НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИДержавна установа

Відділення біотехнічних проблем діагностикиІнституту проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ

03028, Київ-28, просп. Науки, 42/1, тел: (044)-525-64-47

ЗВІТПРО НАУКОВО-ДОСЛІДНУ РОБОТУ

Дослідження явища надшвидкого охолодження біологічних об'єктів для створення приладу для кріоконсервування

(перехідний)

Керівник НДРКерівник ДУ «ВБТПД ІПКК НАНУ» к.мед.н. М.В.Сидоренко

СПИСОК ВИКОНАВЦІВ

Керівник Відділення, к.мед.н. Сидоренко М.В.

Зав. лаб., к.б.н. Бурлака Д.П.

Пров.інженер Якимчук О.М.

Пров.інженер Оцалюк В.М.

Інж. І категорії Вдовиченко Н.О.

Інж. І категорії Шеремет О.І.

Інженер Шуляк Н.С.

Слайд 1.Фото макетного зразка приладу для надшвидкого охолодження біологічних об'єктів

в переохолодженому скрапленому азоті.

Фото макетного зразка приладу для надшвидкого охолодження біологічних об'єктів в переохолодженому скрапленому азоті. Прилад має ємність у вигляді термоса для заморозки до якої підключений вакуумний насос. Це дозволяє знизити температуру в термосі до -210оС. Розчини кріопротекторів з культурами клітин поміщали у віали фірми Нунк, Німеччина.

Падіння температури у віалі з фізрозчином при зануренні в азот

Стандартна пробірка з поліпропілену об`ємом 2,5см3 компанії Thermo Scientific Nunc Products (Німеччина) для заморожування клітин пристосована для запису кріогенних температур. В центрі пробірки на центруючих розпірках знаходиться термопара мідь-константан.

Швидкість охолодження 3,56оС/сек або

213,8оС/хв

І опускали в штативі в термос вищевказаного приладу після того як рідкий азот досягне наднизької температури. В контрольних віалах з відповідними кріопротекторами реєстрували температуру охолодження. Конструкція віали з датчиком температури у вигляді термопари показана на слайді 4.

Склад кріопротекторів Склад кріопротекторів використаних в експерименті.

Склад, %

кріопротектори №п/п

10% 5% 20%

1 сахароза ДМСО Фетальна сироватка

2 ПЕГ15т ДМСО Фетальна сироватка

3 ПЕГ20Т ДМСО Фетальна сироватка

4 ПЕГ40Т ДМСО Фетальна сироватка

5 ЕГ ДМСО Фетальна сироватка

Реєстрація температури охолодження кріопротектора з вмістом сахарози

Реєстрація температури охолодження кріопротектора з ПЕГ-15000

Реєстрація температури охолодження кріопротектора з ПЕГ-20000

Характерні перегини кривих заморожування різних кріопротекторів близько -40оС

Швидкість зниження температури зареєстрованої термодатчиком ззовні контейнера (скраплений азот) і в середені кріоконтейнера з фізрозчином та з різними кріопротекторами у віалах об`ємом 2,5см3 компанії Thermo Scientific Nunc Products, Німеччина.

термопара в:

MTTаналіз, рівень абсорбції при

540нм

Молекулярна маса

кріопротектора, дальтон швидкість охолодження

оС/сек

в межах 0 ...-40°С

в межах -40 ...-170°С

рідкому азоті - - 235,3 325

у віалі з фізрозчином

- - 7,0 3,8

у віалі з сахарозою

ª100 ~ª342,3* º 2,5 º 10,0*

у віалі з ПЕГ15000

ª66,88 ~ª15000* º 2,5 º 4,3*

у віалі з ПЕГ20000

ª61,87 ~ª20000* º 2,96 º 4,26*

у віалі з ПЕГ40000

91,4 ~40000* º 3,0 º 2,19*

у віалі з ЕГ 85,75 ~62 4 3,47

В таблиці наведені дані про Швидкість зниження температури зареєстрованої термодатчиком ззовні контейнера (скраплений азот) і в середені кріоконтейнера з фізрозчином та з різними кріопротекторами у віалах об`ємом 2,5см3 компанії Thermo Scientific Nunc Products, Німеччина. Встановлено взаємозв'язок між молекулярною масою кріопротекторів, швидкістю охолодження суміші та проліферативною активністю клітин на основі МТТ аналізу. Якщо точніше то: º) коефіцієнт кореляції між молекулярною масою змінної складової кріопротекторів (високомолекулярних сполук) та швидкістю охолодження зразків від 0 до -40°С становить r=0, 8144.*) коефіцієнт кореляції між молекулярною масою змінної складової кріопротекторів (високомолекулярних сполук) та швидкістю охолодження зразків від -40 до -170°С, r=-0,9096. ª) MTT аналіз також показав закономірність виживання з ростом молекулярної маси кріопротектора в межах 342-20000 дальтон, r=-0,9908.Крім вивчення складу кріопротекторів вивчали зміну їх густини шляхом додавання карбоксиметилцелюлози (КМЦ) (Показник виживання за МТТ-тестом в більшості кріопротекторів збільшується при додаванні (КМЦ).

Зміна рівня проліферативної активності клітин MCF-7 при додаванні КМЦ до складу кріопротектора.

№п/п кріопротектор кріопротектор + КМЦ Зміна рівня

1. кріопротектор з сахарозою

0,457+0,097* 0,597+0,046* 0,14 р<0,01

2. кріопротектор з ПЕГ1,5Т

0,603+0,058* 0,97+0,043* 0,367 р<0,01

3. кріопротектор з ПЕГ4Т

0,494+0,024* 0,344+0,029* -0,15 р<0,01

Підвищення в'язкості розчинів з допомогою КМЦ привело до підвищення рівня активності клітин в порівнянні з контрольним кріопротектором (сахароза), крім кріопротекторів ПЕГ4Т і ПЕГ40Т

Проліферативна активність клітин MCF-7 з 10% КМЦ в кріопротекторі.

Сахароза(контроль)

ПЕГ1,5Т ПЕГ4Т

сахароза

ПЕГ1,5Т ПЕГ4Т ПЕГ15

ТПЕГ20Т

ПЕГ40Т

+ 10% КМЦ

0,4571+0,0097

0,6027+0,0583

0,4935+0,0235

0,597+0,0465

0,969+0,00434

0,3438+0,0293

0,8921+0,0565

0,4396+0,0146

0,578+0,0115

- 131,85%

107,96%

130,6% 212% 75,2% 195,16%

96,17% 126,45%

Показано збільшення виживання клітин карциноми товстого кишечника людини НТ29 при застосуванні ПЕГ. Як і у випадку з клітинами MCF-7 найбільша проліферативна активність активність клітин спостерігається з кріопротектором у складі якого є ПЕГ1,5.

Проліферативна активність клітин карциноми товстого кишечника людини HT29 з кріопротекторами, які містять ПЕГ у своєму складі.

сахароза (контроль) 5HT29No1_ПЕГ1,5T HT29No2_ПЕГ4T1,2027+ 0,0478 2,0519 + 0,0280 1,7135+0,0534 - 170,6% 142,44%

ВИСНОВКИ

• Швидкість зниження температури зареєстрована датчиком в

розчині кріопротекторів об'ємом 1,5мл у поліпропіленовій віалі

набагато (у ~ 35 разів) менша ніж у скрапленому азоті.

• Відмічено кореляційний зв'язок між молекулярною масою

кріопротектора та швидкістю охолодження зразка, а також

виживанням заморожуваних клітин.

• КМЦ (10%) в складі кріопротектора підвищує рівень виживання

клітин MCF-7 і НТ29 після заморожування в рідкому азоті.

Варіант модернізації приладу для вітрифікації

Планшет для підбору оптимальних концентрацій із 3-х кріопротекторів

Досліди проводились на макетному зразку приладу для кріоконсервування. Досвід застосування даного приладу виявив деякі незручності при проведенні досліджень. Тому нами запропоновано наступні рекомендації по вдосконаленню:1. Заміна вакуумного насосу на досконалішу модель. Важливо, щоб новий насос не мав викидів масляної пари. Бажано, щоб він вмикався в однофазну мережу, а не в трьохфазну. При однофазній спрощується установка приладу в лабораторії.2. Досвід показав, що вакуумний насос перегрівається, якщо його багато разів вмикати. Необхідність частого вмикання виникає тоді, коли потрібно реєструвати температуру заморозки зразка кожного кріопротектора. Вирішення цієї проблеми полягає в заміні одно входового реєстратора температури на багатовходовий для 4-6 датчиків (термопар). Крім того, автономний реєстратор з можливістю запису на флешкарту в табличному форматі сумісному з Microsoft Office Excel або аналогічному LibreOffice Calc дозволить обходитись без комп'ютера при реєстрації температур. Це зекономить місце на робочому столі і вартість установки. Багатоканальний реєстратор дозволить заморожувати зразки за один раз не перевантажуючи вакуумний насос.3. Заморожування зразків за один раз доцільно проводити тому, що при повторних переохолодженнях рідкого азоту може розчинятись атмосферний кисень. У викидах вакуумного насосу є дрібні крапельки машинного масла і чим більше його запускати тим більше його виділяється. Поява кисню в таких випадках приводить до вибуху. Заморожування зразків за один прийом має ще одну перевагу: заміну термоса на дешевшу посудину, яку можна розмістити на столі.4. В проведених нами дослідах помічено, що склад кріопротектора впливає на швидкість охолодження зразків, а значить на склування (вітрифікацію). Це закономірно впливає і на виживання клітин. Виживання клітин залежить від типу цих клітин, складу кріопротектора і т.п. Підбір складових кріопротекторів це досить непередбачувана за результатами процедура. Для полегшення підбору складових кріопротекторів нами запропоновано використовувати штатив для трьох змінних речовин кріопротектора. Кожна сторона штатива відображає концентрацію одного з кріопротекторів — в результаті автоматично визначиться оптимальний склад кріопротектора після МТТ тесту.

Крива зміни температури при додаванні 10 мкл кріопротектора у поліпропіленову віалу Nunc об'ємом 2,5см3

Крива зміни температури при додаванні послідовно двох об'ємів кріопротектора по 10мл у поліпропіленову віалу Nunc об'ємом 2,5см3.

Тест термопари мідь-константан при зануренні в рідкий азот.

При зануренні термопари в рідкий азот швидкість охолодження спаю складала 282,5оС/сек, або 16950оС/хв.