR

R’NO2O2N

NHN=C

H+

R

R’

Σχηματισμός παραγώγων (2)Μετά- στήλη παραγωγοποίηση

• Απαιτεί επιπρόσθετα όργανα– Αντλία χαμηλής πίεσης για προώθησηαντιδραστηρίου παραγωγοποίησης στην έξοδο τηςστήλης

– Σπείραμα αντίδρασης• Προκαλεί διεύρυνση ζωνών και μείωσηδιαχωριστικότητας

• Υπάρχει δυνατότητα χρησιμοποιήσεωςχημειοφωταυγών αντιδράσεων με εξαιρετικήευαισθησία

45

Μετά-στήλη παραγωγοποίηση

ΘάλαμοςΑντίδρασης

ΑντλίαΔιάλυμαΑντίδρασης

46

Παραδείγματα Μεθόδων Μετά-Στήλης Παραγωγοποίησης

• Αμινοξέα– Orthophthalic acid, OPA

(φθορισμός)

– Νινυδρίνη (απορρόφηση Vis)

• Ανάγοντα σάκχαρα– Αργινίνη (φθορισμός)

• Καρβαμιδικάζιζανιοκτόνα– Αλκαλική υδρόλυση - OPA

(φθορισμός)

• Βρωμικά ιόντα– Τριβρωμιούχα

(απορρόφηση UV– o-Διανισιδίνη

(απορρόφηση Vis)

• Κυανιούχα ιόντα– Χλωρίωση - πυραζολόνη

(απορρόφηση Vis)

• Μετάλλωνμεταπτώσεως ιόντα– 4-(2-Pyridylazo) resorcinol,

PAR (Απορρόφηση Vis)

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (1)

• Για επιλογή του καταλληλότερου συστήματος καιτων συνθηκών διεξαγωγής χρωματογραφικήςανάλυσης, ο αναλυτής βασίζεται:– Στη θεωρία της τεχνικής– Στην πείρα του– Στις συστάσεις κατασκευαστών συστημάτων HPLC / στηλών

• Τα περισσότερα μείγματα μπορούν ναδιαχωρισθούν / αναλυθούν με HPLC, αρκεί ναεπιλεγεί:– κατάλληλο σύστημα στατικής και κινητής φάσης– ή πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (2)

• Σε γενικές γραμμές επιδιώκεται η εύρεσησυνθηκών έτσι, ώστε τα συστατικά ενόςμείγματος:– να συγκρατούνται σε κάποιο βαθμό στη στατικήφάση

– όχι πολύ ισχυρά• Αποδοτικός διαχωρισμός μπορεί να επιτευχθείμόνο, εάν εξασφαλισθεί:– Διαφορετική ταχύτητα μετακίνησης ζωνώνσυστατικών, λόγω διαφορετικού βαθμούσυγκράτησης στη στατική φάση

– Σε ποσοτική έκφραση σε διαφορετικές τιμέςπαράγοντα χωρητικότητας, k’, περίπου 1-10

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (3)

• Συχνά αναγκαίο να εκτελεσθείκλασμάτωση μείγματος πολλώνσυστατικών πριν την ανάλυση με HPLC, με:– Χρωματογραφική τεχνική– Υγρό-Υγρό εκχύλιση– Εκχύλιση στερεάς φάσης

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (4)

• Μηχανισμοί υγρό-υγρό κατανομής και υγρό – στερεόπροσρόφησης βασίζονται στη διαφορά πολικότητας τωνσυστατικών του μείγματος– Πολικότητα επηρεάζει τη διαλυτότητα και την προσρόφηση

• Διαδικασία υγρό – υγρό κατανομής είναι ευαίσθητη σεμικρές διαφορές στο μοριακό βάρος συστατικών– Προτιμάται για διαχωρισμό παρόμοιων ενώσεων μιας ομόλογηςσειράς

• Διαδικασία προσρόφησης επηρεάζεται απόστερεοχημικές διαφορές– Προτιμάται για διαχωρισμό παρόμοιων ενώσεων με διαφορετικέςστερεοχημικές δομές

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (5)

• HPLC προσρόφησης:– Πειραματικά ευκολότερη από HPLCκατανομής

– Προτιμάται για διαχωρισμό μείγματοςενώσεων με ευρεία περιοχή πολικότητας

• HPLC κατανομής– Διαχωρίζει αποδοτικότερα ενώσεις με πολύμικρές διαφορές πολικότητας

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (6)

• Μείγματα ιοντικών ενώσεων διαχωρίζονταιαποτελεσματικά με:– HPLC ιονταλλαγής

• Μεγαλομοριακές ενώσεις διαχωρίζονταιμε:– HPLC μοριακού αποκλεισμού με επιλογήστήλης με κατάλληλη περιοχή κλασματώσεως

Επιλογή Μηχανισμού ΣυγκρατήσεωςΥγροχρωματογραφίας με Βάση Χαρακτηριστικά

Δείγματος

Πώς Μπορώ να Αναλύσω το Δείγμα

Υδατάνθρακες1. Φρουκτόζη2. Γλυκόζη3. Σακχαρόζη4. Παλατινόζη5. Τρεαλόζη6. Ισομαλτόζη

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)

70/30 Ακετονιτρίλιο/Νερό

1 mL/min Ανιχνευτής = Δείκτη Διάθλασης

1

2 3

4

5

mAU

time

6

Επιλογή Τεχνικής (Μηχανισμού) –Εκλογή Κινητής Φάσης (7)

• Περισσότερες φαρμακευτικές ουσίες είναιμέσου μοριακού βάρους και ενδιάμεσηςπολικότητας.

• Για την ανάλυσή τους χρησιμοποιούνται:– HPLC αντίστροφης φάσης για μη ιοντικέςουσίες

– HPLC κατανομής με σχηματισμό ζεύγουςιόντων (ion-pair) για ιοντικές ουσίες

– Με ίδια στήλη, χημικά συνδεδεμένη ομάδαC18

Επιλογή Κινητής Φάσης (1)• Μετά επιλογή στατικής φάσης επιλέγεται ηκαταλληλότερη κινητή φάση, έτσι ώστε σεσυνδυασμό με την επιλεγείσα στατική φάση ναπετυχαίνει τιμές k’ 1-10

• Εκλογή με «δοκιμή και λάθος» (trial and error), λαμβάνοντας υπόψη βασικές αρχές και εμπειρία

• Λαμβάνονται υπόψη χαρακτηριστικά διαλυτών:– Πολικότητα, διπολική ροπή, διηλεκτρική σταθερά, ενέργειες ηλεκτρονικών μεταπτώσεων, ενέργειεςπροσρόφησης, διαλυτότητες

Επιλογή Κινητής Φάσης (2)• Κατά τα πειράματα εκλογής διαλύτηδοκιμάζονται διάφορα διαλύματα κατά σειράαυξανόμενης πολικότητας, μέχρι επίτευξηςεπιθυμητών τιμών:– Παράγοντα χωρητικότητας k’– Παράγοντα εκλεκτικότητας α

• Για ταχύτερη εκλογή καταλληλότερωνπειραματικών συνθηκών στην HPLC (μεταξύτων οποίων και σύσταση κινητής φάσης) έχουναναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι βελτιστοποιήσεως(όπως μέθοδος Simplex).

Επιλογή Κινητής Φάσης (3)

• Εάν ένα δείγμα περιέχει περισσότερασυστατικά από όσα μπορεί να διαχωρίσειμια ισοκρατική ανάλυση:– Αναπτύσσεται πρόγραμμα βαθμιδωτήςέκλουσης

– Οι μεγάλες τιμές k’ μειώνονται συνεχώς και ναδιαχωρίζονται περισσότερα συστατικά σεμικρότερο χρόνο

Ιδιότητες διαλυτών που χρησιμοποιούνται στην HPLCRI = Δείκτης διάθλασης, λ = μήκος κύματος με απορρόφηση ίση με 1

(σημείο αποκοπής), P’ = Δείκτης πολικότητας, ε = Διηλεκτρική σταθερά

Τροποποιητής (modifier)• Πολικοί διαλύτες (νερό, ακετονιτρίλιο, μεθανόλη) που προστίθεται σε μικρή ποσότητα σε χαμηλήςπολικότητας κινητές φάσης σε HPLC προσρόφησης

• Ο πολικός διαλύτης προσροφάται κατάπροτίμηση στις πλέον δραστικές θέσειςπροσροφητικού υλικού, μειώνοντας τηνπροσροφητική του δύναμη– Επιτυγχάνεται έτσι σταθερή «δραστικότητα» ήπροσροφητική δύναμη και επαναληψιμότητα στηναπόδοση της στήλης

61

Παράγοντας Ανάσχεσης (Retention Factor), k

tR

t0

Σήμα

Ανιχνευτή

Χρόνος

tR: Χρόνος ανάσχεσηςt0: Νεκρός χρόνος

0

0R

tttk −

=

62

Αριθμός Θεωρητικών Πλακών, n

W

W1/2H1/2

H

2

.21

R

R

/

R

Wt

W

2

2

2

π

545

16

•=

=

=

AreaHt

tn

63

Αξιολόγηση Επίδοση Στήλης Βασισμένη στονΑριθμό Θεωρητικών Πλακών (Ν)

• Εάν οι χρόνοι ανάσχεσηςείναι ίδιοι, το εύροςκορυφής είναι μικρότερο σεαυτή με το μεγαλύτερο Ν.

• Εάν το εύρος κορυφής είναιτο ίδιο, ο χρόνοςανάσχεσης είναιμεγαλύτερος σε αυτή με τομεγαλύτερο Ν.

N: Μεγάλο

N: Μικρό

N: ΜικρόN: Μεγάλο

64

Παράγοντας Διαχωρισμού, a

• Παράγοντας διαχωρισμού: Λόγος k των δύοκορυφών

)( 12

1

2

kkkk

>

=αk1 k2

65

Διαχωριστικότητα (Resolution), RS

2,2/11,2/1

RR

21

RRS

12

12

18.1

)(21

hh WWtt

WW

ttR

+

−×=

+

−=

tR1 tR2

W1 W2

W1/2h,1 W1/2h,2 h1/2

66

Απαιτούμενη Διαχωριστικότηταγια Πλήρη Διαχωρισμό

Εάν οι κορυφές είναι ισοσκελή τρίγωνα,διαχωρίζονται πλήρως.

tR2 - tR1 = W1 = W2

RS = 1

(tR2 - tR1)

W1 W2 W1 W2

Εάν οι κορυφές είναι κατανομές Gauss, απαιτείταιRS > 1.5 για πλήρη διαχωρισμό.

tR2 - tR1 = W1 = W2

RS = 1

(tR2 - tR1)

67

Σχέση Μεταξύ Διαχωριστικότηταςκαι Άλλων Παραμέτρων

• Η διαχωριστικότητα είναισυνάρτηση τουπαράγοντα διαχωρισμού(α), του αριθμούθεωρητικών πλακών (Ν), και του παράγονταανάσχεσης (k’).

• O διαχωρισμός μπορεί ναβελτιωθεί με βελτίωσητων 3 παραμέτρων.

+−

=

+

−=

11

41

)(21

2

2

21

1R2RS

k’k’N

WW

ttR

αα

68

Συμμετοχή του ΠαράγονταΧωρητικότητας (k’) στηΔιαχωριστικότητα

• Αύξηση του παράγονταχωρητικότηταςβελτιώνει τοδιαχωρισμό!

• Παράγονταςχωρητικότητας περίπου3 έως 10 είναικατάλληλος. Ηυπέρβαση αυξάνει τοχρόνο ανάλυσης.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 5 10 15 20Παράγοντας Χωρητικότητας

Λόγοςσυμμετοχήγιαδιαχωριστικότητα

69

Συμμετοχή ΘεωρητικώνΠλακών στη

Διαχωριστικότητα• Ηδιαχωριστικότητααυξάνει αναλογικάμε την τετραγωνικήρίζα του Ν.

0,0

1,0

2,0

0 10000 20000 30000Theoretical plate number

Con

tribu

tion

fact

or fo

r res

olut

ion

70

Για βελτίωση διαχωρισμού...

Αύξηση k’

Αύξηση N

Αύξηση α

Πριν τηνΡύθμιση

Αντικατάσταση εκλουστικού με έναμικρότερης εκλουστικής ισχός.

Αντικατάσταση στήλης με μιακαλύτερης επίδοσης.Στήλη μεγαλύτερου μήκους.

Αντικατάσταση υλικού πλήρωσης στήληςΑλλαγή σύστασης εκλουστικού.Αλλαγή θερμοκρασίας στήλης.

71

Ανάλυση βασικών ουσιώνΕπίδραση Υπολειπόμενων Ομάδων Σιλανολών

O

-O-Si-O

Si

SiO

SiH +

Υπολειπόμενη ομάδα σιλανόλης

Οι βασικές ουσίες αλληλεπιδρούνμε τις υπολειπόμενες ομάδεςσιλανόλης, προκαλώντας

καθυστερημένη έκλουση και ουρά.

N

72

Ανάλυση Βασικών ΟυσιώνΠροσθήκη Υπερχλωρικού

Νατρίου

OSi

Si Βασικές ουσίες σχηματίζουν ζεύγη ιόντων μευπερχλωρικά ιόντα, εξισσοροπώντας το

φορτίο και αυξάνοντας την ισχύ κατακράτησης.

H +NClO4 ΖεύγοςΖεύγος ιόντωνιόντων

73

ΧρωματογραφίαΑντίστροφης Φάσης Ζευγών

Ιόντων• Αυξάνει την ισχύ κατακράτησης με την προσθήκη στοεκλουστικό αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων με αντίθετοφορτίο της ουσίας στόχου.

ΣχηματισμόςΣχηματισμός ζεύγουςζεύγους ιόντωνιόντων ΣχηματισμόςΣχηματισμός ζεύγουςζεύγους ιόντωνιόντων

ΕπίδρασηΕπίδραση ιονταλλαγήςιονταλλαγής ΕπίδρασηΕπίδραση ΙονανταλλαγήςΙονανταλλαγής

Βασικές Ουσίες Όξινες Ουσίες

74

ΑντιπροσωπευτικάΑντιδραστήρια Ζευγών Ιόντων

• Ανιοντικές Ουσίες– Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)

• Κατιοντικές Ουσίες– Πεντανοσουλφονικό νάτριο (C5)

– Εξανοσουλφονικό νάτριο (C6)

– Επτανοσουλφονικό νάτριο (C7)

– Οκτανοσουλφονικό νάτριο (C8)

Εφαρμογές HPLC (1)• Διαχωρισμό, ποιοτική και ποσοτική ανάλυσηπολύπλοκων μειγμάτων ουσιών ποικίληςπροέλευσης.

• Σε αντίθεση με GLC, χρησιμοποιείται σεδιαχωρισμούς / ανάλυση μειγμάτων ουσιών:– Μεγάλου μοριακού βάρους– Υψηλής πολικότητας– Πολυμερών– Ιοντικών ενώσεων

Εφαρμογές HPLC (2)

• Ταχύτητα αναλύσεων παρόμοια με αυτήGLC

• Διαχωριστική ικανότητα 3-10 φορέςκαλύτερη από αυτή της TLC

• Κόστος μιας συσκευής HPLC αρκετάυψηλό

77

Ποιοτική Ανάλυση

• Ταυτοποίηση βασισμένη στο χρόνοανάλυσης

• Λήψη φάσματος με τον ανιχνευτή– Φάσμα UV (ανιχνευτής σειράς φωτοδιόδων)

– ΦάσμαMS

• Μεταφορά σε άλλο αναλυτικό όργανο μετάτον παρασκευαστικό διαχωρισμό

Τεχνικές Διαχωρισμού

Έχω δύο τεχνικές διαχωρισμού στο εργαστήριό μου,High Performance Liquid Chromatography (HPLC) καιGas Chromatography (GC). Ποιά θα χρησιμοποιήσω;

Σύγκριση HPLC και GC Πτητικότητα ουσιών Πολικότητα ουσιών

HPLC•Όχι απαίτηση πτητικότητας•Οι αναλύτες πρέπει να είναιδιαλυτοί στην κινητή φάση

GC•Οι αναλύτες πρέπεινα είναι πτητικοί

HPLC

GC

•Διαχωρίζει άπολεςκαι πολικές ουσίες

•Πολυαρωματικούςυδρογονάθρακες (PAHs)- ανόργανα ιόντα

•Διαχωρίζει άπολεςκαι πολικές ουσίες

Σύγκριση HPLC και GC

Σύγκριση HPLC και GC Θερμική αστάθεια αναλυτών Μοριακό βάρος αναλυτών

HPLC•Η ανάλυση μπορεί να γίνεισε θερμοκρασία δωματίουή χαμηλότερη

GC•Οι αναλύτες πρέπει ναείναι ικανοί να επιβιώσουνστην υψηλή θερμοκρασίαεισαγωγής και στήλης

HPLC

GC

•Δεν υπάρχει θεωρητικόάνω όριο

•Πρακτικά η διαλυτότηταείναι το όριο

•Τυπικά < 500 amu

Σύγκριση HPLC και GC

Προκατεργασία δείγματος Μέγεθος δείγματος

HPLC•Το δείγμα πρέπεινα διηθείται

•Το δείγμα πρέπει να είναιστον ίδιο διαλύτη όπωςη κινητή φάση

GC

•Ο διαλύτης πρέπει ναείναι πτητικός και γενικάπτητικότερος από τουςαναλύτες

HPLC

GC

•Εξαρτάται από εσωτερικήδιάμετρο στήλης

• Τυπικά 1 - 5 µL

Σύγκριση HPLC και GC Μηχανισμός διαχωρισμού Ανιχνευτές

HPLC•Αμφότερες η στατικήφάση και η κινητή φάσηλαμβάνουν μέρος

GC

• Η κινητή φάση είναι μόνοο μεταφορέας του δείγματος

HPLC

GC

• Πλέον κοινός UV-Vis• Μεγάλο εύροςμη-καταστροφικών ανιχνευτών

• 3-διαστάσεων ανιχνευτές•Ευαισθησία μέχρι fg

(εξαρτάται από τον ανιχνευτή)

•Πλέον κοινός FID,γενικός οργανικώνενώσεων

Εφαρμογές HPLC στηνΦαρμακευτική Ανάλυση

• Τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματαφαρμακευτικής ανάλυσης– Φαρμακευτικά δείγματα είναι μείγματα (σκευάσματα)– Ανάλυση βιολογικών δειγμάτων για τον προσδιορισμόεπιπέδων φαρμάκων (μελέτες βιοδιαθεσιμότητας, βιοϊσοδυναμίας)

• Περιέχουν φάρμακα, μεταβολίτες τους και ενδογενείς ουσίες

• Συνήθως πριν την εισαγωγή δείγματος στοχρωματογράφο προηγείται εκχύλιση (στερεήςφάσης ή άλλη τεχνική προκαταρκτικούδιαχωρισμού)

85

Στατικές Φάσεις και Κινητές ΦάσειςΧρησιμοποιούμενες στην Χρωματογραφία

Κανονικής Φάσης

• Στατική Φάση– Πηκτή διοξειδίου πυριτίου: -Si-OH

– Κύανο-: -Si-CH2CH2CH2CN– Άμινο-: -Si-CH2CH2CH2NH2

– Δίολο-: -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2OH

• Κινητή φάση– Κύριοι διαλύτες: Αλειφατικοί υδρογονάθρακες,

αρωματικοί υδρογονάθρακες, κλπ.

– Επιπλέον διαλύτες: Αλκοόλες, αιθέρες, κλπ.

86

Σχέση μεταξύ Δεσμών Υδρογόνου καιΧρόνου Ανάσχεσης στην χρωματογραφία

κανονικής φάσης

OH

HO

SiOH

SiOHΙσχυρόςΙσχυρός

ΑσθενήςΑσθενής

Στερεοχημική παρεμπόδιση

ΠολύΠολύ ασθενήςασθενής

87

Σχέση μεταξύ πολικότητας εκλουστικού καιχρόνου ανάσχεσης στον τύπο κανονικής φάσης

100/0

Εκλουστικό: Εξάνιο/μεθανόλη

95/5

98/2

88

Σύγκριση Κανονικής Φάσης καιΑντίστροφης Φάσης

• Κανονικής φάσης– Αποδοτική γιαδιαχωρισμό δομικώνισομερών

– Προσφέρει εκλεκτικότηταδιαχωρισμού μηεπιτεύξιμη με τηναντίστροφη φάση

– Σταθεροποιείται αργά καιείναι επιρρεπής σεδιακυμάνσεις στο χρόνοανάσχεσης

– Δαπανηρά εκλουστικά

• Αντίστροφης φάσης– Ευρεία περιοχή εφαρμογών– Αποδοτική γιαδιαχωρισμούς ομολόγων

– Στατική φάση μεμεγαλύτερο χρόνο ζωής

– Σταθεροποιείται ταχέως– Εκλουστικά χαμηλούκόστους και εύκολα στηχρήση

89

Χρωματογραφία Ιονανταλλαγής

N+

RR

R

SO3- +

++

++

++

+++

Ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση(Δυνάμεις Coulomb)

Ανιονανταλλαγή

Κατιονανταλλαγή

90

Χρωματογραφία ΑποκλεισμούΙόντων

H+

H+

H+

Ιόντα ισχυρών οξέων απωθούνταιαπό το φορτίο και δεν μπορούν ναεισέλθουν στον πόρο.

Ανάλογα με το επίπεδο διάστασης, μερικάιόντα ασθενών οξέων μπορούν ναεισέλθουν στον πόρο.

91

Αρχή ΧρωματογραφίαςΑποκλεισμού Μεγέθους

ΥλικόΠλήρωσης

Το μέγεθος των μορίων τουσυστατικού καθορίζει εάν μπορεί ναεισέλθει στους πόρους.

92

Σχέση μεταξύ μοριακού βάρους και χρόνουανάσχεσης στη χρωματογραφία

αποκλεισμού μεγέθους

‘‘ΟριοΟριο αποκλεισμούαποκλεισμού

ΌριοΌριο διαπερατότηταςδιαπερατότητας

Εκλουστικήχωρητικότητα

ΜοριακόΒάρος

(λογαριθμικήκλίμακα)

Εφαρμογές HPLC

Χημικές

Περιβαλλοντικές

ΦαρμακευτικέςΚαταναλωτικά προϊόντα

Κλινικές

πολυστυρένιαχρωστικέςΦθαλικοίεστέρες

τετρακυκλίνεςκορτικοστεροειδήαντικαταθληπτικάβαρβιτουρικά

ΑμινοξέαΒιταμίνεςΟμοκυστεϊνη

Βιοεπιστήμεςπρωτεϊνεςπεπτίδιανουκλεοτίδια

ΛιπίδιαΑντιοξειδωτικάΣάκχαρα

Πολυαρωματικοί υδρογονάθρακεςΑνόργανα ιόνταΖιζανιοκτόνα

94

Κατασκευή ΚαμπύληςΑναφοράς Μοριακών Βαρών

Μοριακάβάρη

(λογαριθμικήκλίμακα)

Εκλουστική χωρητικότητα

Για διαχωρισμό μεγάλων μοριακών βαρών

Για διαχωρισμό μικρών μοριακών βαρών

Για διαχωρισμό ευρείας περιοχής(μεικτής πηκτής)

Ποσοτική Ανάλυση με HPLC

• Χρησιμοποιούνται οι μέθοδοι πουαναφέρθηκαν στην GLC:– Καμπύλης αναφοράς– Εσωτερικού προτύπου– Ενός σημείου– Κανονικοποίησης (χρήση σχετικής επιφάνειαςκορυφών).

96

Καμπύλη Αναφοράς για μέθοδοπολλαπλών εξωτερικών

προτύπων

C1

C4

C3

C2

Συγκέντρωση Εμβαδόν

A1

A2

A3

A4C1 C2 C3 C4

A1

A2

A3

A4

Συγκέντρωση

ΕμβαδόνΚορυφής

ΚαμπύληΚαμπύλη αναφοράςαναφοράς

97

Καμπύλη αναφοράς για μέθοδοεσωτερικού προτύπου

C1

C4

C3

C2

Συγκέντρωση Εμβαδόν

A1

A2

A3

A4C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS

A1/AIS

A2 /AIS

A3 /AIS

A4 /AIS

Συγκέντρωση αναλύτη / Συγκέντρωση IS

ΛόγοςΕμβαδούαναλύτη

/ Εμβαδόν

IS Calibration curveCalibration curveΑναλύτηςΕσωτερικό

πρότυποd

CIS

CIS

CIS

CIS

AIS

AIS

AIS

AIS

98

Πλεονεκτήματα ΜεθόδουΕσωτερικού Προτύπου (1)

• Ανεπηρέαστη από μη αναπαραγώγιμο εισαγόμενοόγκο.

10 µL εισαγωγή

9 µL εισαγωγή

CX / CIS

AX / AIS

XIS

X IS

ΊδιοςΊδιοςλόγοςλόγοςεμβαδώνεμβαδών

99

Πλεονεκτήματα ΜεθόδουΕσωτερικού Προτύπου (2)

• Ανεπηρέαστη από διαφορές στην ανάκτησηαναλύτη κατά την προκατεργασία.

100% ανάκτηση

90% ανάκτηση

CX / CIS

A X/ A

IS

XIS

X IS

ΊδιοςΊδιοςλόγοςλόγοςεμβαδώνεμβαδών

Μέθοδος Ενός Προτύπου(Εξωτερικού ή Εσωτερικού Προτύπου)

• Για αναλύσεις ρουτίνας• Προϋπόθεση η καμπύλη αναφοράς να είναι γραμμική καινα διέρχεται στατιστικά από το μηδέν

• Το χρησιμοποιούμενο μοναδικό πρότυπο να είναι όσο τοδυνατόν πλησιέστερα προς τα αναμενόμενα άγνωστα

πουπροτεσωτερικοθοδµγια

πουπροτεξωτερικοθοδοµγια

ύύoέxCAAAAC

ύύέxCAAC

sISs

ISxx

ss

xx

______//

______

=

=

Μέθοδος Κανονικοποίησης (1)

Μέθοδος Κανονικοποίησης (2)

103

Καθαρισμός Δείγματος με Διήθησηκαι Φυγοκέντριση

• Γενικά, διηθήστε κάθεδείγμα πριν τηνεισαγωγή!

• Χρησιμοποιείστε μιαςχρήσεως φίλτρο μεδιάμετρο πόρων περίπου0.45 µm.

• Φυγοκεντρικόςδιαχωρισμός για δείγματαδύσκολα προς διήθηση.

Φίλτρο Σύριγγα

104

Καθαρισμός Δείγματος μεΕκχύλιση Στερεής Φάσης

(1)Εξισορρόπηση

(2)ΠροσθήκηΔείγματος

(3)Έκπλυση

(4)Έκλουση

ΔιαλύτηςχαμηλήςεκλουστικήςδύναμηςΔιαλύτηςυψηλήςεκλουστικήςδύναμης

Αναλύτης

Ανεπιθύμητασυστατικά