ISSN 1818-7943

Ñåðèÿ: Áèîëîãèÿ, êëèíè÷åñêàÿ ìåäèöèíà

Òîì 8Âûïóñê 1

2010

Íàó÷íûé æóðíàëÎñíîâàí â íîÿáðå 1999 ãîäà

ÔÅÄÅÐÀËÜÍÎÅ ÀÃÅÍÒÑÒÂÎ ÏÎ ÎÁÐÀÇÎÂÀÍÈÞÍÎÂÎÑÈÁÈÐÑÊÈÉ ÃÎÑÓÄÀÐÑÒÂÅÍÍÛÉ ÓÍÈÂÅÐÑÈÒÅÒ

ÂÅÑÒÍÈÊ

ÍÎÂÎÑÈÁÈÐÑÊÎÃÎ ÃÎÑÓÄÀÐÑÒÂÅÍÍÎÃÎ ÓÍÈÂÅÐÑÈÒÅÒÀÑåðèÿ: Áèîëîãèÿ, êëèíè÷åñêàÿ ìåäèöèíà. 2010. Ò. 8, âûï. 1

Ïåðèîäè÷íîñòü – 4 ðàçà â ãîäÂûõîäèò íà ðóññêîì ÿçûêå

Èíäåêñ ïî êàòàëîãó ÎÀÎ «Ðîñïå÷àòü»18281

Æóðíàë âêëþ÷åí â Ïåðå÷åíüâåäóùèõ ðåöåíçèðóåìûõ íàó÷íûõ èçäàíèé è æóðíàëîâ, ðåêîìåíäóåìûõ Âûñøåé àòòåñòàöèîííîé êîìèññèåéäëÿ ïóáëèêàöèè îñíîâíûõ íàó÷íûõ ðåçóëüòàòîâ äèññåðòàöèéíà ñîèñêàíèå ó÷åíîé ñòåïåíèêàíäèäàòà íàóê

Æóðíàë âêëþ÷åí â Ðåôåðàòèâíûé æóðíàëè Áàçû äàííûõ ÂÈÍÈÒÈ,à òàêæå â ðîññèéñêèé èíäåêñ íàó÷íîãî öèòèðîâàíèÿ

Ýëåêòðîííàÿ âåðñèÿ æóðíàëà ðàçìåùåíàíà ïëàòôîðìå Íàó÷íîé ýëåêòðîííîé áèáëèîòåêè: www.elibrary.ru

Îòâåòñòâåííûé ðåäàêòîð âûïóñêàÌ. Þ. ÄåíèñîâÊîððåêòîð È. À. ÏîõîðóêîâàÎðèãèíàë-ìàêåò Ì. Þ. Äåíèñîâà

Ðåäàêöèîííàÿ êîëëåãèÿ ñåðèè

Ãëàâíûé ðåäàêòîð

ä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. À. Ã. Ïîêðîâñêèé

Çàìåñòèòåëü ãëàâíîãî ðåäàêòîðà

ä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Ì. Þ. Äåíèñîâ

Îòâåòñòâåííûé ñåêðåòàðü

ä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Ã. È. Ëèôøèö

×ëåíû ðåäàêöèîííîãî ñîâåòà

àêàä. ÐÀÍ Â. Â. Âëàñîâàêàä. ÐÀÍ Ë. Í. Èâàíîâààêàä. ÐÀÌÍ Â. È. Êîíåíêîâàêàä. ÐÀÌÍ Â. Â. Ëÿõîâè÷àêàä. ÐÀÌÍ Þ. Ï. Íèêèòèíàêàä. ÐÀÍ Ã. À. Òîëñòèêîâä-ð áèîë. íàóê, ïðîô. Ë. Ô. Ãóëÿåâàä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Ñ. Ä. Íèêîíîâä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Í. Ì. Ïàñìàíä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Ñ. Â. Ñèäîðîâä-ð ìåä. íàóê, ïðîô. Ã. Ñ. Ñîëäàòîâà

Àäðåñ ðåäêîëëåãèè:

óë. Ïèðîãîâà, 2, Íîâîñèáèðñê, 630090, ÐîññèÿÒåëåôîí/ôàêñ: (383) 363 40 08E-mail: medik@vestnik.nsu.ru

Æóðíàë çàðåãèñòðèðîâàíâ Ãîñóäàðñòâåííîì êîìèòåòå ÐÔ ïî ïå÷àòè (ñâèäåòåëüñòâî ¹ 019373 îò 02.11.1999)

Ñäàíî â íàáîð 10.12.2009Ïîäïèñàíî â ïå÷àòü 20.01.2010Áóìàãà îôñåòíàÿ ¹ 1. Ôîðìàò 60 õ 84/8Ãàðíèòóðà Times New RomanÏå÷àòü îôñåòíàÿÓñë. ïå÷. ë. 18,4. Ó÷.-èçä. ë. 19,75Òèðàæ 500Çàêàç ¹ 6

Ðåäàêöèîííî-èçäàòåëüñêèé öåíòð ÍÃÓóë. Ïèðîãîâà, 2, Íîâîñèáèðñê, 630090Ðîññèÿ

© Íîâîñèáèðñêèé ãîñóäàðñòâåííûéóíèâåðñèòåò, 2010

Ðåäàêöèîííûé ñîâåò æóðíàëà

Ïðåäñåäàòåëüä-ð õèì. íàóê Â. À. Ñîáÿíèí

àêàä. ÐÀÍ Â. È. Ìîëîäèí÷ë.-êîðð. ÐÀÍ Ñ. Ñ. Ãîí÷àðîâ÷ë.-êîðð. ÐÀÎ À. À. Íèêèòèí÷ë.-êîðð. ÐÀÍ À. Ì. Ôåäîòîâä-ð ôèç.-ìàò. íàóê À. Â. Àðæàííèêîâä-ð ôèëîñ. íàóê Â. Ñ. Äèåâä-ð þðèä. íàóê Â. Ñ. Êóð÷ååâä-ð ýêîí. íàóê Ã. Ì. Ìêðò÷ÿíä-ð ìåä. íàóê À. Ã. Ïîêðîâñêèéä-ð ôèëîë. íàóê È. Â. Øàïîøíèêîâà

В Е С Т Н И К НОВОСИБИРСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Научный журнал

Основан в ноябре 1999 года

Серия: Биология, клиническая медицина 2010. Том 8, выпуск 1

СОДЕРЖАНИЕ

Оригинальные исследования

Морозкин Е. С., Лосева Е. М., Задесенец К. С., Рубцов Н. Б., Власов В. В., Лактио-нов П. П. Исследование состава внеклеточной ДНК в культуре клеток человека с помощью Fish 3

Горемыкин К. В., Ивлев И. В., Королева Ю. А., Рыжов С. В., Шилов Б. В., Сереб-ров В. Ю., Сазонов А. Э. Исследование взаимодействия лигандов с аденозиновыми рецепторами типа A2B in silico 11

Фомин А. С., Семенов Д. В., Кулигина Е. В., Коваль О. А., Бабкина И. Н., Тикуно-ва Н. В., Матвеева В. А., Матвеев Л. Э., Рихтер В. А. Генно-инженерные аналоги потенциального противоопухолевого пептида лактаптина 17

Кононов А. В., Филипенко М. Л., Новиков Д. Г., Боярских У. А., Петров Д. В., Глат-ко С. Б. Колоректальный рак и полиморфизм генов ключевых ферментов фолат-ного цикла 26

Анюшин А. В., Кабилов М. Р., Пышный Д. В. Флуорометрический анализ селективно-сти гибридизации олигонуклеотидных зондов методом термической денатурации 32

Бабина А. В., Лавриненко В. А., Шестопалова Л. В., Иванова Л. Н. Морфофункцио-нальные особенности почек крыс Браттлборо в различных экспериментальных условиях 40

Виноградова М. С., Боярская А. Р., Иванова Л. Н. Особенности пренатального онто-генеза почек крыс Вистар и вазопрессин-дефицитных крыс Браттлборо 45

Мичурина С. В., Васендин Д. В., Ищенко И. Ю., Жданов А. П. Структурные измене-ния в тимусе после воздействия экспериментальной гипертермии 51

Силко Н. Ю., Шестопалов А. М., Шестопалова Л. В. Случаи выделения вируса болезни Ньюкасла на территории России 57

Высочина Г. И., Ершова Э. А. Содержание и состав флавонолов тарана альпийского, произрастающего в Сибири 62

Лобанова И. Е. Содержание флавоноидов и сапонинов в надземной части Astragalus glycyphyllоs L. 70

Барсуков А. П., Климова Т. М., Соренсен М. В., Щербук Ю. А., Кривошапкин В. Г. Особенности содержания адипонектина в крови коренного населения Республики Саха (Якутия) 74

Ким Л. Б., Путятина А. Н. Постинфарктный репаративный фиброз при лечении ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента 79

Шпагина Л. А., Шпагин И. С., Герасименко О. Н., Зуева М. А. Системные механизмы сосудистых нарушений при сочетанных формах патологии 86

Ряполова Е. А., Нечаева Г. И., Веселовская А. Л. Дислипидемия и инсулинорези-стентность при безболевой ишемии миокарда 92

Герус А. Ю., Флейшман А. Н. Особенности вариабельности ритма сердца у больных с сахарным диабетом 2 типа 96

Пьянников В. В., Березников А. В., Конев В. П., Ахмедов В. А., Сорокина В. В., Васьки-на Т. В. Сравнительная характеристика исследований паренхимы печени методами биопсии и эластографии 101

Сущенко М. А., Козлова И. В. Состояние эзофагогастродуоденальной зоны у лиц с алкогольной болезнью печени 107

Кайгородова Н. З., Казин Э. М. Влияние абиотических факторов среды на функцио-нальные особенности первоклассников 113

Варшал А. В. Эмоциональные и поведенческие проблемы у детей: семейные факторы риска и защиты 119

Сергеева О. Ю., Даниленко К. В. Сезонные изменения овариально-менструальной функции у женщин 125

Катерлина И. Р., Изранов В. А., Соловьева И. Г., Рымар О. Д., Насонова Н. В., Абра-мов В. В. Межполушарная асимметрия головного мозга и морфологическая асим-метрия щитовидной железы 129

Алекперова Х. М. Биоэлектрическая активность головного мозга и курс функцио-нального биоуправления 133

Ефремова Р. И., Воронина Г. А. Адренореактивность как критерий оценки функцио-нального состояния организма 138

Мищенко Н. В., Родыгина С. Н., Сизова Е. Н., Тулякова О. В. Особенности агглюти-нации эритроцитов в зависимости от места проживания доноров 142

Шушарин А. Г., Лифшиц Г. И., Шевела А. И. Опыт восстановления связочно-мышечного волокна лонгидазой 147

Левченко К. Ф., Чернобай Г. Н. Информативность стандартных параклинических тестов у пациентов с раком молочной железы 150

Королева А. М., Мосунов А. И., Казарезов М. В., Домников А. В., Бауэр И. В. Пласти-ческие операции в реабилитации больных с тканевыми дефектами и псевдоартро-зами предплечья 155

Обзоры

Ким Л. Б. Соединительная ткань и проблема социально значимых заболеваний

человека 162 Сведения об авторах 171 Авторский указатель статей, опубликованных в 2009 году 176 Информация для авторов 181

Горемыкин К. В. и др. Исследование взаимодействия лигандов 11

УДК 57+577.1/.3+576.3

К. В. Горемыкин 1, И. В. Ивлев 1, 2, Ю. А. Королева 1, С. В. Рыжов 3, Б. В. Шилов 1, В. Ю. Серебров 1, А. Э. Сазонов 1

1 Сибирский государственный медицинский университет Московский тракт, 2, Томск, 634050, Россия

2 Чешский технический университет ул. Зикова, 4, Прага 6, Чешская Республика, 166 36

3 Университет Вандербилта 2201 Вест Энд авеню, Нашвилл, штат Теннеси, США, 37240

E-mail: covigo@mail.ru

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ С АДЕНОЗИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

ТИПА A2B IN SILICO

Аденозиновый рецептор типа A2B экспрессируется многими иммунными клетками и опосредует раз-витие и поддержание хронического воспаления при бронхиальной астме. В связи с этим аденозиновый рецептор типа A2B рассматривается как мишень в терапии больных с некоторыми заболеваниями лег-ких. Для анализа особенностей взаимодействия молекулы данного рецептора с молекулами различных активаторов и ингибиторов применялось компьютерное моделирование. Созданы модели аденозинового рецептора типа A2B и двух его мутантных форм (программа Modeller), а также 9 активаторов и 15 ингибиторов данного рецептора (программа ChemSketch). На основании полученных моделей произ-веден расчет лиганд-рецепторных взаимодействий с использованием программы AutoDock 4.0. Установ-лена предрасположенность взаимодействия активаторов и ингибиторов с определенными аминокислотами лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа A2B.

Ключевые слова: аденозиновый рецептор типа A2B, компьютерное моделирование по гомологии.

Аденозиновые рецепторы (АР) отно-сятся к сопряженным с G-белками рецепто-рам и состоят из семи трансмембранных α-спиралей, попарно соединенных тремя внешними и тремя внутриклеточными гидрофильными петлями. Они экспресси-руются на тучных, дендритных, бронхо-эпителиальных клетках, клетках эндотелия всех кровеносных сосудов, фибробластах, макрофагах, гладкомышечных клетках бронхов.

В настоящее время изученными являют-ся аденозиновые рецепторы подтипов A1, A2A и A3. Рецептор подтипа A2B исследован недостаточно [1].

Известно, что воздействие аденозина на АР подтипа А2B приводит к включению внутриклеточного метаболического каска-да, следствием чего являются усиление и прогрессирование провоспалительной функ-ции клеток [2]. Поэтому АР могут рассмат-риваться как мишени в терапии больных с многих болезнями и патологическими со-стояниями, такими как бронхиальная астма,

хроническая обструктивная болезнь легких, ишемия органов, артрит и сепсис [1].

Аденозин – это метаболит, образующий-ся при распаде АТФ, АДФ, АМФ. Он явля-ется основным лигандом, который приводит к активации АР всех четырех типов. Однако помимо аденозина описан ряд лигандов (ак-тиваторов и ингибиторов) аденозиновых рецепторов. Взаимодействие лигандов с АР подтипа A2B зависит от многих факторов, в том числе от расположения аминокислот в лиганд-связывающем центре рецептора, что делает актуальным исследование эффек-тивности лиганд-рецепторных взаимодей-ствий при помощи компьютерного модели-рования (in silico). Результаты моделирова-ния могут послужить основой для разработки новых противовоспалительных фармацевтических средств, для которых мишенями будут являться аденозиновые рецепторы подтипа A2B [3].

АР, как и другие рецепторы, сопряжен-ные с G-белками, представляют собой мем-бранные белки, плохо поддающиеся кри-

ISSN 1818-7943. Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. 2010. Том 8, выпуск 1 © К. В. Горемыкин, И. В. Ивлев, Ю. А. Королева, С. В. Рыжов, Б. В. Шилов, В. Ю. Серебров, А. Э. Сазонов, 2010

Оригинальные исследования 12

сталлизации, а следовательно, точному структурному изучению методом рентгено-структурного анализа [4]. В связи с этим точной компьютерной модели АР подтипа A2B не существует.

Эмпирически установлено, что если по-следовательности двух белков идентичны друг другу более чем на 30 %, то они явля-ются «родственными», и степень эволюци-онной дивергенции не столь велика, чтобы их структуры утратили общность. Эти на-блюдения являются основой методики предсказания пространственной структуры, называемой моделированием на основании гомологии. В настоящий момент моделиро-вание используется для установления структуры тех белков, чья третичная струк-тура еще неизвестна.

Трехмерные модели низкомолекулярных веществ – лигандов, можно создать, осно-вываясь на их структурной химической формуле, используя специальное про-граммное обеспечение, рассчитывающее длину связей между атомами и углы между связями.

Накопленные данные позволяют объяс-нить основные закономерности и отличия в структуре аденозиновых рецепторов в ли-ганд-рецепторных взаимодействиях и дают общее представление о перспективных пу-тях поиска новых, более эффективных и селективных лигандов.

Цель исследования: построить компью-терные модели АР подтипа A2B, 9-и его ак-тиваторов и 15-и ингибиторов; затем, ис-пользуя их, проанализировать особенности взаимодействия молекулы аденозинового рецептора подтипа A2B с молекулами различ-ных активаторов и ингибиторов in silico.

Материал и методы

Аминокислотные последовательности рецепторов. Данная последовательность рецептора типа A2B человека дикого типа опубликована в открытом доступе в банке данных NCBI (ID: NP_000667.1) [5]. Первая из созданных в ходе нашего исследования моделей содержит в своей основе амино-кислотную последовательность аденозино-вого рецептора A2B дикого типа.

Вторая модель представляет собой изме-ненную аминокислотную последователь-

ность. В ней все аминокислотные остатки лизина заменены на остатки аргинина: Lys114 → Arg114, Lys147 → Arg147, Lys170 → Arg170, Lys204 → Arg204, Lys234 → Arg234, Lys265 → Arg265, Lys267 → Arg267, Lys269 → Arg269, Lys303 → Arg303, Lys316 → Arg316. Решение проанализировать подобную мо-дель обосновано тем, что лизин играет важ-ную роль в ковалентной модификации бел-ка, что, в свою очередь, влияет на конфор-мацию лиганд-связывающего центра.

Третья модель также представляет собой измененную аминокислотную последо-вательность, где произведены замены: Tyr202 → Arg202, Thr216 → Met216, Leu218 → Ser218, Thr225 → Ala225, Gln227 → Arg227, Tyr292 → Arg292, Tyr299 → Arg299, Tyr308 → Arg308. В данном случае введены замены в третью внутриклеточную петлю, так как существует мнение, что именно этот уча-сток важен для взаимодействия рецептора с нижестоящими сигнальными белками.

Моделирование рецепторов по гомологии при помощи программного пакета MODELLER. Процесс моделирования по гомологии включал несколько шагов, глав-ными из которых являлись поиск структур-ного шаблона с высокой степенью гомоло-гии (или идентичности) и выравнивание последовательностей. Участки, не имеющие гомологии с шаблоном, достраивались не-зависимо. Положение боковых цепей опти-мизировалось с помощью эмпирических методов силовых полей [6]. Основной не-достаток сравнительного моделирования состоит в том, что в структуре шаблона не содержится отличительных черт модели-руемого белка. Из-за этого структура моде-лей, созданных по гомологии, может ока-заться ближе к шаблону, на котором она базировалась, чем к исследуемому белку.

При моделировании АР подтипа А2B и его мутантных форм была применена программа MODELLER. Шаблоном для построения трехмерной модели аденозинового рецепто-ра подтипа А2B послужила трехмерная ком-пьютерная модель АР подтипа А2A, содер-жащаяся в pdb-файле (3eml.pdb). Он нахо-дится в свободном доступе на сайте молекулярного банка данных RCSB PDB [7].

Построение и оптимизация трехмерных компьютерных моделей низкомолекулярных веществ – лигандов аденозинового рецеп-

Горемыкин К. В. и др. Исследование взаимодействия лигандов 13

тора. На основании экспертных оценок [8] и из поставленных целей при выборе про-граммы для построения моделей низкомо-лекулярных веществ было отдано предпоч-тение программному пакету ACD / Chem-Sketch.

Алгоритм 3D оптимизации преобразовы-вает плоскую (2D) структуру, созданную в программе ACD / ChemSketch, в реалистич-ную 3D модель. Оптимизация основана на применении несколько измененных методов молекулярной механики, которые прини-мают во внимание длину химических связей, величину угла между атомами, внут-реннее вращение и невалентные взаимодей-ствия. Модификации включают незначи-тельные упрощения потенциальных функ-ций, а также дополнены эвристическими алгоритмами для неудачных стартовых конфигураций. Эти упрощения предназна-чены для увеличения скорости вычисления [9]. Для оптимизации ACD / ChemSketch использует модификацию силового поля, подобную заложенной в программе CHARMM [10].

Расчет лиганд-рецепторных взаимодей-ствий. Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий производилось при помощи программы AutoDock 4.0 в составе про-граммного комплекса MGL Tools 1.4.5 [11] с использованием суперкомпьютера СКИФ-Киберия. Для многократного запуска про-граммы AutoDock в автоматическом режи-ме были написаны управляющие скрипты.

В программе AutoDock заложен метод молекулярной механики, который заключа-ется в расчете ионных, водородных, кова-лентных, ван-дер-ваальсовых взаимодейст-вий между неподвижными молекулами ли-ганда и рецептора. Такой расчет поочередно производится для нескольких миллионов различных положений лиганда относитель-но рецептора, затем найденные положе-ния – конформации – лиганда сравниваются между собой программой по свободной энергии связывания и среднеквадратичному отклонению расположения атомов относи-тельно друг друга. На основе полученных значений делается вывод о взаимодействиях между лигандом и рецептором.

Статистическая обработка данных. Полученные данные были проанализирова-ны при помощи программы SPSS 11.5.

Для выявления закономерностей в обра-зовании водородных связей между лиган-дами и аминокислотами рецептора исполь-зовались таблицы сопряженности [12]. Для определения достоверностей различий час-тот взаимодействия лигандов и рецепторов использовали односторонний точный кри-терий Фишера.

Результаты исследования и обсуждение

Модели лигандов. Было сконструировано 24 компьютерных модели лигандов АР под-типа A2B: 9 активаторов и 15 ингибиторов. Активаторы: 2-хлораденозин, 2-гексенил-N-этилкарбоксамидаденозин, аденозин, CCPA, CGS 21680, IB-MECA, N (6)-циклопентил-аденозин, N-этилкарбоксамидаденозин, PIA. Ингибиторы: аллоксазин, BW-A1433, CGS 15943, кофеин, CPX, DPCPX, DEPX, I-ABOPX, OSIP-339391, регаденозон, SCH 58261, теофиллин, XAC, XCC, ZM 241385.

Модели аденозиновых рецепторов под-типа A2B. Было построено три модели АР. Одна из моделей является представлением аденозинового рецептора подтипа A2B (ди-кий тип), вторая – подтипа A2B, аминокис-лотная последовательность которого со-держит мутации первого типа (замена всех Lys на Arg), третья – подтипа A2B, амино-кислотная последовательность которого содержит мутации второго типа (локализо-ванные в третьем внутриклеточном доме-не). Шаблоном для всех моделей послужил файл 3eml.pdb, содержащий модель адено-зинового рецептора подтипа A2A.

Компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий. Проведен расчет взаимодействия всех 24 лигандов аденозиновых рецепторов с лиганд-связывающим центром каждого из рецепто-ров. В процессе каждого расчета проведено 50 попыток найти наилучшее положение лиганда в лиганд-связывающем центре ре-цептора. Каждой попытке соответствует 2,5 млн различных конформаций лиганда. По результатам каждой попытки отбиралась одна наиболее энергетически выгодная конформация – с наименьшим значением свободной энергии связывания (с наимень-шим значением изменения свободной энер-гии Гиббса при переходе пары лиганд-

Оригинальные исследования 14

Активаторы Ингибиторы

His2803 %

Ser2831 %

Ser2791 %

Arg / Lys2696 %

Asn25426 %

Asn1864 %

Glu17417 %

Ser921 %

Thr891 %

Ala829 %

Ala641 %

Ser681 %

Ala604 %Ни с одной из

аминокислот25 %

Рис. 1. Процентное соотношение аминокислот аденозинового рецептора типа A2B, образующих водородные связи

рецептор из несвязанного состояния в свя-занное). Таким образом, по завершении расчетов было получено 50 наилучших конформаций для каждой пары «рецептор – лиганд».

Оценка того, с какими аминокислотами взаимодействует тот или иной ингибитор, производилась при помощи графической оболочки программы AutoDock. Для анали-за были взяты не все конформации, а лишь сходные друг с другом. За критерий схоже-сти было принято среднеквадратичное от-клонение положения пары атомов в одной конформации от положения той же пары атомов в другой конформации. Для каждой пары «рецептор – лиганд» анализировалась наибольшая группа, в которую входили конформации, отличающиеся друг от друга по среднеквадратичному отклонению не более чем на 2 Å.

Было установлено, что активаторы и ин-гибиторы образуют водородные связи пре-имущественно с несколькими аминокисло-тами из множества аминокислот, находя-щихся в сайте связывания, причем некоторые аминокислоты обладают сродст-вом как к активаторам, так и к ингибито-рам: Ala82, Glu174, Asn186, Asn254 (рис. 1). Помимо этого, активаторы образуют водо-родные связи с аминокислотами Ile67, Leu81, Cys171, Phe173, Glu175, Val250,

а ингибиторы образуют водородные связи с аминокислотами Ala60, Ala64, Ser68, Thr89, Ser92, Arg269, Ser279, His280, Ser283.

Взаимодействие Ser283 преимуществен-но с ингибиторами согласуется с данными компьютерного моделирования взаимодей-ствия аденозинового рецептора типа A2A, имеющего сходное с A2B строение, с акти-ваторами и ингибиторами [13]. В данном исследовании было показано, что Ser281, соответствующий Ser283 нашей модели A2B рецептора, в большей степени важен для связывания антагонистов и в меньшей – агонистов. В другой работе [14], также по-священной компьютерному расчету взаи-модействия рецептора типа A2A на этот раз лишь с одним из ингибиторов SHA174, ука-зывается, что Asn248, соответствующий Asn254 нашей модели, ответственен за свя-зывание указанного ингибитора. Из данного исследования ясно, что он отвечает также и за связывание рецептора типа A2B с актива-торами.

Посредством одностороннего точного критерия Фишера выяснено, что на уровне статистически значимых различий (p = 0,01) активаторы образуют водородные связи с аминокислотой Ile67 чаще, чем ингибиторы. Phe173 и Glu174 также чаще связываются с активаторами (p = 0,04 и 0,02 соответствен-но) (см. рис. 1). Роль данных аминокислот в

Cys1712 %

Ala8212 %

Leu812 %

Glu1752 %

Asn1862 %

Val2502 %

Ile677 %

(p = 0,01)

Phe1735 %

(p = 0,04)

Glu17429 %

(p = 0,02)

Asn25429 %

Ни с одной из аминокислот

7 %

Горемыкин К. В. и др. Исследование взаимодействия лигандов 15

Дикий тип Мутация второго типа

Leu812 %

Ala8212 %

Cys1712 %

Phe1735 %

Glu17430 %

Glu1752 %

Asn1862 %

Val2502 %

Asn25429 %

Ile677 %

(p = 0,03)Ни с одной из аминокислот

7 % Ala8213 %

Ser923 %

Glu17413 %

Asn1863 %

Asn25433 %

Ser2793 %

Arg2696 %

His2803 %

Ser2833 %

Ни с одной из

аминокислот16 %

Ala603 %

Рис. 2. Процентное отношение образования водородных связей с аминокислотами при взаимодействии лигандов с A2B рецептором дикого типа и мутацией второго типа

активации аденозиновых рецепторов типов A1, A2A, A3 в опубликованных ранее работах [13; 14] не была установлена. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию аденозинового рецептора данного типа A2B.

Внесение мутаций первого и второго типов не привело к статистически значи-мым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре ре-цептора. Действительно, ни одна из произ-веденных аминокислотных замен не затро-нула лиганд-связывающий центр. Единст-венное статистически значимое следствие замены – отсутствие связывания с Ile67 (рис. 2). Вероятно, смена аминокислот вне лиганд-связывающего центра, тем не ме-нее, слегка изменила его конформацию в аллостерической манере, приведя к изме-нению характера связывания лигандов с аминокислотой Ile67.

Одна из замен, Lys269 → Arg269, харак-терная для мутации второго типа, затронула лиганд-связывающий центр. Однако такая замена не привела к изменению связывания с остатком Arg269 (см. рис. 2), вероятно, по причине того, что положительно заряжен-ная аминокислота была заменена также на положительно заряженную.

Заключение

На впервые созданной компьютерной модели аденозинового рецептора типа A2B показано, что активаторы и ингибиторы при взаимодействии с аденозиновым рецепто-ром подтипа A2B и его мутантными форма-ми образуют водородные связи с различны-ми аминокислотами.

Исследование выявило аминокислоты, которые могут играть ключевую роль в ак-тивации аденозинового рецептора типа A2B: Ile67, Phe173 и Glu174. Также показано, что внесение аминокислотных замен в третью внутриклеточную петлю потенциально спо-собно приводить к нарушению связывания с аминокислотой Ile67 в лиганд-связываю-щем центре. Проведение in vitro исследова-ний с использованием A2B рецепторов, му-тантных по указанным аминокислотам, позволит окончательно установить их зна-чение в активации рецептора.

Полученные данные объясняют основ-ные закономерности взаимодействия акти-ваторов и ингибиторов с определенными аминокислотами лиганд-связывающего цен-тра аденозинового рецептора типа A2B и за-дают направление поиска эффективных и селективных лигандов, которые могут быть использованы в терапии больных с хрони-ческими болезнями легких.

Оригинальные исследования 16

Список литературы

1. Hasko G., Linden J., Cronstein B., Pacher P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases // Nature Rev. Drug. Discov. 2008. № 9. P. 759–770.

2. Fredholm B. B., Chern Y., Franco R., Sitkovsky M. Aspects of the general biology of adenosine A2A signaling // M. Prog. Neurobiol. 2007. Vol. 83, № 5. P. 263–276.

3. Yang J., Jones S. P., Suhara T., Greer J. J., Ware P. D., Nguyen N. P., Perl-man H., Nelson D. P., Lefer D. J., Walsh K. Endothelial cell overexpression of fas ligand attenuates ischemia-reperfusion injury in the heart // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 17. P. 15185–15191.

4. Findlay J., Eliopoulos E. Three-dimen-sional modeling of G-protein-linked receptors // Trends. Pharmacol. Sci. 1990. Vol. 11, № 12. P. 492–493.

5. Kim S. H., Kim Y. K., Park H. W., Kim S. H., Kim S. H., Ye Y. M., Min K. U., Park H. S. Adenosine deaminase and adeno-sine receptor polymorphisms in aspirin-intolerant asthma // Respir. Med. 2009. Vol. 103, № 3. P. 356–363.

6. Попов М. Е., Стеньгач М. А., Андрее-ва Н. С. Моделирование субстратного и ин-гибиторного комплексов гистидин-аспар-татной протеиназы // Биоорганическая хи-мия. 2008. Т. 34, № 3. С. 422–429.

7. Jaakola V. P., Griffith M. T., Hanson M. A. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist // Science. 2008. Vol. 322, № 5905. P. 1211–1217.

8. Li Z., Wan H., Shi Y., Ouyang P. Personal experience with four kinds of

chemical structure drawing software: review on ChemDraw, ChemWindow, ISIS / Draw, and ChemSketch // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004. Vol. 44, № 5. P. 1886–1890.

9. Bartzatt R. Evaluation of a simple carrier molecule to enhance drug penetration of dermal layers by utilizing multivariate methods, structure property correlations, and continuous system modeling // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 2004. Vol. 36, № 1. P. 37–53.

10. Brooks B. R., Bruccoleri R. E., Olaf-son B. D., States D. J., Swaminathan S., Kar-plus M. CHARMM – a program for macromolecular energy, minimization and dynamics calculations // J. Comp. Chem. 1983. № 4. P. 187–188.

11. Morris G. M., Huey R., Olson A. J. Using AutoDock for ligand-receptor docking // Curr. Protoc. Bioinformatics. 2008. Vol. 11, № 3. P. 34–37.

12. Гланц С. А. Медико-биологическая статистика. М., 1998.

13. Ijzerman A. P., Wenden E. M. van der, Galen P. J. van, Jacobson K. A. Molecular modeling of adenosine receptors. The ligand binding site on the rat adenosine A2A receptor // Eur. J. Pharmacol. 1994. Vol. 268, № 3. P. 95–104.

14. Jiang Q., Rhee A. M. van, Kim J., Yehle S., Wess J., Jacobson K. A. Hydrophilic side chains in the third and seventh transmembrane helical domains of human A2A adenosine receptors are required for ligand recognition // Mol. Pharmacol. 1996. Vol. 50, № 3. P. 512–521.

Материал поступил в редколлегию 05.10.2009

K. V. Goremykin, I. V. Ivlev, Yu. A. Koroleva, S. V. Ryzhov, B. V. Shilov, V. Yu. Serebrov, A. E. Sazonov

In Silico Study of Interactions Between A2B Adenosine Receptors and Its Ligands

Adenosine receptor A2B is a weakly studied target for bronchial asthma, chronic obstructive pulmonary disease therapy. For a structure-based design project, the three-dimensional information of the designated target is needed. Unfortunately, experimental structure data for A2B adenosine receptor and is not yet available. Homology building (program Modeller) was used to generate three-dimensional structure data using structure information of a homologous protein – A2A adenosine receptor. Then, three-dimensional structures of adenosine receptor ligands (9 activators and 15 inhibitors) were created using program ChemSketch. Activators and inhibitors were then docked into the active site of A2B adenosine receptor using the program AutoDock 4.0. Our results show several amino acids plays the most critical role in the binding of most activators and inhibitors.

Keywords: adenosine receptor A2B, homology modelling, ligand-receptor interactions.