Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной

хроматографии с послеколоночной реакцией и флуоресцентным детектированием

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. Ломоносова

Химический факультетКафедра аналитической химии

Москва, 2014

И. Д. Каргин

Научный руководитель:

д.х.н., проф. А.В. Пирогов

2

Тетрациклины

Тетрациклин (TC) (444.43 г/моль)

Окситетрациклин (OTC) (460.43 г/моль)

Доксициклин (DC) (444.43 г/моль)

ПДК = 10 нг / г

• Фармaкологические препараты

• Ветеринария

• Животноводство

Применение тетрациклина

3

ПДК = 10 нг / г

• Создание способа чувствительного определения антибиотиков тетрациклинового ряда с использованием микроэмульсий методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием

• Изучение влияния состава микроэмульсий на флуориметрические свойства исследуемых соединений

Цели работы

4

5

Типы микроэмульсий:А – «масло в воде» В – «вода в масле» С – биконтинуальная микроэмульсия

Структура микроэмульсии

н-октан

Вода Вода

6

Свойства микроэмульсийМакроэмульсии Микроэмульсии

Расслаиваются с течением времени

Капли относительно большие (1-20 мкм)

Внутренняя поверхность небольшая (15 м2/г)

Высокое поверхностное натяжение (1-10 мН/м)

Относительно статические системы

Термодинамически стабильные системы

Небольшие агрегаты (10-200 нм)

Внутренняя поверхность очень большая (200 м2/г)

Очень низкое поверхностное натяжение (~10-3 мН/м)

Высокодинамичные системы

7

УФ-детектирование

tR, мин

2 4 6 8 10

mAU

0

5

10

15

20

25 OTC

DC

TC

Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 10 мкг/мл каждого ТС). Колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 150 × 4.6 мм (5 мкм). Градиентный режим, элюент – (А) 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH 3; (В) MeCN. Градиент: (0-4 мин) 20% (В), (4-10 мин) линейное увеличение до 40% (В). F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

Соединение tR, мин Ширина пика, мин Rs As cmin, нг/мл

OTC 2.98 0.17 – 0.705 110

TC 3.92 0.21 4.9 0.785 100

DC 8.98 0.19 25.3 0.715 130

8

Режим МЭЖХ

-1

1

3

5

7mAU

tR, мин 3 6 9

OTC + TC

DC

Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 1 мкг/мл каждого). Элюент – (А) - МЭ (3.3% ДДСН, 0.8% н-гептана, 8% н-бутанола), (Б) - МЭ (2% ДДСН, 0.6% н-гептана, 6% н-бутанола). pH 3, F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

Подвижная фаза

Соединение

tR, мин Ширина пика, мин Rs

cmin, нг/мл

МЭ 2% ДДСН,0.6% гептана,

6% н-бутанола

OTC 5.95 0.36 – 180

TC 6.34 0.54 0.84 150DC 15.31 0.78 13.5 220

MeCN/0.01М р-р щавелевой

к-ты

OTC 2.92 0.17 – 110TC 3.98 0.21 4.9 100DC 8.98 0.19 25.3 130

(А) (Б)

Комплексообразование с катионами металлов

Предполагаемые структуры комплексов тетрациклина с катионами магния и кальция

У комплекса тетрациклина с катионом магния наблюдается сильное увеличение интенсивности флуоресценции ( � 20 раз)

9

g

g

Спектры флуоресценции (λEx / λEm = 385 / 512 нм):

1 – 10 мкг/г ТС в МЭ2 – 10 мкг/г ТС в МЭ + Mg2+ (избыток)

1

2

10

0

20

40

60

80

100

120

20% MeCN, 80% 0.01M р-ра щавелевой к-тыМЭ (2/0.6/6)

pH

Ifl, у.е.

3 5 6 7 7.5 8 90

20

40

60

80

100

120

140

20% MeCN, 80% 0.01M р-ра щавелевой к-тыМЭ (2/0.6/6)

Соотношение концентраций TC/Mg2+

Ifl, у.е.

1/1 1/2 1/10 1/20 1/50 1/100

с(ТС) = 10 мкг/мл, λEx / λEm = 385 / 512 нм

Выбор pH и концентрации ионов Mg2+

Название ПАВ Структурная формула Ifl, у.е.

Додецилсульфат натрия (ДДСН) 45

Докузат натрия (ДЗН) 41

Цетилтриметиламмония хлорид (ЦТАХ) 37

11

ДДСНДКЗ

ЦТАХ

Изучение влияния природы ПАВ на флуоресценцию комплексов ТС с Mg2+

с(ТС) = 10 мкг/мл, λEx / λEm = 385 / 512 нм

12

Схема проведения послеколоночной реакции

Насос 1

Насос 2

Колонка

Реакционная петля

ФЛ детектор

Ввод пробы

20% MeCN80% 0.01 M р-ращавелевой к-ты

рН 30.06 М р-р MgCl2 вМЭ состава:4% ДДСН1.2% н-гептана12% н-бутанола

рН 9

Металлический капиллярL = 2 мD = 0,25 ммV = 980 мкл

ТС

Элюат

ТС-MgрН 7.8

Т = 50°С

Кинетика реакции комплексообразования

• Реакция тетрациклина с ионами магния в среде микроэмульсии

Условия: МЭ (2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанол), содержащая 0.06 М Mg2+, pH 9,

с(ТС) = 10 мкг/мл

Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ТС с Mg2+ от времени, λEx / λEm = 385 / 512 нм.

13

Варьирование температуры и скорости подачи элюента

14

Скорость подачи элюента и микроэмульсии с магнием одинакова

С ростом температуры понижается вязкость МЭ

15

Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов с концентрациями 0.05 мг/мл. Элюент: А – 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH = 3; В – MeCN. Градиентный режим: 0 мин – 20% А, (0 – 9) мин – 35% А, (9 – 14) мин – 35% А, (14 – 18) мин – 20% А. F = 0.4 мл/мин, Т = 50°C. Послеколоночная реакция – 60 мМ раствор MgCl2 в МЭ (4% ДДСН, 1.2% н-гептана, 12% н-бутанола). F = 0.4 мл/мин, V = 100 мкл, λEx / λEm = 385 / 512 нм.

ОФ-ВЭЖХ с послеколоночной реакцией

ОТС

ТС

DС

Соединение tR, мин Ширина пика, мин Rs As сmin, нг/мл

OTC 7.13 0.39 – 0.740 8

TC 8.23 0.30 3.2 0.825 5

DC 11.79 0.64 7.6 0.530 25

Пробоподготовка фармацевтических препаратов

Навеска препарата

Экстракция в микроэмульсии на УЗ бане

Центрифугирование

Разбавление подвижной фазой

16

2 минуты, 16 тыс. об./мин

Объем МЭ – 10 млВремя экстракции – 5 минутТемпература – 60 оС

Навеска 0.030 г

Разбавление в 100 раз смесью 80% 0.01 M р-ра щавелевой кислоты20% MeCN

Анализ тетрациклиновой мази

17

Хроматограмма тетрациклиновой мази 3%.

ТС

Степени извлечения тетрациклина из мазей

18

Время экстракции 5 минут 15 минут

Экстрагент рН

Степень извлечения, %(n = 3, P = 0.95)

Мазь 1% Мазь 3% Мазь 1% Мазь 3%

Микроэмульсия 3 99±1 100±1 102±2 101±2

MeCN/ Щавелевая кислота (20/80) 3 85±1 87±2 98±1 97±2

Микроэмульсия 7 97±1 98±2 100±1 103±2

MeCN/ Щавелевая кислота (20/80) 7 83±1 85±2 96±2 97±1

Пробоподготовка молока5 мл молока + 7.5 мл буферного р-ра

Ультразвуковая обработка

Центрифугирование

Центрифугирование

ТФЭ

Разбавление подвижной фазой

19

5 минут, 16 тыс. об./мин

Время обработки – 5 минут

0.1 М р-р ЭДТА вбуферном растворе МакИлвейна, рН 4

Разбавление 0,01 M р-ром щавелевой кислоты

2 минут, 16 тыс. об./мин

3 мл MeCN, 3 мл H2O, 3 мл буф. р-ра

12 мл надосадочной жидкости

3 мл H2O, 3 мл буф. р-ра

1 мл MeCN

20

Хроматограмма реального объекта (молоко)

Рис. 26. Участок хроматограммы исследуемого образца молока «Лианозовское».

0,17

0,19

0,21

0,23

0,25

0,27

0,29

5 6 7 8 9 10 11 12

I, у.е.

tR, мин

ОТС

ТС DС

Участок хроматограммы образца молока «Лианозовское».

21

Хроматограмма реального объекта (молоко)

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14

I, у.е.

tR, мин

(А)

(Б)

ОТС

ТС

DС

Хроматограммы холостого образца молока (A) и молока с добавкой тетрациклинов (Б). Концентрации добавок составляли 20, 20 и 40 мкг/л для OTC, TC и DC соответственно.

22

Выводы1. Впервые показано, что интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов с

ионами Mg2+ в микроэмульсионной среде в 1.8 раза выше по сравнению с водно-органической средой.

2. Изучено влияние природы ПАВ в составе микроэмульсии на интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов. Показано, что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в МЭ на основе анионного ПАВ — ДДСН.

3. Впервые предложена схема проведения послеколоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами Mg2+ в среде микроэмульсий.

4. Выбраны условия чувствительного и селективного хроматографического определения тетрациклинов в виде комплексов с флуоресцентным детектированием в фармацевтических препаратах (мази и таблетки) и пищевых объектах (молоко). Пределы обнаружения составили 5, 8 и 25 нг/мл для TC, OTC и DC соответственно.

5. Выбраны условия извлечения тетрациклинов из молока, степени извлечения составили 87, 82 и 68% для TC, OTC и DC соответственно. Также в ходе дополнительной очистки образцов с помощью ТФЭ картриджа Strata XDB-L достигнута степень концентрирования тетрациклинов, равная 2.5.

6. В работе показана перспективность использования МЭ для количественного извлечения тетрациклина из лекарственных форм на основе мазей. Степени извлечения составили 99-100%. Время пробоподготовки занимает 15 минут.

23

Спасибо за внимание!