ةيرهجملا تاريضحتلا - ksuرداقلا دبع رمع . د ةیرھجملا...

عبد القادر د . عمر

2012 التحضیرات المجھریة

التحضيرات المجهرية

إن عملية التحضريات اجملهرية رغم أهنا غاية يف التعقيد والدقة إال أهنا ذات أمهية كبرية يف احلياة العملية والبحثية والتشخيصية،فهي تعترب األساس األول لتشخيص املرض لذا كانت هذه التحضريات

عمالقة اخلاصة ما ابتكار األجهزة الاجملهرية ذات أمهية كبرية يف اجلانب الطيب والبحثي إىل وقتنا احلاضر ،و لذلك مثل امليكروسكوب اإللكرتوين إال دليل على تلك األمهية، و تنقسم التحضريات إىل قسمني :

حتضريات ال مقطعية ال ميكن عمل مقاطع فيها مثل أنسجة الدم . (1)

حتضريات مقطعية ختص اجملهر الضوئي و اجملهر اإللكرتوين. (2)

ة ذو عالقة وطيدة مع العديد من العلوم مثل علم األمراض وعلم األنسجة وعلم كيمياء وكون هذه التقنياألنسجة وعلم اخللية وغريها من العلوم األخرى اليت ختدمها التحضريات اجملهرية, كان البد من تعريف

بعض هذه العلوم:

: Cytologyعلم اخللية

ب والشكل والوظيفة. وهو العلم الذي يدرس اخلالاي من حيث الرتكي

:Histology (Microscopic Anatomy) علم األنسجة

وهو العلم الذي يدرس الرتاكيب اجملهرية لكل من اخلالاي واألنسجة واألعضاء الذي يتكون منها الكائن احلي.

: Pathologyعلم األمراض

وهو العلم الذي يدرس املرض من حيث أسبابة وميكانيكية تطوره وعالقاته وأعراضه ونتائجه.

التحضريات اجملهرية:

2



Microtechniques (microscopic preparations)

يقصد ابلتحضريات اجملهرية )الدقيقة( أبهنا تلك اخلطوات اليت بواسطتها ميكن دراسة الرتاكيب اخللوية املكونة جلسم الكائن احلي واليت ال ترى ابلعني اجملردة أو أجزاء منها أو أعضاء من اجلسم ابستخدام

أجهزة ومعدات خاصة هلذا الغرض.

وهناك طرق عديدة للتحضريات اجملهرية نذكر منها األكثر شيوعا يف الوقت احلاضر:

: Whole mountالتحميل الكلي (1

حيث يتم وضع العينة أبكملها على الشرحية للفحص مثل الدودة الكبدية و القمل و منها نوعان : التحميل الكلي املؤقت. -ا

لتحميل الكلي الدائم. ا -ب

:Smearing Method 2)مل مسحات ع

وهي من أسرع الطرق التحضريية اخلاصة ابألنسجة الرخوة مثل اخلصى احليوانية والسوائل احليوية مثل الدم والبلغم و السائل املهبلي.

: Teasing Methodالنثر أو النشر( 3تستخدم لدراسة أجزاء من نسيج ما كالعضلة مثال حيث تؤخذ قطعة صغرية من العضالت مث بواسطة إبرة

تشريح يتم تفكيكها إىل الوحدات الرتكيبية مثل األلياف العضلية حيث ميكن لضوء امليكروسكوب أن خيرتقها.

Squashing Method : 4)لسحق أو اهلرسا

تستخدم هلرس العينات الرخوة وحتويلها من احلالة النسيجية إىل احلالة اخللوية على الشرحية الزجاجية مثل دراسة مراحل االنقسام اخللوي و مشاهدة الكروموسومات.

: Direct Methodالطريقة املباشرة( 5

تستخدم للدراسة السريعة للعينات احلية ولوقت قصري جدا كما يف فحص اخلالاي احلرشفية للفم و األميبيا و الربامسيوم.

3



:Sectioning Method 6التقطي ع(

وهي األهم لدراسة العينات على مستواها النسيجي و اخللوي والغرض منها احلصول على قطاع نسيجي رقيق جدا, و هناك ثالث طرق رئيسية تستخدم لعمل املقاطع النسيجية.

تقنية -The paraffin technique 2تقنية الربافني )وهي الطريقة األشهر( -1 The celloidin techniqueالسللودين )وهي األكثر دقة(

The freezing technique (3- تقنية التجميد )وهي األسرع

The Paraffin Technique : أوال: تقنية الربافني

وفيها يستخدم مشع الربافني املنصهر والصلب و فيما يلي اخلطوات املتبعة لعمل قطاعات نسيجية و تتلخص فيما يلي:

احلصول على العينة. -1

تثبيت العينة. -2

غسل العينة. -3

نزع املاء من العينة. -4

ترويق العينة. -5

ختليل أو تشريب العينة. -6

طمر العينة. -7

التشذيب -8

القطع. -9

حتميل القطاعات على الشرحية. -10

صبغ القطاعات. -11

عمل شرحية مستدمية. -12

و سوف نتطرق لكل خطوة بشيء من التفصيل:

4



:Obtaining the specimen 1. احلصول على العينة

من اإلنسان املريض خالل العملية اجلراحية ومن احليوان بعد قتله Biopsyحنصل على العينة مباشرة

: هو إيقاف دائم وسريع جلميع العمليات احليوية. القتل •

التخدير.( –ضرب مؤخرة الرأس –التنخيع –و تتم عملية القتل بعدة وسائل )الذبح •

: وهي من أسهل العمليات وأسرعها وتطبيق على معظم احليواانت الفقارية إذا استثنينا الذبح •األمساك منها وتستخدم سكني حادة جدا وتتم عملية الذبح بقطع أوردة وشرايني الرقبة مع

القصبة اهلوائية والبلعوم .

: ويقصد هبا شل احليوان شال كامال وذلك بفصل احلبل الشوكي عن اجلهاز العصيب التخنيع • املركزي أو املخ وبذلك ال حيس احليوان ابألمل أثناء عملية

التشريح وتتم عملية التخنيع بغرز إبرة التشريح احلادة فيما بني الفقرة األو ىل من الفقرات ن وكي مث حترك هذه اإلبرة مينة ويسرة حىت نضمالعنقية واجلمجمة حىت تصل إىل احلبل الش

االنفصال التام للحبل الشوكي عن اجلهاز العصيب املركزي وكثريا ما يطبق على الضفادع.

: وهتدف إىل ارجتاج خمي مفاجئ حبيث يصبح احليوان بعدها يف حالة ضرب مؤخرة الرأس •ابجتاهك مع يث تكون الناحية البطنيةغيبوبة اتمة تتم هذه العملية ابإلمساك اجليد ابحليوان حب

ترك منطقة العنق والرأس حرة احلركة مث يضرب مبوخرة الرأس اخللفية ويشكل سريع ومفاجئ على أي جسم صلب الطاولة وجيب أن يتم االرجتاج املخي بضربة واحدة فقط بدون تردد أو خوف

الطريقة الدم من فتحيت األنف ) هذه وإال أتمل احليوان ويعرف جناح العملية يف حالة الفار خبروج تناسب الفئران والضفادع( .

: هو إيقاف مؤقت جلميع العمليات احليوية إبستخدام مادة خمدرة مثل: التخدير •

) الكلورفورم(

:Fixation 2. التثبيت

هتدف و الخطوة األولى في تحضير األنسجة من أجل إخضاعها للفحوصات النسيجية والكيميانسيجية هذه اخلطوة إىل احملافظة على النسيج و حمتوايته على احلالة اليت كان عليها يف جسم الكائن احلي أو قريبة

5



ني اجملاميع الفعالة فيزايئية بمن ذلك وتتم عملية التثبيت من خالل التفاعالت الكيميائية و التداخالت ال –دهون –تني برو –للمثبت و اجملاميع الفعالة للمواد الكيميائية املوجودة يف النسيج )كربوهيدرات

صبغات(. و تقوم عملية التثبيت إبيقاف عملية التفتت والتفسخ -أمالح معدنية -إنزميات Disintegration و التعفنPutrefaction البكترياي و الفطرايت و كذلك الناجتة عن نشاط

إيقاف عملية التحلل الذايت للنسيج بفعل اإلنزميات.

الهدف من التثبيت:

و حتويل مكوانت النسيج الذائبة إىل مواد coagulation of proteinsختثري الربوتينات -1لنسيج يف ا غري قابلة للذوابن يف مجيع احملاليل و األوساط الكيميائية اليت سوف يتعرض هلا

العمليات الالحقة.

و swellingواالنتفاخ shrinkageاحلفاظ على سالمة اخلالاي من التشوه واالنكماش -2احملافظة على ضغطها األمسوزي خالل تعرضها للمحاليل الكيميائية يف عمليات نزع املاء و التخلل

و الطمر.

ع. إعطاء النسيج قدر من الصالبة املطلوبة لتهيئته للتقطي -3

هتيئة النسيج حبيث يصبح سهل اإلنفاذ وقابل للتصبيغ و متييز أجزاءه عن بعضها البعض عند -4 الفحص حتت اجملهر .

وحتى تتحقق األهداف المرجوة من التثبيت المذكورة أعاله البد من مراعاة النقـاط التالية:

اختيار املثبت املناسب للعمل حسب الغرض من الدراسة. -

وضع العينة يف املثبت مباشرة بعد أخذها من اجلسم ملنع عملية التحلل والتفسخ. -

إن يكون حجم العينة صغري حبيث يسمح للمثبت ابلنفاذ خالل العينة يف وقت قصري )مسك العينة ال - مم( 5-2يزيد على

ضعف.( 20-10إن يكون حجم املثبت عدة أضعاف حجم العينة) -

ساعة على األغلب.( 24ضرورة التقيد ابلفرتة الزمنية الالزمة للتثبيت حسب املثبت املستخدم) -

األخذ يف االعتبار اآلاثر اليت سيرتكها املثبت على مكوانت النسيج وتركيب اخلالاي بعد التثبيت. -

-ين) جيإذا مل يتوفر املثبت املناسب يف حاله طارئة جيب وضع العينة يف السائل النيرتو -

مئوية( إىل حني توفر املثبت املناسب . 182

6



جيب غمر العينة أبكملها يف املثبت وذلك برج املثبت عدة مرات بعد وضع العينة فيه حىت تتبلل مجيع - أسطح العينة ابملثبت.

Fixativeالمثبت

كيميائي للخالاي الهو عبارة عن وسط سائل حيتوي على مواد كيميائه بعضها يعمل على تثبيت احملتوى واملواد بني اخللوية عن طريق التخثري والرتسيب وبعضها يعمل على معاكسة الوسط املذيب على خالاي

النسيج من التشوه.

شروط المثبت الجيد:

يتخلل األنسجة بسهولة وبسرعة. .1

يعمل يف درجة احلرارة العادية. .2

ال حيدث ضرر ابلنسيج. .3

نوعاً ما حبيث يصبح قوامه سهل التقطيع. يعمل على تيبس النسيج .4

ال يتعارض مع الصبغات املختلفة عند صبغ العينة. .5

يستمر مفعولة ملدة طويلة. .6

يقتل اجلراثيم والفطرايت اليت تساعد على حتلل األنسجة. .7

أن ال يرتك املثبت أي آاثر جانبيه سيئة أو أصباغ على النسيج. .8

أن يكون سعره مناسبا ومتوفرا ابستمرار. .9

العوامل المؤثرة على عملية التثبيت:

(ألن زايدة األس اهليدروجيين أو 8 -6األس اهليدروجيين للمثبت: جيب أن يكون ما بني) -1 . Bufferالنقصان يتلف األنسجة وميكن احلصول على درجة احلموضة ابستخدام حملول واقي

تزداد سرعة النفاذ بزايدة درجة حرارة املكان والعكس صحيح أال أن احلرارة درجة حرارة املكان: -2 ( درجة مئوية. 25العالية تتلف األنسجة لذا يفضل أن تكون درجة احلرارة)

( ضعفا. 20-10تركيز املثبت وكميته: يتناسب مع حجم العينة طرداي) -3

مدة التثبيت: تتناسب مع حجم العينة طرداًي. -4

نيف المثبتات: أنواع وتص

7



( مثبت وقد صنفت 650املثبتات املستخدمة يف الدراسات النسيجية والكيميانسيجية كثرية قد تربو على) م الذي صنف املثبتات إىل: 1960بعدة طرق نذكر منها تصنيف بيكر

لي، يمثبتات كيماوية خمثرة للربوتني: مثل حامض البكريك )املر(، كلوريد الزئبقيك، الكحول اإلث -1 األسيتون، اثلث كلوريد محض اخلليك.

مثبتات كيماوية خمثرة للربوتني: مثل الفورمالدهيد، محض اخلليك، ثنائي كرومات البواتسيوم، ر ابع -2 كلوريد األوزميوم.

وهناك عدة أنظمة لتصنيف املثبتات يعتمد بعضها على:

طبيعة عمل املثبت. .1

استعمال املثبت . .2

الغرض من الدراسة )نسيجيه أو كيميانسيجيه. ( .3

على املواد املوجودة يف املثبت: .4

وغريها. N.B.Fمثبتات حمتويه على جمموعات ألدهايديه مثل:مثبت الفورمالني، فورمول الكالسيوم، •

أوزميوم( -كروم –مثبتات حمتويه على أيوانت معدنية )زئبق)مثبت زنكر،هلي،سوسا( •

تويه على محض املر)مثبت رومسان، كارنوي، بوان.( مثبتات حم •

مثبتات الكحول و األسيتون. •

تركيب المثبت:

مثبتات بسيطة. •

مثبتات مركبة: •

مثبتات تشريح دقيق. •

مثبتات خلوية )نووية و سيتوبالزمية.( •

Formalin 10%الفورمالينأنواع املثبتات اجليدة:

فورمالدهيد وأحسن نسبة للفورمالني % 04هو أكثر احملاليل املثبتة استعماالً . واملركز منه عبارة عن مل من املاء املقطر. 90مل من احمللول املركز إىل 10من احمللول املركز أي إضافة % 01املثبت

.ساعة على األقل حسب حجم العينة 12 42مدة تثبيت العينة من

مميزاته : •

8



رخيص الثمن. .1

ال يسبب تصلب أو انكماش للنسيج إذا تركت العينة فيه فرتة طويلة. .2

يصلح كمثبت جلميع الصبغات. .3

ميكن حفظ العينة فيه مدة طويلة. .4

ميكن االكتفاء بغسل النسيج بعد التثبيت ملدة ساعة فقط. .5

عيوبه : •

له أتثري ضار على اجللد لذلك جيب االستعمال للقفازات. .1

يسبب بعض االلتهاابت للغشاء املخاطي لألنف ولذلك جيب هتوية املكان جيداً . .2

• Zinker Solution تركيبه: محلول زنكر

غرام. ويكمل إىل 1غرام. + سلفات صوديوم 2.5غرام. + دايكرومات بواتسيوم 5كلوريد زئبق قبل االستعمال Pacial acidic acid .مل حامض خليك ثلجي 5مل ماء مقطر .ويضاف 100

مباشرة.

مميزاته : •

قوة حفظه للنواه. .1

يستعمل أكثر لنخاع العظام واألعضاء الدموية. .2

: عيوبه •

ساعة. 12جيب غسل النسيج بعد التثبيت ابملاء اجلاري ملدة .1

ساعة. 24ال ميكن تثبيت العينة ألكثر من .2

• : HelleyFluid محلول هيللي

و أحد احملاليل املثبتة املستعملة حلفظ عينة جراحية ھ

مل فورمالني قبل 5يتم إضافة ھیللي فرق يف أن ھناكمثل تركيب حملول زنكر ولكن تركيبه : • االستعمال مباشرة.

الطحال" –مثبت جيد لألعضاء الدموية " النخاع مميزاته : •

ساعة وإال حدث ضرر للنسيج 24جيب غسل العينة ألكثر من .1عيوبه : •

9



ابهظ الثمن .2

Ethyl Alcohol% 70محلول الكحول االيثيلي تركيز •

تركيبه: •

مل ماء مقطر. 26مل ويضاف 70أنخذ منه % 96كحول ايثلي تركيز

إستخدامه: •

يستخدم أكثر يف تثبيت عينات السوائل واملسحات.

: عيوبه •

غايل الثمن. .1

ال يستعمل كثرياً لضعف ختلله لألنسجة. .2

إذا تركت فيه العينة لفرتة طويلة يسبب انكماش يف النسيج ويعطي صالبة زائدة. .3

• Solution Bouin محلول بوان

تركيبه: •

مل. 75محض البكريك )حملول مائي مشبع( .1

مل. 25( %40فورمالدهيد) .2

مل. 5محض خليك ثلجي .3

ساعة على األقل حسب حجم العينة. 12* مدة تثبيت العينة .4

عيوبه:

يسبب انكماش يف النسيج قلياًل. .1

وجود محض البكريك يعطي النسيج اللون األصفر لذلك جيب غسله يف كحول % .2

إلزالة اللون األصفر. 70

ظ الثمن . ھاب .3

يدخل يف تركيبه محض البكريك. .4

مميزاته:

10



يستخدم يف حاالت العظام . .5

. يستعمل أكثر يف حفظ عينات اخلصية .6

: Osmic acidمحلول حمض االوزميك •

كصبغة.2ويستعمل برتكيز % . حملول محض األوزميك

مميزاته:

نية . ھالعينات الديستعمل يف تثبيت .1

مثبت وصبغة. .2

يستعمل يف األحباث عن وجود أجسام جولوجي. .3

• Sossa solution عيوبه :محلول سوسا

ساعة يتصلب. 24إذا ترك النسيج لفرتة طويلة أكثر من

يزيل قليل من التكلسات املوجودة يف النسيج.

مميزاته:

Tri Chloro Acidic Acid وجود

مميزاته: Clarckمحلول كالرك •

يستخدم أكثر يف املسحات. .1

مثبت جيد للنواة وقوة حفظه للسيتوبالزم. .2

مميزاته: Carnoyمحلول كارنوي •

ساعه 1مثبت سريع .ملدة .1

يستخدم يف حتضري العينة السريعة .2 عيوبه:

غايل الثمن.

• Rossman’s fixative: مثبت روسمان

Picric acidمن املثبتات اليت حتتوي على محض املر

11



مثبتات جيدة لتثبيت بروتينات اخللية –

حتتوي على محض املر وهو ثالثي نرتيت – الفينول

تركيبه: •

• Rossman’s fixative Absolute ethyl alcohol saturated with picric acid 90 ml + 10 ml Formalin 40% .

عيوبه:

غايل الثمن.

: Washingعملية الغسل .3

جيب غسل العينة بعد التثبيت و ذلك إلزالة ما تبقى من أثر املثبت على العينة حىت يزول اللون األصفر. % 70العينات املثبتة يف مثبت بوان ابلكحول

ساعات . 8 – 5مشبع ابليود ومدة الغسيل ترتواح من % 96ـ تغسل العينات املثبتة يف زنكر ابلكحول

% 96ـ العينات املثبتة يف مثبت رومسان تغسل ابلكحول

ساعة . 24ـ العينات املثبتة يف الفورمالني تغسل مباء الصنبور اجلاري ملدة

:Dehydrationعملية نزع املاء .4

وهي الطريقة اليت يتم بواسطتها إحالل مادة حمل املاء املوجود يف النسيج هذه املادة تذوب فيها احملاليل و املواد املستعملة يف اخلطوات القادمة مع عدم تشويه النسيج و تتم هذه العملية بتمرير العينة يف

يف األنسجة يف حالة لو وضعتسلسلة متدرجة االرتفاع يف الرتكيز من الكحول اإلثيلي ملنع انكماش كحول مطلق مباشرة ويفضل الكحول ألنه ميتزج بسهوله مع املاء و مع مادة الزايلول املروقة واليت بدورها

متتزج جيدا مع مادة الطمر الربافينية.

12



ة ياملاء ال ميتزج مع مشع الربافني لذلك جيب التخلص من املاء املوجود يف النسيج اخللوي حىت تسهل عملنفاذ الربافني املصهور إىل داخل األنسجة وتتم عملية نزع املاء بتمرير العينة على سلسلة متدرجة االرتفاع

يف الرتكيز من حماليل الكحول االيثيلي وترتواح املدة الالزمة لرتك العينة يف كل خطوة من خطوات نزع املاء دقيقة إىل ثالث ساعات كحد أقصى ويفضل أن مترر العينة يف 30يف حماليل الكحول املختلفة الرتكيز من

مراحلها األخرية من خطوات نزع املاء على حملولني منفصلني من الكحول املطلق وملدة ترتواح من ساعتني إىل ثالث ساعات يف كل مرة وذلك لزايدة التأكيد من متام نزع املاء من العينة .

كحول ايثيلي بدال من الكحول املطلق % 95الرتكيز يفضل استخدام عند حتضري سلسلة كحول متدرجة % 95مل من حملول الكحول 70أنخذ % 70ومنه تعمل الرتكيز املطلوبة فلكي حنضر حملول برتكيز

. % 95مل من املاء املقطر ليكون الرتكيز النهائي من الكحول 25ونضيف إليه

:Clearingعملية الرتويق .5

اليت بو اسطتها يتم إحالل ماده حمل مادة نزع املاء حيث تقوم هذه العملية ابلسماح ملادة العملية مشع الربافني ابلدخول إىل األنسجة يف اخلطوة الالحقة ألن الكحول املستخدم يف نزع املاء ال ميتزج مع مشع

فافا. لنسيج شالربافني لذا تستخدم ماده مروقه تذوب يف الكحول ومشع الربافني وكذلك جتعل ا

د زيت خشب األرز( .و عن –بنزين –تولوين –الكلورفورم –من أمثلة املواد املروقه )الزيلول استخدام الزيلول و التولوين حيدث أحياان أن يتعكر لون حملول مادة الرتويق و هذا دليل على عدم اكتمال

زع ىل سلسلة الكحوالت للتأكد من عملية ننزع املاء من نسيج العينة يف هذه احلالة جيب إرجاع العينة إاملاء بشكل اتم أما املدة الكافية لرتك العينة يف احمللول املروق فهذا يعتمد على نوع وحجم العينة فكلما زاد

حجم العينة كلما زادت مدة الرتويق.

هولة امتزاجه مع قة لسالكحول ال ميتزج مع مشع الربافني لذا يعترب حملول الزيلول من أنسب احملاليل املرو الربافني والكحول وهناك مواد ميكن استخدامها كمروقات مثل التولوين والبنزين والكلوروفورم ولكنها

سريعة التطاير.

6. :Impregnation or Infiltration عملية التشريب أو التخلل

هر ة، و يعترب مشع الربافني من أشعبارة عن إحالل كامل للمادة املستخدمة يف الطمر مكان املادة املروق املواد املستخدمة يف تشريب النسيج حيث أنه يتخلل العينة بسرعة دون إحداث ضرر برتكيبها النسيجي،

13



كما أنه يكسبها دعامة قوية لتهيئتها للقطع ابمليكروتوم، و يساعد على حفظها يف الظروف العادية لفرتة طويلة دون أي أذى.

( مث تنقل العينة إىل 1:1رير العينة يف مزيج متساوي من الشمع واملادة املروقة) وتتم العملية بتممرات ( كل مرة ملدة 3 -2مشع الربافني املطلق املنصهر داخل الفرن و تكرر هذه العملية لعدة مرات)

نصف ساعة، كما تعتمد عدد مرات تغيري الشمع حسب نوع العينة حبيث تقل كلما كانت العينة رخوة وتزداد كلما كانت العينة صلبة.

وجيب أن يراعى التايل:

أن يتم التخلل لكامل أجزاء العينة وحيل حمل املادة املروقة و إال فإن عملية حتضري القطاعات ستكون - غاية يف الصعوبة.

جيب أن يكون مشع برافني التخلل اتم االنصهار )درجتان أعلى من درجة االنصهار( حيث ميتاز بنفاذية - أسرع.

مم( و أال يزيد زمن ختلل 5ضل أال يزيد مسكها عن) يعتمد ز من التخلل على مسك و حجم العينة و يف -عينات العضالت و األنسجة الضامة عن ثالث ساعات حىت ال يتسبب يف صالبتها بينما ميكن أن ترتك

عينات اجللد واجلهاز العصيب يف الشمع املنصهر حىت ست ساعات.

جيب أال يقل حجم الشمع إىل حجم العينة عن عشرون ضعفا. -

( يف عملية التخليل كما جيب أن celloidinيف تقنيات أخرى استخدام مادة السللويدين) و ميكن يكون الطمر بنفس املادة.

:Embeddingعملية الطمر .7

وهي عملية الغرض منها عمل قالب من العينة حبيث حتيط هبا املادة الطامرة وتدعمها و املواد املستخدمة على نوعني:

و اجليالتني و الشمع الكربوين Agar األوساط املائية عند احلرارة املرتفعة مثل اآلجاربعضها يذوب يف-Carbowax .

البعض اآلخر ال يذوب يف األوساط املائية مثل مشع الربافني و السللويدين و امليثاكريالت و مشع اإلسرت. -

ني كيمياء األنسجة و مشع الربافإال أن الربافني أشهرها و أكثرها استخداما يف معامل األنسجة و عبارة عن مادة هيدروكربونية ممزوجة مبواد بالستيكية.

14



وهناك عدة أنواع من مشع الربافني تبعا لدرجة انصهاره:

( درجة مئوية 50 - 45: ينصهر عند درجة حرارة) soft paraffinالربافني الرخو •

( درجة مئوية. 55 - 50: ينصهر عند درجة حرارة) medium paraffinالربافني املتوسطة •

( درجة مئوية. 68 - 56: ينصهر عند درجة حرارة) hard paraffinالربافني الصلب •

و أهم عامل الختيار نوع الشمع هي حرارة الفرن اليت يعمل فيها القطاعات و نوعية العينة حتت داخل القالب مث تنقل العينة ابستخدام ملقط والفحص، و لعمل القالب الشمعي يعبأ الشمع املنصهر

توضع العينة ابالجتاه املرغوب به، بعدها يرتك القالب على سطح ثلجي فرتة قصرية ليربد سطحه اخلارجي ، و حىت ال يلتصق الشمع أبطراف القالب املعدنية فإنه يفضل مسح قاعدته و أطرافه الداخلية ابلفازلني أو

اجلليسرين قبل ذلك.

مع العلم أن هناك أنواع جديدة من أجهزة الطمر اليت تستخدم الشبكات البالستيكية اخلاصة بتمرير القطاعات ومن مث تطمر القطاعات يف النهاية يف هذه الشبكات ) هلذه القوالب ميكروتوم خاص ذو حامل

( القدمي. مالئم حلجم هذه الشبكات خيتلف عن امليكروتوم ذو احلامل اخلاص ابلقالب املعدين

:Trimmingعملية التشذيب .8

بعد حتضري القوالب الشمعية يستحسن تشذيبها بشفرة حادة حىت تصبح العينة يف وضع مناسب للتقطيع حبيث تصبح أطرافها متوازية و ميكن أن تنطبق على حافة سكني امليكروتوم.

: Sectioningتقطيع العينة .9

يف امليكروتوم كما جيب أن يزود جهاز specimen holderتثبت العينة على حامل العينة - 10( ميكرون للبارافني وبسمك) 7 – 3القطع بسكني حادة جداً وحيدد مسك القطاع املرغوب فيه)

أو سلسله من Ribbons( ميكرون للسللويدين، القطاعات اجليدة عادًة تكون على شكل أشرطة15القطاعات ويفضل أن توضع هذه األشرطة على صفيحه سوداء حىت يسهل متييز القطاعات وأخذ املناسب

منها لوضعه على الشرحية الزجاجية.

: Mountingحتميل القطاعات .10

يقصد هبا وضع القطاع النسيجي على الشرحية الزجاجية، وميكن أن تتم هذه العملية إبحدى طريقتني:

15



( درجة مئوية ويرتك القطا ع يطفو على 45 – 40يوضع القطاع يف محام مائي بدرجة حرارة) ( دقيقه حىت ينفرد متاما ، مترر الشرحية الزجاجية حتت هذا القطاع ويلتقط حبيث 2 - 1سطح املاء ملدة)

تكون أية ليلتصق على وسط الشرحية ، وذلك برفع الشرحية ابجتاه القطاع إىل أعلى مع عدم السماح ساعة( تقريباً كما 24( درجة مئوية ملدة) 45فقاعات هوائية ، ترتك الشرحية جتف على جمفف الشرائح)

يفضل أن تكون الشرحية قد دهنت بالصق ماير)عبارة عن حجمني متساويني من مادة زالل البيض رة ماء مث هريه عليها قطواجلليسرين مع سلسالت الصوديوم( كمادة حافظة. ينقل القطاع إىل شرحية جم

توضع على جمفف الشرائح وترتك حىت تتبخر القطرة املائية ويلتصق القطاع جيداً على الشرحية واملدهونة بالصق ماير مسبقاً.

:Stainingعملية الصبغ .11

جيب أن يزال مشع الربافني من القطاعات متاما ابستخدام الزيلول ومن مث جيب التخلص من الزيلول اآلخر ابلكحول املطلق، بعدها جيب نقل القطاعات إىل بيئة مشاهبه للبيئة املذابة فيها الصبغة هو

القطاعات وذلك hydration)مائية أو كحولية ( فإذا كانت الصبغة مذابة يف املاء مثالً جيب متيؤ دقائق 3 )بتمريرها على سلسلة تركيزها متدرجة االخنفاض من حماليل الكحول حىت تصل إىل املاء

كحول فيكتفي بتمرير القطاعات يف السلسلة 50لكل مرحلة( أما إذا كانت العينة مذابة يف % قبل متريرها يف حملول الصبغة. 50الكحولية حىت تصل إىل %

ومدة الصبغ تعتمد على نوع الصبغة وتركيزها وطبيعة النسيج وقد يصبغ النسيج أبكثر من صبغه أو ما يسمى الصبغ املضاد كاستخدام صبغة اهليماتوكسلني لصبغ األنوية وصبغة قد يلجأ الباحث إىل

األيوسني لصبغ السيتوبالزم.

بعد االنتهاء من عملية الصبغ تبدأ عملية إعداد الشرحية اجملهرية للحفظ املستدمي ابستخدام مادة ( مث يوضع غطاء الشرحية) D.P.Xمشعية أو مادة بالستيكية حافظه مثل مادة بلسم كندا أو مادة )

Cover slip درجة وحبذر شديد حىت ال تتكون فقاعات هوائية 45( بزاوية حادةAir bubbles .وهكذا يتم عمل ما يعرف ابلشرحية املستدمية ،

بعد أن ترتك لتجف على جمفف الشرائح ميكن فحص القطاعات حتت اجملهر.

16



ابقة لدم اليت تستخدم عينات قليلة تتم اخلطوات السيف املختربات الصغرية وخمتربات أحباث ابشكل يدوي بينما يف خمتربات األمر اض اليت يتم فيها أجراء فحوصات روتينية لعينات كثرية تتم

ابستخدام أجهزة حديثه منها جهاز معاملة األنسجة األوتوماتيكي

(Tissue Auto processor ) مميزات تقنية مشع الربافني:

هذه التقنية أتخذ وقت قصري لإلعداد) ليس أكثر من يومني(. -1

متصلة مع بعضها البعض Ribbonsتعطي سلسلة متتابعة من القطاعات تسمى أشرطة -2 وهذه األشرطة مهمة للعمل البحثي.

تعطي قطاعات رقيقة جداً. -3

قطاعات هذه الطريقة سهلة الصبغ. -4

عيوهبا:

تخدم املثبتات والفرن واليت قد تضر ابلنسيج وبتفاصيل تركيب اخلالاي. هذه الطريقة تس -

استخدام املثبتات قد يذيب احملتوى الدهين للنسيج خالل التحضري لذا ال ميكن دراسة الدهون هبذه الطريقة. -

هذه الطريقة ليست مثالية يف كيمياء األنسجة ألن احلرارة حتطم األنزميات مثاًل. -

The Celloidin Technique ثانياً: تقنية السللودين

ن. تشبه الطريقة السابقة طريقة مشع الربافني إال أنه يف هذه الطريقة يتم استبدال الربافني ابلسللويديحيث أن بعض العينات مثل عينات العظم والعني يفضل أن يعمل فيها قوالب من السللويدين املعروفة

( وقبل الطمر جيب أن توضع العينة يف خليط من ثنائي األيثر nitrocelluloseمبادة النيرتوسيليلوز)والكحول اإلثيلي بنسب متساوية مث تنقل العينة ملدة أسبوع يف كل من حماليل السللويدين)

( املذاب يف خليط ثنائي إثيل اإليثر والكحول املطلق على أن توضع العينة داخل احملاليل 8%،4%،2%أضعاف حجم العينة وأن يكون 10كم اإلغالق، وجيب أن يكون حجم احمللول على األقل يف وعاء حم

( وترتك 8أضعاف أطول طرف للعينة. تنقل بعد ذلك العينة إىل حملول السللويدين)% 3عمقه على األقل Fumeفرتة حىت تزول الفقاعات اهلوائية بعدها ينفخ على العينة بشكل جزئي وترتك حتت شافطة أخبرة )

hood أايم حىت يسمح للتبخر إىل نصف احمللول تقريباً، بعد ذلك يعمل قالب من العينة 10 – 5( ملدة

17



( بداخلة كلوروفورم حىت يعمل على تصليب Desiccatorحييط هبا السللويدين وتنقل إىل وعاء جتفيف)( 4ويدين)%سلل القالب، بغد ذلك ترفع العينة من وعاء التجفيف وتلصق على حامل خشيب ابستخدام

( حلني البدء يف عمل قطاعات منة. 70وحيفظ القالب داخل كحول إثيلي)%

Low Viscosityوميكن أن يستخدم نوع خاص من السللويدين ذو لزوجة أقل)Nitrocellulose(ويرمز له ابلرمز )L.V.N ويستخدم يف بعض احلاالت اخلاصة لعينات اجلهاز )

( 5,% 01,% 02طريقة ابستخدام حماليل من نفس املادة برتكيز)%العصيب.وتعامل العينة بنفس الزيت 0.5مذابة خبليط من ثنائي األيثر والكحول اإلثيلي املطلق بنسب متساوية مضافاً إليها %

(. Castor Oilاخلروع)

مميزاهتا:

تعطي مقاطع كاملة الوضوح ميكن رؤية تفاصيل األنسجة. •

فظ الرتاكيب النسيجية كما هي. عدم استخدام احلرارة فيها حي •

ممكن استخدام قطع كبرية من األنسجة مثل استخدام العني كاملًة عيوهبا: •

حتتاج إىل وقت طو يل )شهر تقريباً( إلعداد القطاع. •

ال ميكن احلصول على أشرطة من القطاعات ألهنا مسيكة ومنفصلة عن بعضها البعض. •

قطع والصبغ. قطاع السللويدين جداً صعب يف ال •

Frozen Methodثالثاً:تقنية التجميد

يف هذه الطريقة النسيج الطري أو املثبت جيمد ويصلب ويعمل منه قطاعات ابمليكر وتوم الثلجي (. cryostatأو ما يسمى ابلكريوستات )

مميزاهتا:

طريقة سريعة وبسيطة تستخدم عادة خالل العمليات اجلراحية اليت تطلب تشخيص سريعا للسرطاانت.

املواد الكيميائية املوجودة يف النسيج ال تتغري بسبب عدم استخدام احلرارة.

تستخدم يف كيمياء األنسجة لدراسة فعالية األنزميات اخللوية والكشف عن الدهون وتفاعل ادة مع األنتيجينات . األجسام املض

18



عيوهبا:

ال تعطي سلسله من املقاطع. •

تعطي قطاعات مسيك بسب صعوبة القطع و التصبيغ. •

: Decalcificationعمليه نزع الكالسيوم من النسيج

من املعلوم أن وجود أمالح الكالسيوم يف األنسجة تسبب تصلباً للنسيج

يتعذر معه تقطيع هذه األنسجة بواسطة امليكروتوم لذا جيب إزالة هذه األمالح لنتمكن من احلصول على عينة نسيجية لينة ميكن تقطيعها دون إحداث ثلمات أو أضرار يف سكينة القطع.

تعريف عملية نزع الكلسيوم:هي الطريقة اليت نقوم بواسطتها إبزالة ترسبات أمالح الكالسيوم من األنسجة الغنية هبا مثل العظام واألسنان.

وتتم العملية بوضع العينة يف حملول انزع للكالسيوم مثل: حملول بريين، حملول محض الفورميك املنظم، ت، حملول ليلي. حملول جودنج و ستيورت، حملول مشيد

التحضيرات اال مقطعية

شريحة مجهر ية لسحبة من دم اإلنسان .1

: األدوات واملواد املستخدمة

يود صبغة ال أدوات تشريح –شرائح وأغطية – جمهر مركب –كحول – إبرة وخز مقطر ماء –قطن –مسحة طبية –

محض خليك صبغة رأيت أو لشما دم إنسان –لزق جروح ن

:ابلنشاط املرافق بلوغ األهداف التالية يتوقع منك عزيزي الطالب نتيجة قيامك: األهداف

. لسحبة من دم اإلنسان بشكل سليم للفحص أن تعد شرحية جمهرية1-

. أن تكون قادراً على التعامل مع اجملهر املركب بشكل سليم2-

. واالختالف بني اخلالاي الدم احلمراء والبيضاء أوجه الشبهأن حتدد 3-

-: خطوات العمل

19



. اإلهبام بواسطة املسحة الطبية أو قطن مبلل ابلكحول نظف إصبع .1

على طرف شرحية نظيفة. أثقب اإلهبام إببرة الوخز مث ضع الدم

ى أخرى وضع لز قة عل الطبية مرة بعد احلصول على الدم نظف اإلهبام ابلكحول أو املسحة .2 . اجلرح

درجة 30الشرحية األوىل بزاوية ضع شرحية اثنية فوقها حبيث يكون أحد أطرافها مائالً على .3 .مئوية

خر على معتدلة يف اجتاه الطرف األ بعد انتشار الدم على الشرحية العليا ادفع الشرحية بسرعة .4 ملاذا؟.الشرحية األوىل

الشرحية جتف يف اهلواء دع .5

تقريباً صبغة أخرى لفرتة دقيقتني اصبغ الشرحية بصبغة رأيت أو صبغة لشما ن أو يود أو أي. .6 .

؟ ملاذا. أغسل الشرحية ابملاء املقطر أكثر من مرة .7

……………………………………

. أترك الشرحية لتجف .8

:والحظ ضع الشرحية حتت اجملهر املركب لفحصها .9

………………… . شكل خالاي الدم احلمراء

………………… .خالاي الدم البيضاء شكل

.……………………………… . النواة

أكرب أضف قطرة من محض اخلليك عند طرف غطاء مالحظة خالاي الدم البيضاء بسهولة .10 . الشرحية

خالاي الدم البيضاء واحلمراء

20



الحرشفية شريحة مجهرية للخاليا .2 واملواد املستخدمة: األدوات

-ماء مقطر –قطارة –صبغة ازرق املثيلني -قضيب زجاجي –شرائح وأغطية –جمهر مركب نكاشات أسنان –فازلني

-: خطوات العمل

. ضع قطرة صغرية من املاء املقطر وسط الشرحية .1

حك و لعدة مرات بطانة التجويف الفمي بعد املضمضة بواسطة النهاية املستعرضة لنكاشة األسنان حيت .2حتصل على كمية الأبس هبا من اخلالاي احلرشفية ويعرف ذلك برتاكم مادة بيضاء اللون على رأس

النكاشة.

حرك هناية النكاشة يف قطرة املاء الصغرية على الشرحية. .3

تضاف قطرة صغرية من أزرق املثيلني. .4

متزج القطرة مع قطرة الصبغة جيدا إبستخدان القضيب الزجاجي. .5

حية ابلقرب من حملول العينة ومبساعدة ابرة التشريح نزل الغطاء ابلتدريج حىت ينطبق ضع غطاء الشر .6 على الشرحية اجملهرية.

.ينبسط احمللول متاما مع عدم تكون فقاعات هوائية حبيث يتناسب حجم احمللول مع غطاء الشرحية .7

راحارا يفضل أن تدهن حواف غطاء الشرحية من اخلارج ابلفازلني غذا كان اجلو حا .8

تفحص حتت اجملهر. .9

non)Stratified Squamous - Epitheliumاألنسجة الطالئية احلرشفية املصففة غري الكرياتينية(keratinized تتكون الطالئية يف هذه احلالة من طبقات من اخلالاي فوق بعضها البعض . ويرتاوح مسك أو

ية املسماة طبقة ملبيجي أو الطبقة اجلرثوم –طبقة. وتقع الطبقة السفلى 30-5عدد طبقات اخلالاي عداوة من على غشاء قاعدي مثىن. وتتكون هذه الطبقة السفى من خالاي مكعبانية أو عمودية قصرية ، هلا أنوية كرية –

هي تعطي ف أو بيضاوية وسيتوبالزم حمبب. ويشيع اإلنقسام غري املباشر يف خالاي الطبقة القاعدية ، وعلى ذلك خالاي جديدة تكون الطبقات الواقعة فوقها .

21



أما اخلالاي يف الطبقات الوسطة هلذه الطالئية فهعي متعددة األضالع ، بينما تنضغط خالاي الطبقات السطحية ، وتصبح مفلطحة كلما إقرتبت من السطح. وعلى هذا فإن اخلالاي الواقعة يف الطبقة العليا احلرشفية ، وتبدو

هذه اخلالاي مفلطحة . أنوية

طرز تواجدها

، Conjunctivaعادة يكون هذا الطراز من الطالئيات رطبا ، ويكون بطانة مريء الثدييات ، وامللتحمة خلزعة من H&Eيف الذكور . صبغة Urethraوالقرنية واملهبل والقناة الشرجية واجلزء الطريف يف جمرى البول

مريء سليم تظهر النسيج الطالئي ذو اخلالاي احلرشفية املصففة

مقطع يف اجللد البشري يظهر سطح النسيج الطالئي احلرشفي املصفف, الذي يسمى البشرة .

الوظائف: هلذا الطراز من الطالئية وظائف اإلفراز واحلماية .

Stratifiedئية االكرياتينيةا احلرشفية الطالئية نسيج طالئي حرشفي مصفف كرياتيين الطالEpithelium (Keratinized)Squamous متاثل هذه الطالئية الطراز السابق ، فيما عدا أن اخلالاي

22



احلرشفية السطحية تتحول إىل طبقة ميتة أو قرنية من حراشيف مفلطحة من مادة ، تعرف إبسم اكري اتنيا ة على فرتات ، وحتل حملها طبقة جديدة من اخلالاي الواقعة أسفلها . وتتساقط هذه الطبقة امليت

. Epiderisطرز تواجدها: تكون الطبقة اخلارجية للجلد واملعروفة إبسم االبشرة ا

الوظائف: تقوم هذه الطالئية أساسا بوظيفة احلماية.

تحضير بعض األوليات الطفيلية بالطريقة المباشرة .3

وأنواع (free Living)األوليات عبارة عن كائنات حيوانية وحيدة اخللية، ويوجد انواع منها حرة املعيشة تعتمد على غذائها إما على احليوان أو على النبات وبعض هذه (Parasitic Living)طفيلية املعيشة

اس من الضفادع على عدة اجنالطفيليات ضار ويسبب كثريا من األمراض وحتتوي امعاء الربمائيات وابلذات الكائنات األولية الطفيلية اليت تعترب من انسب املصادر للدراسة لسهولة احلصول عليها:

Kingdom Animal

Phylum Ciliophora Class Ciliatea

Subclass Rhabdophorina Order Hymenostomatida

Suborder Peniculina

Kingdom Animal Phylum Ciliophora Class Ciliatea Subclass Rhabdophorina

Family Trachelidae Genus Dileptus

23



األدوات واملواد املستخدمة:

صبغة ازرق امليثيلني -%0.5حملول كلوريد الصوديوم -أدوات تشريح -كأس زجاجية صغرية -ضفدعة

وئي جمهر ض -ادوات تشريح -قضيب زجاجي -قطارات -اغطية شرائخ -شرائح -داببيس -فازلني – طريقة العمل:

أمسك الضفدعة جيدا من اطرافها اخللفية مث اضرب مبؤخرة رأسها و بشدة على حافة الطاولة حىت .1 تصبح يف غيبوبة اتمة.

تثبت الضفدعة جيدا يف طبق التشريح ابلداببيس على انحيتها الظهرية مث يفتح التجويف البطين .2 ابقي األعضاء.بسرعة وتعذل القناة اهلضمية ويفصل املستقيم عن

ويفتح %0.5مل من حملول كلوريد الصوديوم 10يوضع املستقيم يف الكأس الزجاجية هبا .3 املستقم ابملقص مث حيرك جيداً يف احمللول امللحي وبعدهل يبعد املستقيم وحيفظ احمللول حيت ترتسب

ة.الشرحي خملفات الطعام اسفل الكأس ، توضع قطرة صغرية من هذا احمللول الرائق يف وسط

تضاف قطرة صغرية جدا من صبغة ازرق امليثيلني. .4

التحضيرات المستديمة ألجزاء كيتينية من الحشرة. .4

التخلص من األنسجة والعضالت .1

دقائق 10( ويغلي ملدة %10يوضع اجلزء املراد حتضريه يف حملول صودا كاوية)

)أكثر أو أقل تبعا لصالبة اجلزء( ولكن يراعي أال يفقد لون الكيوتيكل.

Family Parameciidae Genus Paramecium

24



( بدون غلي لكن ملدة أطول قد تصل %10)ميكن وضع اجلزء املراد حتضريه يف حملول صودا كاوية) .إيل عشرة أايم(

تغسل العينات غسال جيدا ابملاء املقطر عدة مرات. .2

: إزالة املاء من العينات .3

-90 -80 -70-60ابإلمرار يف سلسلة من الرتكيزات املتصاعدة للكحول اإليثيلي )

ساعة يف كل تركيز تبعا للحجم والصالبة. 12دقيقة إيل 15( ملدة من 100%

كحول مث تنقل لباقي %70إذا أردان صبغ العينات فإهنا ترتك يف الصبغة بعد متريرها يف تركيز .4 .الرتكيزات املذكورة

:الرتويق عملية .5

دقيقة ) ميكن أستخدام زيت القرنفل أو زيت السيدر(. 10 -5توضع العينة يف الزيلول من

:عمليةاللصق .6

توضع العينة علي شرحية نظيفة ويوضع عليها قطره من الكندابلسم مث تغطي الشرحية بغطاءالشرحية -25مع تفادي دخول فقاعات اهلواءتوضع الشرائح يف فرن لتجف يف درجة حرارة ترتاوح بني

.درجة مئوية 35

حشرة القراد قبل معاجلتها للفحص حتت اجملهر الضوئي.

ةيرهجملا تاريضحتلا - ksuرداقلا دبع رمع . د ةیرھجملا...

Documents