Брошюра igem-2012

iSCALARE Лаборатория суперкомпьютерных технологий Московского физико-технического института

МЕЖДУНАРОДНЫЕ ИНЖЕНЕРНЫЕ СОРЕВНОВАНИЯ

ПО СИНТЕТИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ

Место для шага вперед!

Москва - 2012

Международные инженерные соревнования по синтетической биологии

iSCALARE Лаборатория суперкомпьютерных технологий Московского физико-технического института 2

СОДЕРЖАНИЕ

Опыт полупроводниковой революции 3 Синтетическая биология 4 На пользу человечества 5 Новый виток генной инженерии 6 Организация производственной иерархии 7 Биоконструктор высшего качества 8 По единому стандарту 9 Безопасность превыше всего 10 Живые устройства 11 Инженерные соревнования по синтетической биологии 12 iGEM на страже здоровья 13 Место для шага вперед! 14



ОПЫТ ПОЛУПРОВОДНИКОВОЙ РЕВОЛЮЦИИ Революция в электронной технике началась после того, как в 1957 году Джин Хоерни, сотрудник небольшой компании Fairchild Semiconductor — прароди-тельницы нынешней Кремниевой долины — разработал планарную техноло-гию, основанную на последовательном наслаивании на кремниевой пла-стинке полупроводниковых и других материалов с использованием матриц, называемых фотомасками.

Новый подход позволил создавать точные интегральные цепи и легко модифицировать их, просто заменяя фотомаски. Вскоре были созданы общедоступные библиотеки простых микроцепей. Таким образом, любой желающий мог собрать из деталей необходимое ему для дальнейшей работы более cложное устройство.

Гибкая, надежная технология сборки в сочетании со стандартизированными методами и созданием обширного набора деталей способствовала нала-живанию массового производства полупроводниковых чипов, что позволило конструировать необычайно сложные электронные устройства самого разно-го назначения. Сочетание технологических и методологических инноваций в разработке и производстве полупроводниковых чипов приве-ло к созданию одной из наиболее успешных парадигм за все время существования инженерной науки, способной быть использованной в качестве базовой основы и в новой биомедицинской индустрии, связанной с производством ис-кусственных функциональных биологических систем. Используя опыт полупроводниковой промышленности, стало возможным со-бирать изощренные системы из биологических деталей. Инженерные прин-ципы и методы уже внедрены в производство рядом передовых биотехнологи-ческих компаний для получения коммерческих продуктов. Для становления но-вой биомедицинской индустрии теперь необходимо обучить инженерным подходам как можно больше молекулярных биологов.



СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ Создание совершенно новых форм жизни, исправление ошибок генома собственного организма, предотвращения неизбежного и обращения вспять генетических болезней и отклонений. Звучит заманчиво. Синтетическая биоло-гия делает многие из этих фантастических возможностей доступными для че-ловека уже сейчас. Исторически корни синтетической биологии уходят в 1989 год, когда ко-манда биологов из Цюриха под руко-водством Стивена Беннера синтези-ровала ДНК, содержащую два искус-ственных генетических слова помимо четырёх известных, используемых всеми без исключения живыми орга-низмами Земли.

Синтетическая биология представляет собой новейшее направление генной инженерии, которое объединяет передовые области исследований с целью проектирования и построения новых, в том числе, несуществующих в приро-де, биологических функций и систем. При этом появляется возможность уз-нать гораздо больше о сущности самой жизни, создавая её заново из атомов и молекул, а не разбирая и анализируя отдельные подсистемы.

Одной из целей, которая при этом преследу-ется, является стремление сделать генную ин-женерию строгой научной дисциплиной, кото-рая непрерывно развивается, стандартизируя предыдущие искусственные создания и по-вторно комбинируя их, выявляя новые законо-мерности и взаимосвязи.

Последние достижения в области синтетической биологии позволят в скором времени стереть существующую границу между миром живых организмов и машин, и перейти к программируемым функциональным биосистемам.



НА ПОЛЬЗУ ЧЕЛОВЕЧЕСТВА Одной из первых задач, поставленных в области синтетической биологии, был поиск новых подходов к лечению заболеваний с использованием технологии биофабрик. Джей Кислинг, профессор биоинженерии Калифорнийского университета в Беркли, возглавил лабораторию, которая участвовала в разра-ботке способов борьбы с наиболее опасными для человечества инфекцион-ными заболеваниями: малярией и СПИДом. Что касается малярии, то по крайней мере один препарат, который позволяет уничтожать возбудителя в организме инфицированного, уже найден. Его ос-новой стало вещество природного про-исхождения, более известное как арте-мизинин, синтезируемое растением Artemisia annua. Однако получаемого продукта не достаточно, чтобы удовле-творить тот колоссальный спрос, кото-рый на него существует. Кроме того, он не по карману жителям беднейших стран, страдающих от малярии.

Группа Кислинга начала работать над получением копии набора генов, обеспечивающих синтез артемизинина в клетках растения. Конечной целью было встраивание новой генетической конструкции в дрожжевые клетки и ее модификации с целью повышения выхода продукта.

Проекты, цель которых — синтез новых белков, кандидатов на роль препаратов против малярии и ВИЧ, демонстрируют воз-можности технологии биофабрик. С их помощью можно будет создавать новые средства против множества заболеваний, в том числе и появившихся недавно. Так, использование преимуществ высокоскоростных дешевых способов секвенирования и синтеза ДНК позволит и создавать белковые вакцины гораздо быстрее, чем это делается сейчас.



НОВЫЙ ВИТОК ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Методика искусственного получения молекул ДНК была описана еще в 1979 году в работе лауреата Нобелевской премии по физиологии и медицине Ха-ра Гобинда Кораны. Фактически, это обеспечило создание нового подхода в генетической инженерии.

Однако на первых этапах технология была очень сложной и дорогостоящей. Да и максимальная возможная длина получаемых нуклеотидных цепо-чек не превышала в то время 200 молекул. Потребо-валось более 20 лет напряженной работы ведущих научных коллективов из разных стран для того, чтобы развить это направление до той степени, что искус-ственное синтезирование участков ДНК смогло практически вытеснить операцию клонирования в большинстве проводимых экспериментов.

Словосочетание «генная инженерия» вошло в научный лексикон уже давно, а методы рекомбинантных ДНК стали в наши дни основным инструментом мо-лекулярной биологии. Однако работа биотехнологов пока имеет мало обще-го с той, что осуществляют инженеры и конструкторы. Тому есть ряд причин. Прежде всего, инструменты, применяемые для создания биологических систем, пока еще не столь точны и универсальны, как те, что имеются в распоряжении других специалистов. Не менее важны и различия в самих методах и подходах, использующихся в биотехнологии с одной сто-роны, в инженерных науках — с другой, и здесь биотехнологии предстоит многое позаимство-вать из микроэлектроники.

Применение инженерного подхода в биологии при проектировании новых функциональных систем позволит в ближайшем будущем выйти на совер-шенно иной технологический уровень. Промышленное производство живых устройств в нашей стране может обеспечить новый виток развития таких об-ластей, как медицина, энергетика, сельское хозяйство.



ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ИЕРАРХИИ

Большую пользу биоинженерам может принести заимствование подходов и методов, применяемых в микроэлектронике. Благодаря стандартизации тех-нологических приемов разработчики микрочипов могли сосредоточиться на конструировании и создании микроцепей, другие специалисты собирали электронные компоненты, третьи — устройства и так далее. В биоинженерии при создании сложных функциональных конструкций можно выделить четыре основных уровня организации производственной иерархии. Интегральные системы. Сочетание биологических устройств, которые вы-полняют заданные функции. Система из трех инверторов работает как ос-циллятор. Устройства. Сочетание биологических деталей с определенными функция-ми. Один инвертор может получать на вход «высокий» сигнал и преобразовы-вать его в «низкий». Введение понятия «стандартный сигнал» — число «сра-батываний» полимеразы в секунду. Детали. Генетические конструкции с заданными функциями. Так, транс-крипционный оператор #R0051 пред-ставляет собой сегмент ДНК, который работает в паре с белком #С0051 и регулирует активность генов. ДНК. Сегменты ДНК с заданной нуклеотидной последовательностью для изго-товления деталей. Их синтезируют в специализированных лабораториях и дос-тавляют в готовом виде для сборки. Разработка методов быстрого синтеза с низкой частотой ошибок позволила превратить эту процедуру в рутинную.



БИОКОНСТРУКТОР ВЫСШЕГО КАЧЕСТВА

Если базовыми компонентами электронных схем являются отдельные транзи-сторы, то для их биологических аналогов основу составляют гены – высокоупо-рядоченные участки последовательностей ДНК, выполняющие определенные функции. Для эффективной разработки биоустройств необходима отлажен-ная технология быстрого и качественного получения длинных ДНК цепочек по достаточно низкой цене.

Основания, принадлежащие нуклеотидам из разных цепей одной молекулы ДНК, образуют комплементарные пары: А – Т и G – С. Сама двухцепочечная молекула ДНК скручена в виде двойной спирали, которая стабилизируется водородными связями между основаниями противоположных цепей и межплоскостными взаи-модействиями нуклеотидов в цепи.

Живые организмы используют для синтеза своих ДНК ферменты. Они способ-ны присоединять до 500 нуклеотидов в секунду, исправляя по ходу дела ошиб-ки, вероятность которых равна примерно 10-9. Клеточная биосинтетическая машина превосходит самый лучший ДНК-синтезатор в триллион раз. Последнему на присоединение каждого звена нужно около 300 секунд. Более того, в in vivo ре-пликации бактериального генома одно-временно участвуют несколько полиме-раз, суммарная «производительность» ко-торых составляет 5 миллионов нуклеоти-дов за 20 минут.

Олигонуклеотиды из разных точек имеют перекрывающиеся концевые после-довательности, так что из них можно в дальнейшем собирать более длинные сегменты ДНК, например, целые гены. Параллелизм в синтезе ДНК и исполь-зование систем коррекции позволяют собирать протяженные, почти не со-держащие ошибок генетические элементы гораздо быстрее, при меньших затратах, чем ранее. Это создает необходимую базу для производства функ-циональных биодеталей, которая, как и в случае с полупроводниками, будет, несомненно быстро совершенствоваться.



ПО ЕДИНОМУ СТАНДАРТУ Каждый биоблок должны быть спроектированы таким образом, чтобы хорошо взаимодействовать со всеми другими на следующих двух уровнях организации: ме-ханическом для удобства изготовления, хранения и включения в генетическую цепочку и программном для обеспечения единообразия посылаемых химических сигналов и эффективного взаимодействия с другими фрагментами кода.

Сейчас в Массачусетском технологическом институте создано и систематизировано уже более 100 тысяч элементарных биобло-ков. Зная заранее их характеристики, учё-ный может произвольно соединять их, про-граммируя отклик живого на нужные хими-ческие сигналы.

Один из таких биоблоков является генетическим аналогом компьютерного оператора НЕ. Другой спроектирован так, что является биохимическим оператором И. Как известно из Булевой алгебры, при наличии должного числа таких операторов можно организовать логическую схему, реали-зующую любые двоичные вычисления.

Дальнейшее продвижение идеи внедрения инженер-ного подхода в биологию при проектировании функ-циональных биосистем тормозится следующим об-стоятельством. Когда сконструированный биоблок помещается в клетку, начинается его взаимодейст-вие с исходными клеточными фрагментами ДНК. Очень часто происходит так, что синтезированные элементы при внедрении в генетический код клетки реципиента просто уничтожают её. Именно клетка должна обеспечивать жизнь искусственной ДНК, её дальнейшее копирование и распространение.



БЕЗОПАСНОСТЬ ПРЕВЫШЕ ВСЕГО

Биологические системы способны к самовоспроизведению и эволюции, в связи с чем возникает резонный вопрос: могут ли они выйти из-под контроля и стать опасными?

Практическое применение всего потенциала биоинженерии в меди-цине, производстве новых материа-лов, создании чувствительных датчи-ков, охране окружающей среды, выработке энергии только начина-ется. И как любое новое начинание, оно вызывает опасения у общест-венности.

Такие же соображения высказывались более 35 лет назад. В то время биологи научились вырезать ген из генома одного простейшего организма и встраи-вать его в геном другого, что приводило к появлению комбинаций генов, не существующих в природе. Сегодня такая методика стала основным инстру-ментом всех молекулярных биологов в мире. Как правило, синтетические организмы не выхо-дят за пределы лабораторий. Но можно преду-смотреть эту возможность и создавать только та-кие биологические системы, которые используют другой генетический код, нежели все живые ор-ганизмы, что исключит обмен генами между ни-ми. Искусственные биологические устройства также можно запрограммировать, чтобы после определенного числа делений они самоуничто-жались. Каждая биологическая деталь должна быть маркирована, так чтобы можно было идентифицировать и проследить дальнейшую судьбу сконструирован-ного при ее участии организма. Если говорить о других инженерных областях, то с повышением прецизионности устройств повышается и их безопасность. Очевидно, что то же самое должно произойти и в биоинженерии.



ЖИВЫЕ УСТРОЙСТВА

В 2000-м году Майкл Эловиц и Станислас Лейблер собрали из биологических деталей простейшие генетические уст-ройства — осциллятор и тумблер. О том, что подобные кон-струкции используются для регуляции работы генов ученые знали уже давно, но искусственные генетические функцио-нальные системы были созданы впервые.

Приступая к исследованиям, Эловиц и Лейблер полагали, что им удастся сконструировать биологические часы, которые помогли бы разобраться в ра-боте аналогичных механизмов у естественных живых организмов. Если один из белковых продуктов влиял на активность ге-на, который кодировал флуоресцирующий белок, то при встраивании всей конструкции в бактериальную клетку периодичность работы цепи можно было наблю-дать воочию: клетка то вспыхивала, то гасла, как кро-шечная лампочка новогодней гирлянды. Рон Вейс сконструировал прототип многоклеточной системы, которую можно использовать, например, для поиска взрывчатых веществ. Об опасной наход-ке клетки сообщают световым сигналом. Подобное биологическое устройст-во позволяет запрограммировать миллионы бактериальных клеток, снабдив их инструкциями по взаимодействию друг с другом.

Пожалуй, самое интересное в подобных синтетических био-логических цепях то, что они аналогичны по своим функциям первым электрическим цепям, собранным инженерами-электронщиками для тестирования новых операций при соз-дании полупроводниковых чипов.

Появление таких простых приборов, как осциллятор и переключатель, возмож-ность производить их в нужном количестве и с большой точностью позволили конструировать на их основе сложные электронные схемы. И раз уж специа-листы научились делать столь же надежные биологические аналоги основных электронных блоков, они также смогут составлять из них более сложные кон-струкции, такие как многоклеточные системы и даже устройства с небиоло-гическими функциями.



ИНЖЕНЕРНЫЕ СОРЕВНОВАНИЯ ПО СИНТЕТИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ Для того, чтобы продемонстрировать эффективность инженерного подхода в проектировании живых функциональных систем в январе 2003 года одной из исследовательских групп MIT был разработан специальный курс по проекти-рованию из стандартного набора биоблоков (BioBrics). Основной целью про-екта является подготовка нового поколения уникальных специалистов путем обучения студентов принципам молекулярной генетики и методам генетиче-ской инженерии для создания функциональных биосистем и живых устройств.

В 2004 году факультатив перерос в летние со-ревнования, в которых приняли участие 5 ко-манд. В следующем году студенческие со-ревнования по синтетической биологии при-обрели международный статус и получили свое официальное название – iGEM (The International Genetically Engineered Machine). На чемпионат iGEM-2011 зарегистрировалось более 2000 участников из 160 команд, пред-ставляющих 30 стран мира.

В начале лета всем командам высылается копия реестра стандартных биоло-гических компонентов (The Registry of Standard Biological Parts).

Каждый функциональный биоблок представ-ляет собой фрагмент цепочки ДНК, упакован-ный в специальную генетическую конструк-цию, позволяющую внести последователь-ность нуклеотидов в бактерию кишечной па-лочки и размножить ее в любом количестве.

За три месяца необходимо разработать проект функ-циональной биосистемы, произвести теоретическое обоснование, а потом представить практическую реали-зацию в унифицированном формате. Уровень исполне-ния действительно впечатляет, и многие проекты зачастую ложатся в основу создания новых стартапов.



iGEM НА СТРАЖЕ ЗДОРОВЬЯ

Примером высокого уровня исполнения студенческих работ может служить проект команды из Калифорнийского университета в Беркли, представивших на конкурс искусственный заместитель красных кровяных телец, сконструи-рованный из генетически перепрограммированной бактерии кишечной па-лочки E.сoli.

Эта функциональная биосистема способна осуществлять эффективный транспорт кислорода, не индуцируя при этом, заражения крови и, что не маловажно, может долго сохра-нять свои свойства в состоянии глубокой заморозки.

Так на соревнованиях iGEM-2010 первого приза за создание двух функцио-нальных биосистем в области медицины и здравоохранения удостоилась ра-бота «Антибиотики 21-го века» команды Вашингтонского университета. Задачей первого проекта являлась борьба с грамположительными бациллами сибирской яз-вы. Программируя ряд ферментов на уничтоже-ния патогенной защитной оболочки, биоинжене-ры сделали бациллы беспомощными перед ес-тественными механизмами иммунной системы.

Во втором проекте в бактерию E.сoli был трансплан-тирован созданный аппарат искусственной секре-ции белков, способных эффективно противостоять ряду грамотрицательных бактерий. Эти две биосис-темы представляют собой авангард новой эры ан-тибиотиков, использующих потенциал синтетиче-ской биологии.

В настоящее время повсеместное широкое использование традиционных ан-тибиотиков столкнулось с такими проблемами как увеличение устойчивости вредоносных бактерий к действующим агентам препаратов, с одной сторо-ны, и ухудшение естественной микрофлоры кишечника при длительном ис-пользовании определенных лекарств, с другой. Ответить на эти вызовы призва-ны новые антибиотики 21-го века.



МЕСТО ДЛЯ ШАГА ВПЕРЕД!

Будущее биотехнологий во многом зависит от того, будут ли созданы объединенные об-щей целью, группы единомышленников. Бла-годаря созданию биофабрик по проектиро-ванию живых устройств, аналогичных пред-приятиям по созданию микросхем, развитие биоинженерии будет столь же стремитель-ными, как и полупроводниковая революция в области микроэлектроники.

Студенты, участвующие в международных соревнованиях по синтетической биологии iGEM, являются первым поколением исследователей, изначально обученных мыслить как биологи и как инженеры. Теперь предстоит научить подобному мышлению уже состоявшихся специалистов в обеих областях. По-ка же разрозненные группы биотехнологов занимаются решением узких за-дач, и их работа остается ближе к ремеслу, чем к современному производ-ственному процессу.

Единственный раз российские студенты при поддержке Фон-да некоммерческих программ «Династия» принимали уча-стие в международных соревнованиях по синтетической биологии в 2007 году. Тогда наша команда оказалась в числе финалистов и завоевала золотую медаль iGEM-2007.

В настоящее время Лаборатория суперком-пьютерных технологий МФТИ ведет подготовку новой российской команды для участия в чемпионате iGEM. Тренерами российской сборной по синтетической биологии выступят лучшие ученые из Московского физико-технического института и ведущих учрежде-ний Российской академии наук. Координатором нашей команды для участия в международных инженерных соревнованиях по синтетической биологии iGEM является Максим Алёхин ([email protected]), научный сотрудник Лаборатории суперкомпью-терных технологий МФТИ.

Брошюра igem-2012

Documents