Основы генетической инженерии растений

Определение генетической инженерииОпределение генетической инженерии

Генетическая инженерия Генетическая инженерия (современная биотехнология)– это (современная биотехнология)– это технология получение новых технология получение новых комбинаций генетического комбинаций генетического материала путем проводимых вне материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в созданных конструкций генов в живой организм, в результате живой организм, в результате которого достигается их включение и которого достигается их включение и активность в этом организме и у его активность в этом организме и у его потомствапотомства

""живой измененный организм" живой измененный организм" (генетически модифицированный, (генетически модифицированный, генетически измененный, генетически измененный, трансгенный, генно-инженерный трансгенный, генно-инженерный организм…)организм…) означает любой живой означает любой живой организм, обладающий новой организм, обладающий новой комбинацией генетического комбинацией генетического материала, полученной благодаря материала, полученной благодаря использованию современной использованию современной биотехнологии биотехнологии (Картахенский (Картахенский протокол по биобезопасности, ст.3)протокол по биобезопасности, ст.3)

Типичная трансгенная вставкаТипичная трансгенная вставка

LB Промотор селект.

Гена (35S)

Селект. Ген

(NPTII)

Терм. посл. селективного

гена (NOS, OCS)

Промотор трансгена

(35S)

Трансген (Cry,

EPSPS, Bar)

Терм.посл. трансгена

(NOS)

RB

Выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК)

Получение генетических конструкций путем манипуляций с нуклеиновыми кислотами in vitro

Создание векторных систем для переноса трансгенов в клетки

Перенос трансгенов в отдельные живые клетки, где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам

Получение из трансформированных клеток ГМО

Этапы создания ГМО

Технология рекомбинантных ДНКТехнология рекомбинантных ДНК Выделение ДНК и «разрезание» ее на Выделение ДНК и «разрезание» ее на

отдельные фрагменты с помощью отдельные фрагменты с помощью рестриктазрестриктаз

Клонирование геновКлонирование генов Разделение фрагментов ДНК в пространстве Разделение фрагментов ДНК в пространстве

с помощью электрофореза или с помощью электрофореза или клонирования в клетках клонирования в клетках E.coliE.coli

Идентификация и модификация отдельных Идентификация и модификация отдельных фрагментов ДНК или искусственный синтез фрагментов ДНК или искусственный синтез генов, регуляторных элементов генов, регуляторных элементов

Соединение определенных фрагментов ДНК Соединение определенных фрагментов ДНК с целью построения генетических с целью построения генетических конструкцийконструкций

Нуклеотидные последовательности, Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами распознаваемые некоторыми ферментами

рестрикции и характер получаемых концов ДНКрестрикции и характер получаемых концов ДНК

Рестриктаза Сайт узнавания Характер получаемых концов ДНК

EcoRI Г↓А-А-Т-Т-ЦЦ-Т-Т-А-А↑Г

«Липкие» концы с 5’-фосфатной группой

BamHI Г↓Г-А-Т-Ц-ЦЦ-Ц-Т-А-Г↑Г


PstI Ц-Т-Г-Ц-А↓ГГ↑А-Ц-Г-Т-Ц


Sau3AI ↓ Г-А-Т-Ц Ц-Т-А-Г↑


NotI Г↓Ц-Г-Г-Ц-Ц-Г-ЦЦ-Г-Ц-Ц-Г-Г-Ц↑Г


PvuII Ц-А-Г↓Ц-Т-ГГ-Т-Ц↑Г-А-Ц

«Тупые» концы

HpaI Г-Т-Т↓А-А-ЦЦ-А-А↑Т-Т-Г


HaeIII Г-Г↓Ц-Ц Ц-Ц↑Г-Г


Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", то эти фрагменты соединятся между собой. концы", то эти фрагменты соединятся между собой. Для воссоединения фосфодиэфирных связей Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. необходим фермент ДНК-лигаза.

Для целей генной инженерии большое значение Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3’-катализирует присоединение нуклеотидов к 3’-концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать «липкий». конца ДНК несложно сделать «липкий».

ЛинкерыЛинкеры

Годом рождения генетической инженерии является Годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появились первые публикации 1972 г., когда появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой разрезания рестриктазой RIRI и сшивания ДНК и сшивания ДНК лигазой [лигазой [MertzMertz, , DavisDavis, 1972], а также возможности с , 1972], а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ и молекулу гены других организмов: фага-λ и галактозный оперон бактерии галактозный оперон бактерии E.coli E.coli [[JacksonJackson, , SymonsSymons, , BergBerg, 1972]., 1972].

Первая функционально активная молекула Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде плазмиде E.сoliE.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в плазмида могла успешно функционировать в клетках клетках E.сoliE.сoli, размножаться и передаваться другим , размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью клеткам как естественным путем, так и с помощью человека [человека [Cohen et alCohen et al., 1973]., 1973]

Создание рекомбинантной плазмидыСоздание рекомбинантной плазмиды

Основные требования к векторуОсновные требования к вектору клонированияклонирования

небольшой размер, поскольку эффективность небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в клонирования чужеродной ДНК в E. сoli E. сoli значительно снижается при общей длине значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 т.п.н.;т.п.н.;

наличие уникального сайта рестрикции, в который наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; может быть осуществлена вставка;

наличие одного или нескольких селективных наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.антибиотикам или гербицидам.

Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы:генов используют и другие векторные системы:

фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н),

плазмиды-космиды, содержащие плазмиды-космиды, содержащие coscos--участок генома участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н),

Искусственные хромосомы: Искусственные хромосомы: на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК

длиной 100-300 т.п.н.),длиной 100-300 т.п.н.), на основе на основе FF-плазмиды -плазмиды E. сoliE. сoli ( (BACBAC – бактериальная – бактериальная

искусственная хромосома, емкость 150-300 т.п.н.),искусственная хромосома, емкость 150-300 т.п.н.), дрожжей (дрожжей (YACYAC-дрожжевая искусственная хромосома, в -дрожжевая искусственная хромосома, в

ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). длиной порядка 800 т.п.н и более).

В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E. сoli E. сoli используют также используют также Bacillus subtilisBacillus subtilis,, дрожжи дрожжи Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae и др. и др.

Выделение геновВыделение генов

Искусственный синтез геновИскусственный синтез генов На основании данных о последовательности На основании данных о последовательности

аминокислот белка-продукта генааминокислот белка-продукта гена С помощью ПЦР на основании данных о сиквенсе С помощью ПЦР на основании данных о сиквенсе

генагена С помощью С помощью RTRT-ПЦР на основе мРНК гена-ПЦР на основе мРНК гена

Выделение генов из смеси Выделение генов из смеси рестрикционных фрагментов геномной рестрикционных фрагментов геномной ДНКДНК- - с помощью электрофореза и с помощью электрофореза и in situin situ гибридизации ДНК с мечеными зондамигибридизации ДНК с мечеными зондами

- путем создания и анализа клонотек генов- путем создания и анализа клонотек генов

Получение к ДНК с РНК-матрицы с помощью Получение к ДНК с РНК-матрицы с помощью фермента обратной транскриптазыфермента обратной транскриптазы

Блоттинг по СаузернуБлоттинг по Саузерну

Строение генетических конструкцийСтроение генетических конструкций

LB Промотор селект.

Гена (35S)

Селект. Ген

(NPTII)

Терм. посл. селективного

гена (NOS, OCS)

Промотор трансгена

(35S)

Трансген (Cry,

EPSPS, Bar)

Терм.посл. трансгена

(NOS)

RB

Целевые гены. Трансгены и цисгены. Смысловые и Целевые гены. Трансгены и цисгены. Смысловые и антисмысловые конструкцииантисмысловые конструкции

Основные признаки: Основные признаки: толерантность к гербицидам, толерантность к гербицидам, устойчивость к насекомым-вредителям, устойчивость к насекомым-вредителям, устойчивость к вирусным болезням, устойчивость к вирусным болезням, система получения гетерозисных гибридов на система получения гетерозисных гибридов на

основе мужской стерильности/восстановления основе мужской стерильности/восстановления фертильности,фертильности,

устойчивость к засухе,устойчивость к засухе, пригодность для производства биотоплива.пригодность для производства биотоплива. удлинение сроков созревания и способность к удлинение сроков созревания и способность к

длительному хранению, улучшенные качественные длительному хранению, улучшенные качественные характеристики (состава жирных кислот характеристики (состава жирных кислот растительного масла, крахмала, пониженное растительного масла, крахмала, пониженное содержание никотина в листьях табака), содержание никотина в листьях табака), улучшенные кормовые свойства,улучшенные кормовые свойства,

Селективные геныСелективные гены

Гены устойчивости к антибиотикам:Гены устойчивости к антибиотикам: npt IInpt II ((neo, aphIIneo, aphII ) неомицинфосфотрансферазы ) неомицинфосфотрансферазы IIII из из

транспозона транспозона TnTn5 5 EE. . colicoli гены устойчивости к гигромицину В, стрептомицину, гены устойчивости к гигромицину В, стрептомицину,

хлорамфениколу и др.хлорамфениколу и др.

Гены толерантности к гербицидам:Гены толерантности к гербицидам: генген фосфинотрицин фосфинотрицин NN-ацетилтрансферазы -ацетилтрансферазы barbar от от

Streptomyces hygroscopicusStreptomyces hygroscopicus и ген и ген patpat от от Streptomyces Streptomyces viridochromogenesviridochromogenes

Гены ферментов, катаболизирующих нетоксичные Гены ферментов, катаболизирующих нетоксичные сахара маннозу, сахара маннозу, DD-ксилозу, 2-деоксиглюкозу (-ксилозу, 2-деоксиглюкозу (manman,, xylAxylA))

гены, обеспечивающие ростовые преимущества или гены, обеспечивающие ростовые преимущества или повышенную способность к морфогенезу повышенную способность к морфогенезу трансформированных клеток (трансформированных клеток (iptipt изопентил изопентил трансферазы из трансферазы из TiTi-плазмиды -плазмиды AA. . tumefacienstumefaciens))

Репортерные геныРепортерные гены

Ген Ген gusgus ( (или или uidAuidA) ) фермента β-глюкоронидазы изфермента β-глюкоронидазы из EE. . colicoli

ген люциферазы (ген люциферазы (lucluc) из светлячков ) из светлячков Photinus Photinus pyralispyralis

ген ген gfpgfp зеленого флюоресцентного протеина (зеленого флюоресцентного протеина (GFPGFP- - green fluorescent proteingreen fluorescent protein) из медузы ) из медузы Aequorea Aequorea victoriavictoria..

Получение ГМО без селективных геновПолучение ГМО без селективных генов

Использование генетических конструкций без Использование генетических конструкций без целевых геновцелевых генов

Целевой ген толерантности к гербицидам может Целевой ген толерантности к гербицидам может быть использован и в качестве селективногобыть использован и в качестве селективного

Котрансформация с последующим негативным Котрансформация с последующим негативным отбором по селективным генам в расщепляющихся отбором по селективным генам в расщепляющихся поколениях полученных трансформантовпоколениях полученных трансформантов

Удаления селективных генов из генома ГМО:Удаления селективных генов из генома ГМО: использование генетических конструкций, использование генетических конструкций,

содержащих последовательности транспозоновсодержащих последовательности транспозонов использовании сайт-специфических рекомбиназиспользовании сайт-специфических рекомбиназ

Промоторы, используемые в генетической Промоторы, используемые в генетической инженерии растенийинженерии растений

1. 1. Конститутивные промоторы:Конститутивные промоторы: CaMV35SCaMV35S – – вируса мозаики цветной капустывируса мозаики цветной капусты CMoVbCMoVb – – вируса мозаики норичникавируса мозаики норичника гена гена nosnos нопалинсинтазы нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens гена гена ractract11 актина риса актина риса гена гена ZmUbiZmUbi убиквитина кукурузыубиквитина кукурузы

2. Тканеспецифические промоторы:2. Тканеспецифические промоторы: PSsuAraPSsuAra от арабидопсиса (экспрессия в зеленых от арабидопсиса (экспрессия в зеленых

тканях)тканях) PTA 29PTA 29 от табака (экспрессия в пыльниках) от табака (экспрессия в пыльниках) rbcSrbcS от арабидопсиса (светочувствительный) от арабидопсиса (светочувствительный)

Методы переноса трансгенов в клетки Методы переноса трансгенов в клетки растенийрастений

Прямой (биолистика)Прямой (биолистика) Непрямой (агробактериальная Непрямой (агробактериальная

трансформация)трансформация)

Приборы для биолистикиПриборы для биолистики

Агробактериальная трансформация с Агробактериальная трансформация с помощьюпомощью Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Gram -Gram - DicotsDicots WorldwideWorldwide

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Опухоль возникает в результате необратимого Опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., 1977]. Причем гены, расположенные на Т-фрагменте 1977]. Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов — октопинов и специфических соединений опинов — октопинов и нопалинов. Помимо этих соединений в клетках нопалинов. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны, резко стимулирующие ростовые фитогормоны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли.процессы, что приводит к образованию опухоли.

Строение Строение T-T-области области Ti-Ti-плазмиды плазмиды Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Агробактериальная трансформацияАгробактериальная трансформация

Коинтегративный и бинарный вектораКоинтегративный и бинарный вектора

Binary vector

LB RB

Co-integrative

Пример плазмидного бинарного Пример плазмидного бинарного векторавектора

Только трансформированные клетки Только трансформированные клетки способны делиться и регенерировать способны делиться и регенерировать растения на питательной среде, растения на питательной среде, содержащей селективный агентсодержащей селективный агент

Молекулярно-генетический анализ трансгенных Молекулярно-генетический анализ трансгенных растенийрастений

Подтверждение вставки рекомбинантной ДНК:Подтверждение вставки рекомбинантной ДНК: Саузерн-блоттингСаузерн-блоттинг ПЦР-детекция целевого гена или других элементов ПЦР-детекция целевого гена или других элементов

вставкивставки Определение количества копий вставки, анализ Определение количества копий вставки, анализ

наследования целевого гена при половом наследования целевого гена при половом размноженииразмножении

Подтверждение экспрессии целевого гена:Подтверждение экспрессии целевого гена: Нозерн-блоттингНозерн-блоттинг ПЦР-детекция кДНК целевого генаПЦР-детекция кДНК целевого гена Вестерн-блоттингВестерн-блоттинг Сиквенс кДНК целевого генаСиквенс кДНК целевого гена Количественное определение степени экспрессии Количественное определение степени экспрессии

целевого генацелевого гена

Методы детекции ГМСМетоды детекции ГМС

Основанные на выявлении белков-продуктов Основанные на выявлении белков-продуктов трансгенов (трансгенов (ELISAELISA-тест)-тест)

Основанные на детекции фрагментов ДНК, Основанные на детекции фрагментов ДНК, характерных для трансгенных вставок:характерных для трансгенных вставок:

- ПЦР + элетрофорезПЦР + элетрофорез- ПЦР в реальном времениПЦР в реальном времени- ПЦР+детекция ДНК на биочипеПЦР+детекция ДНК на биочипе

Схема лабораторного исследования: Схема лабораторного исследования: Выделение ДНКВыделение ДНК Идентификация растительной ДНК Идентификация растительной ДНК Идентификация регуляторных Идентификация регуляторных

последовательностей, маркерных геновпоследовательностей, маркерных генов Идентификация трансформационного событияИдентификация трансформационного события Количественный анализ рекомбинантной ДНККоличественный анализ рекомбинантной ДНК

Специфичность ПЦР-анализаСпецифичность ПЦР-анализа

Официально допущено к использованию 54 Официально допущено к использованию 54 трансгенных событий (линий) кукурузы, в том трансгенных событий (линий) кукурузы, в том числе 25 половых гибридов между различными числе 25 половых гибридов между различными ГМ-линиями . Из них 48 (89%) содержат 35ГМ-линиями . Из них 48 (89%) содержат 35SS--промотор. Не содержат 35промотор. Не содержат 35SS-промотор линии -промотор линии GAGA21, 21, MIRMIR604, 604, LYLY038, 3272, 038, 3272, EventEvent 98140 и гибрид 98140 и гибрид MIRMIR604×604×GAGA21. Линии 21. Линии GAGA21, 21, MIRMIR604 и 3272 604 и 3272 содержат терминатор содержат терминатор NOSNOS..

Официально допущено к использованию 17 Официально допущено к использованию 17 трансгенных событий (линий) сои. Из них 11 трансгенных событий (линий) сои. Из них 11 содержат 35содержат 35SS-промотор.-промотор.

Чувствительность метода ПЦР+электрофорез составляет Чувствительность метода ПЦР+электрофорез составляет 0,1%ГМО (350,1%ГМО (35SSпромотор), что подтверждается анализом промотор), что подтверждается анализом

соответствующих референсных материалов:соответствующих референсных материалов:

ООKK 413413bb 411 411bb 413 413aa 410410bb 410 410aa ПК Соя ПК Кук ПК Соя ПК Кук

Экспрессия трансгеновЭкспрессия трансгенов

ТранзиентнаяТранзиентная СтабильнаяСтабильная Факторы, оказывающие влияние на стабильную Факторы, оказывающие влияние на стабильную

экспрессию:экспрессию: Защитная реакция растений на чужеродный Защитная реакция растений на чужеродный

генетический материалгенетический материал Размер вставки и количество копийРазмер вставки и количество копий Перестройки ДНК вставкиПерестройки ДНК вставки Состав вставкиСостав вставки Строение трансгеновСтроение трансгенов Строение промоторовСтроение промоторов Место встраивания в геномМесто встраивания в геном

Основы генетической инженерии растений

Documents