知识点知识点 3.13.1

微生物与发酵工艺微生物与发酵工艺

知识点知识点 3.13.1

第一节 第一节 工业生产常用的微生工业生产常用的微生物及要求物及要求第二节 第二节 工业微生物菌种的衰工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏退、复壮与保藏

知识点知识点 3.13.1

第三节 第三节 工业微生物菌种的选工业微生物菌种的选育育第四节 第四节 生产菌种的改良生产菌种的改良第五节 第五节 种子的扩大培养种子的扩大培养

第一节 第一节 工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物及要求及要求

一、工业生产常用的微生物一、工业生产常用的微生物 ⒈ ⒈ 细菌细菌 工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、

醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和

肌苷酸等等。肌苷酸等等。

⒉ ⒉ 酵母菌酵母菌 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、工业上用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、

类酵母等。类酵母等。 分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶 (lip(lip

ase)ase) 以及生产可食用、药用和饲料用酵母以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。菌体蛋白等。

酿酒酵母的菌落酿酒酵母的菌落 大肠杆菌的菌落大肠杆菌的菌落

⒊ ⒊ 霉菌霉菌 工业上常用的霉菌工业上常用的霉菌

有：藻状菌纲的根有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、半知菌类的曲霉、青霉等。它们可用青霉等。它们可用于生产多种酶制剂、于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及抗生素、有机酸及甾体激素甾体激素 (steroid (steroid hormone)hormone) 等。等。

⒋ ⒋ 放线菌放线菌 在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力

作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈或呈分散生长，或呈菌丝团菌丝团状生长。状生长。

放线菌的最大经济价值在于能产生多种放线菌的最大经济价值在于能产生多种抗抗生素生素 (antibiotic)(antibiotic) 。。

从微生物中发现的抗生素，有从微生物中发现的抗生素，有 6060 ％以上是％以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。素、庆大霉素等。

常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。

⒌ ⒌ 担子菌担子菌 ⒍ ⒍ 藻类藻类

螺旋藻螺旋藻

灵 芝灵 芝

二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求

⑴ ⑴ 原料廉价、生长迅速、目的产物产量高；原料廉价、生长迅速、目的产物产量高； ⑵ ⑵ 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周易于控制培养条件，酶活性高，发酵周

期较短；期较短； ⑶ ⑶ 抗杂菌和噬菌体的能力强；抗杂菌和噬菌体的能力强； ⑷ ⑷ 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，

不产生任何有害的生物活性物质和毒素，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。保证安全生产。

第二节 第二节 工业微生物菌种的衰退、工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏复壮与保藏

一、微生物菌种的衰退一、微生物菌种的衰退 ⒈ ⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因 菌种衰退的菌种衰退的原因原因有两个方面：有两个方面： 一是菌种保藏不妥；一是菌种保藏不妥； 二是菌种生长的条件要求没有得到满足，二是菌种生长的条件要求没有得到满足，

或是遇到不利的条件，或是失去某些需要或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。的条件。

此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。变，从而丧失新的特征等情况。

菌种的菌种的自发突变自发突变和和回复突变回复突变是引起菌种自是引起菌种自身衰退的主要原因。身衰退的主要原因。

微生物细胞在每一世代中的突变概率一般微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为为 1010-8-8～～ 1010-9-9，保藏在，保藏在 00～～ 4 ℃4 ℃ 时这一时这一突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退的可能。的可能。

菌种的菌种的回复突变回复突变是指突变菌株因遗传组成是指突变菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。退化。

野生型菌株 突变

菌株

原养型菌株

诱变

二次诱变

或回复突变

突变不完全突变不完全造成菌体遗传组成的差异。造成菌体遗传组成的差异。

⒉ ⒉ 菌种性能的改变菌种性能的改变 ⑴ ⑴ 菌种遗传特性的改变菌种遗传特性的改变 ① ① 异核现象导致微生物群体发生变异。异核现象导致微生物群体发生变异。 ② ② 自发突变导致菌种遗传特性改变。自发突变导致菌种遗传特性改变。 ③ ③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的突变所产生的变种或杂交重组所形成的

杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同同基因型基因型（亦称遗传型）的个体。（亦称遗传型）的个体。

比较：比较：基因型基因型和和表 型表 型

⑵ ⑵ 菌种生理状况的改变 菌种生理状况的改变 ① ① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。菌种的特性。

如如灰色链霉菌灰色链霉菌 ((Streptomyces griseusStreptomyces griseus))

链霉菌属孢子丝的主要类型链霉菌属孢子丝的主要类型 链霉素分子式链霉素分子式

② ② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。而影响发酵产量。

③ ③ 在某些培养条件下，菌体的某些基因处在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。状态改变。

⒊ ⒊ 防止菌种衰退的措施防止菌种衰退的措施 ⑴ ⑴ 菌种的分离菌种的分离 如如芽孢杆菌芽孢杆菌 如如 AT3.942AT3.942 栖土曲霉栖土曲霉

黑曲霉黑曲霉

⑵ ⑵ 菌种的复壮 菌种的复壮 狭义的复壮狭义的复壮与与广义的复壮广义的复壮 比较：比较：正突变正突变和和负突变负突变

⑶ ⑶ 提供良好的环境条件提供良好的环境条件 发酵生产上一般只用发酵生产上一般只用三代三代内的菌种内的菌种 ⑷ ⑷ 用优良的保藏方法用优良的保藏方法 ⑸ ⑸ 定期纯化菌种定期纯化菌种

二、菌种的复壮二、菌种的复壮 ⑴ ⑴ 纯种分离 纯种分离 菌落纯菌落纯 细胞纯细胞纯

⑵ ⑵ 通过寄主体进行复壮 通过寄主体进行复壮 如如杀螟杆菌杀螟杆菌

⑶ ⑶ 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 如如““ 5406”5406” 菌种菌种

枯草芽孢杆菌菌落枯草芽孢杆菌菌落

单核细胞单核细胞

米曲霉菌落米曲霉菌落

三、菌种的保藏三、菌种的保藏 ⒈ ⒈ 菌种保藏的原理菌种保藏的原理 ⒉ ⒉ 菌种保藏方法菌种保藏方法 ⑴ ⑴ 斜面低温保藏法斜面低温保藏法 ⑵ ⑵ 液体石蜡封存保藏法液体石蜡封存保藏法 ⑶ ⑶ 固体曲保藏法固体曲保藏法 ⑷ ⑷ 砂土管保藏法砂土管保藏法 ⑸ ⑸ 冷冻干燥法冷冻干燥法 ⑹ ⑹ 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法

中温大曲中温大曲

液氮保藏菌种液氮保藏菌种

简易冷冻干燥法简易冷冻干燥法

低温冰箱低温冰箱液氮罐液氮罐

⒊ ⒊ 菌种保藏的注意事项菌种保藏的注意事项 ⑴ ⑴ 菌种在保藏前所处的状态菌种在保藏前所处的状态 ⑵ ⑵ 菌种保藏所用的基质菌种保藏所用的基质 低温低温保藏斜面保藏斜面培养基，碳源比例应少些，营培养基，碳源比例应少些，营

养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。谢活动增强，影响保藏时间。

⑶ ⑶ 操作过程对细胞结构的损害操作过程对细胞结构的损害 冻结速度冻结速度 真空干燥程度真空干燥程度

第三节 第三节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育

菌种菌种选育选育

经验经验育种育种

定向定向育种育种

自然自然选育选育诱变诱变育种育种杂交杂交育种育种

分子分子育种育种

主要通过突主要通过突变和筛选来变和筛选来育种育种

常规的杂常规的杂交育种交育种原生质原生质体融合体融合通过通过 DNADNA重组技术重组技术来育种来育种

稀释法稀释法

一、自然选育一、自然选育 ⒈ ⒈ 从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株 ⑴ ⑴ 采样采样 ⑵ ⑵ 增殖培养增殖培养 ⑶ ⑶ 纯种分离纯种分离 ⑷ ⑷ 生产性能的测定 生产性能的测定

划线法划线法

⒉ ⒉ 从自发突变体中获得菌株从自发突变体中获得菌株

自然突变自然突变是指在自然条件下出现的基因变是指在自然条件下出现的基因变化。化。

微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌种（突变株）常常是打破了殖，而生产菌种（突变株）常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出表现出生活力比野生菌株弱、遗传特性不生活力比野生菌株弱、遗传特性不够稳定够稳定的特点。的特点。

二、诱变育种的程序二、诱变育种的程序 比较：比较：野生菌株野生菌株与与突变菌株突变菌株 比较：比较：负变异株负变异株与与正变异株正变异株

⒈ ⒈ 出发菌株的选择出发菌株的选择 ⒉ ⒉ 菌悬液的制备菌悬液的制备 ⒊ ⒊ 前培养前培养 ⒋ ⒋ 诱变诱变 ⒌ ⒌ 变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选 青霉青霉

诱变过程诱变过程 L-L- 亮氨酸产量亮氨酸产量 /g/g••LL-1-1

发酵方式发酵方式黄色短杆菌黄色短杆菌 分批发酵分批发酵

（恒温（恒温 28℃28℃））

补料分批发酵补料分批发酵（恒温（恒温 28℃28℃ ））

补料分批发酵补料分批发酵（变温控制）（变温控制）

TQ9806(RifTQ9806(Rifrr300μg/300μg/mL)mL)

18.518.5 21.321.3 22.722.7

↓↓ 自发突变自发突变TK0301(RifTK0301(Rifrr400μg/400μg/mL)mL)

21.821.8 23.123.1 24.324.3

↓↓DES+LiClDES+LiCl 复合诱变复合诱变TK0302(RifTK0302(Rifrr600μg/600μg/mL)mL)

23.523.5 25.925.9 26.626.6

↓↓UV+LiClUV+LiCl 复合诱变复合诱变TK0303(RifTK0303(Rifrr800μg/800μg/mL)mL)

25.225.2 27.727.7 28.328.3

↓ ↓ UVUV与光复活交替处理 与光复活交替处理 +LiCl+LiCl 复合诱变复合诱变

TK0304(RifTK0304(Rifrr1000μg/1000μg/mL)mL)

26.426.4 28.028.0 26.926.9

目的突变菌株目的突变菌株 TK0303TK0303 的诱变图的诱变图谱谱

导致微生物同步生长的选择法导致微生物同步生长的选择法

三、诱变育种方案设计三、诱变育种方案设计 ㈠ 突变的诱发㈠ 突变的诱发 诱变剂所造成的诱变剂所造成的 DNADNA 分子的某一位置的分子的某一位置的结构改变称为结构改变称为前突变前突变。。

⒈ ⒈ 诱变剂接触诱变剂接触 DNADNA 分子分子 ⒉ ⒉ DNADNA 损伤的修复损伤的修复 光复活作用光复活作用 切补修复切补修复 重组修复重组修复 SOSSOS 修复系统修复系统 DNADNA 多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用

⒊ ⒊ 从前突变到突变从前突变到突变光复活作用 光复活作用

修修复复系系统统

校正校正差错差错

引起引起差错差错

切补修复切补修复

DNADNA多聚酶校正作多聚酶校正作用用

重组修复重组修复

SOSSOS 修复系修复系统统

不利于不利于突变突变

有利于有利于突变突变

⒋ ⒋ 从突变到突变表型从突变到突变表型 突变基因的出现并不等于突变表型的出现，突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延表型迟延。。

表型迟延有两种原因：表型迟延有两种原因： 分离性迟延分离性迟延 生理性迟延生理性迟延

前突变 突变 突变表型前突变 突变 突变表型 比较：比较：基因型基因型与与表型表型

㈡ 诱变剂的种类及选择㈡ 诱变剂的种类及选择 ⒈ ⒈ 诱变剂诱变剂 物理诱变剂物理诱变剂和和化学诱变剂化学诱变剂 ⒉ ⒉ 影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素 ㈢ 出发菌株的选择㈢ 出发菌株的选择 ① ① 选择纯种作为出发菌株，借以排除选择纯种作为出发菌株，借以排除异核异核

体体或或异质体异质体的影响。的影响。 ② ② 选择出发菌株，不仅是选产量高的，还选择出发菌株，不仅是选产量高的，还

应该考虑其他因素。应该考虑其他因素。 ③ ③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，

不但可以提高变异频率，而且高产突变株的不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。出现率也大。

㈣ 筛选的方法㈣ 筛选的方法 ⒈ ⒈ 制定筛选方案制定筛选方案 整个流程可分为整个流程可分为诱变诱变和和筛选筛选两部分。两部分。 筛选过程筛选过程主要包括主要包括传种斜面传种斜面、、菌株保藏菌株保藏和和筛筛

选高产菌株选高产菌株这这三三项工作。项工作。

⒉ ⒉ 营养缺陷型的筛选方法营养缺陷型的筛选方法 比较：比较：营养缺陷型营养缺陷型（（ auxotrophauxotroph）、）、原养原养型型（（ prototrophprototroph）、野生型（）、野生型（ wild typwild typee））

比较：基本培养基（比较：基本培养基（ MMMM）、完全培养基）、完全培养基（（ CMCM）、补充培养基（）、补充培养基（ SMSM））

野生型菌株 突变

菌株

原养型菌株

诱变

二次诱变

或回复突变

回复突变株回复突变株

负（正）变株、负（正）变株、营养缺陷型等营养缺陷型等

二次诱变二次诱变

突突变变菌菌株株

天冬氨酸天冬氨酸

黄色短杆菌的代谢过程黄色短杆菌的代谢过程

甲硫氨酸甲硫氨酸 苏氨酸苏氨酸 赖氨酸赖氨酸

中间产物Ⅰ中间产物Ⅰ

天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶

中间产物Ⅱ中间产物Ⅱ

抑制抑制

高丝氨酸高丝氨酸

高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶脱氢酶

天冬氨酸天冬氨酸

人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸

中间产物Ⅰ中间产物Ⅰ

天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶

中间产物Ⅱ中间产物Ⅱ

甲硫氨酸甲硫氨酸 苏氨酸苏氨酸

高丝氨酸高丝氨酸

高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶脱氢酶

不能合成不能合成 可以大可以大量积累量积累

赖 氨 酸赖 氨 酸

人工诱变的人工诱变的菌种不能产生菌种不能产生

营养缺陷型的筛选，一般是经诱变后，再营养缺陷型的筛选，一般是经诱变后，再经经中间培养中间培养、、淘汰野生型淘汰野生型、、检出营养缺陷检出营养缺陷型型、、确定生长谱确定生长谱等步骤。等步骤。

甲硫氨酸缺陷型菌株甲硫氨酸缺陷型菌株

夹层平板法夹层平板法

⒊ ⒊ 突变株的筛选突变株的筛选

透明圈透明圈

育种工作中常采用育种工作中常采用随机筛选随机筛选和和理性化筛选理性化筛选这两种筛选方法。这两种筛选方法。

⑴ ⑴ 随机筛选 随机筛选 ① ① 摇瓶筛选法摇瓶筛选法

② ② 琼脂块筛琼脂块筛选法选法

③ ③ 筛选自动筛选自动化和筛选工化和筛选工具微型化具微型化

⑵ ⑵ 理性化筛选理性化筛选

初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物次级代谢产物 (( 主要是抗生素主要是抗生素 )) 高产菌高产菌株的筛选株的筛选

① ① 初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选 Ⅰ Ⅰ 降低终产物浓度降低终产物浓度 (a) (a) 筛选终产物营养缺陷型筛选终产物营养缺陷型

反反馈馈抑抑制制模模式式图图

CC DDBB

反馈阻遏反馈阻遏

AA EE

反馈抑制反馈抑制

aa bb cc dd

发酵产物发酵产物 限量供给限量供给

赖氨酸高产菌赖氨酸高产菌株的代谢调控株的代谢调控机制机制

(b) (b) 筛选细胞膜透性改变的突变株 筛选细胞膜透性改变的突变株 如用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型如用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型 (bi(bi

otin deficiency)otin deficiency)进行谷氨酸发酵进行谷氨酸发酵

Ⅱ Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株筛选抗反馈突变菌株 (a) (a) 筛选结构类似物筛选结构类似物 (( 抗代谢物抗代谢物 )) 抗性突变抗性突变株株

如选育如选育 LL-- 精氨酸（精氨酸（ LL-Arg-Arg ）高产菌株，可）高产菌株，可采用筛选结构类似物采用筛选结构类似物 DD-Arg-Argrr菌株的方法菌株的方法

一般文献中采用上标“一般文献中采用上标“ r”r” 表示抗性，表示抗性，““ s”s” 表示敏感型表示敏感型

(b) (b) 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

能够生长的培养基能够生长的培养基 菌株菌株

野生型菌株 野生型菌株

营养缺陷型菌株 营养缺陷型菌株

原养型菌株原养型菌株

突变突变

回复突变回复突变或基因重组或基因重组

MMMM或或 CM CM

SMSM或或 CM CM

MMMM或或 CM CM

② ② 次级代谢产物次级代谢产物 (( 主要是抗生素主要是抗生素 )) 高产菌高产菌株的筛选。株的筛选。

质粒产物质粒产物 分叉中间体分叉中间体 (a) (a) 利用营养缺陷型筛选利用营养缺陷型筛选 渗漏缺陷型渗漏缺陷型 (leaky mutant)(leaky mutant) 是遗传性障碍是遗传性障碍

不完全的不完全的营养缺陷型营养缺陷型 一般文献中采用上标“一般文献中采用上标“ -”-” 表示营养缺陷型，表示营养缺陷型，

上标“上标“ L”L” 表示渗漏缺陷型表示渗漏缺陷型 例如：例如： MetMet--+ Thr+ ThrLL表示甲硫氨酸缺陷和苏表示甲硫氨酸缺陷和苏

氨酸渗漏氨酸渗漏

莽草酸莽草酸

芳香族氨基酸芳香族氨基酸

氯霉素氯霉素分叉中间体分叉中间体

反馈调节

反馈调节

芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素

(b) (b) 筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株 (c) (c) 筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株

抑菌圈抑菌圈

(d) (d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。筛选去碳源分解代谢调节突变株。 ““ 葡萄糖效应葡萄糖效应”” 葡萄糖的（毒性）葡萄糖的（毒性）结构类似物结构类似物也可用于筛选也可用于筛选

去碳源分解代谢调节突变株去碳源分解代谢调节突变株

(e) (e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。

αα--氨基己二酸氨基己二酸

赖氨酸赖氨酸

青霉素青霉素分叉中间体分叉中间体

反馈调节

反馈调节

筛选赖氨酸筛选赖氨酸结构类似物结构类似物抗性突变株，抗性突变株，可以促进青可以促进青霉素合成霉素合成

(f) (f) 筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 (g) (g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变筛选前体或前体结构类似物抗性突变株株

(h) (h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株

㈤ 突变基因的表现㈤ 突变基因的表现 菌种的发酵产量决定于菌种的菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性遗传特性和和

菌种的菌种的培养条件培养条件 例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变株株

第四节 第四节 生产菌种的改良生产菌种的改良 一、一、常规的杂交育种常规的杂交育种 青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生殖的过程殖的过程

菌菌丝丝联联结结

异核体

异核体

杂合二倍

杂合二倍

体体

亲本型分离

亲本型分离

子子

重组型分离子

重组型分离子质配质配 核配核配

染色体染色体交换交换

单倍化单倍化

二、原生质体融合二、原生质体融合 原生质体融合一般包括标记原生质体融合一般包括标记菌株的筛选菌株的筛选、、原原

生质体的制备生质体的制备、、原生质体的融合原生质体的融合、、融合子的融合子的选择选择、、实用性菌株的筛选实用性菌株的筛选等。 等。

主要试剂：主要试剂：脱壁酶、聚乙二醇脱壁酶、聚乙二醇 (PEG)(PEG) 和和 CaCa2+2+

原生质体融合过程简介如原生质体融合过程简介如下 ：下 ：

⒈ ⒈ 标记菌株的筛选标记菌株的筛选 ⒉ ⒉ 原生质体的制备原生质体的制备 ⑴ ⑴ 菌体的预处理菌体的预处理 ⑵ ⑵ 菌体的培养时间菌体的培养时间 ⑶ ⑶ 酶浓度酶浓度 ⑷ ⑷ 酶解温度酶解温度 ⑸ ⑸ 酶解时间酶解时间 ⑹ ⑹ 渗透压稳定剂渗透压稳定剂

⒊ ⒊ 原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生 ⒋ ⒋ 融合子的选择融合子的选择 ⒌ ⒌ 灭活原生质体融合技术在育种中的应用灭活原生质体融合技术在育种中的应用 ⑴ ⑴ 单一亲株灭活单一亲株灭活 ⑵ ⑵ 双亲株或多亲株灭活双亲株或多亲株灭活

三、三、 DNADNA 重组技术重组技术 ㈠ ㈠ DNADNA 重组过程重组过程 重组重组 DNADNA 技术一般包括四步，即技术一般包括四步，即目标目标 DNADNA片段的获得片段的获得、、与载体与载体 DNADNA 分子的连接分子的连接、、重重组组 DNADNA 分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞及及从中选出含有从中选出含有所需重组所需重组 DNADNA 分子的宿主细胞分子的宿主细胞。。

作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上加上外源基因的表达及稳定性的考虑外源基因的表达及稳定性的考虑。。

㈡ 分子育种技术㈡ 分子育种技术 通过基因工程改造后的菌株称为通过基因工程改造后的菌株称为工程菌工程菌

利用基因工程技利用基因工程技术生产氨基酸术生产氨基酸

第五节 种子的扩大培养第五节 种子的扩大培养 一、种子扩大培养的任务一、种子扩大培养的任务 二、种子制备的过程二、种子制备的过程 ⒈ ⒈ 孢子制备孢子制备 ⑴ ⑴ 放线菌孢子的制备放线菌孢子的制备 菌种进入种子罐有菌种进入种子罐有两两种方法：种方法： 孢子进罐法孢子进罐法 摇瓶菌丝进罐法摇瓶菌丝进罐法

搅拌种子罐搅拌种子罐

⑵ ⑵ 霉菌孢子的制备霉菌孢子的制备

⒉ ⒉ 种子制备种子制备 ⑴ ⑴ 摇瓶种子制备摇瓶种子制备 ⑵ ⑵ 种子罐种子制备种子罐种子制备 比较：比较：种子制备的目的种子制备的目的和和发酵的目的发酵的目的

种子罐的种子罐的级数级数主要决定于菌种的性质和菌体主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。 生长速度及发酵设备的合理应用。

种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。而造成发酵的波动。

酵母菌的三级培养过程酵母菌的三级培养过程

三、种子培养三、种子培养 ⒈ ⒈ 表面培养法表面培养法 ⒉ ⒉ 固体培养法固体培养法 ⒊ ⒊ 液体深层培养液体深层培养

四、种子质量的控制四、种子质量的控制 ㈠ 影响孢子质量的因素及其控制㈠ 影响孢子质量的因素及其控制 ⒈ ⒈ 培养基培养基 ⒉ ⒉ 培养温度和湿度培养温度和湿度 例如：龟裂链霉菌斜面例如：龟裂链霉菌斜面

⒊ ⒊ 培养时间和冷藏时间培养时间和冷藏时间 ⑴ ⑴ 孢子的培养时间孢子的培养时间 ⑵ ⑵ 孢子的冷藏时间孢子的冷藏时间 ⒋ ⒋ 接种量接种量

㈡ 影响种子质量的因素及其控制㈡ 影响种子质量的因素及其控制 ⒈ ⒈ 培养基培养基 ⒉ ⒉ 培养条件培养条件 ⒊ ⒊ 种龄种龄 在工业发酵生产中，一般都选在生命力极在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的为旺盛的对数生长期对数生长期，菌体量尚未达到最，菌体量尚未达到最高峰时移种。高峰时移种。

⒋ ⒋ 接种量接种量 双种法；倒种法；混种法双种法；倒种法；混种法

分批发酵条件下，黄色短杆菌分批发酵条件下，黄色短杆菌 TK0303TK0303 的菌体形态变的菌体形态变化化

5L5L 罐延迟期（罐延迟期（ 44hh ））

5L5L 罐对数期（罐对数期（ 3232hh））

5L5L 罐稳定期（罐稳定期（ 4848hh） ）

5L5L 罐衰亡期（罐衰亡期（ 6868hh））

摇瓶衰亡期（摇瓶衰亡期（ 7272hh））

⒌ ⒌ 种子质量标准种子质量标准 ⑴ ⑴ 细胞或菌体 细胞或菌体 ⑵ ⑵ 生化指标生化指标 ⑶ ⑶ 产物生成量 产物生成量 ⑷ ⑷ 酶活力酶活力 ⒍ ⒍ 种子异常的分析种子异常的分析 ⑴ ⑴ 菌种生长发育缓慢或过快菌种生长发育缓慢或过快 ⑵ ⑵ 菌丝结团 菌丝结团 ⑶ ⑶ 菌丝粘壁菌丝粘壁

放线菌放线菌

菌丝团菌丝团

霉菌菌丝霉菌菌丝

思 考 题思 考 题

⒈ ⒈ 微生物有哪些特点微生物有哪些特点 ?? 试举例说明微生物的试举例说明微生物的工业应用。工业应用。

⒉ ⒉ 工业生产中使用的微生物菌种为什么会发工业生产中使用的微生物菌种为什么会发生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌种衰退的措施有哪些？种衰退的措施有哪些？

思 考 题思 考 题

⒊ ⒊ 简要说明诱变育种的步骤。诱变育种应简要说明诱变育种的步骤。诱变育种应注意哪些问题？注意哪些问题？

⒋ ⒋ 试比较诱变育种技术、原生质体融合技试比较诱变育种技术、原生质体融合技术、术、 DNADNA 重组技术三种育种方法的优缺点。重组技术三种育种方法的优缺点。

⒌ ⒌ 影响种子质量的因素有哪些影响种子质量的因素有哪些 ??如何控制如何控制种子质量？ 种子质量？