Г лобальный мониторинг за пище-выми инфекциями, проводимыйВОЗ, показал, что 47 % всех

вспышек были вызваны сальмонелла-ми, причем 34 % связаны с потребле-нием куриного мяса [5]. Источникамиинфекции также могут быть молоко,сливочное масло, сыр: в молоке саль-монеллы выживают до 20 дней, в сли-вочном масле – 4 мес, в сырах – 1 год,в замороженном мясе – 2–3 года [6].

Основной путь заражения при саль-монеллезе – алиментарный. Факторамипередачи возбудителей сальмонеллезаявляются, как правило, продукты живот-ного происхождения. В настоящее времячаще всего заболевания возникают приупотреблении в пищу инфицированныхяиц или продуктов, в состав которыхвходят яйца. Ряд заболеваний связан синфицированным сальмонеллами мясоми мясопродуктами. Инфициро ван нымимогут быть и продукты растительногопроисхождения (овощи, фрукты, ягоды),а также дрожжи, кондитерские краси-тели. Даже при интенсивном размно-жении в пищевых продуктах сальмо-неллы не изменяют их вкус, запах иливнешний вид [1].

Определение сальмонелл в пище-вых продуктах и сырье, а также раз-личных объектах окружающей средыявляется одним из ключевых звеньевмногоуровневой системы профилакти-ки острых кишечных инфекций вообщеи сальмонеллеза в частности.

КЛАССИЧЕСКИЙ МЕТОДОПРЕДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ

В сфере санитарно-микробиологи-ческого контроля пищевых продуктов«золотым стандартом» по-прежнемуостается бактериологический метод.Он позволяет выявлять и идентифи-цировать патогенные и санитарно-пока-зательные микроорганизмы, характе-ризующие эпидемическую опасностьисследуемых продуктов. Однако из-засвоей продолжительности, трудоемко-сти и громоздкости классический

«чашечный» метод все меньше отве-чает реалиям современной жизни, непоспевая за масштабностью и дина-мичностью развития пищевого про-изводства. Рутинный технологическийконтроль сырья и продуктов питаниянуждается в экспрессных методах, поз-воляющих оперативно приниматьрешения.

Согласно ГОСТ Р 52814–2007 (ИСО6579:2002) «Продукты пищевые. Методвыявления бактерий рода Salmonella»[3] методика определения сальмонеллв продуктах питания является сложным,многостадийным процессом, главныенедостатки которого – длительность итрудоемкость. Алгоритм определениясальмонелл согласно этому документуподразумевает неселективное обога-щение подготовленного образца в забу-ференной пептонной воде в течение18±2 ч, затем селективное обогащениене менее чем в двух жидких элективныхсредах в течение 24±3 ч с последующимвысевом на плотные среды (табл. 1). Вкачестве элективных рекомендуютсямагниевая среда Раппопорт–Вас сили -адиса, селенитовый бульон или тетра-тионатная среда Мюллера–Кауф манна.Из каждой среды селективного обога-щения высев производится не менеечем на две плотные среды, XLD агар иеще одну: висмут-сульфит агар, средус бриллиантовым зеленым, среду Эндо,Левина или Плоскирева. Согласно боль-шинству других отечественных доку-

ментов [3] основной плотной средойдля высева из обогащения являетсявисмут-сульфитный агар. Инкубация наплотных средах проводится 24±3 ч длябольшинства сред или 48±2 ч для вис-мут-сульфитного агара с первичнымучетом через 24 ч. Таким образом,минимальное время получения отри-цательного ответа 18+24+48 = 90 ч.

При наличии типичных колоний, подо-зрительных на принадлежность к родуSalmonella, время анализа существен-но увеличивается. Репрезентативноечисло типичных колоний отсевают насреду Клиглера или Олькеницкого(18±2 ч), затем при наличии типичныхсвойств выполняют биохимическую ипри необходимости серологическуюидентификацию вначале до рода, затемдо серотипа (не менее 48 ч). Такимобразом, окончательный положи-тельный ответ при использовании клас-сического метода получают в среднемчерез 140–160 ч.

Не следует также забывать о тру-доемкости метода, связанной преждевсего с приготовлением, хранением иутилизацией питательных сред. Дляисследования каждого образца исполь-зуется одна среда неселективного обо-гащения, две жидкие среды селектив-ного обогащения и по две чашки каждойиз двух плотных селективных сред. Приналичии типичного роста количествосред для идентификации будет исчис-ляться десятками пробирок и чашек.

Ускоренный метод обнаружениясальмонелл в пищевых продуктахс использованием петрифильмов3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System

Канд. биол. наук Д.М.СОКОЛОВ,д-р биол. наук М.С.СОКОЛОВООО «МикроБио»

УДК 637.1/.3

Таб ли ца 1

Этап метода

Продолжительность исследования разнымиметодами, ч

ГОСТ Р52814–2007

(ИСО 6579:2002)

3M™ Petrifilm™ SalmonellaExpress System

в зависимости от степениконтаминации образца

<104 КОЕ/г >104 КОЕ/г

Неселективное обогащение 18±2 18±2 18±2в жидкой средеСелективное обогащение 24±3 – 8в жидкой средеКультивирование на плотных 48±2 24±2 24±2селективных средах

ИТОГО: время выдачи отрицательного 83–95 38–44 46–52результата при отсутствии типичных колоний

Отсев колоний на среду Клиглера 18±2 – –или Олькеницкого и ПАБиохимическая идентификация �48 4 4

ИТОГО: время выдачи положительного >147–163 42–48 50–56результата, подтвержденного биохимически

Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио" 123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, info@mibio.ru, www.mibio.ru

45

СИСТЕМА УСКОРЕННОГООБНАРУЖЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ

Несмотря на недостатки, у бактерио-логического метода есть главное пре-имущество перед экспресс-методамина основе иммунологических и молеку-лярно- биологических технологий.Классический метод позволяет оценитьжизнеспособность целевых микроорга-низмов, а значит, их реальную опас-ность, а также обладает самой высокойчувствительностью из существующихметодов исследования. Поэтому усилиякомпаний, занятых в сфере лаборатор-ного бизнеса, направлены на совер-шенствование, упрощение и ускорениебактериологического метода.

Для ускорения процедуры анализа всостав современных питательных средпомимо селективных добавок, подав-ляющих рост нецелевой микрофлоры,вносятся специальные хромогенныедобавки, позволяющие определять мар-керы, высокоспецифичные для той илииной группы целевых микроорганиз-мов. Использование таких добавок даетвозможность облегчить учет и сокра-тить длительность анализа за счетисключения этапа идентификации. Вхромогенных средах для определениясальмонелл чаще всего используютсяхромогенные добавки на основе про-пиленгликоля, который сальмонеллыспособны разлагать, в отличие от дру-гих бактерий.

Еще одним перспективным реше-нием, упрощающим процедуру бакте-риологического анализа, являетсяиспользование питательных сред наспециальных подложках. Срок хранениятаких сред не уступает сухим, а способприменения заметно проще, так какисключаются этапы приготовления, сте-рилизации и разливки, нет необходи-мости в подготовке посуды, а инокуля-ция пробы в большинстве случаев нетребует сложных манипуляций.

Компания 3М (США) разработалатест-системы 3M™ Petrifilm™ (петри-фильмы) – питательные среды на под-ложке. Петрифильмы предназначеныдля санитарно-микробиологическогоконтроля пищевых продуктов и широкоиспользуются во всем мире. Только встранах EC тест-пластины 3M™ Petri -film™ используют более 3000 произво-дителей. С 2011 г. 3M™ Petrifilm™ реко-мендованы Роспотребнадзором РФ дляприменения в производственных лабо-раториях, контролирующих производ-ственное сырье и пищевые продукты, атакже в испытательных лабораториях

Роспотребнадзора и Россельхоз -надзора, сертификационных центрах идругих организациях, аккредитованныхна право проведения микробиологиче-ских исследований [4]. Тест-системы3M™ Petrifilm™ позволяют определятьтакие показатели микробиологическо-го качества пищевых продуктов, какКМАФАнМ, дрожжи и плесени, БГКП(ЛКП), E.coli, S.aureus, Listeria spp. имолочнокислые бактерии.

В 2013 г. компания 3М анонсирова-ла новую тест-систему 3M™ Petrifilm™Salmonella Express System, предна-значенную для ускоренного определе-ния сальмонелл бактериологическимметодом (рис. 1). Компоненты тест-системы 3M™ Petrifilm™ SalmonellaExpress System приведены в табл. 2.Данная тест-система соединяет в себеэлементы классического метода с пре-имуществами питательных сред на под-ложках и подразумевает два алгорит-ма исследования в зависимости отобщей степени контаминации образ-цов. Сильно контаминированными счи-таются образцы, в которых уровеньКМАФАнМ превышает 104 КОЕ/г.Образцами с низкими уровнями конта-минации, как правило, являются пище-вые продукты, прошедшие термиче-скую обработку.

Первичное обогащение подготов-ленного образца осуществляется в фир-

менной среде обогащения – 3M™Salmonella Enrichment Base, в которуюперед использованием добавляется спе-циальная ростовая добавка – 3M™Salmonella Enrichment Supplement.Образцы инкубируют 18 ч при 41,5 °C.Далее обогащенные образцы с низкойстепенью контаминации высевают пет-лей на заранее подготовленные под-ложки 3M™ Petrifi lm™ SalmonellaExpress (SALX) Plate для получения изо-лированных колоний (рис. 2). Посевыинкубируют 24 ± 2 ч при 41,5 °C. Приисследовании образцов с высокой сте-пенью фоновой контаминации обога-щенный образец перед высевом на под-ложку подвергают дополнительномуэтапу селективного обогащения в средеРаппопорт–Вассилиадиса в течение 8 чпри 41,5 °С [2].

После инкубации посевы на под-ложках просматривают на наличиетипичных колоний: красных колоний,ассоциированных с зоной пожелтениявокруг колонии; красных, ассоцииро-ванных с пузырьками газа; красныхколоний, обладающих обоими призна-ками. При отсутствии типичных коло-ний выдается отрицательный резуль-тат, время получения которого составитдля низкоконтаминированных образ-цов 38–44 ч, а для высококонтамини-рованных – 48–52 ч, что в 2 разабыстрее по сравнению с классиче-ским методом (см. табл. 1).

При наличии типичных колоний ихотмечают маркером на пленке, покры-вающей питательную среду на подлож-ке, и проводят биохимическую иденти-фикацию путем наложения на посевспециального диска 3M™ Petrifilm™Salmonella Express (SALX) ConfirmationDisk, покрывающего всю площадь посе-ва (см. рис. 2). Подложку вместе с дис-ком инкубируют 4 ч при 41,5 °C. Сальмо -неллами будут считаться бактерии,образующие типичные колонии, которыепри инкубации с диском меняют свойцвет с красного на черно-синий [6].

М О Л О Ч Н А Я П Р О М Ы Ш Л Е Н Н О С Т Ь№ 4 , 2 0 1 4

Рис. 1. Тест- система 3M™ Petrif i lm™Salmonella Express System

Компоненты тест-системы 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System Количество Номер вкаталоге

3M™ Salmonella Enrichment Supplement – Селективная добавка 1 г/уп. SESUP001к среде обогащения3M™ Salmonella Enrichment Base – Основа среды для обогащения 500 г/уп. SEB500сальмонелл3M™ Rappaport-Vassiliadis R10 (R-V R10) Broth – Среда Раппапорт- 500 г/уп. BP0288500Вассилиадиса для селективного обогащения сальмонелл3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Confirmation Disk – 5 шт/уп. 6538Диск для биохимического подтверждения сальмонелл3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Plate – 50 шт/уп. 6536Петрифильмы для обнаружения сальмонелл3M™ Petrifilm™ Flat Spreader – Распределитель 2 шт/уп. 6425для 3M™ Petrifilm™ (SALX)

Таб ли ца 2

Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио" 123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, info@mibio.ru, www.mibio.ru

Таким образом, использование 3M™Petrifilm™ Salmonella Express Systemпозволяет получить биохимически под-твержденный положительный резуль-тат уже через 42–56 ч, что в 3 разабыстрее по сравнению с классическимметодом (см. табл. 1).

СИСТЕМА 3M™ PETRIFILM™SALMONELLA EXPRESS SYSTEM –

МНЕНИЕ НЕЗАВИСИМЫХЭКСПЕРТОВ

Качество петрифильмов 3M™Petrifilm™ Salmonella Express Systemподтверждено путем проведениясравнительных испытаний с методами,регламентированными законодатель-ством США, и референсными метода-ми, регламентированными междуна-родными организациями (ИСО, АОАС).

Сравнительное испытание тест-системы 3M™ Petrifilm™ SalmonellaExpress System провела независимаяко м п а н и я Q L a b o r a t o r i e s , I n c .(Цинциннати, шт. Огайо), специализи-рующаяся на проведении подобныхиспытаний. В отчете этой компании [7]приведены результаты сравненияэффективности 3M™ Pet r i f i lm™Salmonella Express System с амери-канскими стандартами USDA/FSIS MLG4.05 (2011) Isolation and Identification ofS a l m o n e l l a f r o m M e a t , P o u l t r y ,Pasteurized Eggs and Catfish Products иFDA/BAM Chapter 5 Salmonella, а такжестандартом ISO 6579: Microbiology offood and animal feeding stuf fs —Horizontal method for the detection ofSalmonella spp. Исследования быливыполнены согласно требованиям про-токола апробации новых методов, реко-мендованного AOAC.

Ускоренным и референсным мето-дами исследовали по 25 образцов каж-дого из 8 видов пищевых продуктов исырья (куриный, говяжий и свиной

фарши, замороженные сырые креветки,пастеризованные яйца, готовые кури-ные нагетсы, шпинат, сухой корм длясобак), а также один объект окружающейсреды (смывы с поверхности нержа-веющей стали). В каждой серии образ-цов исследовали 5 незараженных образ-цов в качестве отрицательного контроляи 20 образцов, зараженных тестовымиштаммами сальмонелл в низких кон-центрациях (0,2–2 КОЕ/образец).

Проведенные исследования показа-ли отсутствие статистически достовер-ных различий между результатами 3M™Petrifilm Salmonella Express System иполученными традиционными рефе-ренсными методами. Более того, в рядеслучаев (при исследовании куриногофарша, сырых замороженных креветок,свежего шпината и сухого корма длясобак) методом 3M™ Petrifilm SalmonellaExpress System сальмонеллы выделя-лись с частотой, превышающей резуль-таты традиционных методов.

В отчете подчеркиваются преиму-щество в скорости выполнения иссле-дования методом 3M™ Petrifilm Salmo -nella Express System по сравнению страдиционными методами и большаяпростота выполнения исследования.

3M™ Petrifilm™ Salmonella ExpressSystem – инновационная тест-системадля санитарно-микробиологическогоконтроля продуктов питания, способнаобеспечить достоверный надежныйрезультат, не уступающий результатамреференсных методов. Тест-система3M™ Petrifilm Salmonella Express Systemобладает рядом преимуществ, позво-ляющих увеличить эффективность ипроизводительность работы:˜ ускоренное получение надежныхрезультатов (в 2–3 раза быстрее посравнению с классическим методом);˜ исключаются этапы приготовления,стерилизации и разливки питательныхсред;˜ нет необходимости в подготовкепосуды;

˜ процедура посева значительно упро-щена;˜ занимают мало места при хранениии утилизации;˜ сроки хранения не уступают срокамхранения сухих сред;˜ упрощение процедуры посева, стан-дартизация учета результата позволяетснизить долю ошибок, вызванных чело-веческим фактором, и высвободитьвысококвалифицированный персоналлаборатории для выполнения другихзадач;˜ ускоренный метод обнаружениясальмонелл с использованием 3M™Petrifilm™ Salmonella Express Sys-tem сертифицирован международнойорганизацией AOAC (Association of Ana-lytical Communities).

Все вышеизложенное делает тест-систему 3M™ Petrifilm™ SalmonellaExpress System крайне привлекатель-ным инструментом при определениисальмонелл для всех микробиологов,занятых в сфере контроля продуктовпитания и других объектов окружающейсреды.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1. ГОСТ Р 52814–2007 (ИСО 6579:2002)«Продукты пищевые. Метод выявлениябактерий рода Salmonella».2. Инструкция по применению и интер-претации результатов – 3M™Petriflm(SALX) экспресс-система для определениясальмонелл. 2013. 11 с.3. Методические указания МУ 4.2.2723–10«Лабораторная диагностика сальмонелле-зов, обнаружение сальмонелл в пищевыхпродуктах и объектах окружающей среды»(утв. Главным государственным санитар-ным врачом РФ 13 августа 2010 г.).4. Методы микробиологическогоконтроля объектов окружающей средыи пищевых продуктов с использовани-ем петрифильмов: методическиеуказания (МУК 4.2.2884–11). – М.: Федеральный центр гигиены и эпиде-миологии Роспотребнадзора, 2011.5. Россельхознадзор /новостиhttp://www.fsvps.ru/fsvps/news/5755.html6. Соколов Д.М., Соколов М.С.Ускоренные методы выявления бактерийрода сальмонелла в пищевых продуктах исырье // Вопросы питания. 2013. Т. 82. № 1.7. Crowley E., Boyle M., Bird P. et al.Comparative Evaluation of the 3M™Petriflm™ Salmonella Express System for theDetection of Salmonella species in Food andEnvironmental Surfaces, Q Laboratories, Inc.,1400 Harrison Avenue, Cincinnati, OH 45214,March 12, 2013.

46 М О Л О Ч Н А Я П Р О М Ы Ш Л Е Н Н О С Т Ь № 4 , 2 0 1 4

Рис. 2. Петрифильм 3M™ Petri f i lm™Salmonella Express (SALX) Plate для обнару-жения сальмонелл

Микробиология, контроль гигиены,

химический анализ воды

ООО «МикроБио»

123060, Москва, 1- й Волоколамский проезд, 10

Тел.: (495) 221-20-26, www.mibio.ru, info@mibio.ru

Р

Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио" 123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, info@mibio.ru, www.mibio.ru