研究生：张 圆

导　师：梁建生

G 蛋白是广泛存在于真核生物中具有重要生理调节功能的蛋白质。异源三聚体G 蛋白由 α 、 β 、 γ 三个亚基构成，它们通过复杂的三维结构交联在一起并在真核生物的细胞信号转导过程中发挥着十分重要的作用。拟南芥中同样存在着G 蛋白 , 其蛋白结构与哺乳动物类似 ,研究表明：植物中的 G 蛋白参与了激素、光和植物防御等多种信号的转导过程。

拟南芥生物学特性

G—蛋白概述

G—蛋白信号转导过程

拟南芥中的 G—蛋白

植物中 G—蛋白偶联受体蛋白

植物中 G—蛋白偶联的效应器

G—蛋白在植物信号转导上的研究进展

拟 南 芥 （ Arahidopsis thaliana ） 属 十 字 花 科（ Crucifer ）拟南芥属（ Arahidopsis thaliana category ），二年生草本植物，没有任何经济价值。但因其具有形态个体小、生长周期快、种子多、形态特征简单、基因组小等生物学特点，自20 世纪 80 年代以来迅速成为植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物（ Model plant ），被誉为植物界的“果蝇（ fruit fly ）”。

G- 蛋白是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有 GTP水解酶活性，广泛存在于真核生物中的一类蛋白。G 蛋白是一个超级家族，在细胞信号转导中起着重要作用的 G- 蛋白主要有两类：一类是与膜受体偶联的异源三聚体 G 蛋白 (Heterotrimeric GTP binding protein) ；另一类存在于细胞的不同部位，被称为“小 G 蛋白”（ Small GTP binding protein ）。 G— 蛋白在真核细胞膜信号的分选和扩大、蛋白质的合成与运输、细胞骨架的形成、囊泡在细胞内的运输以及细胞增殖及分化等方面起着重要的调节作用（ Bourne H R et 2000 ）。

Structure of G-protein

异源三聚体 G 蛋白由 α 、 β 、 γ三个亚基构成，它们通过复杂的三维结构交联在一起

α β

γ

α β

γ

美国北卡罗莱纳州大学的 John Sondek’s 研究组利用晶体学技术，对哺乳动物和拟南芥 G －蛋白的分子结构进行了计算机模拟，构建了拟南芥 G 蛋白的分子模型，拟南芥的 G －蛋白结构与哺乳动物的 G －蛋白结构非常相似 :

与动物不同，目前研究者已在拟南芥中发现 1 种 α 亚基（ GPA1 ）、 1 种 β 亚基（ AGB1 ）和 2 种 γ 亚基（ AGG1 、AGG2 ）（ Table 1 ），理论上，它们只能组合成 2 种异三聚体 G- 蛋白形式，这与人类具有至少 23 种 α 亚基、 6 种β 亚基和 12 种 γ 亚基 (Michael et al 2001) ，理论上可以组合成 1656 种不同的 G- 蛋白具有较大的差异。因而，拟南芥中是否有其它类型 G －蛋白存在，如此少的 G 蛋白是如何介导细胞中全部的信号转导过程还需进一步研究。

Subunit

Name

GeneName

Calculated MW

Calculated PI

Proteinlength(a

a)

Register

time

Author

α

GPA1

44546.0 6.2132 383 1990

Ma, H et al

βAGB1

41006.0 7.2549 377 1994Weiss et

al

γ

AGG110948.0 4.1757 98 2000

Mason et al

AGG211139.0 4.5008 100 2001

Mason et al

GPA1： 在拟南芥 G 蛋白的三个亚基中 ,α 亚基是研究的热点 ,

在 TA IR 中和 α 亚基相关的文章达 19篇之多。 G 蛋白 α 亚基类似于哺乳动物中 G 亚基家族的 Gi ，特别是 Gi 亚家族中的 Gz ，研究已知， Gz 在哺乳动物中通过控制 K+ 通道而影响细胞的增殖和死亡，因而推测 GPA1 可能在拟南芥中扮演同样的角色。通过对拟南芥 gpa1-1突变体（缺乏 GPA1 ）研究表明：该突变体在下胚轴和叶形成过程中细胞分裂减少（Figure1) 。而对拟南芥 GPA 过量表达突变体研究表明：该突变体过量表达 GPA1 并导致细胞异常的分裂，包括形成大量过分分裂的分生组织 (Figure2)（ Ullah et al, 2001 ） 。在酵母菌中过量表达豌豆的 Gα刺激了细胞的分裂（ Kim MC et al,2002 ）。这些研究都表明GPA1 参与了控制细胞分裂的信号转导过程。

与生长素信号途径不同 ,G 蛋白可能直接偶联了 ABA 信号转导途径。 Wang 等人证实，在拟南芥 gpa1突变体中，完全缺失了受 ABA抑制的光诱导气孔开张现象，此外 gpa1突变体由于缺失了 ABA 的反应能力， ABA不能够抑制 K+ 的内流或激活不依赖于 PH值的阴离子通道。有趣的是在 gpa1突变体中， ABA诱导的气孔关闭却没有受到影响，这也表明：在保卫细胞中 ABA诱导的气孔关闭和 ABA 介导的阻止气孔开张其机理可能不同， G 蛋白可能参与了 ABA 介导的阻止气孔开张，而 ABA诱导的气孔关闭可能不需要 G 蛋白的参与 (Wang et al,2001) 。

Ullah 等人利用 gpa1突变体研究种子萌发实验时发现，该突变体种子对 GA敏感性下降了数百倍，对Glc 的敏感性增强，而对 ABA 和乙烯的反应与野生型差别不大，对 BR完全没有敏感性。利用 GPA1过量表达突变体研究表明，与野生型相比，突变体的种子对 GA 的敏感性提高了上百万倍，但仍需要GA才能萌发。这些均表明在控制萌发过程中 GPA1 没有直接和 GA 信号途径相偶联。此外研究发现对于野生型种子，在 GA量过少时可以通过增加 BR量以促进萌发，但 gpa1却丧失了这种能力。这项研究暗示着 GPA1 可能直接是与 BR 的信号转导相偶联的并由此调节种子对 GA 的敏感性 (Ullah et al,2002) 。其具体过程可能如下：

BR

GA Germination

GCR1

ABA

Pirin1 GPA1 AGB1

RGS1

AGB1和 AGG1： 对拟南芥 G 蛋白 β 和 γ 亚基研究方面的报道较少。 Kevin 等人利用 G 蛋白 β 亚基的突变体 agb1-1 研究也表明，突变体的叶、花和果实的发育与其野生型明显不同，这表明 AGB1 参与了 ER （ a kind of receptor-like kinase ）信号转导途径，而此信号途径可能对拟南芥的器官形状的形成有关（

Figure3)。 (Kevin et al. 2001) 。

Ullah 通过研究拟南芥 gpa1 和 agb1 两类突变体根系表型发现： agb1-2 的侧根原基远较其野生型 col 多，而 gpa1-2突变体的侧根原基较其野生型 ws 要少得多 (Figure4) ，而根系的表型是由于生长素诱导的细胞分裂和细胞伸长所决定的。结合其它的相关证据，研究者认为：生长素诱导的细胞分裂并不是和 G 蛋白直接偶联的，而可能是 G 蛋白参与了控制生长素敏感性的信号路径， AGB1对生长素调节的细胞分裂呈现出一种抑制效应（ Ullah et al,2003 ）。其可能信号路径如下：

　　　　　　　　　　　　　　

Auxin root cell division

GPA1 AGB1

G 亚基是通过非共价键的疏水作用紧密结合在一起的并共同完成信号下游信号的转导过程，这两个亚基若单独表达时会导致 Gβ亚基的不稳定和 Gγ 亚基不折叠，因而关于单独的 G 和 G 亚基的功能尚未见相关报道。

众多研究表明： G 蛋白信号系统广泛存在于哺乳动物跨膜信号转导过程中并发挥着十分重要的作用。近年来的研究表明：植物中同样存在着 G 蛋白，并参与了植物的光信号转导、植物激素信号转导和植物细胞防御信号转导的过程。

经典的异三聚体 G 蛋白信号传导系统由 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 、 G 蛋白和效应器三部分组成。当特异性的配体与膜上的 GPCR 结合后，活化的 GPCR 通过跨膜构象的变化，激活相应的 G 蛋白，催化 G 蛋白α 亚基结合的鸟苷二磷酸 (GDP)替换为鸟苷三磷酸 (GTP) ，从而导致 α 亚基构象改变，降低 α 亚基和亚基的亲和力，使三聚体解离为 G (GTP) 和G 。解离的 G (GTP) 和 G 分别调控信号转导下游各自的效应器，产生第二信使，使得信号得到级联放大并最终诱导细胞产生生理反应 G-protein signaling in mammal

当 G 亚基利用自身的 GTP 水解酶活性催化 GTP 水解为 GDP ，导致 G (GDP) 与效应物离解，并重新结合 G ，形成非活化状态的三聚体 G- 蛋白，终止了信号的转导。已有的研究表明，哺乳动物中 G- 蛋白参与了光、气体、激素等多种信号转导过程，其信号转导的下游效应器包括腺苷酸环化酶 (Adenylyl cyclase) 、 Ca2+ 、K+ 通道、磷脂酶 C(Phospholipase,C) 、以及 β上腺素受体激酶等。 GPCR 、 G 蛋白和效应器的不断发现，已成为近二十年来的研究热点 (Bourne 1990;HallA1990) 。

在经典的 G 蛋白信号途径中， G 蛋白的偶联受体是一种七次跨膜结构的蛋白，目前在动物细胞中已经发现上千种七次跨膜蛋白。与此不同的是，在拟南芥中仅发现 1 种被确信为七次跨膜结构的蛋白 MLO1 ，其隐性性状体对一种粉状霉菌有抑制作用，但近来对 mlo突变体研究表明其对疾病的抵抗过程并不需要 G蛋白的参与（ Kim MC,2002 ）。

GCR1 是从拟南芥中克隆到的另外 1 种可能的 G 蛋白偶联受体，其序列与动物细胞中的 GPCR 具有一定的相似性，并推测可能其具有七次跨膜结构，但尚未得到证实(Josefsson et al,1997) 。过量表达 GCR1改变了细胞的周期，打破了种子的休眠并缩短开花的时间 ,难以解释的是其细胞分裂的 M 期似乎和 S 期是分离开的（ Colucci G,2002 ）。而 gcr1 （缺失突变体）则没有表现出任何的和 G 蛋白突变体相似的表型。这暗示着 GCR 可能没有和 GPA1直接偶联或者 GCR 的功能是多余的 。

植物 G 蛋白信号转导上游受体的研究目前尚未有突破，其可能的情况：一是在植物中 G 蛋白仅仅偶联了 1 个或很少的七次跨膜蛋白受体，并将跨膜信号转导给下游受体，这反映在所有植物 G 蛋白的 C末端区域具有极高的保守性，而在有上千种受体的动物细胞中，这一区域的保守性并不很高。二是在植物中 G 蛋白的信号转导途径可能并不依赖于七次跨膜蛋白受体。三是 G 蛋白可能是与非七次跨膜结构的蛋白相偶联的。特别是近年来关于植物中类受体蛋白激酶（ receptor-like kinases ）的研究表明，G 蛋白可能是与植物中所存在的数百种类蛋白激酶相偶联的 。

哺乳动物中， G 蛋白的下游效应器包括腺苷酸环化酶 (Adenylyl cyclase) 、 Ca2+ 、K+ 通道、磷脂酶 C (Phospholipase,C) 、以及 β 上腺素受体激酶等。而在植物中目前仅有 PLD （ Phspholipase D ）、 K＋、Ca2＋被确信是 G 蛋白的下游效应器。 Ritchie 和 Gilroy 在大麦糊粉层细胞添加 GTPS改变了 PLD 的活性，这证明 PLD 可能是位于 G 蛋白下游的效应器（ Ritchie and Gilroy,2000 ）。

Lein 和 Saalbach从烟草中克隆出一个 PLD 的 cDNA ，并通过细菌将蛋白表达并对蛋白进行了纯化。经过离体实验证明 G 对 PLD 的活性有很强的抑制作用，这进一步证明了 PLD 可能是和 G 蛋白信号相偶联的（ Lein and Saalbach,2001 ）。 Fairley-Grenot 和 Assmann 等人在 1991 年用完整的蚕豆保卫细胞原生质为材料证实 GTPS 、 CTX 和 PTX均抑制 K＋内流，而 GDPS则促进 K＋内流 (Fairley-Grenot,Assmann,1991) 。 Wang 等人通过对拟南芥 gpa1突变体研究表明：该突变体似乎含有过多的 G, 并且缺乏了 ABA抑制的 K+ 内流功能，这表明在离子通道激活上要么可能需要 GPA1 的参与，或者 G 可以阻滞通道的活性， K+ 可能是其下游的效应器（ Wang et al,2001 ）。

此外，有证据表明在植物细胞中，一种异源三聚体 G 蛋白可以激活 Ca2+流。 Aharon等人利用膜片钳技术研究野生型番茄和一种GTPase-deficient番茄重组体 TGalpha1 ，研究表明重组体的 G使得阳离子通道活性增强，并证明 G 蛋白参与了膜上 Ca2+ 通道的激活 (Aharon et al 1998) 。

由于 G 蛋白所介导的信号转导过程在哺乳动物跨膜信号转导中发挥着十分重要的作用，人们推测G 蛋白信号在植物细胞信号转导过程中也可能发挥着类似的重要性。越来越多的证据表明， G- 蛋白参与了多种植物生理过程，包括植物激素反应、病原体防御以及气孔调控等。但直到目前，其中任何一条的完整信号转导途径尚未见相关报道。目前，在植物和拟南芥中，研究较多的是 G- 蛋白在光信号转导、植物激素信号转导、植物细胞防御机制中的作用。

光信号转导 近年来，光信号转导一直是植物细胞信号转

导最活跃的研究领域。 Okamota 等人报道，过量表达 G 蛋白 α 亚基的拟南芥，不管其G 蛋白活性状态如何都对红光和远红光过分敏感 (Okamota et al., 2001) 。但 Alan 等人利用拟南芥 G 蛋白 α 亚基和 β 亚基缺失突变体研究却排除了 G 蛋白直接参与了红光和远红光控制下胚轴生长的信号转导过程。（ Alan et al,2003 ）

植物激素信号转导 植物激素作为植物体内的内源性调节物质，对植物的生

长发育起着广泛的调节作用。 。在拟南芥激素信号转导研究上， Ullah 等人利用拟南芥 α 亚基突变体的研究表明： α 亚基在 G 蛋白偶联的生长素调节的细胞增殖中扮演了一定的角色，而利用 β 亚基突变体研究表明， β 亚基也影响了生长素的调节途径。他利用拟南芥 gpa1突变体研究表明，油菜素内酯 (BR) 信号转导在植物发育的不同时期可能是和 G- 蛋白相偶联的 (Ullah et al,2001,2002,2003) 。 Wang 等人利用拟南芥 G 蛋白 α 亚基突变体 gpa1证实 :ABA诱导的气孔开张和 K+ 内流能力需要 GPA1 基因的参与 (Wang,2001) , 这暗示着 G- 蛋白可能参与了 ABA 相关的信号转导。 Kevin 等人利用拟南芥 β 亚基突变体 agb1 研究表明， AGB1 基因参与了拟南芥器管如花、叶、果实等形状控制 (Kevin,2001) ，由于众多植物激素参与了植物器管形态的建成，这暗示着可能 G －蛋白参与了这些激素的信号调控。

植物细胞防御机制 植物不能像动物一样能分化出特定的可移动细胞执

行免疫反应，为了逃避外界生物对其浸染，植物进化出许多比较精细的反应机制来防御外界浸染，其中 G 蛋白参与了外界浸染信号的转导过程。 Xing等人证实，在蕃茄对真菌的抵抗机制中，某些诱发因子可引起番茄质膜上 H+-ATPese 的去磷酸化，与此同时，利用 GTPS 和 CTX 在没有诱发因子的情况下，也能发生相似的现象，而且可用 G- 蛋白α 亚基的抗体在经诱发处理的质膜蛋白质中鉴别出两种蛋白质，其可能是 G 蛋白的解体产物 (Xing,1997) 。 Kawakita 发现真菌激发子能增强马铃薯块茎微粒体结合 GTPS 的能力和 GTPase 的活性 (Kawakita et al 1994) 。这些都暗示着 G- 蛋白可能参与植物对外界浸染抵抗的信号转导。

展望 目前，拟南芥中 G- 蛋白的研究正处于起步阶段，

目前研究热点主要有三个：一是利用 EMS (ethylmethane-sulfonate) 对拟南芥种子进行诱变或利用外源基因插入法获取相关突变体，通过研究突变体和正常野生型的差异，探求拟南芥 G- 蛋白信号转导途径中的相关组分。二是利用拟南芥基因组资源，采用生物信息学方法在拟南芥中寻找更多编码 G-蛋白亚基的基因，并对新的 GPCR 、 G 蛋白及其效应器基因进行克隆。三是利用目前的分子生物学方法，探明 G- 蛋白在光信号转导、激素信号转导、植物细胞防御、离子通道等方面明确的信号转导途径以及相应的调节措施。

Morphology of wild-type, and mutant,2-day-old seedlings. Wild type (middle), gpa1-1 (left), and gpa1-2 (right). Bar, 1.5 mm. (B)

Cellular phenotypes from the ectopic expression of GPA1 induced by dex. Arrowheads indicate the position of ectopic cell divisions.