เอนไซม์ (enzyme)
DESCRIPTION
เอนไซม์ (Enzyme). บริษัท ไทย เซมเทค จำกัด. To protect the environment. เทคโนโลยีชีวภาพ เพื่อ รักษาสิ่งแวดล้อม. www.zymetec.com. 02-450 6038. Made in USA. ความเป็นมาของ เอนไซม์. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
เอนไซม ์(Enzyme)
To protect the environment.เทคโนโลยชีวีภาพ เพื่อรกัษาสิง่
แวดล้อมwww.zymetec.com
Made in USA.
บรษัิท ไทยเซมเทค จำ�กัด
02-450 6038
คว�มเป็นม�ของ เอนไซม์เอนไซมถ์กูนำ�ม�ใชค้รัง้แรก ในปี ค.ศ. 1878 ซึ่งมกี�รใชใ้น
ก�รเรง่ปฏิกิรยิ�ก�รหมกันำ้�ต�ลของยสีต์ พบว�่ส�ม�รถเรง่ปฏิกิรยิ�ใหเ้รว็ขึ้น
คำ�ว�่ Enzyme ม�จ�กภ�ษ�กรกี แปลว�่ In yeast
- เอนไซมเ์ป็นโปรตีนท่ีมลัีกษณะก้อนกลม ท่ีถกูสงัเคร�ะห์ขึ้นเพื่อทำ�หน้�ท่ีตัวเรง่ปฏิกิรยิ�เคมต่ี�งๆในกระบวนก�รเมต�บอลิซมึของสิง่มชีวีติ โดยมกี�รทำ�ง�นท่ีคล้�ยคลึงกันกับก�รทำ�ง�นของคะตะลิสต์
เอนไซม ์(Enzyme) เอนไซม ์คือ สารท่ีเรง่
ปฏิกิรยิาโดยทำาหน้าท่ีเป็น catalyst มคีวามจำาเพาะกับ substrate สงู โดยเอนไซม์ทำางานเรง่ปฏิกิรยิาโดยลดพลังงานกระตุ้น สว่นใหญ่เป็นสารอินทรยีก์ลุ่มโปรตีน แบง่เป็น 2 ชนิด คือ1. เอนไซมท่ี์ทำางานภายในเซลล์ (endoenzyme หรอื intracellular enzyme)2. เอนไซมท่ี์ทำางานภายนอกเซลล์ (exoenzyme หรอื extracellular enzyme)
เอนไซมป์ระกอบด้วยสว่นท่ีเป็น โปรตีน หรอื apoenzyme รวมกับสารอินทรยี ์ท่ีเรยีกวา่ coenzyme จงึเป็นเอนไซมท่ี์สมบูรณ์ หรอื holoenzyme ในบางครัง้อาจมไีอออนท่ีสำาคัญในการทำางานของเอนไซมเ์รยีกวา่ cofactor
การทำางานของเอนไซม์
ลักษณะพเิศษของเอนไซมท่ี์แตกต่�งจ�กคะตะลิสต์1 . มคีว�มจำ�เพ�ะ (selectivity) ต่อปฏิกิรยิ�และซบัส
เตรท โดยท่ีเอนไซมห์น่ึงจะทำ�ง�นได้ขึ้นอยูกั่บโครงสร�้งของซบัสเตรทท่ีจะส�ม�รถจบัได้พอเหม�ะภ�ยในรอ่ง
2. มคีว�มส�ม�รถในก�รเรง่ได้สงูม�ก โดยบอกเป็นค่�หมุนเวยีน (turnover number) ซึ่งหม�ยถึง จำ�นวนส�รตัง้ต้นท่ีทำ�ปฏิกิรยิ�เปล่ียนเป็นผลิตผลของปฏิกิรยิ�ใน 1 หน่วยเวล� เมื่อใชเ้อนไซม ์1 โมเลกลุ โดยเอนไซมต่์�งๆจะมค่ี�น้ีอยูร่ะหว�่ง 10 – 108 ต่อวนิ�ที
โครงสร�้งของเอนไซม ์เอนไซมม์ขีน�ดตัง้แต่ 12,000 ถึง กว�่ 1 ล้�นด�ลตัน
สว่นใหญ่เป็นส�รประกอบโปรตีน โครงสร�้งของเอนไซม์แบง่ได้ 2 ชนิด คือ
1 . โปรตีนธรรมด� (simple protein) เป็นโปรตีนท่ีมีกรดอะมโินเป็นองค์ประกอบอย่�งเดียว เอนไซมพ์วกน้ีมีโครงสร�้งเป็นทรงกลม
2 . โปรตีนรวมตัวกับส�รอ่ืน (conjugated protein) ประกอบด้วยกรดอะมโินรวมกับส�รอ่ืนท่ีไมใ่ชโ่ปรตีน ท่ีเรยีกว�่โคแฟกเตอร ์(cofactor) จงึจะส�ม�รถทำ�ง�นได้อย�่งสมบูรณ์ เรยีกเอนไซมก์ลุ่มนี้ว่� holoenzyme ถ้�แยกโคแฟกเตอรอ์อกจะทำ�ใหเ้อนไซมก์ลุ่มนี้จะไม่ส�ม�รถทำ�ง�นได้อย�่งสมบูรณ์เรยีกว�่ อะโพเอนไซม ์(apoenzyme)
Apoenzyme + Cofactor = Holoenzyme
Inorganic เชน่ Fe 2+ ion etc.
Organic เชน่ vitamin เรยีก coenzyme
โคแฟกเตอร ์แบง่ได้เป็น 2 พวกคือ1 . ส�รอนินทรยีห์รอืไอออนของโลหะ (metal ions) หรอื
เกลือแรม่โีครงสร�้งง่�ยๆได้แก่ Fe 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ เป็นต้น
2 . ส�รอินทรยีห์รอืโคเอนไซม ์เป็นโมเลกลุอินทรยีม์ีโครงสร�้งซบัซอ้น ท่ีมขีน�ดเล็กและทนต่อคว�มรอ้นได้ดี โคเอนไซมส์ว่นใหญ่จะเป็นวติ�มนิท่ีละล�ยนำ้� ทำ�หน้�ท่ีในก�รย�้ยหมูต่่�งๆ เชน่ หมูไ่ฮโดรเจน อะมโิน ฟอสเฟต
โดยถ้� โคเอนไซมจ์บักับอะโพเอนไซมอ์ย่�งหลวมๆ เรยีก โคเอนไซมก์ลุ่มนี้ว�่ ซบัสเตรทรว่ม (cosubstrate) แต่ถ้�โคเอนไซมจ์บักันอย�่งแน่นหน�กับเอนไซมด์้วยพนัธะโคว�เลนต์ จะถกูเรยีกว�่หมูพ่รอสเทติก (prostetic group)
Active และ Enzyme-substrate complex
เอนไซมท์ี่ผลิตโดยร�่งก�ย แบง่ได้เป็น 2 กลุ่ม คือ1 . เอนไซมย์อ่ยอ�ห�ร (digestive enzyme) ทำ�หน้�ท่ี
ยอ่ยอ�ห�รภ�ยในระบบท�งเดินอ�ห�รเพื่อสง่ส�รอ�ห�รไปยงัเซลล์ต่�งๆในร�่งก�ร ได้แก่1.1 เอนไซมโ์ปรตีเอส (protease) ยอ่ยโปรตีน1.2 เอนไซมไ์ลเปส (Lipase) ยอ่ยไขมนั1.3 เอนไซมอ์ะไมเลส (amylase) ยอ่ยแป้ง
2. เมต�บอลิคเอนไซม ์(metabolic enzyme) มอียูใ่นเซลล์ทกุเซลล์ในทกุอวยัวะ เอนไซมน์ี้จะทำ�หน้�ท่ีเก่ียวกับทกุปฏิกิรยิ�ท่ีเกิดขึ้นในร�่งก�ย มหีน้�ท่ีซอ่มแซมสว่นท่ีสกึหรอ ชว่ยระบบภมูคิุ้มกัน
เอนไซมแ์บง่ได้ 2 ประเภทคือ1 . ไอโซเอนไซม ์หรอื ไอโซไซม ์(isoenzyme หรอื
isozyme) เป็นเอนไซมท่ี์มโีครงสร�้งแตกต่�งกันแต่ส�ม�รถเรง่ปฏิกิรยิ�เดียวกันได้
2 . อัลโลสเตอรกิเอนไซม ์(allosteric enzyme) หรอื เอนไซมค์วบคมุ (regulatory enzyme) เป็นเอนไซมท่ี์ประกอบด้วยหน่วยยอ่ยๆหล�ยหน่วยรว่มกัน เชน่ หน่วยยอ่ยเรง่ (catalytic enzyme) ส�รท่ีมอิีทธพิลต่อก�รควบคมุก�รทำ�ง�นของเอนไซม์เหล่�น้ี เรยีกว�่ ตัวควบคมุ (effector หรอื modulator หรอื regulator)
ตัวควบคมุ ม ี2 ชนิด คือ 2.1 ตัวเรง่ (activator) ทำ�ใหเ้อนไซมท์ำ�ง�นได้ดีขึ้น เรยีก positive modulator2.2 ตัวยบัยัง้ (inhibitor) ทำ�ใหเ้อนไซมท์ำ�ง�นได้ช�้ลง เรยีกว�่ negative modulator
บรเิวณของเอนไซมท่ี์มตัีวควบคมุ เรยีก บรเิวณควบคมุ (regulatory site หรอื allosteric site)
เรยีก เอนไซมท่ี์มทัีง้บรเิวณเรง่และบรเิวณควบคมุว�่ อัลโลสเตอรกิเอนไซม ์
ก�รเรยีกชื่อต�มแบบส�มญั (recommended name)มหีลักเกณฑ์ดังน้ีคือ1 . เรยีกต�มชื่อของซบัสเตรทท่ีเอนไซมเ์รง่ปฏิกิรยิ� แล้ว
ลงท้�ยด้วยคำ�ว�่ “ase” เชน่ เอนไซมเ์รง่ปฏิกิรยิ�ก�รสล�ยยูเรยี เรยีกว�่เอนไซมยู์รเีอส (Urease)
2. เรยีกต�มชนิดของปฏิกิรยิ�แล้วลงท้�ยด้วยคำ�ว�่ “ase” เชน่เอนไซมอ์อกซเิดส (oxidase) เรง่ปฏิกิรยิ�ออกซเิดชนัของซบัสเตรทท่ีม ีO2
3. เรยีกต�มขอ้ท่ี 1 และ 2 รวมกัน เชน่ ไกลซนีดีค�รบ์อกซิเลส (glycinedecarboxylase)
4. เรยีกต�มชื่อเฉพ�ะไมส่มัพนัธกั์บซบัสเตรทหรอืปฏิกิรยิ�ท่ีเก่ียวขอ้ง เชน่เพปซนิ (pepsin) เป็นเอนไซมย์อ่ยโปรตีน เป็นต้น
ก�รเรยีกชื่อเอนไซมต์�มระบบ (systemic name)ต�มขอ้ตกลงของกรรม�ธกิ�รเอนไซมน์�น�ช�ติ ได้มกี�ร
เรยีกชื่อต�มตัวเลข โดยมลัีกษณะคือ
EC xx.xx.xx.xx (อักษร x คือตัวเลข)
Enzyme functional class
subclass
Sub sub
class
ลำ�ดับท่ี
เชน่ EC 2.7.3.2
2 = ชนิดเอนไซม ์transferase
7 = ชนิดยอ่ยของรหสัตัวท่ี 1 หม�ยถึงก�รย�้ยหมูฟ่อสเฟต
3 = ชนิดยอ่ยของรหสัตัวท่ี 2 หม�ยถึงก�รแบง่ยอ่ยของหมูฟ่อสเฟต
2 = รหสัเฉพ�ะตัวของเอนไซมช์นิดนัน้
การแบง่เอนไซมต์ามชนิดของปฏิกิรยิา1. oxidoreductase ปฏิกิรยิ�ออกซเิดชนั-รดีักชนั ก�ร
ถ่�ยทอดอิเล็กตรอน
2. transferase ย�้ยหมูฟ่งัก์ชนัจ�กส�รหนึ่ง ไปอีกส�รหน่ึง
3. hydrolase ไฮโดรไลซสิ แยกพนัธะด้วยนำ้�4. lyases เติมพนัธะคู่5. isomerase ไอโซเมอรไ์รเซชนั6. ligases สร�้งพนัธะโดยสล�ย ATP
รูปรา่งโมเลกลุของเอนไซม์
กลไกก�รทำ�ง�นของเอนไซม์ให ้E = Enzyme S = Substrate P = Product ES = Enzyme เมื่อจบักับ Substrate EP = Enzyme เมื่อผลิต Product และยงัคงจบักัน
อยู่
ขัน้ตอนแรก : เอนไซม ์E รวมตัวกับสารต้ังต้น S ได้เป็นสารประกอบ ES E + S ES
การทำางานของเอนไซม์
ขัน้ตอนท่ีสอง : สารประกอบ ES เกิดการเปลี่ยนแปลงเป็น ES*
ES* EP
การทำางานของเอนไซม์
EPES*
ขัน้ตอนท่ีสาม :เกิด สารประกอบ ระหวา่งเอนไซมกั์บผลผลิต
ขัน้ตอนท่ีสดุท้าย :ได้ผลผลิตออกมา และได้เอนไซมก์ลับมาเหมอืนเดิม
EP E + P
จลน์ศ�สตรข์องเอนไซม ์
E + S ES E + P k1
k 3
k2
k 4
จลนศาสตรข์องเอนไซม์ เอนไซมท์ำ�ปฏิกิรยิ�กับสบัสเตรท เกิดเป็นเอนไซม์-สบัส
เตรทคอมเพลกซก่์อนแล้วจงึสล�ยในขัน้ตอนท่ี 2 ให้ผลผลิต และเอนไซมก์ลับคืนม� อัตร�เรว็ของปฏิกิรยิ�ในก�รเปล่ียน S ไปเป็น P ขึ้นอยูกั่บอัตร�เรว็ในก�ร เปล่ียน ES ไปเป็น P และ E นัน่คือ อัตร�เรว็ในก�รเกิด P จะขึ้นอยูกั่บคว�มเขม้ขน้ของ ES
เมื่อ k1 k2 k3 และ k4 คือ ค่�คว�มเรว็คงท่ี (velocity constant) หรอื ค่�อัตร�เรว็คงท่ี (rate constant) ของปฏิกิรยิ�ทัง้ 4
ท่ี steady state อัตร�เรว็ในก�รเกิด ES จะเท่�กับอัตร�เรว็ในก�รสล�ย ES ทำ�ให ้[ES] คงท่ี จะได้
สมก�รไมคีลิส-เมนเทน (Michaelis-Menten constant) แสดงถึง ความสมัพนัธร์ะหวา่งอัตราเรว็ของปฏิกิรยิา และความ
เขม้ขน้ของ S เมื่อทราบ Vmax และ KM
Vmax คือ คว�มเรว็สงูสดุ (maximum velocity) ของก�รทำ�ง�นของเอนไซม์
KM คือ ค่�คงท่ีไมคีลิส-เมนเทน (Michaelis-Menten constant) ของปฏิกิรยิ�ของเอนไซมท่ี์ steady state มหีน่วยเป็นโมล/ลิตร
V = Vmax[S] KM + [S] ท่ี V = Vmax /2 หรอื ครึง่หนึ่งของความเรว็สงูสดุ (half
maximal) จะได้ KM = [S]
สมการไลน์วเีวอร-์เบอรก์ เป็นสมก�รจ�กก�รกลับสมก�รไมคีลิส-เมนเทน 1 = KM .
1 + 1 v Vmax
[S] Vmax
เมื่อเขยีนกราฟระหวา่ง 1/v และ [S] จะได้กราฟเสน้ตรงท่ีมคีวามชนั = KM/Vmax และจุดตัดแกน 1/v คือ 1/Vmax และจุตัดแกน 1/[S] คือ -1/KM ทำาให้สามารถหาค่า KM และ Vmax ท่ีถกูต้องได้
Enzyme Kinetics
Increase the substrate concentration,observe the change of enzyme activity
Substrate concentrationExam Chapters
Score
Enzym
e activity
Student A
Student B
Student C
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Juang RH (2004) BCbasics
Increase Substrate C
oncentration
21 3 4 5 6 7 80
0 2 4 6 8
Substrate (mmole)
Product
80
60
40
20
0
S+E↓P
(in a fixed period of time)
Juang RH (2004) BCbasics
Essential of Enzyme Kinetics
E S+ P+
Steady State Theory
In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.
SE E
Juang RH (2004) BCbasics
Constant ES Concentration at Steady State
S P
EES
Reaction Time
Concentration
Juang RH (2004) BCbasics
An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)
Vmax
Km S
vo
1/S
1vo
Double reciprocal Direct plot
1) Use predefined amount of Enzyme → E 2) Add substrate in various concentrations → S (x ,y)
3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y, y)
4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax
5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km
1Vmax
- 1 Km
1/2
Juan
g R
H (2
004)
BC
basi
cs
A Real Example for Enzyme KineticsD
ata
no
1234
0.250.501.02.0
0.420.720.800.92
Absorbance v (mmole/min)[S]0.210.360.400.46
(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min
VelocitySubstrate Product Double reciprocal
1/S 1/v421
0.5
2.081.561.351.16
→→ → →
1.0
0.5
0
v
Dire
ct p
lot
Dou
ble
reci
proc
al 2.0
1.0
0
1/v
-4 -2 0 2 41/[S]
0 1 2[S]
1.0
-3.8
Juan
g R
H (2
004)
BC
basi
cs
ปัจจยัท่ีควบคมุการทำางานของเอนไซม์1.คว�มเขม้ขน้ของเอนไซม์2.คว�มเขม้ขน้ของส�รตัง้ต้น หรอืซบัสเตรต (substrate)3.ค่�คว�มเป็นกรด-เบส (pH)4.อุณหภมู ิ(optimum temperature) การยบัยัง้การทำางานของเอนไซม์- การยบัยัง้แบบถาวรInhibiter ทำ�ใหส้ว่น active site เปล่ียนแปลงไป เอนไซมไ์มส่�ม�รถกลับสูใ่นสภ�พท่ีทำ�ง�นได้อีก- การยบัยัง้ท่ีกลับคืนได้ 1.ก�รยบัยัง้แบบแขง่ขนั โดยตัวยบัยัง้มโีครงสร�้งคล้�ยกับซบัสเตรตทำ�ให ้ส�ม�รถแยง่จบักับเอนไซมไ์ด้ 2.ก�รยบัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั โดยส�รเคมบี�งชนิดไปจบักับสว่น cofactor ทำ�ใหเ้อนไซมไ์มส่�ม�รถทำ�ง�นได้
การยบัยัง้แบบถาวร
การยบัยัง้แบบแขง่ขนั การยบัยัง้แบบไม่แขง่ขนั
ปัจจยัท่ีมผีลต่อการทำางานของเอนไซม์ 1. อุณหภมู ิเมื่ออุณหภมูสิงูขึ้น แอกติวตีีของเอนไซมจ์ะเพิม่ขึ้น
เรื่อยๆ จนถึงจุดสงูสดุหน่ึง (temperature optimum) แล้วจะลดลง ซึ่งจำ�เพ�ะต�มชนิดของเอนไซม ์สว่นใหญ่อยูใ่นชว่งอุณหภมู ิ25–40 oC แต่ท่ีอุณหภมู ิสงูกว�่จุดน้ีม�กๆ เอนไซมจ์ะเกิดก�รเสยีแอกติวตีีท�งชวีภ�พ
2. pH จุดท่ีทำ�ใหเ้อนไซมม์แีอกติวตีีสงูสดุ เรยีกว่� pH optimum ซึ่งสว่นใหญ่อยูใ่นชว่ง pH 6-7.5 ถ้� pH สงู หรอืตำ่�เกินไปจะทำ�ใหเ้กิดก�รสญูเสยีแอกติวตีีท�งชวีภ�พ
3. ความเขม้ขน้ของเอนไซม ์ ท่ีคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทม�กเกินพอ (excess) อัตร�เรว็ของปฏิกิรยิ� จะเพิม่ขึ้น เมื่อคว�มเขม้ขน้ของเอนไซมเ์พิม่ขึ้น
4. ความเขม้ขน้ของสบัสเตรท เมื่อคว�มเขม้ขน้ของเอนไซมค์งท่ี ท่ีคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทน้อยๆ ปฏิกิรยิ�จะ เกิดขึ้นด้วยอัตร�เรว็ม�กจนกระทัง่ถึงคว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรทจุดหนึ่งท่ีอัตร�เรว็ของ ปฏิกิรยิ�จะคงท่ี คว�มเรว็ของปฏิกิรยิ�ท่ีสงูสดุ เรยีกว�่ คว�มเรว็สงูสดุ (Vmax)
ตัวยบัยัง้เอนไซม์แบง่ออกได้เป็น 2 ประเภท1. ตัวยบัยัง้แบบผันกลับไมไ่ด้ (irreversible
inhibitor) เก่ียวกับก�รทำ�ล�ยหรอืเปล่ียนแปลง functional group 1 หมูห่รอืม�กกว�่ท่ีจำ�เป็นสำ�หรบัแอกติวตีีบนโมเลกลุของเอนไซม ์ซึ่งตัวยบัยัง้แบบน้ีจะจบั กับเอนไซมอ์ย�่งแน่นทัง้แบบโคว�เลนท์และนอนโคว�เลนท์ เชน่ ก�รยบัยัง้เอนไซมไ์ซโคลออกซจิเินส (cyclooxygenase) โดยย�แอสไพรนิ (aspirin หรอื acetyl salicylate)
2. ตัวยบัยัง้ แบบผันกลับได้ (reversible inhibitor) แบง่เป็น 3 ชนิด
2.1 ตัวยบัยัง้แบบแขง่ขนั (competitive inhibitor) หม�ยถึง ส�รท่ีส�ม�รถเข�้ ไปแยง่สบัสเตรทจบัท่ีบรเิวณแอกตีฟบนโมเลกลุของเอนไซม ์แล้วทำ�ใหแ้อกติวตีีในก�รเรง่ปฎิกิรยิ� ของเอนไซมล์ดลง โดยค่� KM เปล่ียน แต่ Vmax คงท่ี เชน่ กรดม�โลนิกส�ม�รถจบัเอนไซมซ์กัซนิิก ดีไฮโดรเจเนส (succinic dehydrogenase) ในปฏิกิรยิ�ก�รออกซไิดสก์รดซกัซินิกไปเป็นกรด ฟูม�รกิ เพร�ะมโีครงสร�้งคล้�ยกับกรดซกัซนิิก
2.2 ตัวยงัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั (noncompetitive inhibitor) หรอืตัวยบัยัง้ แบบผสม (mixed inhibitor) โดยตัวยบัยัง้ชนิดน้ีจะเข�้ไปจบัท่ีบรเิวณอ่ืนบนโมเลกลุของ เอนไซมท่ี์ไมใ่ชบ่รเิวณเรง่ เชน่บรเิวณควบคมุ ทำ�ใหโ้ครงร�่งของเอนไซมเ์ปล่ียนแปลงไป ทำ�ให้บรเิวณเรง่เปล่ียนไปจงึทำ�ง�นไมไ่ด้ เชน่ Cu2+ Hg2+ และ Ag+ หรอือนุพนัธ ์(derivative) ของมนัส�ม�รถทำ�ปฏิกิรยิ�กับ หมู-่SH ของซสิเตอีนทำ�ใหโ้ครงรูปส�มมติิ (three dimensional conformation) ท่ีจำ�เพ�ะของเอนไซมเ์สยีไป ในกรณี noncompetitive inhibitor ค่� Vmax เปล่ียนแปลง(ลดลง) สว่น KM ไม่เปล่ียนแปลง
2.3 การยบัยัง้แบบอันคอมเพติตีฟ (uncompetitive inhibition) ก�รยบัยัง้ แบบนี้เกิดขึ้นเมื่อตัวยบัยัง้เข�้รวมเฉพ�ะกับเอนไซมส์บัสเตรทคอมเพลกซเ์ท่�นัน้แบบไมผั่นกลับ เกิดเป็น ESI คอมเพลกซ ์ซึ่งจะไมไ่ด้ผลผลิตเกิดขึ้น ลักษณะเหมอืนกับก�รยบัยัง้แบบไมแ่ขง่ขนั โดยไมเ่กิดก�ร ผันกลับ (reversible) เมื่อเพิม่คว�มเขม้ขน้ของสบัสเตรท ค่� Vmax ลดลง และค่� Km ลดลง แต่คว�มชนัไม่เปล่ียนแปลง
Enzyme Inhibition (Mechanism)
I
I
S
S
S I
I
I II
S
Competitive Non-competitive Uncompetitive
EE
Different siteCompete for
active siteInhibitor
Substrate
Car
toon
Gui
deEq
uatio
n an
d De
scrip
tion
[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [I].
[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.
[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].
E + S → ES → E + P + I↓EI
←
↑
E + S → ES → E + P + + I I↓ ↓EI + S →EIS
←
↑ ↑
E + S → ES → E + P + I ↓ EIS
←
↑
EI
S X
Juang RH (2004) BCbasics
Km
Enzyme Inhibition (Plots)
I II Competitive Non-competitive Uncompetitive
Dire
ct P
lots
Dou
ble
Rec
ipro
cal
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
I I
Km [S], mM
Vmax
I
Km’
Vmax’Vmax’
Vmax unchangedKm increased
Vmax decreasedKm unchanged
Both Vmax & Km decreased
I
1/[S]1/Km
1/vo
1/ Vmax
I
Two parallellines
I
Intersect at X axis
1/vo
1/ Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/ Vmax
1/vo
Intersect at Y axis
= Km’
Juang RH (2004) BCbasics
หน่วยวดัก�รทำ�ง�นของเอนไซม์1 . หน่วยเอนไซม ์หม�ยถึง จำ�นวนเอนไซมท่ี์ทำ�ใหป้รมิ�ณ
ของผลิตภัณฑ์เกิดขึ้นหรอืปรมิ�ณของซบัสเตรทลดลง มค่ี�เป็น ไมโครโมลต่อน�ที หน่วยส�กล (international unit, IU หรอื U)
1.0 IU คือ แอคติวตีิของเอนไซมห์รอืปรมิ�ณของเอนไซมท่ี์เรง่ก�รเปล่ียน 1.0 ไมโครโมลของซบัสเตรทใน 1 น�ทีท่ีอุณหภมู ิ25 º Cค�ท�ล (katal : kat) หม�ยถึง ปรมิ�ณของเอนไซมท่ี์เรง่ก�รเปล่ียนแปลง 1
โมลของซบัสเตรทใน 1 วนิ�ที หน่วยท่ีนิยมใช ้คือ µkat , nkat, pkat
1 kat = 1/60 U = 1.67 x 10 -2 U
2. หน่วยแอคติวตีิเฉพ�ะ (specific activity) หม�ยถึง หน่วยเอนไซม ์ต่อ 1 มลิลิกรมัของโปรตีน ใชใ้นก�รห�คว�มบรสิทุธิข์องเอนไซม์
Enzyme Kinetics
vo=Vmax [S]Km + [S]
Km Vmax &E1E2E3
1st order
zero order
Competitive
Non-competitive
Uncompetitive
Direct plot
Double reciprocal
Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other
Affinity withsubstrate
Maximumvelocity Inhibition
Activity
Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km
k3 [Et]
kcatTurn overnumber
kcat / Km
Activity Unit1 mmole
min
Specific Activity
unitmg
Significance
Juang RH (2004) BCbasics
Significance of Enzyme Kinetics
vo =Vmax [S]Km + [S]
Obtain Vmax and Km
[S] = Low → High [S] = Fixed concentration
zero order
1st order
E3E2E1
Proportional toenzym
e concentrationv0 = Vmax × K = k3 [Et] × K
Juang RH (2004) BCbasics
Km = [S]
Km + [S] = 2 [S]
Vmax
2 =Vmax [S]Km + [S]
Km: Affinity with Substrate
If vo =Vmax
2
S2S1 S3
S1 S2 S3
Vmax
1/2
When using different substrate
Affinity changesKm
vo =Vmax [S]Km + [S]
Juan
g R
H (2
004)
BC
basi
cs
Km: Hexokinase Example
Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP
123456
Glucose Allose Mannose Substratenumber
Km = 8 8,000 5 mM
CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Number, kcat
vo =Vmax [S]Km + [S]
(vo)E + S ES E + P
k2
k1 k3
When substrate excess, k3 = kcat, turn over number (t.o.n)
When [substrate] is low
= k3 [E][S]Km + [S]= Km
k3 [E][S]
Omit the [substrate] Substrate specificityStart from M-M eq.
Second order(IV)
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Numbers of Enzymes
Catalase H2O2
Carbonic anhydrase HCO3-
Acetylcholinesterase Acetylcholine
40,000,000
400,000
140,000
b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000
Fumarase Fumarate 800
RecA protein (ATPase) ATP 0.4
Enzymes Substrate kcat (s-1)
The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263
Enzyme Activity Unit
Reaction time (min)P
rodu
ct [P
]0 10 20 30 40
Slopetan
S → P mmole
vo = [P] / min
Unit =
Activity Units
Protein (mg)
t
mmole/min
yx
yx = tan
Juan
g R
H (2
004)
BC
basi
cs
Specific Activity =