下水試料中の女性ホルモン 測定法の課題 - lc/ms/ms と elisa の比較から-
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下水試料中の女性ホルモン 測定法の課題 - LC/MS/MS と ELISA の比較から-. 建設省土木研究所 ○高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、 岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明. 背景・目的. 17β エストラジオール の内分泌攪乱 作用大 下水 の内分泌攪乱作用にしめる 割合大 実態調査 (下水道)は ELISA法 を使用 ELISA法は測定 簡易 bu t 正・負の誤差 ↓ LC/MS/MS を用いた測定法の検討 ELISA法の測定値を 確認. LC/MS/MS 法 の検討. GC/MS : 誘導体化が必要 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
下水試料中の女性ホルモン測定法の課題
- LC/MS/MS と ELISA の比較から-
建設省土木研究所○ 高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、 岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明
背景・目的• 17β17β エストラジオールエストラジオールの内分泌攪乱作用大作用大• 下水下水の内分泌攪乱作用にしめる割合大割合大• 実態調査実態調査(下水道)はELISA法ELISA法を使用• ELISA法は測定簡易 簡易 bubu t 正・負の誤差t 正・負の誤差
↓
•LC/MS/MSLC/MS/MS を用いた測定法の検討• ELISA法の測定値を確認確認
LC/MS/MS 法の検討•GC/MS : 誘導体化が必要 抱合体の分解必要 形態別の把握が困難
•LC/MS/MS : 誘導体化が不要不要 抱合体の分解不要分解不要 形態別形態別の把握が可能• 使用装置 : FINNIGAN TSQ7000
条件検討① 化法と特定イオン イオンAP-ESI AP-CI
MW 特定イオンPosi Nega Posi Nega
17β E2 272 [M-H]- × 271 × 271
EE2 296 [M-H]- × 295 × 295
E2-Ac 314 [M-H]- × 313 × 313
E2-3Sul(Na) 374 [M-Na]- × 351 × ×
Estrone 270 [M-H]- - 269 - -Estriol 288 [M-H]- - 287 - -
条件検討② MS/MS 測定条件Collision EnergyとDaughter Ions
親イオン20eV 30eV 40eV 50eV
17β E2 271 × × 145,183 145,183
EE2 295 × × 145 145,159
E2-Ac 313 × 253 253 145
E2-3Sul(Na) 351 × 271 271 271
Estrone 269 × (145) 145 145
Estriol 287 × × 145,171 145,171強度が減少、イオン BG が低下、 S/N 比が 10 倍以上
向上
• 装 置: TSQ7000 、 HP1100• :カラム HP Zorbax Eclops XDB-C18 、 2.1×150mm• 移動相:アセトニトリルアセトニトリル // 水水( 60:40 )、 0.2mL/min• 注入量: 10μL• 化 :イオン AP-ESIAP-ESI NegativeNegative 、 Collision Energy 40eV 、 Argon 2.2-2.3 mTorr • 測定質量数: 271271( Parent ) 、 145( Daughter )
測定条件 LC/MS/MS 法
供試試料 (下水試料)下水処理方式 処理水量
A 標準活性汚泥法 172千m3/ 日
B 標準活性汚泥法 152千m3/ 日
C 標準活性汚泥法+砂ろ過+礫間接触酸化
49千m3/ 日
D 循環式硝化脱窒法 92千m3/ 日
E 凝集剤添加循環変法+砂ろ過
118千m3/ 日11年7,8,9月、スポット、流入と放流
試料調整 LC/MS/MS (抽出)
C18固相抽出
溶出( EtOAc/MeOHEtOAc/MeOH = 1/5 )乾固
抽出物
超音波抽出(アセトン)
ろ液
SSろ過ろ過
試料 1000ml
未精製試料の測定
17βEstradiol
17βEstradiol-d3
Ethnyl Estradiol
Standard Influent
m/z=271
m/z=273
m/z=295
4.6×150mm 、 MeCN/H2O=6/4 、 0.4ml/min
精製方法 TLC 法
展開層 最下層 下層 中間層 上層 最上層
Rf値 0.0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.8 0.8-1.0
17β E2 0 0 100 0 0
EE2 0 0 100 0 0
E2-Ac 0.4 0.6 0.2 98.8 0
E2-3Sul(Na) 85.8 7.2 4.1 1.6 1.31. 3
2.
• Silica Gel 60 (MERCK) 、 CHCl3/ アセトン =9/1•回収率は 6060~~ 7070%• 抱合体抱合体の精製は不十分不十分
精製した試料の測定 ( TLC )
17βEstradiol
17βEstradiol-d3
Ethnyl Estradiol
m/z=271、145
m/z=275、 145
m/z=295、 145
精製後 精製前
精製方法 抽出法・ 法カラム• 抽出法 : 親水性成分の除去 EtOAc 、 EtOEt 、 n-Hx に溶解、食塩水で抽出 n-Hxn-Hx/食塩水/食塩水の組み合わせが良好
• 法 : 疎水性成分の除去カラム 、シリカゲル シリカゲルDEA 、 を比較フロリジル フロリジルカラムフロリジルカラムにより良好に精製
試料調整 LC/MS/MS (精製)抽出物
Rf 0.35~ 0.55 ・ MeOH
HexHex :塩水:塩水抽出(ボウ硝脱水)Hex/CH2Cl2= 1/1
フロリジルフロリジルカートリッジEtOAc/ CH2Cl2 = 1/19
シリカゲルシリカゲル TLCTLC ( CHCl3/ =アセトン 9/1 )
測定試料( MeOH ・ 1000倍)
測定の精度 標準物質• 2~18ng/L の標準混合溶液• IS : 17βE2-d3 * ng/L
定量性(検量線) 標準偏差(n=5)
RRF R2 2ng/ L 4ng/ L
検出 下限*
17β E2 1.024 0.996 0.09 0.15 0.3
EE2 0.715 0.989 0.13 0.18 0.4
E2-Ac 3.944 0.999 0.16 0.17 0.5
E2-3Sul(Na) 22.346 0.995 0.24 0.22 0.71. 3
2. 標準偏差の3倍を検出下限とした、
添加回収試験 下水試料
試料添加濃度
μ g/ L測定値μ g/ L
回収率%
精製方法
沈殿下水 無添加 0.0134 - Hx-FL0.03 - - TLC0.05 0.0565 80.3 Hx-FL0.05 0.0481 63.4 FL-TLC0.08 0.0659 65.5 Hx-FL-TLC
放流水 無添加 (<0.001) - TLC0.03 0.0229 76.9 TLC
実試料の測定結果 LC/MS/MS法
流入水 μ( g/ L) 放流水 μ( g/ L)処理場
7月 8月 9月 7月 8月 9月
A 0.011 0.010 0.009 <0.001 <0.001 <0.001
B 0.011 0.012 0.007 <0.001 <0.001 <0.001
C 0.014 0.008 0.011 <0.001 0.001 <0.001
D 0.015 0.007 0.013 <0.001 <0.001 <0.001
E 0.007 0.007 0.011 <0.001 <0.001 0.001
試料調整 ELISA 法
C18固相抽出( MeOHMeOH溶出)
乾固
測定試料( 1000010000 倍倍・ DDMSOMSO )
超音波抽出( MeOMeOHH )
ろ液
SS
ろ過ろ過
試料 1000ml
①希釈試料( 20% DMSO 溶液)②抗体結合マイクロプレート ↓←酵素標識 E2 、試料、 E2抗体③抗原抗体反応(室温、 22時間時間) ↓←洗浄、発色試薬④発色反応(室温、暗所、 3030 分分) ↓←反応停止薬⑤測定(プレートリーダープレートリーダー、 450nm )
測定方法 ELISA法
実試料の測定結果 ELISA
流入水 μ( g/ L) 放流水 μ( g/ L)処理場
7月 8月 9月 7月 8月 9月
A 0.058 0.036 0.062 0.020 0.019 0.025
B 0.057 0.046 0.058 0.036 0.017 0.008
C 0.075 0.047 0.022 0.015 0.010 0.008
D 0.057 0.030 0.028 0.024 0.022 0.013
E 0.031 0.036 0.041 0.006 0.006 0.004
ELISA と LC/MS/MS の比較(流入)
0
5
10
15
20
0 20 40 60 80
ELISA ng/ L法( )
LC/M
S/M
Sng
/L法
()
0
5
10
15
20
0 20 40 60 80
(ng/ L)ELISA法
LC/M
S/M
Sng
/L法
()
ABCDE
ELISA と LC/MS/MS の比較(流入)
まとめ•LC/MS/MSLC/MS/MS 法の測定方法を検討法の測定方法を検討•17βE2 の誘導体誘導体、抱合体抱合体も検出可検出可•試料の精製精製が必要 ( 検出下限 0.3ng/L0.3ng/L)•5処理場の流入と放流を3回測定•ELISA、 LC/MS/MS を比較すると 流入は 2.02.0~~ 8.38.3 倍倍(平均平均 4.74.7 倍倍) 放流は 1ppt1ppt 以下以下( LC/MS/MS )
今後の予定•LC/MS/MS 法の前処理法前処理法の検討
•抱合体の測定検討
•ELISA 法の測定値が高い要因高い要因の検討
•ELISA 法の前処理法前処理法の検討
•生物影響生物影響との関係把握