菌根観察方法の高感度化と 最新トピックŒdab染色の開発 fitc wga am fungal cell...
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菌根観察方法の高感度化と最新トピック
平成28年度農研機構シンポジウム「菌根:リン酸肥料を減らせる根の秘密」
11月8日 帯広
小八重善裕
農研機構 北海道農業研究センター
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菌糸
根毛
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伝統的方法:トリパンブルー染色の特徴
長所• 実績が多い• 明視野観察ができる
短所• トリパンブルーが有害• 酸性溶液を使う• 高いバックグラウンド→高倍率の観察必要• 染色過程・封入剤のラクトグリセロールの操作性の悪さ
20 µm
樹枝状体
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最近の方法:蛍光標識WGAの特徴WGA: wheat germ agglutinin (コムギ胚芽凝集素)
長所• 高い特異性• 高いコントラスト• 蛍光標識WGAは無害• 酸性溶液を使わない
短所• 蛍光顕微鏡が必要• 根の自家蛍光が問題になる
20 µm
樹枝状体
長所を生かして明視野観察化
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AM菌DAB染色の開発
FITC
WGA
AM fungal cell wall (Chitin)
WGA: wheat germ agglutinin
FITC: fluorescein isothiocyanate
N-acetylglucosamine
(GlcNAc)
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AM菌DAB染色の開発
HRP
WGA
DAB
N-acetylglucosamine
(GlcNAc)
AM fungal cell wall (Chitin)
WGA: wheat germ agglutinin
HRP: horseradish peroxidase
DAB: 3,3’-Diaminobenzidine
oxidation
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トリパンブルー染色(ダイズ根)
100 µm 25 µm
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DAB染色(ダイズ根)
100 µm 25 µm
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高い組織保存性 (ダイズ根)
DAB TB
10 mm 10 mm
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共生構造の特定が容易
0
10
20
30
40
50
60
70
arbuscule vesicle hyphae unknown
Perc
en
tag
e DAB 15x
TB 15x
TB 45x
低倍率でも正確に観察できる
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様々な作物に適用できるmaize onion sunflower
potato rice
Bars=100 µm.
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土壌のAM菌の感染ポテンシャルが高いと減肥可能
↓
効率的な感染ポテンシャル評価方法の開発
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AM菌DAB染色
HRP
WGA
DAB
N-acetylglucosamine
(GlcNAc)
AM fungal cell wall (Chitin)
WGA: wheat germ agglutinin
HRP: horseradish peroxidase
DAB: 3,3’-Diaminobenzidine
oxidation
根の付着物と区別できない
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AM菌DAB染色
HRP
WGA
DAB
N-acetylglucosamine
(GlcNAc)
AM fungal cell wall (Chitin)
WGA: wheat germ agglutinin
HRP: horseradish peroxidase
DAB: 3,3’-Diaminobenzidine
oxidation
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AM菌発光検出法の開発
HRP
WGA
ECL
N-acetylglucosamine
(GlcNAc)
AM fungal cell wall (Chitin)
WGA: wheat germ agglutinin
HRP: horseradish peroxidase
ECL: Enhanced chemiluminescence
oxidation
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2 mm
0
50
100
150
200
250
0 500
Sig
nal str
ength
(a.u
.)
RM
colonization
colonization
RM
Distance (pixels)
付着物の偽シグナルを低減
DAB染色
2 mm
0
50
100
150
200
250
0 20 40 60
Sig
nal str
ength
(a.u
.)
colonization
RM
colonization
RM
Distance (pixels)
ECL発光DAB染色
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ハイスループットAM菌感染評価方法
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1
1
0.2 mm
2
極めて高感度
DAB染色ECL発光
2
非AM菌の感染には注意が必要
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0
10
20
30
40
50
1 2
Sig
nal str
ength
(a.u
.)
**
BuckwheatMaize BuckwheatMaize
ハイスループットな評価が可能
Maize: host
Buckwheat: non-host
** P < 0.01, Welch’s t test
(maize versus buchwheat).
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根には多様なAM菌が感染している
各種養分吸収
病虫害抵抗性
乾燥耐性
菌糸の形態
など
200mm
土壌10gから分離したAM菌胞子
菌ごとに異なる機能がある
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温度
水分
土壌理化学性
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
植物細胞 樹枝状体
日照
土壌生物性
核(異核共存体)
新たな価値
根
AM菌
樹枝状体
機能性
土壌
収穫物
養分シグナル
植物
外環境
植物種
品種
施肥
農薬
輪作
耕起
機械設備
収益性
栄養状態
生育ステージ
生産者
菌糸吻合(anastomosis)
菌根機能は様々な要因を受けて発揮される
どの機能がいつ・どこで・なぜ発揮されているのか
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温度
水分
土壌理化学性
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
植物細胞 樹枝状体
日照
土壌生物性
核(異核共存体)
新たな価値菌根機能マーカーの開発
根
AM菌
樹枝状体
機能性
土壌
収穫物
養分シグナル
mRNA
代謝変化
植物
外環境
植物種
品種
施肥
農薬
輪作
耕起
機械設備
収益性
栄養状態
生育ステージ
生産者
菌糸吻合(anastomosis)
圃場における具体的な機能
いつ、どこで、なぜ
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樹枝状体
ベシクル
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Staining procedure
1. Harvest roots, wash gently to remove soil, immersed in 50% EtOH for 3 h.
2. Remove EtOH, add 20 % KOH (covering the roots) and leave for 3 days at RT.
3. Remove KOH and rinse thoroughly (5x) with deionized water.
4. Rinse once with PBS, remove PBS and add 10 mL WGA-HRP solution .
5. Let at least 16h in WGA-HRP solution.
6. Remove WGA-HRP solution, rinse (3x) with PBS and add 10 mL DAB staining
solution.
7. Let at least 20 min in DAB staining solution.
8. Remove DAB staining solution, rinse once with deionized water and add 10 mL
TE to stop the HRP reaction.Yoshihiro Kobae [email protected]@gmail.com
生産現場、教育現場でもぜひ!