lab genetische endocriene en metabole ziekten (klein beetje) biochemie opwerken buis bloed /...

55
Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A.J. Kluijtmans Lab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten UMC St Radboud

Upload: mark-t

Post on 24-May-2015

219 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Laboratorium diagnostiek van cystine

dr. Leo A.J. KluijtmansLab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten

UMC St Radboud

Page 2: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten

(Klein beetje) biochemie

Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten

Meting cystine (eigenlijk: cysteine)

Hoe kunnen we elkaar vinden

Vragen

Inhoud presentatie

Page 3: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten)

Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek

8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen)

Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten

Page 4: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Het UMC St Radboud, Nijmegen

Page 5: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

LGEM laboratorium

Page 6: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

LGEM laboratorium

Page 7: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De humane cel

1. Lysosoom2. Celmembraan3. Mitochondrion4. Endoplasmatisch

reticulum5. Cytoplasma6. Kernmembraan7. Kernporie8. Kern9. Kernlichaampje10.Ribosoom11.Golgi-systeem.

Page 8: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Ontdekt in 1949 door Christian de Duve

De stofzuigers van de cel

Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal)

Afbraakproducten gaan naar cel plasma

Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

Het lysosoom

Page 9: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( )

NH2

Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH

( ) NH2 NH2

Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( )

COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH (

)NH2

De belangrijkste spelers

Page 10: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Hoe gaat het ‘normaal’?

cystine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

Page 11: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Wat gebeurt er bij Cystinosis

cystine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

cystine

Page 12: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Wat gebeurt er bij Cystinosis

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

cystine

Page 13: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Werking van cysteamine

cysteamine

cysteine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystìne-transporter

Page 14: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect

Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten)

Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten

DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

Diagnose cystinosis

Page 15: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:
Page 16: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Isolatie granulocyten uit bloed◦ Vermijden contaminatie met andere bloedcellen

(mn rode)

Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine◦ Oxidatie van cysteine geeft cystine◦ Rode- en witte bloedcellen bevatten veel

cysteine

Wat zijn de ‘challenges’

Page 17: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Granulocyt isolatie(polymorphonucleaire cellen)

Page 18: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden

Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

Leukocyt isolatie, procedure

Page 19: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Dextraan incubatie, 1 uur op ijs

Leukocyten (witte cellen)

Erythrocyten (rode cellen)

Page 20: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Het leukocyten isolaat

Neutrofiele granulo

Eosinofiele granulo

Basofiele granulo

Lymfocyt Monocyt

35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6%

Totaal: 4.4-11.0 x 109 per liter

granulocyten

Page 21: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Dextraan incubatie

Leukocyten (witte cellen)

Erythrocyten (rode cellen)

Page 22: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker).

Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen)

Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm)

Scheiding op soortelijk gewicht

Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie

Page 23: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De Centrifuge

Page 24: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De Ficoll gradient

lymfocyten

granulocyten

Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

Page 25: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:
Page 26: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving

Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten

+ 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

Contaminatie met rode bloedcel

Page 27: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS).

Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g

Afzuigen wasbuffer en invriezen invloeibare stikstof (-196°C)

Opslag in -80°C vriezer tot analyse

Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten

Page 28: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:
Page 29: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Meting cystine uit de granulocyt met HPLC

Page 30: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Wat is de situatie ?

De cel

Lysosoom

cysteine

Andere –SH

verbindingen

cystine

HOOC HC-CH2-SH NH2

Page 31: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Cellen kapot maken

Page 32: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij…

Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine

Vals verhoogd cystine

Page 33: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

N-ethylmaleimide (NEM)

Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)

De oplossing…

Page 34: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( )

+ NEM

Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook

het aanwezige cysteine weg

Het bindt NIET aan cystine

in overmaat

Page 35: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Complex mengsel van verbindingen

Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

Page 36: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Complex mengsel van verbindingen

Page 37: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen.

De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden

Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten.

Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

Het complexe mengsel

Page 38: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Complex mengsel van verbindingen

Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

Page 39: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

HPLC: High Performance Liquid Chromatography(hogedruk vloeistof chromatografie)

Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

Cysteine meting met HPLC

Page 40: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Hoe werkt HPLC?

Page 41: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De ‘cystine’ HPLC in het lab.

Page 42: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden

Page 43: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De vloeistoffen

Page 44: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

De monster verwisselaar van de HPLC

Page 45: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen.

Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

Cysteine kwantificeren

Page 46: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Chromatogram

Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

Page 47: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Van piekoppervlak naar concentratie

Hoeveelheid cysteine

Oppervlakte piek

In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald.

Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µM

Page 48: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Oppervlak ~ Concentratie cysteine

Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine)

Cysteine concentratie wordt gehalveerd.

Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen.

Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.

Van cysteine concentratie naar uitslag

Page 49: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s)

Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten)

Referentiewaarden / Targetwaarden

Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld:

Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.

Page 50: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Kinderpoli: 11-01-2011 Volwassenen: 17-01-2011 Kinderpoli: 25-01-2011 Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01)

Kinderpoli: 12-04-2011 Volwassenen: 18-04-2011 Kinderpoli: 26-04-2011 Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04)     Kinderpoli: 14-06-2011 Kinderpoli: 21-06-2010 Volwassenen: 27-06-2011 Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06)

Volwassenen: 26-09-2011

Kinderpoli: 11-10-2011 Kinderpoli: 25-10-2011 Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

Wat bieden we aan in 2011?

Page 51: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen.

Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking)

Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.

Isolatie granulocyten in Nijmegen

Page 52: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit

Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’

Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.

Ter afsluiting

Page 53: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Analisten:Dinny van Oppenraaij-EmmerzaalJenneke Keizer-GarritsenGwendolyn BeckmannLouk Geelen

“Het Oude Team”Addy de Graaf-HessHenk Blom

Elena Levtchenko

Marjolein Bos

Acknowledgments

Page 54: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Ter afsluiting nog een mooi plaatje…

Page 55: Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

ERNDIM, kwaliteitsrondzendingenEuropean Research Network Inherited Disorders of Metabolism