АВТОРЕФЕРАТ - amazon web services · 4 гуморального иммунитета, а...

На правах рукописи

ХРОМОВА Екатерина Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

ДЕЙСТВИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА НА ЭФФЕКТОРЫ

ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА – 2019

2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном

учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

им. И.И. Мечникова»

Научные руководители:

Костинов Михаил Петрович, доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ,

Ахматова Нэлли Кимовна, доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Зорина Вероника Николаевна, доктор биологических наук, Федеральное

государственное унитарное предприятие «Государственный научно-

исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального

медико-биологического агентства России, советник директора,

Мешкова Раиса Яковлевна, доктор медицинских наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Смоленский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

заведующая кафедрой клинической иммунологии и аллергологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева»

Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «25» апреля 2019 г. в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБНУ НИИВС им. И.И.

Мечникова по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ НИИВС

им. И.И. Мечникова www.instmech.ru.

Автореферат разослан «_____» _______ 2019 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Яковлева Ирина Владимировна

http://www.instmech.ru/

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По данным ВОЗ ежегодно гриппом болеют до 15% населения во всем

мире и от 250 000 до 500 000 человек умирают от гриппа и его осложнений

[WHO, 2018]. Течение и исход гриппозной инфекции особенно неблагоприятен

в группах риска: у детей раннего возраста, пожилых людей, лиц с

хроническими заболеваниями и беременных [Тарбаева Д.А. и др., 2012;

Галицкая М.Г., Бокучава Е.Г., 2014; Зверев В.В. и др., 2015; Костинов М.П. и

др., 2015; Grohkopf L.A. et al., 2014].

Наиболее эффективным средством профилактики гриппа и, как

следствие, снижения количества и тяжести осложнений после гриппа является

вакцинация [Чебыкина, А.В. и др., 2010; Некрасов А.В. и др., 2011]. В

настоящее время для профилактики гриппа чаще используют

инактивированные сплит- и субъединичные вакцины как наиболее безопасные

и способствующие образованию защитного уровня штаммоспецифических

вируснейтрализующих антител к глобулярному домену белка гемагглютинина

и белку нейраминидазе актуальных серотипов вируса гриппа [Костинов М.П.,

Лавров В.Ф., 2010; Зверев В.В., Хаитов Р.М., 2014; Федеральное руководство

по использованию лекарственных средств, 2016, 2017].

В последнее десятилетие в мире идет поиск усовершенствования

технологий производства конъюгированных вакцин и новых адъювантов с

целью усиления интенсивности синтеза специфических антител в короткие

сроки после введения препарата, что стало особенно актуально на пороге

пандемии гриппа (2009-2010 гг.) [Зверев, В.В. и др., 2010, 2011; Теркачёва О.А.

и др., 2012; Черданцев А.П. и др., 2012].

Как показывают исследования, адъюванты в зависимости от их свойств,

усиливают действие антигена, стимулируя гуморальный или клеточный

иммунитет, или одновременно оба вида иммунитета [Авдеева Ж.И. и др., 2015].

В настоящее время, в соответствии с требованиями Европейского комитета к

противогриппозным вакцинам, их иммуногенность оценивается по показателям

4

гуморального иммунитета, а именно, по нарастанию титров антител к штаммам

вируса гриппа [CPMP/BWP/214/96]. Однако для оценки эффективности

адъювантных вакцин важным является изучение не только гуморальных, но и

клеточных механизмов иммунного ответа, играющих ключевую роль в

развитии адаптивного иммунитета с формированием иммунологической памяти

и резистентности к инфекции [Kostinov M.P., 2017].

В Российской Федерации, в отличие от зарубежных адъювантных вакцин

против гриппа, разработанных в 2009-2010 гг., более 20 лет применяется

полимер-субъединичная вакцина против гриппа, которая в качестве адъюванта

содержит иммуномодулятор Азоксимера бромид. В основе его механизма

действия лежит активация фагоцитирующих клеток, естественных киллеров, Т-

и В- клеточного взаимодействия и стимуляция антителообразования

[Афиногенова В.П. и др., 2010; Аллергология и иммунология, 2014;

Иммуномодуляторы и вакцинация, 2013]. Несмотря на имеющееся множество

исследований, подтверждающих безопасность и иммуногенность данной

вакцины среди здоровых и лиц с различными отклонениями в состоянии

здоровья, особенности развития поствакцинального иммунного ответа остаются

малоизученными [Респираторная медицина, 2017; Руководство по клинической

иммунологии в респираторной медицине, 2018]. Также в сравнительном

аспекте недостаточно исследованы механизмы влияния вакцин против гриппа

на формирование врожденного и адаптивного иммунитета.

Цель исследования

Изучение влияния полимер-субъединичной (иммуноадъювантной) и

безадъювантных вакцин против гриппа на эффекторы врожденного и

адаптивного иммунитета у здоровых лиц.

Задачи исследования

1. Оценить изменение субпопуляционной структуры лимфоцитов у

здоровых лиц под воздействием иммуноадъювантной и безадъювантных вакцин

в системе in vitro с учетом исходного уровня сывороточных антител к штаммам

вируса гриппа.

5

2. Изучить содержание гранулоцитов, экспрессирующих TLRs, у здоровых

лиц при стимуляции крови иммуноадъювантной и безадъювантными вакцинами

против гриппа в системе in vitro с учетом исходного уровня сывороточных

антител к штаммам вируса гриппа.

3. Исследовать индуцированный вакцинами против гриппа цитокиновый

профиль (Th1/Th2/Th17/Th9/Th22) супернатантов мононуклеарных лейкоцитов

периферической крови (МЛПК) у здоровых добровольцев.

4. Выявить субпопуляции дендритных клеток в крови у лиц,

иммунизированных иммуноадъювантой и безадъювантными вакцинами против

гриппа.

5. Оценить эффективность формирования клеток памяти при использовании

CD45RO-теста у лиц, иммунизированных различными вакцинами против гриппа.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное иммунологическое исследование

действия современных вакцин против гриппа (иммуноадъювантной и

безадъювантных) на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета.

Установлено, что все исследуемые вакцины против гриппа, кроме

индукции гуморального иммунного ответа, активируют клеточный иммунитет,

увеличивая количество NK-клеток (CD16/56), NKT-лимфоцитов

(CD3/CD16/56), B-лимфоцитов (CD45/CD20), активированных (CD3/HLA-DR)

и цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-лимфоцитов, а также клеток с маркером

ранней активации (CD45/CD25). Среди исследованных вакцин наибольшим

потенциалом в индукции клеточного ответа обладает иммуноадъювантная

вакцина, стимулирующая нарастание численности NK (CD16/56), NKT-клеток

(CD3/CD16/56), B-лимфоцитов (CD45/CD20), активированных (CD3/HLA-DR)

и цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-лимфоцитов, T-регуляторных клеток (T-

regs, CD4/CD25/Foxp3).

У лиц с исходно низкими титрами антител все типы вакцин почти в

одинаковой мере стимулируют эффекторы клеточного иммунитета, тогда как у

6

лиц со средними и высокими титрами антител к штаммам вируса гриппа

иммуноадъювантная вакцина обладает более выраженным эффектом.

Показано, что вакцины против гриппа индуцируют численность не только

клеток с эндосомальными, но и поверхностными Толл-подобными рецепторами

(TLRs). При этом субъединичная вакцина в большей степени оказывает

стимулирующее влияние на гранулоцитарные клетки с экспрессией TLR-4 по

сравнению с контролем (нестимулированные лейкоциты) и сплит-вакциной.

Сплит-вакцина, в отличие от субъединичной вакцины, индуцирует численность

TLR-3 и TLR-9-позитивных клеток. Иммуноадъювантная вакцина увеличивает

субпопуляции TLR-9- и TLR-8-экспрессирующих гранулоцитов по сравнению с

субъединичной и сплит- вакцинами.

Выявлено, что при исходно низких титрах антител к вирусу гриппа в

сыворотке добровольцев, все исследуемые вакцины практически в одинаковой

мере индуцируют нарастание численности TLR-экспрессирующих клеток в

культуре МЛПК, при этом сплит-вакцина активирует больший диапазон клеток

с Толл-подобными рецепторами.

Под воздействием иммуноадъювантной вакцины у лиц со средними и

высокими титрами антител к штаммам вируса гриппа отмечено более

выраженное повышение количества клеток с эндосомальными рецепторами.

Использование безадъювантных вакцин стимулирует нарастание

численности миелоидных (mDCs) и плазмоцитоидных (pDCs) дендритных

клеток в крови вакцинированных лиц только на 7-е сутки с реверсированием до

исходного уровня через месяц, тогда как иммуноадъювантная вакцина

увеличивает их количество как на 7-е, так и на 30-е сутки.

Все исследованные вакцины против гриппа вызывают увеличение

содержания в культуральной жидкости мононуклеарных лейкоцитов

Th1/Th2/Th17/Th9/Th22 цитокинов, что свидетельствует об активации как

гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета. Иммуноадъювантная

вакцина в большей степени индуцирует синтез Th1 цитокинов (IL-12, INF-g, IL-

7

2, IL-6, IL-1β, TNF-α), IL-9 и IL-22, субъединичная вакцина – IL-4, а сплит-

вакцина – IL-5.

Впервые проведено исследование формирования иммунологической

памяти у лиц, вакцинированных против гриппа. Показано, что через 12 мес.

после введения иммуноадъювантной и сплит- вакцин у добровольцев

индуцируются CD45RO+ клетки.

Практическая значимость. Результаты исследования могут служить

дополнительным критерием оценки иммунологической эффективности

существующих и разрабатываемых вакцин против гриппа и других

иммунобиологических препаратов, в особенности содержащих адъюванты, а

также при изучении их механизмов действия на систему иммунитета.

Полученные данные по оценке эффективности вакцин разного типа в

зависимости от исходных титров антител к штаммам вируса гриппа могут быть

применены на практике при выборе оптимального вакцинного препарата для

сезонной вакцинации против гриппа. При совпадении штаммового состава

противогриппозных вакцин настоящего и предыдущего сезонов или при

повторной вакцинации целесообразно применять полимер-субъединичную

(иммуноадъювантную) вакцину.

Реализация результатов исследования. Материалы диссертации

используются в цикле лекций кафедры эпидемиологии Первого МГМУ им.

И.М. Сеченова.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации

доложены и обсуждены на: XXIII Российском национальном конгрессе

«Человек и лекарство» (Москва, 2016); Конференции молодых ученых и

специалистов «Биология, эпидемиология и вакцинопрофилактика

инфекционных заболеваний» (Москва, 2016); Первом калининградском

научном форуме (Калининград, 2016); IX Ежегодном Всероссийском Конгрессе

по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 2017);

Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы

эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики инфекционных и

8

онкологических заболеваний» (Москва, 2017, 2018); XVIII съезде педиатров

России с международным участием (Москва, 2017); XVI Всероссийском

научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе

«Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2017).

Апробация диссертации состоялась 18 сентября 2018 г. на совместной

научной конференции отделов аллергологии и иммунологии ФГБНУ НИИВС

им. И.И. Мечникова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ: 11

статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 4 – в главах

книг, в том числе 1 иностранной.

Структура и объём работы. Материал диссертации изложен на 127

страницах, проиллюстрирован 9 таблицами и 12 рисунками. Диссертация

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов

исследования, 4 глав, содержащих результаты собственных исследований,

заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной

литературы, содержащего 267 источников (их них – 78 отечественных и 189

зарубежных авторов).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Субъединичная, полимер-субъединичная, сплит- вакцины против гриппа

активируют клеточные механизмы врожденного и адаптивного иммунитета:

индуцируют численность NK-клеток (CD16/56), NKT-лимфоцитов

(CD3/CD16/56), B-клеток (CD45/CD20), активированных (CD3/HLA-DR) и

цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-лимфоцитов, клеток с маркером ранней

активации (CD45/CD25), гранулоцитов с эндосомальными и поверхностными

Толл-подобными рецепторами, дендритных клеток миелоидного и лимфоидного

происхождения, стимулируют продукцию Th1/Th2/Th17/Th9/Th22 цитокинов

мононуклеарными лейкоцитами. Наибольшим потенциалом в индукции

клеточного ответа обладает иммуноадъювантная вакцина. Сплит- и

иммуноадъювантная вакцины в большей степени стимулируют

противовирусный иммунитет в сравнении с субъединичной вакциной.

9

2. Определение титров антител к штаммам вируса гриппа может служить

прогностическим критерием активации клеток-эффекторов иммунитета под

воздействием вакцин против гриппа разного типа. Установлены различия в

механизмах активации клеточного иммунитета в зависимости от исходного

уровня антител и использования вакцинных препаратов.

При низких титрах антител все исследуемые вакцины активируют

клеточные эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета, в том числе

гранулоциты, экспрессирующие TLRs. Под воздействием сплит-вакцины

активируется более широкий спектр TLRs.

При средних и высоких титрах антител к вирусу гриппа

иммуноадъювантная вакцина обладает большим потенциалом в активации

различных типов клеток, в том числе гранулоцитов с эндосомальной

экспрессией TLRs.

3. При введении добровольцам сплит- и полимер-субъединичной вакцин

происходит стимуляция СD45RO+ клеток, что может свидетельствовать о

формировании адаптивного иммунитета с образованием клеток

иммунологической памяти.

С О Д Е Р Ж А Н И Е Р А Б О Т Ы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 67 здоровых женщин 18-40 лет без

сопутствующей патологии (никогда не были вакцинированы против гриппа и

не болели в течение последних 6 месяцев гриппом): у 27 чел. кровь

инкубировали с вакцинами против гриппа; 30 женщин иммунизировали

разными типами противогриппозных вакцин; 10 чел. составили группу

контроля. Исследовали кровь до, через 7, 30 дней и 12 месяцев после

вакцинации.

Исследуемые вакцины: Инфлювак (“Abbott biologicals” B.V.,

Нидерланды) – вакцина гриппозная субъединичная инактивированная;

Ваксигрип (“Sanofi Pasteur”, Франция) – инактивированная сплит-вакцина для

10

профилактики гриппа; Гриппол плюс (ООО “НПО Петровакс Фарм”, Россия) –

вакцина гриппозная тривалентная инактивированная полимер-субъединичная,

содержащая иммуноадъювант Полиоксидоний (Азоксимера бромид). Все

вакцины содержали актуальные штаммы вируса гриппа эпидсезонов 2015-

2016гг. или 2016-2017гг.

Оценку иммунофенотипа лейкоцитов, уровня цитокинов в супернатантах

мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК), определение

субпопуляций дендритных клеток (ДК) в крови вакцинированных проводили

методом проточной цитометрии. МЛПК были выделены из цельной крови в

градиенте плотности фиколл-урографина. 106 клеток в 1 мл полной среды

RPMI-1640 с Hepes (ПанЭко, Россия) инкубировали с 10 мкл соответствующей

вакцины в течение 72 часов.

Исходный уровень сывороточных антител к штаммам вируса гриппа А и

В изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Формирование иммунологической памяти к антигенам вируса гриппа у

иммунизированных изучали по экспрессии маркера CD45RO. Изменение

экспрессии рецепторов рассчитывали в процентах по формуле: MFI=MFIт-

MFIк/MFIк (MFIт – среднее значение интенсивности флуоресценции

испытуемого образца; MFIк – среднее значение интенсивности флуоресценции

отрицательного контроля). Значимым, свидетельствующим о наличии клеток

памяти, является значение коэффициента активации 0,2 и выше [Васнева Ж.П.,

2006; Патент РФ на изобретение №2544168 от 04.02.2015].

Методы статистической обработки. Статистический анализ материалов

был проведен с использованием пакета прикладных программ «Statistica for

Windows», ver. 7.0 (Stat Soft, Inc). Для определения статистической значимости

различий количественных признаков при межгрупповом сравнении применяли

U критерий Манна-Уитни. Сравнение показателей в динамике проводили с

использованием непараметрических критериев Вилкоксона. Во всех

процедурах статистического анализа уровень значимости р принимался равным

<0,05. Для выявления различий процента клеток между экспериментальными

11

группами применялся робастный дисперсионный анализ повторных измерений

(программа R, пакет WRS2, функция rmanova) с проведением последующих

попарных сравнений (программа R, пакет WRS2, функция rmmcp), коррекцию

достигнутого уровня значимости осуществляли методом Холма [Mair P., Wilcox

R., 2016]. Коррекцию на множественные сравнения (контроль false discovery

rate) проводили методом Беньямини-Хохберга [McDonald John H., 2009].

Описание данных проводили с помощью медианы и интерквартильного

размаха.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние вакцин против гриппа на субпопуляционную структуру

лимфоцитов периферической крови здоровых доноров в системе in vitro

Вакцины против гриппа оказывали активирующее влияние на эффекторы

клеточного иммунитета (табл. 1), увеличивая численность NK-клеток

(CD16/56), NKT-лимфоцитов (CD3/CD16/56), B-клеток (CD45/CD20),

активированных (CD3/HLA-DR) и цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-

лимфоцитов, а также клеток с маркером ранней активации (CD45/CD25). Более

выраженную способность в индукции клеточного ответа проявила

иммуноадъювантная вакцина, увеличивающая количество NK (CD16/56), NKT-

клеток (CD3/CD16/56), B-лимфоцитов (CD45/CD20), активированных

(CD3/HLA-DR) и цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-лимфоцитов, T-

регуляторных клеток (T-regs) (CD4/CD25/Foxp3). Таким образом, под

воздействием иммуноадъювантной вакцины происходит более значительная

стимуляция эффекторов клеточного иммунитета с вовлечением в иммунный

процесс T-регуляторных клеток.

Добровольцы были разделены на 3 группы, в зависимости от исходного

значения титров антител (АТ) к гемагглютинину вируса гриппа A/H1N1, A/H3N2

и В. Первая группа − низкий уровень АТ (титр 1:20-1:40), вторая группа −

средний уровень АТ (1:80-1:160), третья группа − высокий уровень АТ(≥1:320).

12

Таблица 1. Субпопуляционная структура лимфоцитов периферической крови добровольцев при инкубации клеток с

вакцинами против гриппа

Субпопуляции лимфоцитов N Содержание клеток в группах сравнения, % Me(LQ-UQ)

Frb

p q Контроль Субъединич. Иммуноадъюв. Сплит-

Т-Лимфоциты (CD45/СD3+) 18 79,85

(74,17-83,35)

71,25*

(64,7-79,75)

74,6

(66,38-79,17)

73,91

(66,92-78,22) 8,00 <0,001 0,001

Т-Хелперы (CD45/CD3/СD4+) 21 43,5

(41-49,8)

37,5

(32,7-43,8)

40,2

(31,8-46,5)

41,9

(35,6-47,7) 2,50 0,071 0,107

Цитотоксические Т-лимфоциты,

CTL (CD45/CD3/СD8+) 21

23,5

(17,3-24,7)

21,2

(17,4-23,6)

22,5

(16,9-26,9)

21,5

(18,4-25,8) 0,64 0,533 0,601

Естественные киллеры,

NK-клетки (CD16/56+) 24

4,85

(4,175-5,9)

13,2*

(11,15-14,85)

17,25*#×

(15,93-18,25)

15*#

(13,8-16,25) 180,28 <0,001 <0,001

Естественные киллерные Т-лимфоциты

NKT (CD3/CD16/56+) 24

1,6

(1,3-2,25)

3,6*

(2,775-5,825)

7,5*#×

(6,675-8,225)

5*#

(4,625-6,75) 57,52 <0,001 0,00001

В-клетки (CD45/CD20+) 24 5,15

(4,475-6,725)

16,36*

(15,47-17,7)

21,15*#×

(18,93-22,9)

18,1*

(15,88-19,62) 167,44 <0,001 <0,001

Активир. цитотоксические Т-клетки,

CTL (CD8/HLA-DR+) 20

0,4

(0,275-0,5)

0,7

(0,3-1,2)

1,6*#

(1,2-2,4)

1,35*#

(0,4875-1,975) 13,36 <0,001 <0,001

Активированные Т-лимфоциты

(CD3/HLA-DR+) 12

1,05

(0,65-1,65)

2,7*

(1,875-3,375)

4,95*#×

(3,775-7,1)

2,6*

(1,9-3,575) 8,92 <0,001 0,002

Активир. лимфоциты (CD45/CD25+) 16 1,45

(1-1,775)

3,7*

(2,6-4,85)

4,15*

(3,2-9,075)

4,15*

(3,075-5,275) 12,94 <0,001 0,001

Т-регуляторные клетки, T-regs

(CD4/CD25/Foxp3+) 13

2,7

(1,7-2,9)

3,5

(3,2-4,9)

3,7*

(3,2-5,5)

4,2

(2,2-4,5) 4,27 0,017 0,032

ИРИ (CD4/CD8) 20 1,825

(1,5-3,275)

1,85

(1,45-2,325)

1,85

(1,4-2,5)

1,65

(1,475-2,525) 1,26 0,300 0,389

Примечание. Me – медиана значений, LQ-UQ – нижний и верхний квартили. Frb

– значение критерия Фишера, полученное в результате

робастного дисперсионного анализа повторных измерений. q – скорректированный на множественный сравнения уровень статистической

значимости, проводился методом Беньямини-Хохберга. N – объем выборки. * изменение показателей по сравнению с группой контроля, #

изменения показателей по сравнению с группой субъединичной вакцины, × изменения показателей по сравнению с группой сплит-вакцины.

13

При сопоставлении степени активации клеточных субпопуляций в

зависимости от типа вакцин при исходно известных уровнях титров антител к

штаммам вируса гриппа были получены следующие результаты: у лиц с исходно

низкими титрами АТ к HA вируса гриппа все исследуемые вакцины оказывали

стимулирующее влияние на численность NK (CD16/56), NKT (CD3/CD16/56), В-

клеток (CD45/CD20), лимфоцитов с маркером ранней (CD45/CD25) и поздней

(CD3/HLA-DR) активации (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительный анализ влияния вакцин против гриппа на

субпопуляционную структуру лимфоцитов у лиц с низкими титрами АТ к

вирусу гриппа

Титр

АТ Тип клеток

Вакцины

Субъедин. Иммуноадъюв. Сплит-

Ни

зки

й

(1:2

0-:

40

)

NK (CD16/56+) ↑(К) ↑ (К, Субъедин.) ↑(К)

NKT (СD3/CD16/56+) ↑(К) ↑(К) ↑(К)

В-лимф. (CD45/CD20+) ↑(К) ↑(К) ↑(К)

Активир. Т- лимфоциты

(CD3/HLA-DR+) − ↑(К) −

Лимфоциты ранней

активации (CD45/CD25+) ↑(К) − −

Примечание: р<0,05 - достоверность различий между группами (Тест Манна-Уитни).

Стрелки указывают на повышение показателей по сравнению с исследуемыми группами.

К – контроль. «–» p>0,05.

При наличии исходно средних титров АТ была выявлена более высокая

активность иммуноадъювантной вакцины, которая статистически значимо

увеличивала численность NK (CD16/56), NKT-клеток (CD3/CD16/56), В-

лимфоцитов (CD45/CD20), активированных цитотоксических Т-лимфоцитов

(CD8/HLA-DR) и, в отличие от других исследуемых вакцин, не индуцировала

снижение численности Т-лимфоцитов (CD45/СD3) (табл. 3).

При наличии высоких титров АТ наиболее выраженную активность

проявляла иммуноадъювантная вакцина, увеличивая численность NK

(CD16/56), NKT-клеток (CD3/CD16/56), В-лимфоцитов (CD45/CD20), Т-

лимфоцитов с маркером поздней активации (CD3/HLA-DR), лимфоцитов с

14

маркером ранней активации (CD45/CD25) и T-регуляторных клеток (CD4/CD25/

Foxp3) (табл. 4).


субпопуляционную структуру лимфоцитов у лиц со средними титрами АТ к


Титр


Вакцины


Ср

едн

ий

(1:8

0-1

:160

)

Т-лимфоциты (CD45/СD3+) ↓ (К) − ↓(K)

NK (CD16/56+) ↑ (К)

↑ (К,

Субъедин.,

Сплит-)

↑ (К,

Субъедин.)

NKT (СD3/CD16/56+) − ↑ (К,

Субъедин.)

↑ (К,

Субъедин.)

В-лимфоциты

(CD45/CD20+) ↑ (К)

↑ (К,

Субъедин.,

Сплит-)

↑ (К)

Активир. цитотоксические

Т-клетки (CD8/HLA-DR+) −

↑ (К,

Субъедин.) −


активации (CD45/CD25+) ↑ (К) − −

Примечание: как в таблице 2.


субпопуляционную структуру лимфоцитов у лиц с высокими титрами АТ к


Титр


Вакцины


Вы

сок

ий

(1:3

20

и >

)

NK (CD16/56+) ↑ (К) ↑ (К) ↑ (К)

NKT (СD3/CD16/56+) − ↑ (К)

В-лимф. (CD45/CD20+) ↑ (К) ↑ (К, Сплит-) ↑ (К)

Активир. Т- лимфоциты

(CD3/HLA-DR+) − ↑(Сплит-) −


активации (CD45/CD25+) − ↑ (К) −

Т-regs

(CD4/CD25/ Foxp3+) − ↑ (К) −


Полученные данные могут свидетельствовать о том, что уровень антител

может оказывать опосредованное влияние на клеточное звено иммунного

ответа. Оценка уровня антител до вакцинации против гриппа может явиться

15

инструментом, позволяющим оптимизировать индивидуальный подход к

выбору вакцин.

2. Влияние вакцин против гриппа на содержание TLRs-

экспрессирующих клеток у добровольцев in vitro

Под воздействием противогриппозных вакцин активировались клетки,

экспрессирующие не только эндосомальные, но и поверхностные TLRs (рис. 1).

Рис. 1. Содержание TLRs-экспрессирующих гранулоцитов у

добровольцев (индивидуальные значения и групповые медианы, %) при

культивировании МЛПК с вакцинами против гриппа. Достоверность различий: ***

p<0,001, ** p<0,01, * p<0,05. К - контроль, Суб. - вакцина гриппозная субъединичная

инактивированная, Имм. - вакцина гриппозная тривалентная инактивированная полимер-

субъединичная, Сплит- инактивированная сплит-вакцина для профилактики гриппа.

16

Субъединичная вакцина оказывала стимулирующее влияние на

экспрессию гранулоцитарных клеток, экспонирующих TLR-4, по сравнению с

контрольной группой и сплит-вакциной. Сплит-вакцина в большей степени, по

сравнению с субъединичной вакциной, индуцировала численность TLR-3 и

TLR-9-позитивных клеток. Но в то же время эти обе вакцины приблизительно в

одинаковой мере воздействовали на пролиферацию TLR-8-гранулоцитов. При

этом иммуноадъювантная вакцина обладала большим потенциалом в

стимуляции количества TLR-9- и TLR-8-экспрессирующих клеток по

сравнению с субъединичной и сплит- вакцинами.

То есть, результаты анализов показывают, что сплит- и

иммуноадъювантная вакцины в большей степени стимулируют клетки,

отвечающие за противовирусный иммунитет.

При сопоставлении влияния противогриппозных вакцин разного типа на

нарастание численности TLRs-экспрессирующих клеток в зависимости от

уровней антител к штаммам вируса гриппа были получены следующие

результаты: под воздействием сплит-вакцины у лиц с низкими титрами антител

в культуре МЛПК индуцировалось большее количество клеток,

экспонирующих мембранные и эндосомальные рецепторы (табл. 5).


содержание TLRs-экспрессирующих клеток у лиц с низкими титрами АТ к


Титр АТ TLRs

Вакцины


Мембранные

Ни

зки

й

(1:2

0-1

:40)

2 ↑(К) ↑ (К) ↑(К)

6 ↑(К) ↑(К) ↑(К)

Эндосомальные

3 − − ↑(К)

9 − − ↑(К)

8 ↑(К) ↑(К) ↑(К)

Примечание: р<0,05 - достоверность различий между группами (Тест Манна-Уитни).

Стрелки указывают на повышение показателей по сравнению с исследуемыми группами.

К – контроль. «–» p>0,05.

17

У лиц со средними титрами антител добавление в культуру клеток

(МЛПК) всех вакцин против гриппа индуцировало повышение содержания

TLR-позитивных гранулоцитов, субъединичная вакцина в большей степени

активировала клетки с мембранными рецепторами, а иммуноадъювантная более

выраженно стимулировала дифференцировку клеток с эндосомальными

рецепторами (табл. 6).


содержание TLRs-экспрессирующих клеток у лиц со средними титрами АТ к


Титр АТ TLRs

Вакцины



Ср

едн

ий

(1:8

0-1

:160

)

2 ↑(К) ↑ (К) ↑(К)

4 ↑(К, Сплит-) − −

6 ↑(К) ↑(К) ↑(К)


9 ↑(К) ↑ (К) ↑(К)

8 ↑(К) ↑(К, Субъедин., Сплит-) ↑(К)


У лиц с высокими титрами антител к вирусу гриппа было выявлено

существенное нарастание численности TLR-позитивных клеток с мембранными

и эндосомальными рецепторами под воздействием сплит-вакцины по

сравнению с контрольной группой (табл. 7).


содержание TLRs-экспрессирующих клеток у лиц с высокими титрами АТ к


Титр АТ TLRs

Вакцины



Вы

сок

ий

(1:3

20

и >

)

2 ↑(К) ↑ (К) ↑(К)

6 − − ↑(К)


3 − − ↑(К)

9 ↑(К) ↑(К) ↑(К)

8 ↑(К) ↑(К, Субъедин., Сплит-) ↑(К) Примечание: как в таблице 5.

18

Но следует отметить, что иммуноадъювантная вакцина по сравнению с

другими вакцинами лучше индуцировала нарастание численности TLR8-

экспрессирующих клеток.

Таким образом, иммуноадъювантная вакцина при исходно средних и

высоких титрах антител к штаммам вируса гриппа обладала большей

активностью по сравнению со сплит- и субъединичной вакцинами в отношении

дифференцировки клеток с эндосомальными рецепторами, которые отвечают за

распознавание вирусных агентов.

3. Индуцированный вакцинами против гриппа цитокиновый профиль

(Th1/Th2/Th17/Th9/Th22) лейкоцитов у здоровых женщин

Все исследуемые вакцины против гриппа, в той или иной степени, вызывали

увеличение содержания в культуральной жидкости МЛПК всех Th-1

цитокинов, что может свидетельствовать об активации клеточного иммунного

ответа. При этом активность иммуноадъювантной вакцины была

максимальной, субъединичной – минимальной, соответственно, сплит-вакцина

занимала промежуточное положение (рис. 2).

Рис. 2. Уровень Th-1 цитокинов в культуре МЛПК под воздействием

вакцин против гриппа. Достоверность различий: * - p<0,001; ** - p<0,05 (Kruskal-Wallis

test).

Все исследуемые вакцины способствовали повышению уровня всех Th-2

цитокинов в супернатантах лейкоцитов, что свидетельствует об активации

19

гуморального звена иммунитета. Наибольшей активностью в отношении

стимуляции IL-4 обладала субъединичная вакцина. На продукцию IL-5 более

выраженное действие оказывала сплит-вакцина (рис. 3).

Рис. 3. Уровень Th-2 цитокинов в культуре МЛПК под воздействием

вакцин против гриппа. Достоверность различий: * - p<0,001 (Kruskal-Wallis test).

Все вакцины вызывали увеличение содержания IL-17А, IL-9, IL-22

цитокинов в культуральной жидкости МЛПК (рис. 4).

Рис. 4. Уровень Th17/Th9/Th22 цитокинов в культуре МЛПК под

воздействием вакцин против гриппа. Достоверность различий: * - p<0,001; ** - p<0,05

(Kruskal-Wallis test).

20

Иммуноадъювантная вакцина обладала более выраженным потенциалом

в отношении активации IL-9 и IL-22 по сравнению с субъедничной и сплит-

вакцинами. Известно, что IL-9 усиливает супрессорную функцию

Foxp3+CD4+T-regs in vitro, а отсутствие IL-9-сигнализации понижает

подавляющую активность T-regs in vivo, что приводит к увеличению

эффекторных клеток, в то время как IL-22 отвечает за усиление врожденного

иммунитета, защиту от повреждений, а также повышение регенерации

[Хайдуков С.В., 2013].

Таким образом, повышение уровней IL-9 и IL-22 может

свидетельствовать об усилении регуляторных функций клеток в иммунном

ответе и активации врожденных механизмов иммунной системы.

4. Сравнительный анализ уровней плазмоцитоидных и миелоидных

дендритных клеток у здоровых женщин, вакцинированных

иммуноадъювантной и безадъювантными вакцинами

Использование безадъювантных вакцин приводило к повышению

численности mDCs и pDCs (p<0,05) в крови вакцинированных только на 7-ые

сутки наблюдения (рис. 5).

Рис. 5. Влияние вакцин против гриппа на динамику содержания

дендритных клеток в крови у здоровых лиц. Данные представлены как M±SD (%).

pDC - СD14+ CD16- / CD85k(ILT3)/ CD123; mDC - СD14+ CD16- / CD85k(ILT3)/ CD33.

21

Через месяц эти показатели уже не отличались от исходных уровней.

Иммуноадъювантная вакцина приводила к более существенному (в 2,2-3,6 раз,

p<0,05) увеличению субпопуляций DC (по сравнению с безадъювантными

вакцинами), как на 7-ые сутки, так и через месяц после вакцинации.

Иммунизация вакцинами против гриппа активирует врожденные

эффекторы – первое звено на пути проникновения инфекции – дендритные

клетки, как миелоидного, так и лимфоидного происхождения. При этом более

выраженный и продолжительный эффект такой активации наблюдается при

использовании иммуноадъювантной вакцины по сравнению с субъединичной и

сплит- вакцинами.

5. Оценка формирования клеток памяти у добровольцев через 12 мес.

после иммунизации противогриппозными вакцинами

В качестве маркера степени и валентности специфической активации

использовали отношение стимулированной и спонтанной интенсивности

флюоресценции (ИФ) (индекс стимуляции) меченых FITC CD45RO+ -

лейкоцитов.

Через 12 месяцев в группе вакцинированных субъединичной вакциной

коэффициент активации CD45RO-клеток при инкубации с разными вакцинами

был ниже порога значимости, что свидетельствует о недостаточном

формировании клеток памяти у данных лиц (рис. 6).

Рис. 6. Формирование иммунологической памяти к антигенам вируса

гриппа, входящих в состав разных вакцин, у вакцинированных через 12 мес.

22

Показатели в группе лиц, иммунизированных сплит-вакциной,

преодолевали порог значимости при инкубации лимфоцитов в присутствии

сплит- и иммуноадъювантной вакцин. Наиболее высокие показатели были

отмечены у лиц, вакцинированных иммуноадъювантной вакциной при

инкубации клеток со всеми вакцинами. Самый высокий показатель отмечен в

группе лиц, вакцинированных иммуноадъювантной вакциной при инкубации

лимфоцитов в присутствии одноименной вакцины.

Наши исследования продемонстрировали, что вакцинация лиц против

гриппа с использованием сплит- и иммуноадъювантной вакцин приводит к

формированию клеток иммунологической памяти (CD45RO+), которые

характеризуются способностью к длительному существованию.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что субъединичная, полимер-субъединичная и сплит-

вакцины против гриппа, кроме индукции гуморального иммунного ответа,

активируют клеточный иммунитет. Иммуноадъювантная вакцина обладает

большим потенциалом в стимуляции численности NK (CD16/56), NKT-клеток

(CD3/CD16/56), B-клеток (CD45/CD20), активированных (CD3/HLA-DR) и

цитотоксических (CD8/HLA-DR) Т-лимфоцитов, T-regs (CD4/CD25/Foxp3) по

сравнению с исследованными вакцинами.

2. Показана равнозначная стимуляция эффекторов клеточного иммунитета у

лиц с исходно низкими титрами антител к штаммам вируса гриппа при

использовании всех типов вакцин, и более высокая – у лиц со средними и

высокими титрами антител под воздействием иммунноадъювантной вакцины.

3. Выявлено, что вакцины против гриппа индуцируют численность клеток с

эндосомальными и поверхностными Толл-подобными рецепторами.

Субъединичная вакцина в большей степени оказывает стимулирующее влияние

на TLR4-экспрессирующие гранулоциты по сравнению со сплит-вакциной.

Сплит-вакцина в большей мере, по сравнению с субъединичной вакциной,

индуцирует численность TLR-3 и TLR-9-позитивных клеток.

23

Иммуноадьювантная вакцина обладает большим потенциалом в индукции

численности TLR-9- и TLR8-экспрессирующих клеток по сравнению с

субъединичной и сплит- вакцинами.

4. Определено, что при исходно низких титрах антител к вирусу гриппа в

сыворотке добровольцев все исследуемые вакцины практически в одинаковой

мере индуцируют нарастание численности TLR-экспрессирующих клеток в

культуре МЛПК, при этом сплит-вакцина активирует больший диапазон клеток

с Толл-подобными рецепторами. Под воздействием иммуноадъювантной

вакцины у лиц со средними и высокими титрами антител к штаммам вируса

гриппа отмечено более выраженное повышение количества клеток с

эндосомальными рецепторами.

5. Показано, что использование безадъювантных вакцин стимулирует

нарастание численности миелоидных (mDCs) и плазмоцитоидных (pDCs)

дендритных клеток в крови вакцинированных лиц только на 7 сутки

наблюдения с реверсированием до исходного уровня уже через месяц.

Иммуноадъювантная вакцина приводит к более существенному увеличению

количества антигенпрезентирующих клеток в течение месяца после

вакцинации.

6. Установлено, что все исследованные вакцины против гриппа в разной

степени вызывают увеличение содержания в культуральной жидкости МЛПК

Th1/Th2/Th17/Th9/Th22 цитокинов, что свидетельствует об активации как

гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета. Иммуноадъювантная

вакцина активнее индуцирует синтез Th1 (IL-12, INF-g, IL-2, IL-6, IL-1β, TNF-α)

цитокинов, IL-9 и IL-22; субъединичная вакцина – IL-4; сплит-вакцина – IL-5.

7. Выявлено, что иммунизация добровольцев сплит- и полимер-

субъединичной вакцинами индуцирует формирование СD45RO+ клеток

иммунологической памяти.

24

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние противогриппозных вакцин на субпопуляции дендритных

клеток крови / Хромова Е.А., Ахматова Э.А., Сходова С.А., Семочкин И.А.,

Хоменков В.Г., Ахматова Н.К., Костинов М.П. // Журнал микробиологии,

эпидемиологии и иммунобиологии. – 2016. – № 5. – С. 23-28.

2. Функциональные особенности иммунной системы при физиологическом

течении беременности и их взаимосвязь с вакцинацией против гриппа /

Костинов М.П., Хромова Е.А., Сависько А.А. // Consilium Medicum. – 2016. –

Т. 18. – № 6. – С. 59-62.

3. Сравнительная активность вакцин против гриппа: влияние на

субпопуляционную структуру лимфоцитов / Хромова Е.А., Семочкин И.А.,

Столпникова В.Н., Сходова С.А., Сорокина Е.В., Ахматова Н.К., Костинов

М.П. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2016. –

№ 6. – С. 61-65.

4. Изменение иммунофенотипа лимфоцитов под влиянием

иммуноадъювантных и безадъювантных вакцин против гриппа / Хромова

Е.А., Семочкин И.А, Ахматова Э.А., Столпникова В.Н., Сходова С.А,

Сорокина Е.В., Ахматова Н.К. Костинов М.П. // Российский

иммунологический журнал. – 2016. – Т. 10. – № 2(1) (19). – С. 503-504.

5. Вакцины против гриппа: влияние на TLRs / Хромова Е.А., Семочкин

И.А, Ахматова Э.А., Столпникова В.Н., Сходова С.А, Сорокина Е.В., Тройнич

Я.Н., Ахматова Н.К., Костинов М.П. // Российский иммунологический журнал.

– 2016. – Т. 10. – № 2(1) (19). – С. 505-507.

6. Вакцинация против вирусного гриппа беременных: неизученные

вопросы / Пахомов Д.А., Костинов М.П., Хромова Е.А., Семенова С.С. //

Пульмонология. – 2016. – Т. 26. – № 1. – С. 98-103.

7. Вакцинация беременных с хроническими заболеваниями

бронхолегочной системы / Хромова Е.А., Костинов М.П., Черданцев А.П.,

Ахматова Н.К., Шмитько А.Д., Тезиков Ю.В., Игнатьева М.А. // Руководство

по клинической иммунологии в респираторной медицине / под редакцией

М.П. Костинова, А.Г. Чучалина. – Москва, 2016. – С. 120-126

8. Предупреждение инфекционных потерь: стратегия и тактика

вакцинопрофилактики респираторных инфекций при хронических

заболеваниях / Костинов М.П., Протасов А.Д., Благовидов Д.А., Шмитько

А.Д., Тарасова А.А., Черданцев А.П., Хромова Е.А., Кажарова С.В., В.Б.

Полищук, А.А. Рыжов // Consilium Medicum. – 2016. – Т. 18. – № 3. – С. 65-69.

9. Индукция эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета в

процессe лечения топической формы рекомбинантного интерферона –a2b при

респираторных инфекциях у беременных / Костинов М.П., Лукачев И.В.,

Мещерякова А.К., Дмитриева Е.В., Ахматова Н.К., Хромова Е.А., Магаршак

О.О., Сависько А.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и

иммунобиологии. – 2017. – № 2. – С. 38-45.

25

10. Влияние вакцинации против гриппа на течение беременности, развитие

плода и новорожденных / Хромова Е.А., Ахматова Э.А., Костинова А.М.,

Черданцев А.П., Сависько А.А., Ахматова Н.К. // Акушерство и гинекология. –

2017. – № 7. – С. 12-17.

11. Активация толл-подобных рецепторов вакцинами против гриппа (in

vitro) / Хромова Е.А., Сходова С.А., Столпникова В.Н., Кукина О.М.,

Ахматова Н.К., Костинов М.П. // Медицинская иммунология. – 2017. – Т. 19. –

№ S. – С. 71-72

12. Иммуногенность иммуноадъювантной вакцины против гриппа у

беременных / Костинов М.П., Черданцев А.П., Шмитько А.Д., Праулова Д.А.,

Протасов А.Д., Дагиль Ю.А., Костинова Т.А., Ахматова Н.К., Хромова Е.А.,

Рыжов А.А., Благовидов Д.А., Полищук В.Б., Магаршак О.О., Коровкина Е.С.

// Инфекция и иммунитет. – 2017. – Т.7. – № 2. – С. 193-202.

13. Вакцинация беременных с хроническими заболеваниями бронхолегочной

системы / Черданцев А.П., Хромова Е.А., Костинов М.П., Ахматова Н.К.,

Тезиков Ю.В., Сависько А.А. // Руководство по клинической иммунологии в

респираторной медицине / под редакцией М.П. Костинова, А.Г. Чучалина. –

Москва, 2018. – С. 176-189.

14. The impact of adjuvanted and non-adjuvanted influenza vaccines on the innate

and adaptive immunity effectors / Kostinov M.P., Akhmatova N.K., Khromova

E.A., Skhodova S.A., Stolpnikova V.N., Cherdantsev A. P., Vlasenko A.E. // Book

"Influenza – Therapeutics and Challenges”. – IntechOpen, 2018. – Chapter 5. – P. 83-

109.

15. Влияние современных вакцин против гриппа на ключевые эффекторы

врожденного и адаптивного иммунитета / Хромова Е.А., Сходова С.А.,

Столпникова В.Н., Ахматова Н.К., Костинов М.П. // В кн.: Актуальные вопросы

эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики инфекционных и

онкологических заболеваний. Материалы научно-практической конференции

молодых ученых, 2018. – С. 56.

АВТОРЕФЕРАТ - amazon web services · 4 гуморального иммунитета, а...

Documents