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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université d’ORAN Es Senia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Thèse présentée par
Mr. BEKADA Ahmed Mohammed Ali
Pour l’Obtention du Diplôme de Docteur ÈS SCIENCES
en Sciences Biologiques
Option: Microbiologie Alimentaire et Industrielle
Intitulée
Modélisation et mise en place d’un planHACCP pour la lutte contre Le Mucor
dans un Fromage à pâte molle type camembert
et soutenue publiquement le 2007 devant le jury composé de :
Pr. BELKHODJA Moulay Président U. d'Oran Es Senia
Pr. GUECHI Abdelhadi Examinateur U. Ferhat Abbes.
Sétif
Pr. SLIMANI Miloud Examinateur U. d'Oran Es Senia
Dr. YOUCEF BENKADA Mokhtar Examinateur U. Mostaganem
Pr. BENSOLTANE Ahmed Directeur de Thèse U. d'Oran Es Senia
Pr. BERKANI Abdallah Invité U. Mostaganem
2006 - 2007
Remerciements
La rédaction de cette thèse me donne l’occasion de remerciertoutes les personnes qui ont participé et contribué à son bondéroulement.
Je remercie tout particulièrement :
- Le professeur BENSOLTANE Ahmed, directeur de thèse pourson encadrement, l’apport de ces connaissances, sa disponibilité,sa positivité et sa motivation.
- Le professeur BELKHODJA Moulay pour l’honneur qu’il me faitde présider ce jury.
- Le professeur GUECHI Abdelhadi à qui j’exprime toute mareconnaissance d’avoir accepter volontiers de faire partie de cejury.
- Le professeur SLIMANI Miloud qui a aimablement accepterd’examiner ce travail.
- Le Docteur YOUCEF BENKADA Mokhtar pour l’honneurd’avoir accepter de juger mon travail.
- Le professeur BERKANI Abdellah qu’il trouve ici toute magratitude d’être l’invité de ce jury.
Mes remerciements s’adressent à tout le personnel de la laiteriefromagerie de SIDI SAADA, particulièrement le directeurgénéralpour m’ avoir accueilli durant trois années de suite (2002-2005)au sein de leur unité.Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Monsieur KARER A,
sous directeur de l’administration et responsable de la qualitépour l’intérêt particulier qu’il a accordé à ce thème.
Un merci particulier est adressé au professeur en sécuritéalimentaire Mme SARTER Samira de m’avoir accueilli dans leslaboratoires de CIRAD de Montpellier.
Abstract
During the manufacturing process, the soft cheese standard Camembert
cheese is prone to contaminations by Mucor. The analysis of the
microbiological dangers related to this species were observed more particularly
during stages of maturation (1600 UFC/ml), of moulding (1000 UFC/ml) of
reversal (4800 UFC/ml), of release from the mould and the washing of the
plates is respectively 2000 and 6800 UFC/ml on average. These levels of
contamination are initially related to the quality of the milk believed in the
reception itself in relation to the bad conditions of breeding, draft, storage and
carriage, as well as the material, environment and the personnel charged to
handle the product. The installation of a system HACCP based on the
determination of the points criticize and of the corresponding corrective actions
allows to fight effectively against the opportunism of Mucor. In addition, the
substitution effect of the lactic leavens mesophilic by the thermophiic ones
during maturation on refined Camembert cheeses with 12°C and two relative
moistures different (85% and 95%) on the evolution from the flora mucorale,
the pH and the dry extract showed that the refined cheeses with 12°C/95%HR
were contaminated definitely in Mucor and the contents of dry extract much
weaker than those with 12°C/85%HR. Highly significant effects (p<0.01) of the
substitution of the leavens and relative humidity were observed on the evolution
of parameters pH, dry extract and flora of Mucor. A negative but significant
correlation (p<0.05) between the evolution of the dry extract and the flora of
Mucor for the samples refined to 12°C/85%HR were also noted. Finally the
prediction of the effect of the pH (4.0-6.0), NaCl (1.5-3.0%) corresponding to
the values of aw (0.987-0.910) and of the temperature (10-30°C) on the growth
of the colonies of Mucor racemosus isolated from Camembert cheese during the
stage of refining was carried out on solid medium, the sabouraud with
chloramphenicol. The fungic growth was obtained by the daily measurement of
the diameter of the colonies (mm. Day-1). The primary predictive model of
Baranyi was adopted to consider the growth rate maximum specific (µmax). In
one second approach, two secondary predictive models were developed, the
polynomial model and that of Davey (modified model of Arrhenius). The two
empirical models gave a satisfactory prediction of the experimental results. The
effects of the temperature and the aw on the growth of this fungic species were
clearly shown, contrary to the pH which, with the experimental values tested,
exerted any effect on the growth. This result was also shown by the variance
analysis. The results of this study could be exploited by the industrialists of
cheese dairy in order to predict the development of Mucor racemosus in
Camembert cheese.
Key words: Mucor, Camembert cheese, HACCP, lactic starter, Modeling,
predictive microbiology, empirical Models
Résumé
Durant le processus de fabrication, le fromage à pâte molle type
camembert est sujet à des contaminations par le Mucor. L’analyse des dangers
microbiologiques liés à cette espèce ont été observé plus particulièrement au
cours des étapes de maturation (1600 UFC/ml), de moulage (1000 UFC/ml) de
retournement (4800 UFC/ml), de démoulage et le lavage des plateaux soit
respectivement 2000 et 6800 UFC/ml en moyenne. Ces niveaux de
contamination sont liés en premier lieu à la qualité du lait cru à la réception elle-
même en relation avec les mauvaises conditions d’élevage, de traite, de
stockage et de transport, ainsi que le matériel, l’ambiance et le personnel chargé
de manipuler le produit. La mise en place d’un système HACCP basé sur la
détermination des points critiques et des actions correctives correspondantes
permet de lutter efficacement contre l’opportunisme du Mucor.
Par ailleurs, l’effet de la substitution des ferments lactiques mésophiles par les
thermophiles durant la maturation sur des camemberts affinés à 12°C et à deux
humidités relatives différentes (85% et 95%) sur l’évolution de la flore
mucorale, le pH et l’extrait sec a montré que les fromages affinés à
12°C/95%HR étaient nettement plus contaminés en Mucor et les teneurs en
extrait sec beaucoup plus faibles que ceux à 12°C/85%HR. Des effets
hautement significatifs (p<0.01) de la substitution des ferments et de l’humidité
relative ont été observés sur l’évolution des paramètres pH, extrait sec et flore
mucorale. Une corrélation négative mais significative (p<0.05) entre l’évolution
de l’extrait sec et la flore mucorale pour les échantillons affinés à 12°C/85%HR
ont été également notées.
Enfin La prédiction de l’effet du pH (4.0-6.0), du NaCl (1.5-3.0%)
correspondant aux valeurs d’aw (0.987-0.910) et de la température (10-30°C) sur
la croissance des colonies de Mucor racemosus isolé du camembert au cours de
l’étape d’affinage a été effectué sur milieu solide, le sabouraud au
chloramphénicol. La croissance fongique a été obtenue par la mesure
quotidienne du diamètre des colonies (mm.J-1). Le modèle prédictif primaire de
Baranyi a été adopté pour estimer le taux de croissance maximum spécifique
(µmax). Dans une seconde approche, deux modèles prédictifs secondaires ont été
développés, le modèle polynomial et celui de Davey (modèle modifié
d’Arrhenius). Les deux modèles empiriques ont donné une prédiction
satisfaisante des résultats expérimentaux. Les effets de la température et de l’aw
sur la croissance de cette espèce fongique ont été clairement démontrés,
contrairement au pH qui, aux valeurs expérimentales testées, na exercé aucun
effet sur la croissance. Ce résultat a été également démontré par l’analyse de
variance. Les résultats de cette étude pourront être exploités par les industriels
de fromagerie afin de prédire le développement de Mucor racemosus dans le
camembert.
Mots clés : Mucor, Camembert, HACCP, Ferments lactiques, Modélisation,
microbiologie prédictive, Modèles empiriques
Liste des abréviations
◦ AFNOR : Association Française de Normalisation
◦ aw : Activity of Water (Activité de l’eau)
◦ BPF : Bonnes pratiques de fabrication
◦ BPH : Bonnes pratiques d’hygiène
◦ °C : Degré Celsius
◦ CCP : Critical Control Point
◦ CODEX : Commission de la FAO/OMS
◦ °D : Degré Dornic
◦ dl : Degré de liberté
◦ E S : Extrait Sec
◦ FAO : Food and Agriculture Organisation
◦ HACCP : Hazard Analysis Critical Control Point
◦ HR : Humidité Relative
◦ ICMSF : International Commission on Microbiological Specification
for Foods
◦ ISO : International Organisation for Standardisation
◦ MES : Mesophile
◦ min : Minute
◦ mm : Millimètre
◦ NACMCF : National Advisory Comittee on Microbiological Critical for
Foods
◦ NASA : National Aeronauties Space Administration
◦ OMS : Organisation mondiale de la santé
◦ pH : Potentiel d’Hydrogène
◦ SRCE : Somme des racines carrées des écarts.
◦ T° : Température
◦ THE : Thermophile
◦ UFC : Unité Formant Colonie
◦ US : Unité de Surface
◦ WHO : World Health Organisation
◦ % : Pourcentage
Liste des figures
Figure 1: Diversité des fabrications fromagères
Figure 2: Voie de dégradation du lactose
Figure 3: Voie de dégradation de l'acide lactique
Figure 4: Cycle de développement du Mucor
Figure 5: Schéma de la logique fondamentale du HACCP
Figure 6: Séquence logique d’application du système HACCP
Figure 7: Arbre de décision permettant de déterminer les CCP
Figure 8: Structure documentaire du système HACCP
Figure 9: Cinétiques de croissance microbienne
Figure 10: Modèle primaire de Baranyi
Figure 11: Modèle primaire de Rosso
Figure 12: Modèle secondaire cardinal de température (Prévision du taux de
croissance d’Escherichia coli)
Figure 13 : Modèle secondaire polynomiale (Prévision du taux de croissance en
fonction du pH et de la température de Brochotix thermosphacta
Figure 14 : Diagramme de fabrication industrielle d’une pâte molle type
camembert à l’unité de Sidi saada
Figure 15 : Diagramme de fabrication du camembert expérimental
Figure 16 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et
microscopique (à droite) du Mucor mucedo (GR 40).
Figure 17 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et
microscopique (à droite) du Mucor hiemalis (GR 40).
Figure18 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et
microscopique (à droite) de Mucor racemosus (GR x 40).
Figure 19 a : Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau des
surfaces intérieures
Figure 19 b : Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau
des surfaces extérieures
Figure 20 : Evaluation du niveau de contamination atteint dans les sols, les
murs et les rigoles d’égouts
Figure 21 : Evaluation du niveau de contamination atteint chez le personnel
Figure 22 : Evolution du Mucor sp au cours de la chaîne de fabrication du
camembert
Figure 23 : Evolution de l’acidité Dornic en fonction du temps pour les souches
mésophile et thermophile
Figure 24a : Evolution de la flore mucorale au cours de l’affinage à
12°C/85%HR
Figure 24b : Evolution de la flore mucorale au cours de l’affinage à
12°C/95%HR
Figure 25a : Evolution du pH durant le process de fabrication jusqu’à l’étape de
Ressuyage
Figure 25b : Evolution du pH durant l’affinage à 12°C/85%HR
Figure 25c : Evolution du pH durant l’affinage à 12°C/95%HR
Figure 26a : Evolution de l’extrait sec au cours de l’affinage à 12°C/85%HR
Figure 26b : Evolution de l’extrait sec au cours de l’affinage à 12°C/95%HR
Figure 27 : Evaluation du diamètre de croissance des colonies de Mucor
racemosus à pH 4.5, concentration en NaCl de 1.5% et à
température de 20°C.
Figure 28a : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw
sur le logarithme népérien de croissance maximum µ max de
Mucor racemosus)- Taux de NaCl 1.5 %
Figure 28b : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw
sur logarithme népérien de croissance maximum µ max de Mucor
racemosus)- Taux de NaCl 2 %
Figure 28c : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw
sur le logarithme népérien de croissance maximum µ max de
Mucor racemosus)- Taux de NaCl 2.5 %
Figure 28d : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw
sur le logarithme népérien de croissance maximum µ max de
Mucor racemosus)- Taux de NaCl 3 %
Figure 29a : Courbes adaptées du modèle de Davey exprimant le logarithme
népérien de la croissance maximale (µ max) en fonction de l’inverse
de la température (°K)
Figure 29b : Courbes adaptées du modèle de Davey exprimant le logarithme
népérien de la croissance maximale (µ max) en fonction de l’inverse
de la température (°K)
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les différents points de prélèvement
Tableau 2 : Morphologie des principales espèces de Mucor
Tableau 3 : Détermination des points critiques relatifs au Mucor et mise en
place d’un plan HACCP au cours de la fabrication d’un fromage à
pâte molle type camembert
Tableau 4 : Résultats des tests d’identification des levains industriels
Tableau 5 : Les principaux paramètres de coagulation et de salage
Tableau 6a : Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur
Substitution ferments MES/THE
Tableau 6b: Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur
Hygrométrie
Tableau 6c: Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur
temps (durée d’affinage)
Tableau 7: Corrélation entre paramètres flore mucorale et extrait sec
Tableau 8 : Evaluation du taux de croissance en fonction de la T°, pH, NaCl et
aw.
Tableau 9 : Estimation des valeurs statistiques des coefficients de deux modèles
de régression aux différentes conditions (T°, pH, aw)
Tableau 10 : Analyse de variance du taux de croissance en fonction des
différents paramètres (T°, pH, aw)
Table des matières
INTRODUCTION
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I Technologie de fabrication de fromage à pâte molle typecamembert
1 FABRICATION FROMAGE..........................................................................011.1 La coagulation..............................................................................................021.1.1 Les caséines...............................................................................................021.1.2 La coagulation acide..................................................................................031.1.3 La coagulation enzymatique......................................................................031.2 L'égouttage ...................................................................................................041.2.1 Egouttage du coagulum acide....................................................................05.1.2.2 Egouttage du coagulum enzymatique .......................................................051.2.3 Egouttage du coagulum mixte...................................................................051.3 Le salage...................................................................................................... 06.2 AFFINAGE DES FROMAGES À PÂTE MOLLE………………………….072.1 Les agents d’affinage....................................................................................072.1.1 La flore bactérienne...................................................................................082.1.1.1 Les bactéries lactiques…………………………………………………082.1.1.2 Les bactéries de surface………………………………………………. 092.1.2 Les levures …………………………………………… ......................... 092.1.2.1 Cas de Geotrichum candidum………………………………………….102.1.2.2 Les principales activités biochimiques de Geotrichum candidum……. 102.1.2.3 Evolution de Geotrichum candidum au cours de l'affinage……………112.1.2.4 Rôle dans l'affinage des fromages à pâte molle ……………………….122.1.3 Les moisissures ........................................................................................132.1.4 Les interactions entre micro-organismes..................................................132.2 Biochimie de l’affinage ..............................................................................142.2.1 Dégradation du lactose et transformation de l'acide lactique....................142.2.2 Protéolyse et transformation des acides aminés…………………………172.2.3 Lipolyse et transformation des acides gras................................................192.2.4 Production d’arômes et développement des caractéristiques………….…20
organoleptiques2.3 Facteurs influençant l’affinage ...................................................................212.3.1 Facteurs internes au fromage.....................................................................212.3.1.1 L’activité de l’eau des fromages………………………………….……222.3.1.2 Le pH des fromages……………………………………………….…...222.3.2 Facteurs environnementaux.......................................................................232.3.2.1 La température…………………………………………………………23
2.3.2.2 L’hygrométrie………………………………………………………..232.3.2.3 La ventilation et la composition gazeuse des caves…………………242.3.2.4 Les traitements de surface des fromages………………………….....25
Chapitre II Les Mucorales
1-Généralités…………………………………………………………………262-Caractéristiques biologiques……………………………………………….263- Description de la moisissure………………………………………………264-Classification……………………………………………………………….265- Reproduction et cycle de développement………………………………… 275-1- Reproduction asexuée………………………………………………….. 275-2- Reproduction sexuée…………………………………………………… 286- Accident dit du « poil de chat »………………………………………….. 306-1- Description………………………………………………………………306-2- Sources et conditions de contamination…………………………………316.3- Maîtrise des accidents dus aux Mucor…………………………………..316.4- Maîtrise des accidents dus au Mucor par la méthode HACCP………….326.4.1- Au stade de réception de lait cru………………………………………326.4.2 Ensemencement et maturation………………………………………….326.4.3 Le moulage……………………………………………………………..336.4.4 Le salage………………………………………………………………..336.4.5 L’affinage………………………………………………………………34
CHAPITRE III LE HACCP : Hazard Analysis and Critical ControlPoint
1- L'Harmonisation du système HACCP à l'échelle international…………352- Historique……………………………………………………………….353- Application du HACCP à différentes branches de l'industrie agro-
alimentaire………………………………………………………………364- Le HACCP –Définition…………………………………………………365- Intérêts du système HACCP………………………………………….....37
6- Principes du système HACCP……………………………………….....417- Etapes du système HACCP…………………………………………….42
7-1 Constitution de l’équipe HACCP……………………………………...427-2 Description du produit…………………………………………………427-3 Identification de l’utilisation attendue…………………………………457-4 Description du procédé de fabrication…………………………………457-5 Vérification sur site du diagramme de fabrication…………………….457-6 Analyse des dangers…………………………………………………...45
7-7 Déterminer les points critiques pour la maîtrise des dangers …………467-8 Etablir les limites critiques pour chaque CCP ………………………. 477-9 Etablir un système de surveillance pour chaque CCP…………………497-10 Etablir les actions correctives ………………………………………. 497-11 Etablir des procédures de vérification ……………………………….497-12 Etablir un système d’enregistrement et de documentation……………50
CHAPITRE IV La microbiologie prévisionnelle ou prédictive
1- Généralités sur la modélisation …………………………………………….522- Fondements et démarches de la modélisation……………...………………533- Modélisation de la croissance des micro-organismes....................................553-1 Cinétiques de la croissance microbienne……………………………….….553-2 Description des principaux modèles.......……………………………….….573-2-1 Le modèle primaire de Baranyi..…………………………………….…..573-2-2 Modèle primaire de Rosso………………………………………………583-3 Les modèles secondaires…………………………………………….…….603-3-1 Modèles cardinaux…………………………………………………..…..603-3-2 Modèles secondaires polynomiaux………………………………….…..623-3-3 Modèle d’Arrhenius……………………………………………..............63
PARTIE EXPE RIMENTALE
MATERIELS ET METHODESI- Détermination des points critiques relatifs au Mucor sp et mise en placed’un plan HACCP dans un fromage à pâte molle type camembert……….…65I-1- Techniques de fabrication du camembert industriel……………………..65I-2 Niveaux de prélèvement……………………………………………….…66I-3 Prélèvement des échantillons à contrôler………………………………...68I-4 Techniques analytiques ………………………………………………….69
II- Etude de la substitution des ferments lactiques mésophiles par desthermophiles sur le développement des Mucor sp lors de l’affinage………..69II-1 Dispositif expérimental………………………………………………….69II-1-1 Préparation des souches………………………………………………72II-1-2 Etude des caractères morphologiques…………………………………72II-1-3 Etude des caractères physiologiques………………………………….72a- Température de croissance………………………………………………..72b- Test de croissance en milieux hostiles……………………………………73II-1-4 Etude des caractères biochimiques……………………………………74a- Mise en évidence de la catalase…………………………………………..74b- Culture sur lait tournesolé………………………………………………...74c- Etude du métabolisme carboné………………………………………. ….74
d Etude de l’interaction bactérienne…………………………………… 75e- Etude du pouvoir acidifiant………………………………………….. 76II-2-Analyses physico-chimiques et microbiologiques…………………..76II-2-1- Le pH……………………………………………………………..76II-2-2- Le taux de matière sèche…………………………………………76II-2-3- Recherche et dénombrement des Mucor sp………………………77II-2-4- Etude statistique…………………………………………………..77
III- Modélisation de l’effet combiné de pH, de l’Aw, de Nacl et de latempérature sur la croissance de Mucor racemosus isolé d’une pâte
molle type camembert………………………………………………....…...78III-1- Isolement de l’espèce mucorale……………………………………...78III-2-Préparation de l’inoculum ………………………………………….. 78
III-3- Milieu de croissance et conditions d’incubation …………………... 78III-4- Modèles de développement……………………………………... … 79
RESULTATS ET DISCUSSION
IV-1 Isolement et identification des espèces mucorales………………… 82IV-2 Evaluation de la contamination par le Mucor au niveau du matériel. 83IV-3 Evaluation de la contamination par le Mucor au niveau
de l'ambiance, sols, murs, et les rigoles d'égouts…………………… 85IV-4 Evaluation de la contamination des mains du personnel par
le Mucor……………………………………………………………. 87IV-5 Evaluation de la contamination par le Mucor au cours
de la fabrication…………………………………………………….. 88IV-6 Etablissement d’un plan Haccp……………………………………. 90V-1 Caractérisation des levains industriels……………………………... 94V-2 Evolution du pouvoir acidifiant des levains industriels …………… 96V-3 Comparaison des paramètres de coagulation et de salage…………. 97V-4 Evolution de la flore mucorale ……………………………………. 98V-5 Evolution du pH et effet sur la flore de Mucor……………………. 99V-6 Evolution de l’extrait sec et effet sur la flore de Mucor…………… 103V-7 Analyse statistique…………………………………………………. 105VI-1 Estimation du taux de croissance en fonction des différents
paramètres physico-chimiques…………………………………….. 108VI-2 Le modèle polynomial ……………………………………………… 113VI-3 Le modèle de Davey …………………………………………………116VI-4 Les modèles et la prédiction de croissance de Mucor racemosus…... 118
CONCLUSIONREFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
INTRODUCTION
Le public est en droit d'attendre que les aliments qu'ils consomment soient
sans danger et propres à la consommation. Les intoxications alimentaires et les
maladies transmises par les aliments sont, dans la meilleure des hypothèses,
déplaisantes, au pire, elles peuvent être fatales. Mais elles ont aussi d'autres
conséquences, les foyers d'intoxication alimentaires peuvent perturber les
échanges et entraîner un manque à gagner, du chômage et des litiges. La
détérioration des aliments est une source de gâchis, elle est coûteuse et peut se
répercuter négativement sur le commerce et la confiance des consommateurs.
Il faudrait aussi noter, qu'en Algérie, plus de 4000 cas de toxi-infections
alimentaires ont été déclarés au ministère de la santé pour la seule année 1997.
Ceci nous amène à rester encore conscient de l'existence de quelques
insuffisances en la matière, et c'est là l'aspect le plus important de s'attacher avec
enthousiasme à trouver les voies et les moyens appropriés pour pallier à cette
situation.
Divers outils sont à la disposition des opérateurs pour leur permettre de
répondre à ces attentes. Les bonnes pratiques de fabrication (BFP), les bonnes
pratiques d'hygiène (BPH) correspondant à des moyens ou activités génériques,
propres à un secteur professionnel déterminé, qui doivent être appliqués dans
tous les cas.
Néanmoins, il souhaitable de mettre en place une méthode qui va
permettre d'hiérarchiser les dangers au niveau de la chaîne de fabrication. Dans
ce souci, il est indispensable de pouvoir quantifier leurs risques et leurs
amplitudes et d'établir la relation entre ces risques et l'importance du danger
final. Pour répondre à ces besoins la méthode HACCP (analyse des risques et
maîtrise des points critiques) est une arme efficace et un outil essentiel
contribuant à la mise en place de l'assurance qualité au sein des entreprises agro-
alimentaires qui va prendre en compte la filière dans sa totalité depuis la
production jusqu'à la distribution au consommateur.
Dans le cas des industries laitières Algériennes, cette démarche est plus
que nécessaire. C’est ainsi que parmi les produits laitiers, le fromage à pâte
molle type camembert l’objet de cette étude est souvent sujet à différentes
contaminations en particulier par le mucor responsable de l'accident dit "poil de
chat" lui causant un défaut d'aspect redoutable (Bertier et al,1990;
Dumont,2002). L'écrasement des sporanges portés à l'extrémité des hyphes
donne des taches noirâtres qui déprécient la qualité des fromages (Lemens, 1979
; Desfleurs, 1982). Un excès de Mucor peut développer des toxines présentant
un danger pour le consommateur qui se manifeste notamment par des troubles
digestifs (Moreau, 1976). En conséquence, l’un des objectifs visés à travers cette
étude est de déterminer les sources de contamination mucorales sur ce type de
fromage au cours de son passage dans la chaîne de fabrication et de proposer des
solutions qui peuvent servir à améliorer la qualité organoleptique et hygiénique
du produit par la mise en place d'un plan HACCP permettant d'analyser les
dangers associés aux différents stades du processus de production (HA) et
d'identifier les points critiques à maîtriser (CCP) dans le système (Mortimore et
Wallace, 1994). Le second objectif porte sur le contrôle du Mucor par
l’amélioration des paramètres technologiques de fabrication en maîtrisant un
point critique (CCP) primordial lors de la fabrication ; il s’agit du choix du
ferment lactique utilisé durant l’ensemencement. Or, le développement
harmonieux de la flore d’affinage et le bon déroulement de celui-ci dépendent en
grande partie des étapes antérieures plus particulièrement la coagulation,
l’égouttage et le salage et dont l’interdépendance est très étroite de telle sorte
qu’elles sont directement responsables de l’évolution des paramètres ou facteurs
écologiques extrinsèques comme le pH, l’activité de l’eau (aw), le taux du
chlorure de sodium (Desmazeaud,1997). La qualité de l’égouttage dépend du lait
initial (composition, traitements subis) mais aussi de l’acidification lactique au
moment de la coagulation (Ramet, 1997) et également de la température
(Kandarakis et al.,2001). L’égouttage fixe les caractéristiques physiques (pH,
aw) et chimiques des préfromages qui en partie vont contrôler la cinétique de
croissance des micro-organismes et donc de l’affinage (Brulé et al., 1997)
Enfin, le dernier objectif consiste, dans le cadre de la microbiologie
prédictive, de déterminer les conditions environnementales du milieu (pH, aw,
taux de sel et température) permettant la croissance des Mucor et ce par le biais
de la modélisation. De nombreux travaux sur la modélisation de croissance des
bactéries en fonction des facteurs expérimentaux (température, pH, aw,….etc)
ont été publiés à ce jour (McMeekin et al., 1987 ; Davey,1994 ; Zwietering et
al.,1994 ; Rosso et al.,1995). Cependant peu de modèles sur la croissance des
espèces fongiques dans les produits alimentaires ont été abordés ; citons
notamment ceux de Gibson et al., 1994 ; Cuppers et al.,1997 ; Valik et al.,1999 ;
Panagou et al.,2003)
La microbiologie prévisionnelle s’avère un outil indispensable aidant à
prévenir les dangers microbiologiques imputés aux Mucor sp et à éliminer les
risques. Ceci permettra aux opérateurs industriels d’instaurer une démarche
qualité dans le cadre de l’application du système HACCP.
Chapitre I Technologie de fabrication de fromage à pâte molle type
camembert
1- Fabrication du fromage
La transformation du lait en fromage se fait, généralement, en quatre
étapes principales : la coagulation, l'égouttage, le salage et l'affinage. Selon le
lait initial et les paramètres technologiques mis en oeuvre au niveau de ces
étapes, une grande variété de fromages peut être obtenue (figure1).
Figure 1 : Diversité des fabrications fromagères (Lenoir et al., 1985)
1.1 La coagulation
La coagulation représente la première étape de transformation du lait qui
constitue la principale matière première des fromages. Le lait est un milieu
complexe contenant de nombreux composés essentiels pour la constitution des
fromages, tels que les matières grasses, le lactose, les matières protéiques et les
matières minérales ainsi que des micro-organismes (Mahaut et al., 2000a)
La coagulation résulte d'un changement irréversible du lait qui passe de l'état
liquide à l'état semi-solide. Lors de cette transformation, les caséines, qui
représentent 80 % des protéines du lait de vache, vont jouer un rôle essentiel.
1.1.1 Les caséines
Elles se trouvent dans le lait sous forme d'un complexe des diverses
caséines liées à du phosphate de calcium colloïdal. Ces protéines, qui
contiennent des groupes acides et amines à caractère basique, sont sensibles au
pH du milieu et coagulent en se séparant de la phase aqueuse à pH acide (pH
isoélectrique : 4,6). Il existe plusieurs types de caséines, dont les principales sont
les caséines α, β, γ et К. Elles s'organisent en micelles de caséines : particules
sphériques formées par l'association des caséines (α S1, α S2, β, К ), de quelques
fragments peptidiques (caséine γ ) et de composants minéraux (principalement
calcium et phosphate). La caséine К a la propriété de stabiliser les micelles en
présence de calcium. Contrairement aux autres caséines, elle apparaît très
sensible à l'action de la chymosine principale enzyme de la présure (Brulé et al.,
1997) .
Au cours de l'étape de coagulation, les micelles de caséines subissent des
modifications physico-chimiques sous l'action des enzymes protéolytiques
(présure) et/ou de l'acide lactique produit par les bactéries lactiques. Deux types
de coagulation sont ainsi définis : la coagulation acide et la coagulation
enzymatique.
1.1.2 La coagulation acide
Ce type de coagulation résulte d'un abaissement du pH du lait par ajout
d'acide minéral ou bien par production d'acide lactique par des bactéries
lactiques, suite à la dégradation du lactose. Lorsque le pH est inférieur à 5,2, le
phosphate de calcium est solubilisé, provoquant une désorganisation des
micelles. Il y a alors une réorganisation protéique et la formation d'un réseau
protéique tridimensionnel, insoluble emprisonnant du lactosérum et de la
matière grasse, appelé gel ou coagulum. Le coagulum est dit "lactique". Il est
généralement cassant, perméable, et peu contractile après égouttage. Les
caractéristiques des gels lactiques dépendent, à la fois, de la teneur en protéine,
de la température, du pH final, de l'apport de minéraux et de la vitesse
d'acidification mais aussi de la nature du levain lactique (Brulé et al., 1997) .
1.1.3 La coagulation enzymatique
Des enzymes d'origine animale, végétale et microbienne peuvent faire
coaguler le lait. Mais la plus couramment employée est la présure.
Elle se compose d'un mélange de chymosine et de pepsine. Le mécanisme de
coagulation enzymatique comporte trois étapes principales :
- l'hydrolyse enzymatique de la caséine К (coupure d'une liaison peptidique
spécifique : Phe105-Met106),
- l'agrégation des micelles de caséines,
- la réticulation et la formation du gel.
A l'issue de ces trois étapes, les micelles se réorganisent, pour former un gel
appelé "gel présure" qui est souple, très cohésif, imperméable, contractile et ne
s'égouttant pas spontanément.
Dans le cas de la coagulation enzymatique, plusieurs paramètres peuvent
aussi influencer la coagulation et les caractéristiques physiques du coagulum,
comme la concentration en enzyme, la température liée à l'activité enzymatique,
le pH agissant sur le temps de coagulation, les caractéristiques du lait comme sa
teneur en calcium, en caséines et son état après traitements préalables.
Il existe également des coagulations dites "mixtes" qui associent les deux
types de coagulation (cas des fromages frais). Les propriétés des gels ainsi
formés et l'aptitude à l'égouttage sont intermédiaires entre celles du coagulum
acide et celles du coagulum présure.
A l'issue de l'étape de coagulation, le lait se trouve à l'état semi-solide (gel
+ lactosérum) et les caractéristiques physico-chimiques du gel formé
conditionnent l'aptitude à l'égouttage et les caractéristiques finales du fromage.
1.2 L'égouttage
L'égouttage se traduit macroscopiquement par une élimination du
lactosérum qui s'accompagne d'une rétraction et d'un durcissement du gel.
L'égouttage résulte, à la fois, d'un processus actif, appelé synérèse, et de
l'aptitude du gel à évacuer le lactosérum occlus. Il ne s'agit pas d'une simple
déshydratation. La plus grande partie des éléments solubles du lait (lactose, sels
minéraux) et quelques fractions insolubles mineures (protéines solubles) sont
expulsées du gel avec l'eau (Ramet, 1997a). La synérèse a un mécanisme
complexe résultant d'un pouvoir de contraction de la trame protéique et d'une
aptitude du gel à évacuer le lactosérum, selon sa porosité et sa perméabilité.
Lors de l'égouttage, l'acidification lactique est importante car elle apporte
une protection acide et règle la déminéralisation de la pâte du fromage.
Globalement, l'égouttage fixe les caractéristiques physiques (pH, aw) et
chimiques des préfromages. Ces propriétés ont une grande importance car elles
vont, pour partie, contrôler la cinétique de croissance des micro-organismes,
l'action de leurs enzymes, et donc l'affinage. Les techniques d'égouttage
dépendent des caractéristiques physico-chimiques du coagulum et du mode de
coagulation employé.
1.2.1 Egouttage du coagulum acide
Les gels acides, sont très friables et constitués d'un réseau de caséines
déminéralisées sans structure réticulée, contrairement au caillé enzymatique. Le
coagulum présente une forte perméabilité qui conduit à un écoulement statique
du sérum. Les techniques fréquemment employées pour ces égouttages sont la
mise en faisselles et la centrifugation. En fin d'égouttage, le fromage est sans
cohésion et fortement humide.
1.2.2 Egouttage du coagulum enzymatique
Il est constitué d'un réseau de caséines bien organisées. Au moment de la
réticulation, des liaisons se créent à l'intérieur de ce réseau, entraînant la
rétractation du gel et l'expulsion d'une partie du lactosérum contenu dans les
mailles du réseau. Ces gels ont une forte porosité, mais une perméabilité faible.
Pour extraire le lactosérum, des traitements mécaniques (découpage,
pressage, et/ou brassage) et thermiques (chauffage) sont appliqués. Cependant,
pour obtenir une pâte suffisamment égouttée, ces traitements sont toujours
associés à une acidification (dont la durée d'action est variable en fonction des
technologies fromagères) qui accroît la contraction du gel et s'accompagne d'une
déminéralisation importante du caillé.
1.2.3 Egouttage du coagulum mixte
Ces coagulums, produits par action simultanée des bactéries lactiques et
de la présure, ont une aptitude à l'égouttage intermédiaire entre les deux
coagulums précédemment cités. Un grand nombre de fromage est obtenu par
coagulation mixte et la multiplicité des combinaisons possibles entre l'équilibre
acide/enzyme, est à l'origine de la grande diversité typologique des fromages à
pâtes molles et à pâtes pressées non cuites. Pour ce type de coagulum, c'est
l'acidification (prématuration des laits) qui va déterminer le comportement
rhéologique et l'aptitude à l'égouttage.
La qualité de l'égouttage va dépendre, d'une part, du lait initial
(composition, traitements subis…) mais aussi de l'acidification lactique au
moment de la coagulation, du taux d'enzymes coagulantes présentes ou ajoutées
au lait avant coagulation, et également de la température (Kandarakis et al.,
2001) et de la technique d'égouttage employée.
1.3 Le salage
L'incorporation de chlorure de sodium dans le fromage a trois rôles
majeurs (Hardy, 1997) :
- le drainage de la phase aqueuse libre du caillé et la formation de la croûte,
- l'action directe ou par aw (activité de l'eau) sur le développement des micro-
organismes et l'activité des enzymes et, donc, sur la phase d'affinage. Action sur
les micro-organismes directement en fonction de leur halotolérance (résistance
au sel),
- les caractéristiques organoleptiques des fromages.
Le salage est réalisé, essentiellement avec du chlorure de sodium, selon
deux méthodes :
- salage à sec par saupoudrage superficiel, frottage ou incorporation dans la
masse du caillé,
- salage en saumure par immersion dans une solution de chlorure de sodium
saturée.
La différence de concentration entre la phase aqueuse du fromage et la
saumure provoque une diffusion du sel dans la pâte et une migration inverse de
la phase aqueuse vers la saumure (Payne et Morison, 1999 ; Simal et al., 2001).
En fin de salage, le sel se trouve concentré dans les couches superficielles du
fromage et migre jusqu'au cœur du fromage (en raison d'un gradient de
concentration) pendant l'affinage.
Les cinétiques de transfert du sel au moment du saumurage sont
dépendantes de la perméabilité, du rapport surface/volume et du pH du caillé, et
également de la température, du pH, et de l'agitation de la saumure (Mahaut et
al., 2000b).
Au-delà du phénomène de dilution, la saumure doit être régulièrement contrôlée
car, au cours du temps, elle se charge en constituants du caillé, son pH se
modifie, et elle peut être contaminée par des micro-organismes halotolérants.
Le salage représente une étape importante non seulement pour la
formation de la croûte et le goût salé des fromages affinés, mais aussi parce qu'il
conditionne la phase d'affinage en intervenant sur l'activité de l'eau des fromages
qui régit les développements microbiens et enzymatiques, principaux agents de
l'affinage.
2- Affinage des fromages à pâte molle
De manière générale, l'affinage correspond à une phase de digestion
enzymatique des constituants du caillé. Ce substrat, issu de la coagulation et de
l'égouttage du lait, est constitué de matière protéique, de matière grasse et d'une
fraction des composants solubles du lait. Au cours de l'affinage, le caillé est
transformé sous l'action d'enzymes présentes à l'origine dans le lait (plasmine,
lipase…), ajoutées au lait (enzymes coagulantes par exemple), et produites au
cours de l'affinage par synthèse microbienne (bactéries, levures et/ou
moisissures) (Mahaut et al., 2000a).
2.1 Les agents d’affinage
Les micro-organismes sont les principaux agents biologiques contribuant
à l’élaboration des fromages. Dans les deux premières étapes de la fabrication
(la coagulation du lait et l’égouttage du gel), les bactéries lactiques jouent un
rôle déterminant de par leur activité acidifiante (Choisy et al., 1997b) .
Au cours de l’affinage, les enzymes d’origine microbienne participent très
activement aux modifications de texture et au développement de la flaveur. Les
diverses études sur la microbiologie des fromages montrent qu'il s'agit de
véritables écosystèmes microbiens, à l'intérieur desquels il existe de nombreuses
interactions entre les différents micro-organismes (Beresford et al., 2001).
2.1.1 La flore bactérienne
La flore bactérienne normale des fromages à pâte molle comprend deux
groupes principaux : les bactéries lactiques et les bactéries de surface.
2.1.1.1 Les bactéries lactiques
Elles sont les premières espèces microbiennes à se développer dans le lait
et le caillé, et en modifiant les caractéristiques du milieu, elles préparent les
conditions de développement des autres espèces responsables de l'affinage
(essentiellement levures et moisissures). Les bactéries lactiques ont en commun
l'aptitude à produire de l'acide lactique en quantité importante à partir du lactose
(fermentation lactique). Elles participent également plus directement à l'affinage
en produisant des composés d'arômes ou des précurseurs (Larpent, 1987). Elles
sont généralement apportées par les levains. Ce groupe est constitué par :
- Les lactocoques homofermentaires, qui constituent la flore dominante dans la
plupart des fromages. Il s'agit d'espèces mésophiles dont la fonction principale
est de transformer le lactose en acide lactique (quatre molécules de lactate
produites par molécule de lactose) et de produire des enzymes protéolytiques
intervenant dans l'affinage de la pâte. En effet, ils peuvent produire des
précurseurs d'arômes (par leur action sur les petits peptides) lorsque les
concentrations en lactose deviennent négligeables (Desmazeaud, 1992).
- Les lactobacilles et streptocoques thermophiles qui ont un rôle acidifiant et
protéolytique et qui sont utilisés pour limiter le phénomène de post-acidification.
Les lactobacilles, apportés par le lait sont présents en nombre relativement
faible en début d’affinage, mais ils se multiplient assez activement au cours de la
maturation. Par leur potentiel métabolique, ils peuvent participer au
développement de l’arome (Lenoir et al., 1983).
- Les Leuconostoc hétérofermentaires, sont également présents mais en nombre
très variable selon la nature du levain. Ils produisent de l'acide lactique (deux
molécules de lactate produites par molécule de lactose) et qui sont souvent
associés aux lactocoques dans la production de composants aromatiques
(alcools, acétate…) et de gaz carbonique (Lenoir et al., 1983).
2.1.1.2 Les bactéries de surface
Il s’agit de bactéries appartenant pour l’essentiel aux groupes des
Micrococcaceae et des bactéries corynéformes. Les genres et les espèces
impliqués sont nombreuses et leur taxonomie est en pleine mutation
(Stackebrandt et al., 1997). La croissance de ces bactéries à la surface des
fromages est possible en raison de leur caractère aérobie, de leur résistance au
sel et de leur aptitude à se multiplier aux températures de 10-12 °C. Toutefois,
ce développement n’intervient que si le pH du milieu est suffisamment élevé,
car ce sont des organismes acido-sensibles.
2.1.2 Les levures
Les levures se rencontrent surtout à la surface des fromages et jouent des
rôles variés tels que la désacidification des pâtes, par consommation d'acide
lactique, la formation d'éthanol et de produits secondaires, l'estérification, les
actions protéolytiques et lipolytiques. Il existe de nombreuses levures classées
selon leurs caractéristiques physiologiques. Parmi celles-ci on peut citer les
Kluyveromyces, l’espèce Debaryomyces hansenii et la levure de la bière et du
pain, Saccharomyces cerevisiae.
2.1.2.1 Cas de Geotrichum candidum
Anciennement classé parmi les champignons levuriformes, Geotrichum
candidum est désormais admis au sein du groupe des levures (Gueguen et
Schmidt, 1992).
- Sur le plan morphologique, Geotrichum candidum forme des thalles blancs à
crème, mats, lisses ou duveteux, très ras ou légèrement feutrants. Trois types
morphologiques ont été différentiés : les souches levuriformes (couleur crème,
peu de mycélium, activité acidifiante et protéolytique faibles), les souches plus
ou moins feutrantes (couleur blanche, activité protéolytique plus marquée et
plutôt alcalinisante) et les souches intermédiaires.
Certaines espèces ou certaines souches d'une espèce donnée présentent
une aptitude à la filamentisation ; elles peuvent former un pseudo-mycélium,
voire un mycélium vrai, ce qui leur donne un aspect proche de celui des
champignons filamenteux.
- Au plan microscopique, Geotrichum candidum se caractérise par des
arthrospores qui se forment par désarticulation des hyphes sporulants. D'abord
cylindriques, lors de leur formation, ces arthrospores s'arrondissent pour devenir
ovalaire (De Hoog et al., 1986).
- Sur un plan physiologique, Geotrichum candidum et les levures, en général,
ont un temps de génération très court (quelques heures selon les espèces, les
souches et les conditions de culture). Le développement des levures est fonction
de la température (optimum à 25°C), du taux de sel, du pH (optimum autour de
6), de l'oxygène, du gaz carbonique et des apports nutritionnels. G. candidum
utilise les sources carbonées presque exclusivement par voie oxydative (Amrane
et al., 1999).
2.1.2.2 Les principales activités biochimiques de Geotrichum candidum
- L'utilisation des lactates : Geotrichum candidum n'assimile pas le lactose
quelles que soient les conditions de culture et de milieu. Par contre, il a la
capacité d'utiliser les lactates comme source de carbone. Ceci a pour
conséquence l'augmentation du pH permettant un assouplissement de la pâte, la
croissance des bactéries de surface acido-sensibles et une action convenable des
lipases et des enzymes protéolytiques.
- L'activité protéolytique : Geotrichum candidum possède deux à trois
protéases exocellulaires (enzyme excrétée par la cellule productrice et qui
agit dans le milieu extérieur) et une protéase endocellulaire (enzyme qui
reste dans la cellule productrice et qui attaque les corps pénétrant dans la
cellule). Il possède des activités aminopeptidasiques exo et intracellulaires
(enzymes, diversement localisées dans la cellule, qui sont libérées après
lyse de la cellule) et une activité carboxypeptidasique liée au mycélium.
De par leur équipement exopeptidasique, les souches de Geotrichum
candidum sont douées d'une aptitude particulière à la libération d'acides
aminés à partir des peptides issus des caséines ainsi qu'à la réduction de
l'amertume des fromages, lorsqu'il y a eu production de peptides
amérisants par la flore d'affinage.
- L'activité lipolytique : le niveau d'activité lipolytique de Geotrichum
candidum varie beaucoup, selon les souches. Il est constitué de deux
lipases exocellulaires et d'une lipase liée au mycélium. Il est capable, par
voie oxydative, de dégrader les acides gras pour produire des méthyl
cétones et des alcools secondaires, qui sont des composés d'arômes très
importants.
2.1.2.3 Evolution de Geotrichum candidum au cours de l'affinage
Geotrichum candidum est présent à l'intérieur des fromages et en surface,
en plus grande quantité. Sur le Camembert, il se développe dès le premier jour
d'affinage mais sa croissance augmente nettement du 4-5ème jour d'affinage, où
il commence à apparaître en surface, au 10-12ème jour. Durant cette période, il
consomme essentiellement du lactate mais aussi des sucres comme le glucose ou
le galactose. Ensuite, la concentration en Geotrichum candidum tend à se
stabiliser, jusqu'à la fin de l'affinage (Molimard et al., 1995).
2.1.2.4 Rôle dans l'affinage des fromages à pâte molle
Au niveau de la fabrication des fromages, Geotrichum candidum est
ensemencé par addition au lait avant emprésurage ou par vaporisation à la
surface des caillés. Il a été principalement étudié au niveau de l'affinage du
Camembert. Il se développe après 4-5 jours à la différence de Kluyveromyces
lactis qui couvre la surface dès le premier jour, Geotrichum candidum agit en
consommant l'acide lactique issu de la fermentation du lactose par les bactéries
lactiques. Il participe ainsi à la remontée du pH du caillé. Sa rapidité de
croissance lui confère un rôle de couverture et de lutte contre les contaminants.
Geotrichum candidum intervient également sur la dégradation des
protéines et des matières grasses. Il participe au développement de l'arôme des
fromages (Berger et al., 1999), et également à la diminution de l'amertume
(Mourgues et al., 1983 ; Molimard et Spinnler, 1996) probablement liée à une
forte activité aminopeptidasique. Il permet donc l'amélioration de certains
caractères organoleptiques des fromages de type Camembert. Cependant, il peut
également être à l'origine de défauts type "graisse" ou "peau de crapaud", qui se
forment à la surface du caillé. Ainsi, une peau grasse, plus ou moins plissée,
empêche Penicillium camemberti de s'implanter correctement et modifie les
caractéristiques de texture et la qualité organoleptique du fromage. Par
conséquent, il est nécessaire de bien sélectionner les souches de Geotrichum
candidum qui peuvent avoir des effets très variables selon les espèces. Les
critères de sélection sont essentiellement basés sur leur morphologie et leurs
aptitudes physiologiques et biochimiques.
2.1.3 Les moisissures
Divers types de fromages sont caractérisés par la présence de moisissures
superficielles ou internes. L'espèce Penicillium, et plus précisément Penicillium
camemberti (feutrage blanc en surface) représente la principale moisissure
utilisée dans la fabrication des fromages à pâte molle et à croûte fleurie. Les
moisissures interviennent au cours de l'affinage par désacidification des pâtes et
cette neutralisation contribue à une modification de la texture de la pâte qui perd
son aspect granuleux. Par ailleurs Penicillium camemberti est un actif
producteur d'enzymes protéolytiques et lipolytiques (dégradation des acides
aminés et des acides gras), ce qui lui confère un rôle important sur
l'aromatisation des fromages.
Ainsi, les bactéries, les levures et les moisissures, agissent simultanément au
cours de l'affinage et peuvent avoir des actions combinées.
2.1.4 Les interactions entre micro-organismes
De manière générale, les interactions sont classées selon deux catégories :
les interactions directes par contact entre les cellules des différents micro-
organismes, et les interactions indirectes, nécessitant l'intermédiaire d'une
substance produite par l'un ou l'autre des microorganismes (facteur de
croissances, inhibiteurs…). Les interactions positives caractérisent une
stimulation et, à l'inverse, les interactions négatives, une inhibition. La
microflore des fromages est en évolution constante, l'équilibre microbien entre
les différentes espèces, varie en fonction du temps d'affinage avec une
succession des flores impliquées (Molimard, 1994 ; Molimard et al., 1995 ;
Leclercq-Perlat et al., 2002)
Dans le cas plus particulier de G. candidum, son association avec d'autres
levures est généralement stimulante. Son association avec Kluyveromyces lactis
et Penicillium camemberti permet une désacidification du caillé plus rapide, ce
qui agit favorablement sur le développement de la flore bactérienne superficielle
acido-sensible participant fortement à l'affinage des fromages. Et, de façon plus
macroscopique, cette association joue sur l'aspect de la couverture de surface et
sur l'amertume des fromages dans le cas du Camembert, mais l'effet reste
variable en fonction des souches présentes. Geotrichum candidum peut
également avoir une action d'antagonisme sur des contaminants tels que Mucor.
Cependant, de nombreux mécanismes d'interaction existant entre les
levures et les moisissures ne sont pas encore élucidés. Mais, ces interactions
interviennent sur le développement des microorganismes et, par conséquent,
influencent indirectement les réactions biochimiques ayant lieu dans le fromage,
au cours de l'affinage.
2.2 Biochimie de l’affinage
Les transformations biochimiques confèrent au caillé des caractères
nouveaux. La pâte, à l’origine relativement dure, compacte, sans grande saveur,
est modifiée dans sa composition, sa structure et, par suite, dans son aspect, sa
consistance, sa couleur. Simultanément, une saveur et un arôme nouveaux se
développent. Les phénomènes impliqués dans cette évolution sont d’une grande
complexité en raison, notamment, de la nature du substrat, de la variété des
agents responsables des transformations, de la diversité des modifications subies
par les constituants, et du très grand nombre de produits formés.
Au cours de l’affinage, trois principales modifications biochimiques sont
observées : la dégradation du lactose, la dégradation des protéines ou protéolyse,
l'hydrolyse des triglycérides ou lipolyse.
2.2.1 Dégradation du lactose et transformation de l'acide lactique
La principale transformation du lactose (principal glucide présent dans le
lait) est sa conversion en acide lactique par les bactéries lactiques.
Cette conversion commence lors de la coagulation et de l'égouttage. Selon les
micro-organismes, la dégradation du lactose entraîne la formation de nombreux
métabolites (figure 2) :
- les bactéries lactiques homofermentaires produisent 90 à 95 % d'acide lactique
et de petites quantités de produits secondaires (éthanol, acide acétique…),
- les bactéries lactiques hétérofermentaires, donnent environ 50 % d'acide
lactique et 50 % d'acide acétique, d'éthanol et de CO2,
- les bactéries coliformes produisent de l'acide lactique, de l'acide acétique, de
l'acide formique, du CO2 et de l'hydrogène, les levures produisent de l'éthanol,
du CO2 et de petites quantités d'acétaldéhyde et d'acides organiques en aérobie
(au coeur des fromages, certaines levures produisent des acétates…) .
(Mahaut et al., 2000a)
Figure 2 : voie de dégradation du lactose (Merlet, 1995)
Dans le cas des fromages de type Camembert, la quantité de lactose
résiduel dans le caillé décroît rapidement entre le 1er et le 10ème jour de
fabrication. C'est Kluyveromyces lactis qui consomme en premier le lactose en
surface et à l'intérieur du caillé. La concentration en lactose dans le caillé est
quasi inexistante à partir du 7-8ème jour d'affinage.
En ce qui concerne l'acide lactique produit par les levains lactiques, son
évolution est variable selon le type de pâte et le type de flore (figure 3).
Figure 3 : Voie de dégradation de l'acide lactique (Merlet, 1995)
En présence d'oxygène (aérobiose), l'acide lactique est consommé par les
moisissures et les levures pour former de l'éthanol, du dioxyde de carbone et de
l'eau. Et, en anaérobie, certaines levures (Kluyveromyces lactis) le transforment
principalement en acide acétique.
Dans le Camembert, l'acide lactique est consommé par les levures, les
moisissures et les bactéries de surface. Suite à l'action de Kluyveromyces lactis
sur le lactose, Geotrichum candidum intervient entre le 4-5èmeet le 10-12ème
jour d'affinage et consomme à coeur et en surface, le lactate produit par la
dégradation du lactose ; ceci a pour effet de neutraliser le pH du caillé,
essentiellement en surface. A partir du 6- 7ème jour d'affinage, Penicillium
camemberti agit en surface en consommant le lactate car les quantités de lactose
sont négligeables en surface à 6-7 jours d'affinage (Leclercq-Perlat et al., 2002).
La remontée du pH, liée à la consommation de l'acide lactique, permet le
développement de souches acido-sensibles (exemple des bactéries de surface qui
agissent après 15-20 jours d'affinage)
et leurs enzymes vont avoir des actions protéolytiques et lipolytiques sur les
composants du caillé.
2.2.2 Protéolyse et transformation des acides aminés
Au cours de l'affinage, la protéolyse est due à trois catégories d'enzymes :
la plasmine du lait, les protéases coagulantes, et les protéases et peptidases
microbiennes. L'action de ces enzymes dépend, à la fois, des paramètres de
fabrication, des compositions physico-chimiques du caillé et de la nature de la
flore microbienne (Choisy et al., 1997a).
La plasmine est naturellement présente dans le lait et associée aux
micelles de caséine. Elle exerce une activité protéolytique sur les caséines.
Les protéases coagulantes proviennent essentiellement de la présure. Elles
ont une action spécifique sur la caséine et une action de protéolyse générale sur
les autres protéines. Elles produisent généralement des peptides qui seront
hydrolysés en acides aminés libres par les enzymes microbiennes. Cependant,
elles n'ont pas un rôle essentiel sur la protéolyse primaire par rapport à celui de
Geotrichum candidum ou de Penicillium camemberti.
Les enzymes protéolytiques microbiennes se divisent en deux groupes :
les endopeptidases(ou protéases) qui hydrolysent les protéines en libérant des
peptides, et les exopeptidases (aminopeptidases, carboxypeptidases,
dipeptidases) qui scindent les peptides en acides aminés libres.
Le système protéolytique des bactéries lactiques agit grâce à une protéase
de paroi qui hydrolyse les caséines en oligopeptides et sur plusieurs peptidases
intracellulaires.
Geotrichum candidum synthétise plusieurs protéases exocellulaires
agissant sur la caséine, une aminopeptidase alcaline exocellulaire et une
carboxypeptidase acide. Elles sont reconnues pour leur aptitude particulière à la
libération d'acides aminés à partir de peptides issus des caséines.
Penicillium camemberti possède un système protéolytique complexe très
actif et variable selon les souches (Trieu-Cuot et Gripon, 1982 ; Lenoir et al.,
1992), et du caillé. Dans le cas de Camembert, Penicillium camemberti entraîne
une production importante de peptides et d'acides aminés. L'effet protéolytique
de Penicillium camemberti progresse de la surface (où il s'est implanté) vers
l'intérieur du fromage, ce qui est caractéristique de l'évolution de la protéolyse
des fromages à pâte molle et à croûte fleurie (Noomen, 1983). Il faut, cependant,
remarquer qu'une activité trop élevée peut entraîner des défauts d'amertume.
L'association Geotrichum candidum / Penicillium camemberti permet une
protéolyse plus intense accompagnée d'une moindre amertume (Mourgues et al.,
1983 ; Molimard et Spinnler, 1996).
Une fois hydrolysées, les protéines forment des peptides et des acides aminés
qui vont, eux même, subir des transformations et des dégradations en chaîne,
pour donner des composés aromatiques.
Dans un premier temps, les principales enzymes agissant sur les acides
aminés sont des décarboxylases, des transaminases, des désaminases qui
forment des acides cétoniques, des amines, des aldéhydes… Dans un deuxième
temps, les oxydases et les réductases agissent sur les aldéhydes formés pour
libérer des alcools et des acides (Hemme et al., 1982). La protéolyse est donc à
l'origine de l'apparition de nombreux composés aromatiques ou de leurs
précurseurs. Sur le plan organoleptique, un autre rôle majeur de la dégradation
des protéines porte sur la texture des fromages car les protéines représentent la
phase solide continue de la pâte fromagère et elles constituent le réseau
tridimensionnel qui piège les globules gras et le lactosérum.
Aussi, toute modification de la nature des protéines présentes dans le fromage
influera sur ses caractères rhéologiques. Pour certains types de fromages à pâte
molle, les modifications de texture sont très prononcées entre le début et la fin
de l'affinage.
En conclusion, au cours de l'affinage, l'hydrolyse des protéines joue un
rôle essentiel sur les propriétés organoleptiques des fromages puisqu'elle
participe à la fois à l'assouplissement de la pâte et au développement de la
flaveur des fromages.
Selon les différentes flores en présence, la nature et la quantité des
composés aromatiques issus de la dégradation des protéines associée à celle des
lipides, varient. En fin d'affinage, cette variation est à l'origine de la typicité
sensorielle de chaque fromage.
2.2.3 Lipolyse et transformation des acides gras
Les principaux constituants de la matière grasse du lait sont les lipides
neutres, avec 98 % de triglycérides et 0,2 à 0,5 % de diglycérides. Les
phospholipides représentent environ 1 %, les acides gras libres 0,1 à 0,2 % et la
fraction insaponifiable 0,3 à 0,5 %.
Sous l'action des lipases, les triglycérides sont hydrolysés en glycérides
partiels et en acides gras libres (Choisy et al., 1997a).
Les moisissures telles que Penicillium camemberti ont l'activité
lipolytique la plus importante. Les lipases des levures sont moins connues pour
leur action lipolytique que celles des moisissures. Cependant, dans les fromages
de type Camembert, même si Penicillium camemberti est le principal agent
lipolytique, Geotrichum candidum est probablement responsable de la
modification du profil des acides gras libres en faveur des acides insaturés
(Choisy et al., 1997a). Différents systèmes enzymatiques, ou groupes
d'enzymes, ont pour substrat les acides gras, essentiellement sous leurs formes
libres et estérifiées (coenzyme A). Les voies métaboliques des acides gras sont
principalement des β-oxydations et des estérifications. Les β-oxydations
transforment les acides gras saturés en acides α-cétoniques qui, par
décarboxylation, donnent des méthylcétones (agents de saveurs). Celles-ci, par
réduction, forment des alcools secondaires participant à l'arôme global des
fromages. Les réactions d'estérification sont à l'origine de la formation d'esters
d'acides gras à chaîne courte avec l'éthanol, le phényléthanol ou le méthanethiol
qui participent aussi à l'arôme des fromages.
La matière grasse a un rôle déterminant sur les qualités organoleptiques
des fromages, dû à ses liaisons avec les autres constituants et aux
transformations qu'elle subit au cours de l'affinage.
2.2.4 Production d’arômes et développement des caractéristiques
organoleptiques
Les répercussions de l'action des micro-organismes sur la flaveur des
fromages sont particulièrement nettes. Les produits formés au cours de la
maturation sont à l'origine de la saveur et de l'arôme des fromages affinés.
Comme il est décrit dans les paragraphes précédents, les dégradations du
lactose, de l'acide lactique, des matières protéiques et lipidiques sont à l'origine
de ses composés aromatiques.
Une grande diversité d'arômes caractérise les fromages. Elle est liée aux
constituants du caillé, aux conditions de fabrication et d'affinage et, surtout, à la
diversité des flores présentes à l'intérieur et en surface des fromages. Ainsi, le
lien existant entre la diversité des composés aromatiques produits et les micro-
organismes présents dans le fromage (fromage modèle ou réel) a été montré par
de nombreux auteurs (Martin et al., 1999 ; Berger et al., 1999 ; Dahl et al.,
2000). Pour les fromages à pâte molle et à croûte fleurie, la grande diversité des
composés issus des réactions biochimiques permet, notamment, d'identifier et de
quantifier les molécules responsables du goût et de l'odeur de ce fromage
(Dumont et al., 1974 ; Molimard et Spinnler, 1996 ; Kubickova et Grosch,1998).
Dans le cas des croûtes fleuries, les moisissures et/ou les levures sont les
principales responsables de l'aspect des fromages. La couleur et l'uniformité de
la couverture de surface vont dépendre de la composition physico-chimique du
caillé, des conditions d'affinage, de la présence ou non de contaminant mais
aussi de l'activité et de l'état physiologique des micro-organismes.
Au-delà des propriétés organoleptiques précédemment citées, la texture
représente également une caractéristique importante des fromages. La protéolyse
et la lipolyse agissent fortement sur le développement de la texture mais d'autres
paramètres tels que le pH, le taux de sel, l'eau présente dans la pâte et, également
les conditions d'affinage comme la température vont influer sur la texture des
fromages (Vassal et al., 1986 ; Kfoury et al., 1998 ; Ramkumar et al., 1998).
2.3 Facteurs influençant l’affinage
Tous les paramètres susceptibles d'agir sur le développement des micro-
organismes, la production d'enzymes et les activités enzymatiques jouent un rôle
déterminant au cours de l'affinage.
Ces paramètres peuvent être intrinsèques au fromage, ou bien, être liés à
des facteurs environnementaux de la cave comme la température, l'humidité
relative ou la composition de l'atmosphère pendant la phase d'affinage.
2.3.1 Facteurs internes au fromage
Les composants du caillé (protéines, matières grasses, sels minéraux,
micro-organismes…) ont une influence sur l'évolution de l'affinage, de par leur
nature et leur concentration dans le caillé. Mais, parmi tous les facteurs
intrinsèques du fromage, deux facteurs liés au procédé semblent jouer un rôle
important sur l'affinage : l’activité de l’eau et le pH (Choisy et al., 1997a).
2.3.1.1 L’activité de l’eau des fromages
L’activité de l'eau (aw) représente la disponibilité de l’eau dans un produit.
Dans le cas des fromages, elle exerce une action majeure sur le développement
microbien et l'activité enzymatique.
En effet, les pâtes humides s'affinent plus vite que celles fortement
égouttées. L'activité de l'eau est essentiellement déterminée par les teneurs en
eau et en sel. Pendant l’affinage, elle dépend également de l’hygrométrie de la
cave. En effet, le fromage perd son humidité progressivement jusqu’à ce que
l'équilibre, entre l’aw de surface et l’hygrométrie ambiante, soit atteint. Cette
évolution contribue à la formation d’un gradient vertical de concentration en eau
entre le cœur et la surface du fromage. Une autre cause de modification de l’aw,
en cours d’affinage, est liée aux réactions biochimiques d’hydrolyse existant
dans le substrat et qui fixent l’eau. Ceci entraîne une diminution de l’eau libre et
donc de l’aw.
2.3.1.2 Le pH des fromages
Le pH agit également sur les micro-organismes et les enzymes. Seules les
bactéries lactiques, les levures et les moisissures peuvent se développer à des pH
inférieurs à 5. L'activité des enzymes est, elle aussi, très sensible aux variations
de pH. L'activité maximale des protéases se situe dans l'intervalle de pH 5-7,5,
et celle des lipases dans la zone de pH 7,5-9,0. Au-dessous de pH 5, l'activité et
la stabilité de nombreuses enzymes sont fortement réduites. La neutralisation du
caillé se fait au cours de l’affinage et selon différents mécanismes en fonction
des types de fromages ; Pour les pâtes molles à croûte fleurie, la neutralisation
est obtenue par voie biochimique à l’aide de levures ou moisissures acidophiles
se multipliant en surface. Cependant, lors de la phase d’affinage, l’ambiance de
la cave, en particulier la présence de NH3, exerce également une forte influence
sur l’évolution du pH, et donc de l’affinage.
2.3.2 Facteurs environnementaux
Les fromages à pâte molle et à croûte fleurie possèdent une flore de
surface à caractère aérobie très marqué, ce qui demande une bonne maîtrise de
l’air des caves d’affinage et, notamment, de trois paramètres essentiels : la
température, l’humidité relative et la composition de l’air (Ramet, 1997b) .
2.3.2.1 La température
La température est un facteur majeur de la croissance microbienne et de
l'activité enzymatique. Elle possède une influence importante sur le déroulement
de l'affinage, par son intervention sur les équilibres et la dynamique de ces
systèmes microbiens et enzymatiques. Les températures optimales diffèrent
selon les groupes microbiens : 20-30°C pour les moisissures, levures, bactéries
de surface et 30-35°C pour les bactéries lactiques mésophiles. De même, les
températures optimales des enzymes varient selon leur type : 30-35°C pour les
lipases et 45-50°C pour les protéases. Cependant, les températures d'affinage
sont bien inférieures à ces optima et dépendent du type de fromages
(Camembert, 8-14°C ; Rogeret, 10-12°C). La température a un effet sur la
vitesse d'affinage. De manière générale, une augmentation de la température a
tendance à diminuer la durée d’affinage. Cependant, une élévation trop
importante peut entraîner des modifications organoleptiques comme une
hétérogénéité de texture ou un développement d’amertume. A l’inverse, un
refroidissement permet de freiner l’évolution des fromages, facilitant la conduite
d’affinage, car les températures basses ralentissent les phénomènes
biochimiques.
2.3.2.2 L’hygrométrie
L'hygrométrie influence la teneur en eau du fromage et l’activité de l’eau
à sa surface. Le taux d’hygrométrie est fixé en fonction du type de fromages et
des micro-organismes présents en surface.
Pour les croûtes fleuries, il varie entre 90 et 99 %. Le choix de l’hygrométrie
permet de favoriser, ou au contraire, d’inhiber les micro-organismes en fonction
de leur sensibilité à l’aw. L’hygrométrie étant inférieure à 100 %, il se produit
toujours une évaporation de l’eau contenue dans le fromage vers l’atmosphère.
Cette perte d’eau varie fortement en fonction de plusieurs paramètres liés au
fromage :
- la teneur en eau totale du fromage : plus le fromage contient d’eau libre, plus il
est susceptible d’en évaporer.
- la surface spécifique du fromage définie par le rapport surface / volume. A
masse égale, les fromages possédant une grande surface d’évaporation perdent
davantage d’eau pendant l’affinage.
- l’état de liaison de l’eau : il est lié à l’aw, puisque seule l’eau libre peut
s’évaporer.
- l’état de surface du fromage : plus la croûte est sèche en surface, plus
l’évaporation est faible.
- le temps de séjour en cave et la vitesse de renouvellement de l’air dans la cave
agissent sur la perte en eau.
2.3.2.3 La ventilation et la composition gazeuse des caves
Ces deux paramètres participent également à l’environnement des
fromages au cours de leur affinage. La circulation d’air permet d’éviter des
micro-ambiances qui pourraient se former autour de chaque fromage. Le débit
de l’air dans la cave doit être suffisant pour maintenir un taux d’humidité et,
donc, être capable d’évacuer la quantité d’eau évaporée par les fromages.
Cependant, il faut éviter une vitesse de l’air trop importante qui pourrait
entraîner un assèchement des fromages en surface.
En ce qui concerne la composition gazeuse de l’atmosphère, il convient
d’assurer un renouvellement de l’air afin de maintenir des concentrations en
oxygène, dioxyde de carbone ou ammoniac adaptés à chaque type de fromages.
Pour l’affinage des fromages possédant une flore de surface aérobie, il est
important d’avoir une concentration en oxygène permettant une croissance
satisfaisante des micro-organismes. Cependant, dans la pratique, contrairement à
la température et à l’hygrométrie, la maîtrise de la composition de l’ambiance
relève très souvent de l’empirisme, par manque de quantification en temps réel
des éléments constituant l’atmosphère d’affinage.
2.3.2.4 Les traitements de surface des fromages
En plus des facteurs environnementaux, l’intervention directe de l’affineur
sur le fromage et les soins qu’il leur apporte, influencent l’évolution de
l’affinage.
L’absence d’intervention sur les fromages pendant la durée de leur
affinage entraîne une hétérogénéité du développement des flores et donc une
variabilité des caractéristiques organoleptiques. Dès l'entrée en cave des
fromages, le support d’affinage doit être choisi de façon à leur assurer une
aération suffisante. Au cours de l’affinage, un retournement des fromages est
généralement pratiqué et possède une double fonction. Il sert, d’une part, à
régulariser la forme des fromages qui tendent à s’affaisser sous l’effet combiné
de leur poids et de la protéolyse et lipolyse, et d’autre part, à régulariser le
développement des flores utiles et réduire le risque de développement de flores
indésirables. La fréquence des retournements est fonction des types de fromages.
Pour les pâtes molles à croûte fleurie, ils s’effectuent tous les 3 ou 4 jours.
Lors des retournements, la flore peut être couchée, manuellement par frottage,
pour obtenir une couverture plus homogène.
Chapitre II : Les Mucorales
1-Généralités
Les fromages à pâte molle et à croûte fleurie sont particulièrement
exposés à un accident de fabrication appelé « poil de chat ». Les agents de cette
nuisance sont des moisissures du genre Mucor qui se développent à la surface
des fromages contaminés formant des taches noirâtres (Sozzi et al., 1971).
2-Caractéristiques biologiques
Le Mucor sp. est un genre de champignon zygomycète, comportant des
espèces se présentant sous forme de moisissures, très communes sur le pain et
sur d’autres substances végétales. Dans les fromageries, ces agents se trouvent
dans l’ambiance des ateliers de fabrication du camembert et ils apparaissent sous
forme de touffes noires plus hautes que le Penicillium (Moreau, 1976).
Les réservoirs à Mucor sont le sol et les végétaux en décomposition. Ses
spores se trouvent partout dans la nature, elles sont très résistantes aux
conditions défavorables et sont rencontrées en suspension dans l’air humide.
3- Description de la moisissure
La morphologie du Mucor est de type filamenteuse avec à l’extrémité des
sporanges contenant de nombreuses spores. Il s’installe de manière conséquente
en cas d’absence de concurrence microbienne dans des conditions de
température et d’humidité rencontrées en technologie de fabrication fromagère.
La durée du cycle est de 02 jours si les éléments favorisants sa croissance sont
réunis (Marie et al.,2002).
4-Classification
Classe : Phycomycètes
Sous classe : Zygomycètes
Ordre : Mucorales
Sous ordre : Sporangiophores
Famille : Mucoraceae
Genres : Mucor, Rhizomucor, Rhizopus, Absidia
Parmi les espèces de Mucor les plus fréquemment rencontrées en
fromagerie on peut citer :Mucor racemosus, Mucor plumbeus, Mucor hiemalis,
Mucor fuscus, Mucor globosus et Mucor mucedo (Desfleurs, 1980). Leurs
aspects sont différents à la surface des fromages, certains sont gris ou marrons à
poils longs alors que d’autres sont noirs à poils rats. Leur vitesse de croissance
n’est également pas la même, certains sont plus envahissants que d’autres
(Botton et al.,1990).
5- Reproduction et cycle de développement
Les caractéristiques des accidents dus aux Mucor s’expliquent assez bien
par les données sur la reproduction et la croissance. Il existe deux types de
reproductions différentes selon les conditions (Devoyod, 1988).
5-1- Reproduction asexuée
Elle se fait par l’intermédiaire de sporanges ou sporocystes qui naissent à
l’extrémité de filaments dressés. A la rupture, ils libèrent des milliers de spores
(environ 30000) dans l’ambiance où elles sont disséminées et qui vont germer
pour former à leur tour des sporanges et ainsi de suite (Figure 7). La paroi des
spores est facilement mouillable, une sorte de mucus semble les envelopper. On
parle de myxospores, c'est-à-dire des spores humides qui adhèrent facilement à
n’importe quel support (mains, habits, matériel, moules, claies,…). L’eau, les
surfaces ruisselantes, les vapeurs humides favorisent leur dispersion (Bergère et
Lenoir, 1997). Les spores de Mucor germent très vite et les filaments mycéliens
qu’elles produisent croissent également très vite (5 à 10 fois plus rapidement que
ceux des Pénicillium).Pour cela, en plus d’une humidité élevée, il est nécessaire
que les spores soient en contact direct avec le milieu nutritif. Une fois implanté
sur son support, le Mucor épuise très rapidement les facteurs nutritifs
nécessaires à son développement et différencie très tôt des sporanges qui
libèrent de nouvelles spores et le cycle continue (Devoyod, 1988).
5-2- Reproduction sexuée
Elle consiste à la conjugaison de deux espèces de Mucor par leur courts
rameaux situés à l’extrémité, ils fusionnent leur noyaux pour former un œuf
résistant ou zygospore. Cette forme de résistance, comme les chlamydospores,
permet au Mucor de survivre à de mauvaises conditions, de résister à différents
agents physiques ou chimiques tels que la dessiccation, la chaleur, les
antiseptiques (Devoyod, 1988). Certaines spores résistent même à la digestion
des ruminants et se retrouvent dans les féces, prêtes à germer (Lemens, 1996).
Dés que les conditions deviennent favorables, la germination commence.
Le Mucor est donc une moisissure très répandue dont il est difficile de se
débarrasser.
Figure 4 : Cycle de développement du Mucor (Marie et al., 2002)
Suivant le mode de reproduction, le Mucor se développe selon deux types
morphologiques radicalement différents : l’un filamenteux, l’autre lévuriforme.
Cette dualité, que l’on dénomme communément « dimorphisme moisissure-
levure », est donc soumise aux facteurs environnementaux. Le développement
des Mucor en aérobiose (surface des fromages par exemple) conduit à une
croissance typiquement « moisissure » tandis que la croissance « lévuriforme »
n’apparaît que lorsque la culture est insuffisamment aérée (à la surface de
contact fromage-support, par exemple).
Les Mucor apparaissent donc comme des espèces particulièrement
adaptées à la colonisation de différents substrats humides (activité en eau
supérieure à 0.93).
6- Accident dit du « poil de chat »
6-1- Description
Cet accident peut se présenter sous deux formes : une forme bénigne et
une forme aigue (Devoyod, 1988). La forme bénigne se manifeste par
l’apparition, à la surface des fromages, de quelques touffes duveteuses
blanchâtres terminées par des petites boules noires. L’aspect des thalles, rigides,
parallèles et serrés, rappelle les poils d’un chat d’où le nom donné à cette
anomalie. En général, cette forme ne dure que quelques jours et n’atteint qu’un
nombre limité de fromages. Par contre dans la forme aigue, des lots entiers de
fromages doivent être déclassés voire éliminés car invendables. Leur surface est
envahie de touffes grisâtres à noirâtres donnant au produit un aspect peu
engageant, une odeur plus ou moins prononcée de moisi et un goût altéré. Les
symptômes apparaissent, en général, au bout de 2 à 3 jours, c'est-à-dire 4 à 5
jours après l’emprésurage, mais toujours avant le développement de la flore
normale. En effet, les thalles du Mucor sont souvent installés dés le moulage des
caillés, avant même la pulvérisation superficielle des spores de Pénicillium. Le
problème du poil de chat est avant tout un problème de compétition entre ces
deux espèces. Si le Mucor est installé le premier, il gène la croissance du
Pénicillium ; il supporte mieux l’anaérobiose, ses spores germent plus vite à la
température ambiante des hâloirs de la fromagerie(12-14°C) et ses hyphes
s’allongent et se ramifient rapidement. De plus, même si le fromage est bien
recouvert par le Pénicillium, le Mucor peut s’implanter au niveau de la surface
de contact avec la claie, l’anaérobiose partielle n’ayant pas d’incidence sur sa
germination, contrairement à Pénicillium camemberti (Lemens, 1996).
Il convient de souligner aussi que les conditions dans les hâloirs
conviennent souvent mieux au développement des Mucor que du Penicillium
camemberti.
Sur le plan physico-chimique, les conditions favorables à l’apparition de
cette altération sont :
- Un pH au démoulage trop élevé : pH> 4.8
- Une hygrométrie trop importante : > 85% dans les salles de ressuyage,
>91% dans les locaux d’affinage.
- Un taux de sel trop faible (< 1%) (Bergere et Lenoir, 1997).
6-2- Sources et conditions de contamination
Les Mucor, champignons saprophytes, sont particulièrement abondants
sur les murs, plafonds, carrelages des salles de fabrication (Moreau, 1983).
La contamination est possible par les mains et les bottes du personnel qui
circule dans les différents locaux. Dans d’autres cas, c’est le matériel (étagères,
claies, stores,…) trop sommairement nettoyé qui permet de véhiculer les spores.
Le bain de saumure peut être lui aussi contaminé par ces myxospores et devenir
ainsi un véritable diffuseur de spores.
L’eau utilisée pour le nettoyage et le rinçage du matériel peut être aussi
incriminée lors d’un accident de poil de chat (Lemens, 1996). L’eau d’adduction
peut être contaminée lors des périodes où la chloration est insuffisante ou par
une pollution des canalisations entre le point de chloration et le point
d’utilisation.
6.3- Maîtrise des accidents dus aux Mucor
Les moyens de lutte consistent d’une part à éviter la contamination
massive par ces moisissures, d’autre part à les empêcher de proliférer sur les
fromages, surtout aux périodes critiques. Il faut dans un premier temps veiller
aux vecteurs potentiels tels que les aérations intempestives, l’hygrométrie de
l’air et des locaux, l’eau éventuellement doit être filtrée, l’interférence des
circuits de fromages contaminés avec ceux des fromages sains, les matériel et
locaux (accentuer les opérations de désinfection, l’eau de javel étant très
efficace). En outre pour éviter la prolifération, il faut bien prendre en compte les
facteurs technologiques : évolution de l’acidification du caillé, température et
hygrométrie des différentes salles, salage, état des saumures et favoriser
l’implantation rapide du Penicillium.
6.4 Maîtrise des accidents dus au Mucor par la méthode HACCP
L’utilisation de la démarche HACCP pour assurer la salubrité des produits
livrés aux consommateurs représente un outil intéressant pour les industries
laitières. La maîtrise des dangers microbiologiques revêt une importance
particulière pour les fabrications au lait cru ou toutes les mesures préventives
doivent être appliquées avec encore plus de rigueur, d’un bout à l’autre de la
chaîne.
Parmi les différentes étapes de fabrication d’un fromage à pâte molle de
type camembert, certaines présentent des risques particulièrement importants de
contamination, d’où la nécessité d’une vigilance accrue dans le respect des
recommandations hygiéniques à chacune de ces étapes ( LeBars-Bailly et al.,
1999).
6.4.1 Au stade de réception de lait cru
La qualité de la matière première utilisée est fondamentale. Le lait ne doit
pas contenir de spores de Mucor, pour cela, il faut qu’au niveau de l’atelier de
fabrication, les cuves de transport, les circuits de réception et les cuves de
stockage soient régulièrement nettoyées et désinfectées. Des mesures d’hygiène
doivent être prises en amont, chez le producteur laitier qui doit respecter une
hygiène rigoureuse de la traite ainsi que la réalisation des programmes de
nettoyage désinfection de tout le matériel (machine à traire, tuyauterie, tank de
réfrigération et de stockage du lait avec des produits adaptés (Devoyod , 1988).
6.4.2 Ensemencement et maturation
La sélection des ferments lactiques et leur bon dosage sont des points
critiques de point de vue technologique. La quantité de ferments doit être celle
nécessaire à une acidification assez rapide et suffisante. La température du lait
doit permettre la croissance des ferments (Jouve, 1996).
L’ensemencement du caillé par les levains fongiques est aussi une étape
qui présente un risque de contamination mais qui va aussi influencer les
possibilités de multiplication ultérieure des espèces contaminantes. Il est
nécessaire d’utiliser des ferments dépourvus de contaminants mais aussi
possédant des aptitudes physiologiques leur permettant de se développer
rapidement sur le fromage. Plus ce développement sera rapide, plus les risques
d’apparition des Mucor sont minimes. C’est l’effet barrière de la flore fongique
souhaitée. Pour que ces ferments se développent rapidement, il faut que
l’ensemencement soit suffisamment abondant le substrat (le caillé) doit
présenter des paramètres physico-chimiques permettant la croissance des
ferments fongiques tels que le pH et la teneur en eau (Breton, 1990).
6.4.3 Le moulage
Le moulage est une étape qui présente des risques élevés de
contamination, plus encore lorsqu’il est effectué à la louche. On peut avoir une
contamination par le matériel, les moules, les louches, si ceux – ci sont mal
lavés, mal désinfectés ou encore mal séchés. En effet, le séchage s’avère être
une étape très importante pour éviter une contamination éventuelle par des
myxospores. Le séchage des moules à l’air libre est à proscrire en raison de
l’abondance des spores dans l’atmosphère. Il peut être nécessaire de prévoir, au
sein de l’atelier de fabrication, un local spécifiquement destiné à cet usage
(Bergere et Lenoir, 1997).
6.4.4 Le salage
Le salage constitue une étape à risque, non pas que l’on risque de
contaminer le caillé, mais surtout parce qu’il est possible, en salant trop ou trop
peu, de créer des conditions favorables au développement des spores
contaminantes éventuellement présentes. Certaines espèces de Mucor sont
capables de supporter de grandes variations en teneur de sel que les espèces
fromagères (Desfleurs, 1980).
6.4.5 L’affinage
Pendant cette étape, il existe à la fois un risque de contamination du
fromage et un risque de multiplication des spores contaminantes déjà présentes
dans le caillé. L’atmosphère des chambres d’affinage est particulièrement
propice au développement des moisissures. Le problème est que les espèces de
Mucor contaminantes ont une vitesse de croissance supérieure à celle des
espèces fromagères. Par conséquent, une contamination du caillé au cours des
étapes précédentes deviendra rapidement visible pendant la période d’affinage.
L’hygiène de ces locaux est aussi très importante car ils ne doivent pas
représenter un réservoir de contaminants susceptibles ensuite de se développer
sur les fromages (Botton, 1990).
CHAPITRE III LE HACCP : Hazard Analysis and Critical Control
Point
1- L'Harmonisation du système HACCP à l'échelle international:
Le système d'analyse des risques points critiques pour leur maîtrise
(HACCP) identifie des dangers spécifiques et détermine les mesures préventives
à adopter en vue de les maîtriser et ceci dans le but d'assurer l'innocuité des
aliments. Le système HACCP est un instrument destiné à évaluer les dangers et
à établir des méthodes de contrôle axées sur des mesures préventives au lieu de
faire appel essentiellement à des procédures de contrôle à posteriori du produit
fini.
Le système HACCP peut être utilisé tout au long de la chaîne alimentaire,
de la production au consommateur final. Outre le renforcement de l'innocuité
des aliments, les avantages comprennent une meilleure utilisation des ressources
et une solution plus opportune aux problèmes qui se posent. De plus
l'application du système HACCP peut aider les autorités responsables de la
réglementation dans leur tache d'inspection et favoriser le commerce
international en renforçant la confiance à l'égard de l'innocuité des aliments
(NACMCF, 1989).
2- Historique
Le concept de HACCP est né aux Etats-Unis vers 1970 dans l'industrie
chimique pour mettre en place l'assurance de la qualité des opérations de
fabrication. Il s'est alors trouvé très tôt ,dés 1972 repris par les industries telles
que Pillsbury corporation travaillant aux cotés de la NASA et des laboratoires de
l'armée américaine pour la conception et la réalisation de l'alimentation des
cosmonautes.
Presque en même temps, le concept de HACCP a été très largement
introduit dans l'industrie américaine de la conserve. Ultérieurement, la méthode
a été utilisée sur une base volontaire dans diverses industries de l'alimentation
européennes (Jouve, 1996).
Parallèlement à son utilisation par ces industriels, diverses organisations
internationales ont prôné le recours au HACCP, considéré comme l'un des
meilleurs moyens de garantir la sécurité des produits alimentaires, en
prolongements des actions entreprises à la fois par les industriels eux-mêmes et
les organismes publics. Vont en particulier en ce sens les recommandations de
l'organisation mondiale de santé (OMS), de l'international Commission for
Microbilogical Spécification for Food (ICMSF) et plus récemment du Codex
Alimentarius qui vient de proposer la première harmonisation internationale des
définitions et des éléments de base de système (Codex Alimentarius, 1993).
3- Application du HACCP à différentes branches de l'industrie agro-
alimentaire
Il est bien établi que la majorité des accidents morbides à allure
épidémique d'origine alimentaire sont imputable à des traitements à
températures erronées, à une manutention incorrecte ou à une contamination
croisée une fois que les articles produits ne sont plus sous le contrôle des
fabricants. Ces derniers doivent également prendre conscience le fait que les
nombreux dangers dont sont porteurs les produits alimentaires sont déjà présents
dans les matières premières lorsqu'elles atteignent les usines où elles sont
transformées et que les mesures de contrôle actuellement disponibles à ce stade
de la chaîne alimentaire ne permettent pas de les éliminer (F.A.O/O.M.S, 1999).
4- Le HACCP –Définition:
C'est l'abréviation du Hazard Analysis and Critical Control Points qui
pourrait être traduite en français par analyse des risques et maîtrise des points
critiques.
Le HACCP est une approche systématique pour fabriquer des aliments
salubres acceptables basée sur l’identification et la gestion des points critiques à
maîtriser (Notermans et al.,1996)
Le système HACCP est une démarche préventive, spécifique et
responsabilisante qui doit permettre d'assurer la qualité des denrées alimentaires
dans le contexte d'une démarche qualité globale, il consiste en un contrôle
rigoureux depuis l'arrivée de la matière première jusqu'à l'expédition du produit
fini (Mortimore et Wallace, 1996).
Le recours à une approche fondée sur les principes de ce système
permettra ainsi d'anticiper ou de prévenir les problèmes avant qu'ils ne
surviennent (Figure 8).
Lorsqu'il est correctement appliqué, ce système permet de contrôler toutes
les étapes du processus de fabrication qui pourraient être sources de risques,
qu'ils soient d'origine microbiologique, physique ou chimiques (Rohmer, 1995).
5- Intérêts du système HACCP
Les avantages du système sont nombreux et peuvent être résumés comme
suit:
Atouts stratégiques
- Assurer la confiance du producteur sur la qualité de son produit.
- Apporte des garanties relatives à la sécurité alimentaire.
- Confère une image positive au pré du public, des médias, des salariés de
l'entreprise et des clients.
Atouts économiques
- Permet au producteur d'acquérir de nouveaux marchés (grandes distributions,
des marchés internationaux).
- Assure une meilleure rentabilité des ressources.
Atouts juridiques
-Assure la sécurité du consommateur tout en répondant à la réglementation
admise dans le pays.
- Permet à l'entreprise d'exercer conformément aux lignes directives des
administrations d'inspection et de contrôle de qualité.
Atouts managériaux
- Nécessite l'implication d'un personnel dans la démarche HACCP.
- Oriente la société vers un système de gestion de qualité (ISO 9001, ISO
9002) (Jouve, 1996).
Figure 5 : Schéma de la logique fondamentale du HACCP (Jouve, 1996)
Description des- matières premières
- ingrédients
Description duproduit fini
Identification del’utilisation attendue
Description du
ProcédéDiagramme de fabricationInformation technique des
Identification des dangers
Agents biologiques, physiques, chimiques
Identification des
conditions conduisant à :- la présence
- la contamination- le développement- la non élimination
de chaque danger
- Dans les
matières
premières
- Ingrédients
- Etapes du procédé
Evaluation
Danger(s) - Gravité- Fréquence- Probabilité
-Conditions
Faible impact Fort impact
Figure 5 (suite) : Schéma de la logique fondamentale du HACCP (Jouve, 1996)
* Bonnes Pratiques de Fabrication et d’Hygiène
Faible impact
Fort
Mise enplace
Amélioration
Mise enplace
Amélioration
- Identificationdes CCP
- Identificationdes optionsde maîtrise
à chaque CCP
Pour chaque CCP
- les limites critiques- surveillance
- suivi du procédé- actions correctives
Pour chaque CCP
- documentation- procédures opérationnelles
- procédures pour lasurveillance
Enregistrement
Documentation
RevueAméliorationMise à jour
Vérification
Entretien
Conduite despoints de contrôle
Procédures
Enregistrements
6- Principes du système HACCP
Le système HACCP repose sur sept principes qui définissent comment
établir, réaliser et assurer le suivi d'un plan HACCP pour l'opération étudiée
(Jouve, 1996).
Les principes du HACCP ont reçu une approbation internationale et ont
été publiés en détail par la commission du codex (Codex Alimentarius, 1993 ;
Nothermans et al., 1996).
Principe n°1
- Identifier les dangers associés à une production alimentaire à tous les
stades de celles-ci depuis la culture ou l'élevage jusqu'à la consommation finale,
en passant par le traitement, la transformation et la distribution.
- Evaluer la probabilité d'apparition de ces dangers.
- Identifier les mesures préventives nécessaire à leur maîtrise.
Principe n°2
- Déterminer des points critiques pour la maîtrise de ces dangers: (CCP ou
Critical Control Point).
Principe n°3
- Etablir les limites critiques dont le respect atteste de la maîtrise effective
des CCP.
Principe n°4
- Etablir un système de surveillance permettant de s'assurer de la maîtrise
des CCP.
Principe n°5
- Etablir des actions correctives à mettre en œuvre lorsque la
surveillance révèle qu'un CCP donné n'est plus maîtrisé.
Principe n°6
- Etablir des procédures spécifiques pour la vérification, destinées à
confirmer que le système HACCP fonctionne efficacement.
Principe n°7
- Etablir un système documentaire (procédures et enregistrements)
approprié couvrant l'application des six principes précédents.
7- Etapes du système HACCP
Elles consistent à décrire une séquence logique de 12 activités afin de
mettre en œuvre les principes identifiés précédemment (Figure 9) (Mortimore et
Wallace, 1996).
7-1- Constitution de l’équipe HACCP
L’équipe HACCP est la structure opérationnelle indispensable au
développement de l’action. Elle rassemble des participants de l’entreprise
possédant les connaissances spécifiques et une expérience appropriée au produit
considéré et directement impliqués dans la construction et la maîtrise de la
sécurité. Ces participants constituent le noyau dur de l’équipe, responsable et
pilote de l’étude.
7-2- Description du produit
Il s’agit de procéder à un véritable audit de produit et donc à l’étude et à la
description complète des matières premières, des ingrédients, des produits en
cours de fabrication et des produits finis. Ceci dans le but d’apprécier le rôle
joué par les facteurs liés au produit dans l’origine des dangers étudiés et ou leur
évolution jusqu’à un niveau inacceptable ainsi que les éléments nécessaires à
leur maîtrise.
Constituer l’équipe HACCP
Décrire le produit
Décrire son utilisation prévue
Etablir un diagramme des opérations
Enumérer tous les dangers potentielsEffectuer une analyse des risques
Fixer un seuil critique pour chaqueCCP
Déterminer les CCP
Fixer un seuil critique pour chaque CCP
Mettre en place un système desurveillance
Prendre des mesures correctives
Appliquer des procédures de vérification
Tenir les registres et constituer un dossier
Vérifier sur place le diagramme desopérations
Figure 6 : Séquence logique d’application dusystème HACCP (Codex Alimentarius, 1993)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7-3-identification de l’utilisation attendue
Elle complète les informations précédentes et conduit à préciser la
durabilité attendue, les modalités normales d’utilisation du produit, les
instructions données pour l’utilisation.
7-4- Description du procédé de fabrication
Il s’agit dans ce cas d’un audit du procédé. Au cours de cette phase, le
processus étudié est dissocié en chacune de ses étapes élémentaires identifiés
sous forme de diagramme de fabrication (Flow diagram ; process flow chart) qui
servira de guide pour l’étude.
7-5-vérification sur site du diagramme de fabrication
C’est une étape indispensable afin de s’assurer de la fiabilité du
diagramme préétabli et de l’exclusivité des informations recueillies. Elle se
déroule sur site, pour chacune des étapes élémentaires identifiées et durant les
heures de fonctionnement de la chaîne.
7-6- Analyse des dangers
Etape clé du HACCP qui consiste à collecter et à interpréter toutes
informations disponibles sur les dangers et les conditions de leur présence dans
le but de déterminer ceux puis celles qui doivent faire l’objet d’interventions
spécifiques (plan HACCP détaillé).
Sous le terme de danger, il faut considérer :
- Les agents biologiques (parasites, micro-organismes, toxines),
- Les composés chimiques (toxiques naturels ou acquis ; résidus ; excès
d’additif),
- Les corps étrangers.
Sous le terme de condition, il faut entendre toute situation où l’on aura à
redouter :
- La présence, à un taux inacceptable, de contaminants de nature
biologique, chimique ou physique dans les matières premières, les produits
intermédiaires ou les produits finis.
- La contamination ou la re-contamination à un taux inacceptable des
produits intermédiaires ou des produits finis par des micro-organismes, des
composés chimiques ou des corps étrangers.
- La production ou la persistance à des taux inacceptables de toxines ou
d’autres produits indésirables issus du métabolisme microbien.
- La survie ou la multiplication à des taux inacceptables de micro-
organismes pathogènes et la génération à des taux inacceptables de composés
chimiques toxiques dans les produits intermédiaires, les produits finis, la ligne
de production ou son environnement.
7-7- Déterminer les points critiques pour la maîtrise des dangers
(Principe2)
La détermination d’un CCP peut être facilitée par l’application d’un
« arbre de décision » (par exemple Diagramme de la figure 10) qui présente une
approche de raisonnement logique. L’arbre de décision doit être appliqué avec
souplesse selon que l’activité est une opération de production, de transformation,
d’entreposage, de distribution ou autre. Elle peut servir de guide pour déterminer
les CCPs. L’exemple présenté dans le diagramme peut ne pas être applicable à
toutes les situations. Il est possible de recourir à d’autres approches.
Si un danger a été identifié à une étape où la maîtrise est nécessaire pour
assurer la salubrité et s’il n’existe aucune mesure de maîtrise à cette étape, ou à
toute autre étape, le produit ou le procédé doivent donc être modifiés à cette
étape, ou à tout autre stade antérieur ou ultérieur, en vue de l’inclusion d’une
mesure de maîtrise.
7-8- Etablir les limites critiques pour chaque CCP (Principe 3)
Les limites critiques doivent précisées pour chaque point critique pour la
maîtrise des dangers. Dans certains cas, plusieurs limites critiques seront établies
à une étape déterminée. Parmi les critères fréquemment utilisés, on note les
mesures de température, de temps, d’humidité, de pH, d’aw, de taux de chlore
disponible et des paramètres sensoriels tels que l’aspect visuel et la texture.
Existe-t-il une ou plusieurs mesure (s)Préventive(s) de maîtrise ?
Oui NonModifier l’étape, le procédé
ou le produit
La maîtrise est-elle nécessairepour garantir la salubrité ?
Oui
Non Pas de ccpC
Stop*
L’étape est-elle expressément conçue pouréliminer la probabilité d’apparition d’un
danger ou la ramener à un niveauacceptable ?**
Oui
Non
Est-il possible qu’une contaminations’accompagnant de dangers identifiés survienne à
un niveau dépassant les limites acceptables ouces dangers risquent-ils d’atteindre des niveaux
inacceptables
Q1
Q2
Q3
Oui Non Pas de CCP
Stop*L’étape suivante permettra-t-elle d’éliminer le ou
les risque(s) identifié(s) ou de ramener leur
Q4
Oui Non
Pas de CCP Stop*
Point critique pour la maîtrise(CCP)
** Il est nécessaire de définir les niveaux acceptableset inacceptables en tenant compte des objectifs
généraux lors de la détermination des CCP dans leplan HACCP.
* Passer au prochain dangeridentifié dans le processus décrit.
Figure 7 : Arbre de décision permettant de déterminerles CCP (FAO/OMS 1999)
7-9- Etablir un système de surveillance pour chaque CCP (Principe4)
La surveillance correspond à la mesure ou à l’observation programmée
d’un CCP par référence à ses limites critiques. Les procédures de surveillance
doivent être telles qu’elles permettent de déceler toute perte de maîtrise des
CCPs. Par surcroît, la surveillance doit, idéalement, fournir une information en
temps utile pour faire des ajustements et s’assurer da la maîtrise du processus
pour éviter de dépasser les limites critiques. Si la surveillance n’est pas continue,
le nombre et la fréquence des opérations de surveillance doivent être suffisants
pour garantir la maîtrise du CCP. La plupart des procédures de surveillance des
CCPs doivent être réalisées rapidement dans la mesure où elles correspondent à
des contrôles en direct pour lesquels on ne dispose pas du temps nécessaire à de
longs essais analytiques.
7-10- Etablir les actions correctives (principe 5)
Dans le contexte du système HACCP, des actions correctives spécifiques
doivent être prévues pour chaque CCP de façon à pouvoir réagir aux écarts
lorsqu’ils surviennent.
Les actions entreprises doivent permettre de vérifier que le CCP a été à
nouveau maîtrisé.
7-11- Etablir des procédures de vérification (principe 6)
Etablir des procédures pour s’assurer que le système HACCP fonctionne
correctement. Des méthodes de suivi et de vérification des procédures et des
tests, y compris l’échantillonnage au hasard et l’analyse, peuvent être utilisés
pour vérifier que le système HACCP fonctionne correctement. La fréquence des
vérifications doit être suffisante pour valider le système HACCP. Les activités
de vérification comprennent par exemple :
-L’examen du système HACCP et de ses documents.
-L’examen des écarts et la destination donnée aux produits.
-La confirmation que les CCPs sont bien maîtrisés.
-La revalidation des limites critiques établies.
7-12- Etablir un système d’enregistrement et de documentation
(Principe 7)
Un enregistrement efficace et précis est essentiel pour l’application du
système HACCP. Les procédures HACCP se référant à chacune des étapes
doivent être documentées et ces documents doivent réunis dans un manuel
(Figure 11).
Les enregistrements concernent par exemple :
- Les ingrédients
- La transformation
- Le conditionnement
- L’entreposage et la distribution
- Les dossiers relatifs aux écarts
Figure 8: Structure documentaire du système HACCP
(Codex Alimentarius, 1993)
Règles d’organisation
dispositions généralesPLAN HACCP
Organismes,
Définitions des fonctions,
Procédures de vérifications,
Procédures de revue du système
Procédures préventives de maîtrise,
conduite du processus qualification du personnel
Procédures de surveillance, Procédures d’actions correctives
Enregistrements documentaires
Niveau descriptif synthétique
(Manuel HACCP)
Niveau de preuve
Niveau d’application
Niveau de référence
Niveau de surveillance
Niveau de preuve
CHAPITRE IV La microbiologie prévisionnelle ou prédictive
1- Généralités sur la modélisation
La croissance microbienne est un phénomène très complexe du fait du
nombre et du type de réactions qui interviennent, mais également de l’influence
et de l’interaction de certains facteurs extérieurs qui peuvent s’exercer.
La définition des conditions optimales de croissance des micro-
organismes était basée sur l’étude d’un grand nombre possible de paramètres
maîtrisables (composition du milieu, facteurs extérieurs on ne faisant varier
qu’un seul à la fois et les interactions entre les paramètres étaient négligées.
Traditionnellement, les microbiologistes essaient de comprendre les
phénomènes sous-jacents à la conservation des produits alimentaires par des
challenge tests, c’est à dire qu’ils interprètent a posteriori les différences entre
les états microbiologiques initial et final par des considérations sur les
conditions physico-chimiques de stockage. Or ces méthodes sont fastidieuses et
coûteuses et ne concernent que le produit testé et les conditions dans lesquelles
il a été étudié.
Actuellement, l’application des méthodes mathématiques et de
statistiques, a permis d’accroître de façon considérable la connaissance de ces
phénomènes et leur maîtrise (Leveau et Bouix, 1988). C’est ainsi qu’il est
possible d’établir une équation mathématique permettant de traduire de façon
aussi précise que possible le phénomène que l’on veut analyser. Cette équation
peut être complexe en faisant intervenir tous les paramètres à étudier. Le modèle
ainsi réaliser est soumis au test de validité c’est à dire évaluer l’écart entre les
valeurs expérimentales et les valeurs fournies par le calcul à l’aide du modèle.
C’est dans ce contexte que le concept de microbiologie prévisionnelle (Roberts,
1995 ; Whiting, 1995 ; McMeekin et Ross, 1996) a été proposé ; les phénomènes
observés sont modélisés avec des modèles généraux valables pour plusieurs
micro-organismes et plusieurs types d’aliments. Ceci nous conduit à prévoir le
résultat d’un essai sans pour autant le réaliser (simulation), d’ou un gain de
temps considérable (Buchanan et whiting, 1996). Cette approche est largement
exploitée actuellement afin d’optimiser et accroître la rentabilité des
phénomènes de fermentation par exemple et d’assurer également la sécurité
microbiologique des produits alimentaires grâce à l’estimation des risques
associés à des germes pathogènes (Baranyi et Roberts,1994).
L’utilisation de la microbiologie prévisionnelle intervient également dans
la mise en place des démarches HACCP en indiquant les conditions permettant
la croissance ou la survie des micro-organismes (analyse des risques) et delà à
identifier les points critiques pour la maîtrise de la sécurité des aliments
(Baker,1995 ; Notermans et al,1995).
Enfin, la simulation du comportement des micro-organismes sous
différentes conditions environnementales peut permettre de fixer les limites
critiques à ne pas dépasser pour certains facteurs (la température, le pH,
l’aw,…..).
2-Fondements et démarches de la modélisation
Le développement des micro-organismes obéit à des lois, que l’on peut
représenter par des équations mathématiques. Une courbe de croissance
microbienne comporte dans tous les cas plusieurs phases bien distinctes. On peut
attribuer à cette courbe une ou plusieurs expressions mathématiques. Ce sont ces
expressions que l’on nomme « modèles ».
Les modèles publiés décrivant la croissance des micro-organismes sont
pour la plupart des modèles empiriques, c’est à dire qu’ils sont développés à
partir d’observations de faits expérimentaux (Hedges,1991). Il existe cependant
des modèles dits mécanistes qui sont construits à partir de théories sur le
comportement des micro-organismes et qui sont donc intellectuellement plus
satisfaisants (Cole et al., 1991). Ces modèles mécanistes sont basés sur les
phénomènes biologiques et leur compréhension, et sont parfois appelés modèles
phénoménologiques (Heitzer et al.,1991).
D’une manière plus générale, on distingue deux grandes familles de
modèles descriptifs du développent microbien : les modèles primaires et les
modèles secondaires.
Les modèles primaires décrivent l’évolution de la population de micro-
organismes en fonction du temps dans un environnement déterminé.
Ils peuvent être statiques ou dynamiques ; de croissance ou de décroissance, de
destruction ou de survie.
Les modèles statiques de croissance décrivent par exemple la courbe de
croissance d’une population en conditions stables de température comme par
exemple les modèles classiques dits « logistiques » de Gompertz, ou encore de
Buchanan.
Les modèles dynamiques de croissance, comme ceux de Baranyi
expriment également la croissance de la population, mais en tenant compte par
exemple des conditions de températures qui varient dans le temps (Zwietering et
al., 1990).
Les modèles secondaires par contre décrivent la dépendance des paramètres de
l’évolution des micro-organismes (temps de latence, taux de croissance
maximale, concentration cellulaire maximale) par rapport aux conditions de
l’environnement, décrites par les conditions de température, de pH, ou d’activité
de l’eau. Ainsi un modèle secondaire peut servir à modéliser l’évolution du taux
de croissance maximum (µmax) en fonction de la température, les autres
conditions de l’environnement étant stables. Les paramètres influents sur le
développement microbien sont nombreux, mais dans les conditions normales,
une poignée de paramètres suffissent pour le décrire avec une bonne précision.
3-Modélisation de la croissance des micro-organismes
3-1-Cinétiques de la croissance microbienne
Il existe plusieurs méthodes expérimentales permettant de mesurer
l’évolution des populations de micro-organismes (détermination du taux de
croissance maximum µmax). Ces différentes techniques reposent sur deux grands
types de mesures :
Les mesures directes du nombre de micro-organismes fondées sur les
dénombrements sur boites de Petri ou la cytométrie en flux (Rosso et al.,1993).
Les mesures indirectes du nombre de micro-organismes qui consistent à
évaluer les variations de la densité bactérienne par le dosage de certains
composés dont la synthèse est due au métabolisme bactérien (ATPmètrie,
dosage du glucose, du CO2,etc.), ou par la mesure des variations d’une grandeur
physique du milieu comme la densité optique (turbidimétrie), ou la mesure de la
conductance ou de la capacitance (l’impédancemétrie) (Baranyi et
Roberts,1994).
Le schéma classique de la croissance d’une population de micro-
organisme en milieu non renouvelé (Figure 9) comporte sept phases bien
distinctes :
La phase de latence, qui correspond à une phase de transition entre un état
physiologique initial et un état de croissance à proprement parler (phase
d’adaptation au nouvel environnement).
La phase d’accélération
La phase de croissance quasi-exponentielle. La pente de la droite (lorsque
la concentration bactérienne est exprimée en coordonnées semi-logarithmiques)
correspond à la vitesse (ou taux) de croissance maximale, µmax (h-1) :
µmax = y2-y1 / t3-t2
La phase de décélération ou phase de freinage, qui semble intervenir au
fur et à mesure que le substrat s’épuise ou que des produits toxiques
s’accumulent.
La phase stationnaire maximale.
La phase d’accélération de la décroissance.
La phase de décroissance exponentielle, qui apparaît lorsque le milieu
devient fortement défavorable à la multiplication des cellules.
log (Concentration microbienne)
Figure 09 : Cinétiques de croissance microbienne (Leveau et Bouix,1988).
Les cinétiques de croissance observées en pratique ne correspondent pas
au schéma classique simplifié de la figure 9 qui présentent une grande
variabilité. Néanmoins de nombreux efforts ont été fournis pour modéliser les
quatre ou cinq premières phases de cette cinétique.
Les cinétiques de croissance microbienne sont le plus souvent
représentées proportionnelle à x c’est à dire que le taux de croissance dx/dt est
constant :
1/x dx/dt = µmax
t ≥0 et 0< x0 ≤ x
Des modèles plus complexes permettant de décrire de façon continue les
phases de croissance de 1 à 5 ont été proposés par de nombreux auteurs qui
utilisent le modèle de Gompertz appliqué sur le logarithme décimal de la
concentration bactérienne (Gibson et al., 1988 ; Zwietering et al., 1990).
3-2 Description des principaux modèles
3-2-1 Le modèle primaire de Baranyi (Baranyi et Roberts, 1994) introduit la
fonction de freinage f(x) permettant de décrire les phases 4 et 5 et une fonction
d’adaptation α (t) pour décrire les phases 1 et 2 (Figure 10) :
1/x dx/dt = µmax α (t) f(x)
avec f(x) = 1- x/xmax et α (t) = q(t)/1+q(t)
La fonction α (t) est une fonction sigmoïde strictement croissante à
valeurs dans [0,1] et tendant vers 1 lorsque t tend vers l’infini. La fonction q(t) à
l’état physiologique de la cellule.
La forme intégrée de ce modèle est la suivante (Baranyi et Roberts,1994) :
Y= y0 +µmax A(t)- ln[1+ eµmaxA(t)-1/ eymax-y0)]
avec A(t) = t + 1/µmax ln[e -µmaxt (1-e–h0) + e-h0] (4)
et h0 = µmax x lag
Ce modèle repose sur l’hypothèse que l’adaptation se fait au taux de
croissance µmax et donc α(t) = α(0) = e-h0 avec h0 = ln [1+1/q0]
Le modèle de Baranyi (4) est un modèle non linéaire à quatre paramètres
avec :
-y0=ln(x0) le logarithme népérien de la concentration microbienne initiale,
-ymax=ln(xmax) le logarithme népérien de la concentration microbienne
maximale que peut atteindre la population de départ,
-µmax le taux de croissance maximum,
-h0 une constante égale au produit du taux de croissance par le temps de
latence (Zwietering et al.,1994). Selon Rosso,(1995), la constante h0 peut être
prise égale à h0=µopt X lagmin.
Les paramètres µopt et lagmin sont respectivement les taux de croissance et
temps de latence à la température optimale de croissance.
Le modèle de croissance de Baranyi est un modèle primaire car il permet
de relier la concentration de la population microbienne au temps ; il appartient
au premier niveau de modélisation.
3-2-2 Modèle primaire de Rosso appelé également modèle logistique avec
délai et rupture. Une croissance microbienne, obtenue à température, pH et
activités de l’eau constants, est ajustée à un modèle primaire (Figure 11).
L’équation est de la forme :
si t<= à lag dN/dt=0
si t> à lag dN/dt= µmax.N(1-N/Nmax)
Figure 10: Modèle primaire de Baranyi (Baranyi et Roberts, 1994)
Figure 11: Modèle primaire de Rosso (Rosso et al., 1995)
3-3 Les modèles secondaires : Il existe des modèles cardinaux, polynomiaux
ou encore d’Arrhenius.
Les modèles secondaires correspondant au modèle de Baranyi peuvent
s’écrire sous la forme :
µmax ou h0 = f(T, pH, aw ;θ)
T et pH désignent respectivement la température et le pH, aw est une variable
corrélée à la teneur en sel du milieu. θ est le vecteur des paramètres.
3-3-1 Modèles cardinaux
Le modèle le plus simple est le Modèle des Températures Cardinales
avec point d’Inflexion (modèle CTMI) de Rosso et al.(1993). Il relie le taux de
croissance maximum à la température seule (Equation 7).
0 T≤Tmin
µmax = µopt x γ (T) Tmin<T<Tmax (6)
0 T≥Tmax
avec γ(T) =
Les trois températures Tmin, Topt et Tmax sont les températures cardinales
caractéristiques du micro-organisme : Tmin est la température minimale de
croissance en dessous de laquelle aucune croissance n’est observée ; Topt est la
température optimale de croissance correspondant au taux de croissance µopt ;
Tmax est la température maximale de croissance au dessus de laquelle la
croissance n’est plus observée (Figure 12).
Il existe une relation biologique linéaire reliant les trois températures
cardinales (Rosso et al.,1993):
Tmin = Topt – 31.425 avec r2 = 0.899 et σr2 = 11.738 (7)
Tmax = 1.1 x Topt + 3.429 avec r2 = 0.971 et σr2 =3.774 (8)
Ces relations linéaires sont valables pour des micro-organismes aussi bien
psychrophiles, que mésophiles ou bien encore thermophiles.
Afin de tenir compte du pH sur la croissance microbienne, Rosso et
al.,(1995) ont proposé de complexifier le modèle CTMI en définissant le modèle
des températures et pH cardinaux (CTPM).
Enfin pour tenir compte de l’effet de la teneur en sel du milieu sur la
croissance des micro-organismes, Zwietering et al.,(1992) ont proposé
Le modèle complet des températures, pH et activités de l’eau cardinaux
(CTPAM). Ces modèles donnent une bonne précision d’ajustement. Ils
présentent en outre l’intérêt d’une signification biologique évidente des
(T-Tmax) (T-Tmin)
(Topt-Tmin)[(Topt-Tmin)(T-Topt)+(Topt-Tmax)(Topt+Tmin-2T)]
paramètres (température, pH, aw…). Enfin ce sont des modèles évolutifs,
présentant de larges possibilités d’amélioration des prévisions.
Figure 12 : Modèle secondaire cardinal de température (Prévision du
taux de croissance d’Escherichia coli)(Rosso et al.,1993)
3-3-2 Modèles secondaires polynomiaux
Ces modèles sont utilisés pour décrire une croissance liée à plus de deux
facteurs :
Taux de croissance µ =( ax + by + cz + dx2 + ey2 + …..+ fzn)
X, y,….z sont des facteurs environnementaux.
Les modèles polynomiaux sont aisés à calculer, et donnent des prévisions
acceptables. Leur défaut principal est que les paramètres (a,b,c…n) sont sans
signification biologique (McClure et al., 1993) (Figure 13).
Figure 13: Modèle secondaire polynomiale (Prévision du taux de croissance en
fonction du pH et de la température de Brochotix thermosphacta (McClure et al., 1993)
3-3-3 Modèle d’Arrhenius
Ce modèle s’inspire des cinétiques de réactions chimiques. Il s’exprime par la
relation :
µ= A e-Ea/RT
µ : taux de croissance
Ea : énergie d’activation (cal.mol-1)
R : constante des gaz parfaits
A : autre constante
T : température de stockage (degré Kelvin)
Le modèle d’Arrhenius concerne la croissance ou l’inactivation microbienne
(Bourgeois, 1991).
Objectifs de l'étude
A- Détermination des points critiques à l'origine de la contamination du fromage
par le mucor au cours de son passage dans la chaîne de fabrication qui peuvent
servir à l’amélioration des qualités organoleptiques et hygiéniques du produit
par la mise en place d’un plan HACCP. Proposition des solutions préventives et
correctives permettant de maîtriser les dangers microbiologiques relatifs aux
mucors.
B- Amélioration de la maîtrise des paramètres technologiques de fabrication
grâce à la substitution des ferments lactiques mésophiles constitués de
Lactococcus lactis ssp lactis et Lactococcus lactis ssp cremoris par les
thermophiles représentés par Streptococcus salivarus ssp thermophilus durant la
maturation. Cette dernière étant considéré comme un point critique à maîtriser
(CCP : Critical Control Point) en terme d’analyse des risques dans le système
HACCP.
C- Détermination de l’influence da la température, de la concentration en NaCl,
de l’activité de l’eau (aw) et du pH sur la croissance d’une espèce mucorale :
Mucor racemosus contaminant le fromage à pâte molle type camembert et ce par
le développement de modèles prédictifs empiriques.
MATERIELS ET METHODES
I- Détermination des points critiques relatifs au Mucor sp et mise en place
d’un plan HACCP dans un fromage à pâte molle type camembert
Cette étude expérimentale a été réalisée à la laiterie- fromagerie Sidi
Saada (Wilaya de Relizane) dans une période très critique ou la maladie du poil
de chat sévissait et posait de sérieux problèmes pour l’unité allant de 2002
jusqu’à la fin 2005.
I-1- Techniques de fabrication du camembert industriel
Le lait utilisé pour l’élaboration du camembert est un lait de vache cru
récolté dans la localité de la wilaya de Relizane.
Après standardisation qui consiste à normaliser la composition du lait en
matière grasse à 26 g/l, ce dernier subit une pasteurisation à 78°C/15 à 20
secondes dans le but d’améliorer sa qualité microbiologique. Le lait est ensuite
stocké dans des tanks pendant 24 heures à 4-6°C, puis il est soutiré vers les tanks
de la salle de maturation ou il subit un réchauffage à 38°C, ensuite une
maturation allant de 15 min à 1h-30min tout en ajoutant les ingrédients
suivants :
- Ferment lactique mésophile (Lactococcus lactis ssp lactis et Lactococcus
lactis ssp cremoris) à raison de 2%.
- Chlorure de calcium (CaCl 2) à raison de 0.05 g/l
- Penicillium camemberti et Geotrichum candidum à raison de 0.1%
L'emprésurage est effectué par la présure d'origine fongique à raison de
2.5 %/100l de lait. Le temps de prise marquant le début de la coagulation est de
10 minutes, alors que la coagulation totale dure 30 à 40 minutes. Après cela
intervient l’étape de tranchage ou le caillé est découpé en grains de 2 à 2.5 cm3
afin d’augmenter la surface d’exsudation du sérum, suivi d’un léger brassage
pour éviter la réaglomération des grains du caillé et qui par choc mécanique
facilite l’exsudation du sérum hors des grains. Après avoir soutiré 30 à 40 % de
lactosérum, on procède au moulage du coagulum dans des clayons comprenant
des moules. Les pièces obtenues vont subir deux retournements successifs, le
premier est opéré après 1 heure 30 minutes, le second intervient 03 heures après.
L'égouttage est activé durant 16 heures dans une salle dont le gradient de
température baisse de 18 à 16 °C.
Les fromages sont ensuite démoulés manuellement, placés sur des claies
et plongés dans un bain de saumure pour atteindre 1.7 à 1.8 % de NaCl /100 g de
fromage.
Le temps de salage est fonction de l’acidité et dure environ 20 à 45
minutes. Une fois salés, les fromages expérimentaux subissent un ressuyage
pendant 2 à 3 heures à une température de 14 à 15 °C et à une humidité relative
de l’ordre de 85%.
L'affinage constitut la dernière étape, les fromages sont placés dans des
hâloirs à une température de 12 à 15 °C et une hygrométrie de 90% (figure 17).
I-2- Niveaux de prélèvement
Les niveaux de prélèvement destinés à l’analyse microbiologique sont
mentionnés dans le tableau suivant :
Tableau 1 : Les différents points de prélèvement
Niveaux de prélèvement
Matières premières Lait cru
Lait après pasteurisation
Lait avant maturation et après maturation
Appareillages et
matériels
Appareils et matériels de : la salle de réception
la salle de maturation
la salle de fabrication
la salle de salage
la salle de ressuyage
la salle d’affinage
Personnels Mains, blouses et bottes du personnel au contact du
produit
Sols, murs
et ambiance
Différentes salles : Réception
Maturation
Fabrication
Salage
Ressuyage
Affinage
Chaîne de fabrication Lait coagulant
Caillé après tranchage et brassage
Caillé durant l’égouttage et retournements
Fromage après démoulage
Fromage après salage
Fromage après ressuyage
Fromage durant l’affinage (3èm,6èm, 9èm et 12èm jour)
Réception de lait Acidité 16°D↓
Stockage du lait (tanks) T° 4-6°C↓
Standardisation 26 g/l de MG↓
Pasteurisation 78°C/20 S↓
Maturation 1 h à 1h 30 min30°C
Cacl2 0.05 g/lPenicillium etGeotrichum 0.1%
Présure 25 ml/100l Coagulation↓
Grains 2 à 2.5 cm Tranchage ↓
Léger brassage Synérèse↓
Retournement le 1er à 1 h30 min après moulagele 2èm à 3 h après moulage
↓Egouttage 16 heures à 16-18°C
↓Salage du caillé 24 -26% NaCl
20 à 45 min↓
Ressuyage 15°C/85% HR/24h
Pulvérisation de ↓moisissures Affinage 12J à 12°C/ 90%HR
et retournement ↓
Conditionnementet
conservation
Figure 14: Diagramme de fabrication de Camembert industriel à l’unité de Sidi saada
I-3- Prélèvement des échantillons à contrôler
L'expérimentation s'est déroulée de la mi-Mars jusqu'à la fin Avril. Les
échantillons sont prélevés en triples essais dans des conditions d'asepsie strictes,
puis immédiatement soumis à un examen microbiologique mucorale.
Les prélèvements au niveau de l'ambiance sont réalisés en laissant les
boites de pétri contenant la gélose spécifique aux mucors ouverte durant 02
heures. Concernant les autres points de la chaîne (personnels, murs, sols, rigoles
d'égouts et matériels), le prélèvement est réalisé par écouvillonnage.
I-4- Techniques analytiques
Après prélèvement des essais expérimentaux, chaque échantillon est mis
dans un tube à essai stérile contenant 9 ml d'eau physiologique stérile. Tout en
effectuant une légère agitation et à partir des dilutions décimales retenues de 10-
1 à 10-3, porter 1 ml de chaque dilution et ensemencer dans des boites de pétri
contenant le milieu gélosé sélectif pour les Mucor et dont la composition en
grammes par litre est la suivante : Extrait de malt : 20, Extrait de levure : 2,
Chloramphénicol : 0,5, Kétoconazole : 0,05, Agar-agar : 15, pH = 5,4 – 5,8
Après ensemencement, les boites sont incubés pendant 05 jours à 20°C
(Lemens, 1996). La lecture et le dénombrement ont lieu à partir du troisième
jour.
Les résultats sont exprimés en UFC/ml ou en UFC/g de produit.
II- Etude de la substitution des ferments lactiques mésophiles par des
thermophiles sur le développement des Mucor sp lors de l’affinage
II-1-Dispositif expérimental
Les fromages expérimentaux destinés à l'affinage ont été préparés avec du
lait de vache pasteurisé et standardisé en matière grasse. La maturation sert à
améliorer le lait en tant que milieu de culture pour les bactéries lactiques et
d’amener le lait à son pH optimum d’emprésurage, consiste à réchauffer le lait
aux températures de 30°c et 42°C et qui correspondent respectivement aux
températures optimales de croissance des ferments lactiques ensemencés
mésophiles et thermophiles. Les ferments lactiques industriels sont identifiés
comme suit:
Mésophile MA014 : - Lactococcus lactis subsp.lactis
- Lactococcus lactis subsp.cremoris
Thermophile TA052 : - Streptococcus salivarus subsp.thermophilus
Au cours de cette étape sont également additionnés du chlorure de
calcium : CaCl2 (0.05g/l), le Penicillium camemberti et Geotrichum candidum
(principales souches de couverture et d’affinage) à raison de 0.1%. Le lait pré-
coagulé nécessite un temps de maturation d’une heure à une heure et demi et
atteint une acidité qui varie de 22 à 24 °D. L’emprésurage est effectué à l’aide
d’une présure d’origine fongique à raison de 25ml pour 100 litres de lait, tout en
maintenant la température de la salle de fabrication entre 26 –28 °C. Le caillé
mixte obtenu est découpé, homogénéisé puis mis en moules. Le salage se fait
par immersion dans une saumure de chlorure de sodium : NaCl (26%). La durée
de salage est fonction de l’acidité Dornic atteinte au démoulage. Les fromages
jeunes sont ressuyés puis transférés en salle d’affinage jusqu’au moment de
l’emballage (J12).Les conditions d’ambiance, température et humidité relative
sont respectivement de l’ordre 12 °C et 85%.Afin d’estimer l’effet de l’humidité
relative sur l’évolution des paramètres mesurés, d’autres essais ont été réalisées
dans une atmosphère de 95%, la température étant maintenue à 12°C.Les
fromages sont retournés une fois tous les 48 heures accompagnés par une
nouvelle pulvérisation en surface de moisissures. Le procédé de fabrication du
camembert est présenté sur la figure 18
Les pâtes molles expérimentales sur lesquelles ont porté nos analyses sont
réparties en deux lots dont chacun contient 06 pièces de camembert soit un
nombre de 12 pièces.
Réception de lait Acidité 16°D ↓
Stockage du lait (tanks) T° 4-6°C ↓
Standardisation 26 g/l de MG ↓
Pasteurisation 78°C/20 S ↓Ferments lactiques Maturation 1 h à 1h 30 min
SubstituésCacl2 0.05 g/l
Penicillium etGeotrichum 0.1%
Essai N°1 Essai N°2Ferment mésophile (2%) Ferment thermophile (2%)
30° C 42° C
Présure 25 ml/100l Coagulation ↓
Grains 2 à 2.5 cm Tranchage ↓
Léger brassage Synérèse ↓
Retournement le 1er à 1 h30 min après moulagele 2èm à 3 h après moulage
↓Egouttage 16 heures à 16-18°C
↓Salage du caillé 24 -26% NaCl
20 à 45 min ↓
Ressuyage 15°C/85% HR/24h
Pulvérisation de ↓moisissures Affinage 12J à 12°C/85%HR
et retournement et à 12°C/95%HR ↓
Conditionnementet
conservation
Figure 15: Diagramme de fabrication de Camembert industriel expérimental
Les levains lactiques industriels mésophiles et thermophiles ayant servi à
la maturation du lait pour l’élaboration du camembert expérimental ont subi un
certain nombre de tests permettant la vérification de la pureté, l’identité des
souches qui les caractérisent, la concentration bactérienne ainsi que leur pouvoir
acidifiant. Les étapes suivies sont les suivantes :
II-1-1 Préparation des souches
Les souches lyophilisées concentrées sont repiquées directement dans 10
ml de lait écrémé et incubées pendant 01 heure, suivi de dilutions succéccives
jusqu’à 10-9 à 10-10 dans de l’eau distillée stérile. 1 ml de la dernière dilution est
inoculé dans des boites de pétri contenant le milieu M17 recommandé par
Petransxienne et Lapied, (1981). Un dénombrement est effectué après
incubation à 30°C et 42°C pendant 24heures pour respectivement les
lactocoques et Streptococcus thermophilus
II-1-2 Etude des caractères morphologiques
Cette étude s’effectue par examen microscopique et permet d’observer la
morphologie des cellules, leur taille, leur mode regroupement après coloration
de Gram.
II-1-3 Etude des caractères physiologiques
a- Température de croissance
Après inoculation en bouillon M17 avec les cultures des souches à tester, les
tubes sont incubées à 45°C/24-48heures. Ce test permet de distinguer
Streptococcus thermophilus qui pousse à 45°C et même au dessus (50°C) des
lactocoques incapables de croître à cette température, mais par contre poussent
encore à 10°C alors que Streptococcus thermophilus ne le peut pas. (Leveau et
Bouix, 1980).
b- Test de croissance en milieu hostile
- Croissance en présence de 6.5% NaCl
Les souches pures sont cultivées en bouillon M17 à 6.5% de NaCl, puis
incubées à 30 et 42°C pendant 24 à 48 heures pour respectivement les
lactocoques et S. thermophilus. La croissance est appréciée par l’apparition de
troubles. Dans ce milieu seul les Streptocoques se développent (Leveau et
Bouix, 1980).
- Croissance en présence de 4% NaCl
On utilise le même milieu cité précédemment avec cependant 4% de
NaCl. Il faut rappeler que Lactococcus lactis subsp cremoris ne peut pas croître
dans ce milieu (Schleifer et al., 1985).
- Croissance à pH 9.6
Ce test est réalisé en inoculant un milieu liquide (bouillon M17) dont le
pH est porté à 9.6par les souches lactiques. Les tubes sont incubés à 30°C et
42°C pendant 24-48 heures pour respectivement Lactococcus lactis et
Streptococcus thermophilus (Guiraud et Galzy, 1980).
- Croissance sur lait bleu de Sherman
Le bleu de méthylène est décoloré par les germes possédant une activité
réductasique. Cette propriété est utilisée pour estimer la charge microbienne du
lait, mais également pour caractériser les espèces (Guiraud, 1998). Le milieu de
Sherman à 1% est employé. Après ensemencement, les tubes sont portés à 30 et
42°C pendant 24-48 heures. Dans ce milieu, Streptococcus thermophilus ne se
développe pas (Leveau et Bouix, 1980).
II-1-4 Etude des caractères biochimiques
a- Mise en évidence de la catalase
La recherche de la catalase est effectuée par contact de la culture avec une
solution fraîche d’eau oxygénée à 10 volumes. Une » goutte d’eau oxygénée est
placée sur une lame propre et une colonie jeune développée sur gélose M17 y est
répartie à l’aide d’une pipette pasteur. Un dégagement gazeux indique un
résultat positif (catalase positive) (Guiraud, 1998).
b- Culture sur lait tournesolé
Ce test a pour objectif de mettre en évidence la présence de la réductase. Il
se fait sur lait écrémé tournesolé. Un ensemencement à 1% est réalisé à partir de
la culture sur bouillon M17. L’activité en cours de l’incubation à 30°C est notée.
Ce milieu permet d’observer plusieurs types de réactions. Un virage mauve au
rose indique une acidification (A) due à l’attaque du lactose. Une décoloration
de l’indicateur depuis le fond du tube traduit une réduction. La souche peut
ensuite coaguler le lait (C) (Guiraud, 1998).
Les lactocoques réduisent le tournesol avant de coaguler le lait, par contre
Streptococcus thermophilus acidifie et coagule le lait sans réduction antérieure
(Leveau et Bouix, 1980).
c- Etude du métabolisme carboné
- Recherche de la citratase
Cette recherche est réalisée en inoculant les germes à identifier dans un
lait écrémé stérilisé additionné de citrate de sodium stérile et gélosé grâce à un
apport de gélose blanche elle-même stérilisée au préalable. Le métabolisme du
citrate se manifeste par la production de gaz dans la masse du milieu en 3 à 5
jours d’incubation à 30°C pour les mésophiles et 42 °C pour les thermophiles
(Leveau et Bouix, 1980).
- Recherche du type fermentaire
Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat
carboné est catabolisé (Novel, 1993).
Après l’ensemencement du milieu de culture, 4 ml de gélose blanche stérile
est ensemencé en surface. Les tubes sont incubés à 30° et 42°C. Le gaz produit
pousse la gélose vers le haut du tube (Guiraud, 1998).
- Etude de la fermentation des sucres
Elle est recherchée par ensemencement d’un milieu de base pour
fermentation des streptocoques (eau peptonée à 0.5% contenant du pourpre de
bromocrésol) dans lequel on rajoute du sucre à la concentration finale de 0.5%
(Guiraud et Galzy, 1980).
Le développement de la culture et le virage de l’indicateur coloré du à
l’acidification du milieu traduit la fermentation du sucre.
d- Etude de l’interaction bactérienne
Cette recherche de l’interaction est effectuée uniquement pour les souches
lactiques constitutives du levain mixte mésophile. Celle-ci est réalisée après
confirmation de l’identité des souches selon la méthode de Flemming et al.,
(1975). Lactococcus lactis subsp lactis considérée comme inhibitrice est
déposée en touches à la surface du milieu de culture M17 gélosé à l’aide de
l’inoculateur multipoints. Les boites sont mises à l’étuve après séchage pendant
24 heures à 37°C, la culture est ensuite recouverte avec 7 ml de gélose molle à
0.7% d’agar contenant 0.5 ml d’une culture jeune de Lactococcus lactis subsp
cremoris considérée comme indicatrice. Après solidification, les boites sont à
nouveau incubées à 37°C durant 24 heures. La présence d’inhibition sera
traduite par l’existence d’un halo clair autour de la souche ensemencée en
touche.
e- Etude du pouvoir acidifiant
Le pouvoir acidifiant est déterminé par la mesure de l’acidité Dornic
développée (1°D = 0.1 g d’acide lactique).
Le principe consiste à neutraliser l’acidité par une base (NaOH 0.1 N) en
présence de la phénophtaléine à 1% comme indicateur coloré (Accolas et al.,
1977 ; Lucas et Rey Rolle, 1989).
II-2-Analyses physico-chimiques et microbiologiques
Les analyses physico-chimiques ont porté essentiellement sur la mesure
de la variation du pH durant toutes les étapes de la chaîne de fabrication ainsi
que la mesure de l'extrait sec total au cours de la période d'affinage
II-2-1- Le pH
La mesure de pH est réalisée avec un pH-mètre (WTW, pH340,+-0.01) et
une électrode de contact (WTW sentix, pH 2 à 13), étalonnée à l’aide de
solutions tampons à pH 4, 7 et 10.
II-2-2- Le taux de matière sèche
La mesure du taux de M.S est appliquée selon la norme AFNOR NF V
04-282 (AFNOR, 1985). Elle nécessite une balance de précision (OHAUS,
Analytical plus AP 310, 0-310g +-0,0007 g) et une étuve (Memmert, ULP 600,
20-300°C). Le principe de cette mesure repose sur une différence de masse
entre l’échantillon initial et le même échantillon séché pendant 24 à 48 Heures à
102°C +- 2°C. La différence de masse représente la quantité d’eau évaporée. La
masse obtenue après séchage ramenée à la masse initiale, représente le % de
matière sèche (équation 1)
Equation 1=m2-m0/m1-m0 x 100
M0 : poids de la capsule vide
M1 : Poids de l’échantillon dans la capsule
M2 : Poids de l’échantillon après séchage
II-2-3- Recherche et dénombrement des Mucor sp
L’analyse mucorale a été effectuée au cours de la phase d’affinage. A
partir des dilutions décimales retenues (10-1 à 10-3), 1 ml de chaque dilution est
porté dans des boites de pétri contenant la gélose sélective pour les Mucor (voir
composition dans § I-4).
Après ensemencement, les boites sont incubés pendant 05 jours à 20°C
(Lemens, 1996). La lecture et le dénombrement ont lieu à partir du troisième
jour.
Les résultats sont exprimés en UFC/g de produit.
II-2-4- Etude statistique
L’analyse de variance avec le monofactoriel en randomisation totale a été
adopté pour le traitement des résultats du pH au cours de la chaîne de fabrication
du camembert jusqu’à l’étape de ressuyage.
Durant l’affinage, une analyse de variance à trois critères de classification,
soit le trifactoriel en randomisation totale a été appliqué pour le traitement des
donnés des paramètres pH, de l’extrait sec et de la flore mucorale. Les facteurs
étudiés étant, la substitution des ferments MES/THE, l’hygrométrie (85 et 95%
HR) et le temps (durée d’affinage).
Les moyennes de résultats des trois paramètres ont été comparées deux à
deux selon le test de Newman –Keuls (Dagnelie, 1986).
III- Modélisation de l’effet combiné de pH, de l’Aw, de Nacl et de la
température sur la croissance de Mucor racemosus isolé d’une pâte molle
type camembert.
III-1- Isolement de l’espèce mucorale
Parmi les nombreuses espèces de Mucor isolées à partir du camembert
dans l’unité de fromagerie de Sidi Saada, une seule espèce a fait l’objet d’une
modélisation prédictive. Il s’agit de Mucor racemosus, une espèce difficile à
éliminer de l’environnement de fromagerie, et ayant l’habitude de se développer
aisément dans des conditions ou l’hygrométrie est assez élevée 80 à 95%.
III-2-Préparation de l’inoculum
La culture de Mucor racemosus a lieu dans le milieu Sabouraud au
chloramphénicol et incubée pendant 07 jours à 24+- 0,5°C afin d’obtenir le
maximum de spores. Après récupération, les spores sont transférées dans de
l’eau distillée stérile additionnée de 20 gouttes de Tween 80 (Rosso et robinson,
2001). Les concentrations atteintes après dénombrement sont de l’ordre de 1-5 x
106 spores.ml-1.
III-3- Milieu de croissance et conditions d’incubation
Le milieu standard de croissance utilisé dans toute l’expérimentation est le
sabouraud au chloramphénicol. Des concentrations en Nacl (Merck) variant de
l’ordre de 1.5%, 2%, 2.5% et 3% (p/v) sont additionnées au milieu, ce qui
correspond aux valeurs d’activité de l’eau (aw) respectives de 0.987, 0.950,
0.930, et 0.910. Les valeurs d’activité de l’eau (aw) ont été mesurées par un
appareil Aqualab série 3. Les valeurs de pH du milieu ont été ajustées par une
solution HCl 0.1N afin d’atteindre des pH de l’ordre de 4.0, 4.5, 5.0 et 6.0.
01 ml de la suspension de spores est inoculée aseptiquement au centre des
boites de pétri contenant 20 ml de milieu sabouraud gélosé.
Toutes les boites de pétri ont été enveloppées dans des sachets en
plastiques afin d’éviter toute variation de l’aw. La mesure du diamètre des
colonies de l’espèce mucorale de tous les essais expérimentaux est réalisée à
l’aide d’un pied à coulisse dans deux directions orthogonales horizontalement et
verticalement.
Au total quatre vingt expériences (4 NaCl X 4 pH X 5 Températures) ont
été réalisées dans cette étude. Chaque essai est répété 03 fois. La durée
d’incubation est de 15 jours.
III-4- Modèles de développement
La croissance fongique a été établie par la mesure quotidienne de
diamètres (exprimés en millimètre) en fonction du temps (exprimé en
jours)(Gervais et al.,1988). Les taux de croissance en mm.J-1 ont été évalués par
la régression linéaire (Sautour, 2001) en utilisant le Microsoft Excel version
97 : L’évaluation des taux maximums de croissance des colonies (µ max) a été
obtenue par l’application du modèle primaire de Baranyi et al, (1993). Ensuite
les valeurs de µ max ont été appliquées aux modèles secondaires pour décrire les
effets simples et combinés de la température, du pH et de la concentration en
NaCl sur la croissance de Mucor racemosus.
Le premier modèle utilisé est le modèle quadratique de surface de
réponse. La transformation de l’activité de l’eau introduite par Gibson et al.,
(1994) est donnée par l’équation suivante :
bw =1- aw (1)
L’expression du logarithme normal du taux de croissance prend la forme
d’une équation polynomiale suivante :
Ln µmax = a1 +a2T + a3 bw + a4 pH + a5 T2 + a6 bw2 + a7 pH2 (2)
+ a8T.bw + a9T.pH + a10 bw.pH
a1……….a10 sont des coefficients estimés par la régression linéaire.
Un autre modèle d’Arrhenius modifié par Davey constitue la deuxième
approche à examiner est donné par l’équation suivante : (Davey, 1989)
Ln µmax = a1 + a2 pH + a3 pH2 + a4aw + a5aw2 + a6/T + a7/T2 (3)
a1………a7 sont des coefficients à estimer par la régression non linéaire.
Enfin, une analyse de variance à trois critères de classification en
randomisation totale a été appliquée en utilisant le Statbox. Version 6.3 afin
d’estimer l’effet des paramètres aw, pH, et température ainsi que leur interactions
sur le facteur étudié taux de croissance.
Résultats et discussions
IV-1 Isolement et identification des espèces mucorales
Plusieurs espèces de Mucor dont Mucor hiemalis, Mucor mucedo et
Mucor racemosus ont été isolées durant la période d’expérimentation tableau2).
Leur identification a été faite en tenant compte des caractéristiques culturales:
forme, couleur, dimension de la colonie, des sporanges, de la columelle et des
spores (Pitt et Hocking., 1997).
Tableau 2 : Morphologie des principales espèces (selon Pitt et Hocking, 1997 )
ColonieCouleurHauteur (cm)
Mucor racemosusBlanc jaunâtre(souvent 1cm)
Mucor hiemalisBrun-grisâtre1-2 cm
Mucor mucedoBrun-jaunâtre1.5-2 cm
SporangeFormeCouleur
SphériqueBrun jaunâtre
Sphérique- ovaleBrun
globuleuxBrun noirâtre
ColumelleFormecouleur
Ovale sphériqueIncolore
Ovale denticuléebrune
Sphériquebrune
SporesFormeCouleur
ElliptiqueJaune clair
SphériqueJaunâtre
LissesBrun jaunâtre
Figure 16 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et microscopique (à droite)
du Mucor mucedo (GR 40).
Figure 17 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et microscopique (à droite)
du Mucor hiemalis (GR 40).
Figure 18 : Photo d’observation macroscopique (à gauche) et microscopique (à droite)
du Mucor racemosus (GR 40).
IV-2 Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau du
matériel
Les résultats obtenus dans les différents matériels montrent que le niveau
de contamination par le Mucor dans toutes les surfaces est assez élevé. Dans les
surfaces internes, les niveaux de contaminations les plus sévères sont
enregistrées dans la laveuse des bassines de coagulation, la laveuse des plateaux
et la retourneuse du 1er et 2ème retournement après lavage, avec respectivement
un nombre moyen de 1200, 9000, 8000 et 7200 UFC/US (Figure 19 a). Ceci
démontre que le risque de prolifération du mucor dans le produit au cours de son
passage dans la chaîne de fabrication semble être générée par le contact direct de
celui ci avec les surfaces intérieures du matériel contaminé. Cette contamination
serait également due au non respect des règles de nettoyage NEP (nettoyage en
place) soit la concentration, le temps, la température et l'action mécanique. Ceci
se traduit par la présence des traces de produits aux différents points sous cités
(Plusquellec et Leveau, 1991)
Par ailleurs, les surfaces extérieures du matériel sont aussi contaminées
avec une moyenne de 5000 UFC/US environ via l’air ambiant circulant chargé
en spores (Figure 19 b). Selon Cerf et Carpentier, (1992), les micro-organismes
trouvent dans certaines surfaces des conditions favorables à leur croissance, et
peuvent alors se retrouver dans l’air et contaminer d’autres surfaces qui soient
en contact avec les produits alimentaires.
Figure 19 a : Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau des
surfaces intérieures
0100020003000400050006000700080009000
10000
Lave
use
bass
ines
coag
ulat
ion
Ret
ourn
euse
Lave
use
plat
eaux
Table
coag
ulat
ion
Plate
aux
avan
t mou
lage
Plate
aux
aprè
sm
oula
ge
Empile
ur
Table
d'ég
outta
ge
Table
dém
oula
ge
Cha
riot sa
lage
Cha
riot re
ssuya
ge
Points de prélèvement
UF
C/U
S
Figure 19 b : Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau des
surfaces extérieures
IV-3 Evaluation du niveau de contamination par le Mucor au niveau de
l'ambiance, sols, murs, et les rigoles d'égouts
Le niveau de contamination le plus remarquable de l'ambiance par le
Mucor a été enregistré durant les étapes de maturation (1200 UFC), brassage
(2000 UFC), moulage (3200 UFC), les retournements (2500 UFC) et le lavage
des plateaux (1000 UFC)(Figure20a). Ceci peut être expliqué par une mauvaise
circulation de l'air véhiculant les spores ainsi qu'aux nombreux facteurs de
contamination tels que la vapeur des laveuses, le matériel, les sols et les murs.
Selon (Marie et al,2002),la présence de 500 spores par m3 d'air est suffisant pour
contaminer le lait et les fromages Ainsi il serait raisonnable à l'unité d'utiliser
plusieurs extracteurs afin d'évacuer l'air contaminé vers l'extérieur et d'améliorer
la qualité de l'air environnant en adoptant un dispositif d'air stérilisant. L’air
reste le principal vecteur de spores susceptibles d'affecter le fromage (Lemens,
1996). Par ailleurs tous les murs de l'atelier fromager accusent un fort taux de
spores soit 2800 UFC/US en moyenne et ceci plus particulièrement au cours des
étapes, de moulage, d'égouttage, de retournements et de lavage des plateaux
(Figure 20b). Les sols murs et plafonds doivent être les plus lisses possibles et
010002000300040005000600070008000
Tankstoc
kage
lait
Tankmatur
ation
bass
ines
coag
ulatio
n
Tranc
he-c
aillé
Mou
leus
e
Lave
useba
ssines
Retou
rneu
se
Lave
useplateau
x
Points de prélèvement
UFC
/US
non poreux ainsi les revêtements doivent être compatibles tant avec les matières
premières qu'avec les produits de nettoyage et de désinfection (Plusquellec et
Leveau, 1991 ; Amgar, 1992)
Dans les hâloirs une légère contamination a été enregistrée soit 600
UFC/US en moyenne. Ces résultats sont dus à une mauvaise opération de
nettoyage des murs qui s'effectue par simple jet d'eau sans détergents ni
désinfectants. Ceci est valable pour les surfaces des sols des salles de maturation
de soutirage et de moulage ou le niveau de pollution est le plus élevé soit 1200,
10000 et 7900 UFC/US en moyenne respectivement.
Concernant les rigoles d'égouts, le niveau de contamination devient
important durant les opérations de moulage 5400 UFC/US, de retournement
9800 UFC/US, de démoulage 12000 UFC/US et de lavage des plateaux 7700
UFC/US en moyenne.
Figure20a : Evaluation du niveau de contamination de l’ambiance de fromagerie par le
Mucor
0200400600800
100012001400160018002000
Mat
uratio
n
coag
ulatio
n
Tranc
hage
Brass
age
Soutir
age
Mou
lage
Ret
ourn
emen
ts
Egout
tage
Dém
oulage
Lava
gede
spl
atea
ux
Salag
e
Res
suya
ge
Affina
ge
Points de prélèvement
UF
C
Figure 20b : Evaluation du niveau de contamination atteint dans les sols, les murs et les
rigoles d’égouts
IV-4 Evaluation du niveau de contamination des mains du personnel par le
Mucor
Il a été remarqué un niveau de contamination appréciable dans les mains
du personnel exerçant les activités de coagulation, de salage, de ressuyage et
d’affinage soit une moyenne de 7500UFC/US (Figure 21). Cette présence assez
importante des spores de Mucor provient éventuellement par le contact direct
avec le matériel et l'ambiance de l'atelier de fromagerie, de plus la perte des
produits sur le sol favorise la prolifération des microorganismes. Le personnel
est responsable de la dissémination d'un nombre non négligeable de particules,
certaines étant chargées de divers microorganismes (Jouve, 1991).Les vêtements
peuvent être à l'origine d'une contamination, il arrive qu'ils soient en contact des
produits en cours de fabrication. Souillés de matières organiques, ils constituent
alors d'excellent supports pour le développement de microorganismes (Accolas
et al, 1991). C'est ainsi que le personnel doit être non seulement sensibilisé pour
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Matu
ratio
n
coagulatio
n
Tranch
age
Brassa
ge
Sou tirage
Moula
ge
Retourn
ements
Egouttage
Démou lage
Lavagedes
plate
auxSala
ge
Ressuyage
Affinage
Points de prélèvement
UF
C/U
S
Sols Rigoles d'égouts Murs
respecter les bonnes pratiques d'hygiène mais aussi mettre à leur disposition des
bassines de désinfection à base d'eau javellisée à forte concentration et des
lavabos dans chaque étape de la chaîne ou le produit est manipulé
manuellement.
Figure 21 : Evaluation du niveau de contamination atteint chez le personnel
IV-5 Evaluation du niveau de contamination au cours de la fabrication
A la réception, le lait cru est relativement chargé en spores de Mucor soit
1200 UFC/ml en moyenne. Ceci est en étroite relation avec les mauvaises
conditions d'élevage, de traite, de stockage et de transport adoptés par les
éleveurs. La présence de 1000 spores de Mucor par litre de lait est suffisante
pour qu'apparaisse l'accident "poils de chat" sur les fromages particulièrement au
démoulage et plus la contamination est précoce plus l'accident est rapide et
intense (Marie et al, 2002). La pasteurisation détruit totalement les spores
mucorales mais au cours de la maturation un nombre appréciable de spores a été
décelé dans le lait à cause vraisemblablement des mauvaises conditions
hygiéniques régnant à l'intérieur de l'atelier de fromagerie plus particulièrement
l'air ambiant, le sol, les murs et les rigoles d'égouts. Après coagulation, le niveau
0
2000
4000
6000
8000
10000
Rec
eptio
nlait
prép
aratio
nleva
in
Coa
gulatio
n
Brass
age
Soutirag
e
Mou
lage
Retiour
nemen
ts
Dém
oulage
Salag
e
Res
suya
ge
Affina
ge
Points de prélèvement
UF
C/U
S
de contamination atteint dans le caillé obtenu est relativement réduit soit une
baisse de l'ordre de 85% (Figure 22).
Cependant, la plus forte contamination du fromage a lieu durant
l’égouttage, le premier et le second retournement soit respectivement 3200,4500
et 4800 UFC/ml. Il semble que le pH atteint dans le caillé n'élimine pas
totalement les espèces mucorales qui paraissent adaptées aux conditions de
fabrication du camembert particulièrement en fin d'égouttage ou le pH atteint
des valeurs comprises entre 4.6 et 4.9 ( Hardy et al,1982).
Le salage permettant de compléter l'égouttage diminue l'activité de l'eau
(l'Aw) et crée à la surface des fromages un milieu sélectif permettant ainsi de
réduire considérablement le niveau de contamination par le mucor. Il en est ainsi
pour le ressuyage pratiqué à une humidité relative de 85% et à une température
de 14°C – 15°C empêchant ainsi la multiplication des mucors dans le fromage (
Jouve, 1996; Desmazeaud, 1997).
Durant l'affinage, une baisse notable du seuil de contamination a été
enregistrée, celle ci est vraisemblablement liée à la baisse de la température dans
les hâloirs (12-13 °C) qui ralentit considérablement la croissance du Mucor
(Hardy et al., 1982) , ainsi qu'à la compétition par la flore microbienne qui
s'installe notamment le Geotrichum candidum et le Penicillium camemberti au-
delà du 6ème jour (Lenoir et al., 1983 ) ceci aboutit à l'élimination totale du
mucor. Cependant cette élimination totale n’est pas le résultat d’une maîtrise
d’un point critique au cours de cette ultime étape de fabrication, mais plutôt à la
performance des souches microbiennes d’affinage constituées principalement de
levures et de moisissures.
Figure 22 : Evolution du Mucor au cours de la chaîne de fabrication du camembert
IV-6 Etablissement du plan HACCP
Le plan HACCP est un document formel qui rassemble les
informations clé de l’étude et recense le détail de tout ce qui pourrait être
critique du point de vue de la gestion de sécurité alimentaire. Ce plan établi est
constitué de deux documents essentiels :
- Le procédé de fabrication du fromage camembert au niveau de
l’unité industrielle de Sidi Saada.
- Le tableau de maîtrise HACCP rassemblé dans une matrice
(Tableau2).
L’utilisation de l’arbre de décision pour chaque danger et à toutes les
étapes du processus nous a permis d’identifier et de déterminer les
points critiques (CCP) à maîtriser.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Reception
dula
it
Pasteuris
ation
Matu
ratio
n
Coagulatio
n
Tranch
age
Brassa
ge
Sou tirage
Moula
ge
Egouttage
1er reto
urnem
en t
2èmre
tourn
ement
Démou lage
Salage
Ressuyage
Affinage
J3
Affinage
J6
Affinage
J9
AffinageJ12
Points de prélèvement
UF
C/m
l
Etapes duprocédé
Dangers Mesurespréventives
CCPoui/non
Limites critiques Surveillances Actionscorrectives
Vérification Responsabilité
Procédures Fréquences
Réception dulait cru
Présence de spores de mucor Bonnespratiquesd'élevage et detraite
Oui Minimiser lenombre de spores demucor dans le lait
Analysemucorale
A chaqueréception
Hygiène au coursd'élevage et de latraite
Analysesmucoralespour chaqueéleveur
Eleveur
Pasteurisation Présence de spores sur lasurface extérieure des tanksde stockage
Eviterl'ouverture destanks
Non - - - - - -
Maturation dulait
Présence de spores de mucordans le lait
Opération souscontrôled'hygièneNettoyage etdésinfectioninstruments dematuration
Oui -Lavage etdésinfection avantusage-Respect du moded'ensemencement
Surveillance desopérations denettoyage
A chaquepréparation
L'ensemencementest effectué parle responsabled'A.QRénovation del'air ambiant de lasalle
Vérification del'efficacité dunettoyage etdésinfectionpar analysemucorale surl'ambiance dela salle
Préparateur dulevainResponsabled'assurancequalité
Coagulation Présence demucor(personnel,;l'ambiance,murs ,sol)
Rénovation del'air ambiantdésinfectiondes mains
Oui Températuremaintenue entre 26-28°CRespect du temps deprise
Surveillancefréquente desopérations denettoyage desmains, del'ambiance etdes murs,
A chaquepréparation
Rénovation del'air ambiant etles solutions dedésinfection desmains
Analysemucorale del'ambiance etdes mains
Responsableassurancequalité
Tranchage Présence de mucor(ambiance, tranche caillé etsol)
Nettoyageefficace etdésinfection dutranche caillé
Oui Absence de résidusdu caillé dans letranche caillé
Contrôle visuelsur le tranchecaillé et test parécouvillonnage
À chaquenettoyageavantdémarrage
Nettoyage etdésinfection
Vérification del'efficacité denettoyage destrancheurs
OpérateurproductionTechnicien dequalité
Brassage Présence de mucor(personnel et ambiance)
Mettre à ladisposition dupersonnel dessolutions dedésinfection .Rénovation del'air ambiant
Oui Aucune spore dansles mains dupersonnel
Contrôlemicrobiologiquedes mains et del'ambiance
Avantdémarrageet au coursde lafabrication
Rénovation dessolutions dedésinfection desmainsInstallation d'undispositif d'airstérile
Vérification del'efficacité dedésinfectionparécouvillonnageet testmucorale pour
Responsableassurancequalitéet opérateurde production
Tableau 3 : Détermination des points critiques relatifs au Mucor et mise en place d’un plan HACCP au cours de lafabrication d’un fromage à pâte molle type camembert
l'ambianceMoulage Présence de mucor
(mouleuse, ambiance,plateaux, chariot, le cailléaprès moulage,le sol,etrigoles d'égouts
Nettoyage etdésinfection Oui
Absence de sporesde mucor dans lematériel
Contrôlemicrobiologiqueparécouvillonnage
Avant ledémarrageet au coursde lafabrication
Renforcer lenettoyage et ladésinfection dumatériel
Vérificationdes restes derésidu dans lematériel etanalysesmucorales
Responsableassurancequalité
Egouttage Présence de mucor Nettoyage etcontrôle del'ambianceVérifier latempérature dela salled'égouttage
Oui26-28°C baisse1°C/heure à 19-20°C la nuit
Contrôle de latempérature
Quotidienne Nettoyage etdésinfection de lasale d'égouttage
Vérification dela températureet la duréed'égouttage
Opérateur deproductionTechnicien dequalité
Retournements Présence de mucor Nettoyage etdésinfection dumatériel
Oui Gestion del'environnement etrespect de la duréede retournements
Contrôle visuelEnregistrementdes temps deretournements
Avant etdurant lafabrication
Contrôlemicrobiologiquede l'ambiance
Vérificationsquotidiennesde la durée desretournements
Technicien dequalité
Démoulage Présence de mucor Procédured’hygiène dupersonnel etformation àcelle -ci
Oui Mains propres etdésinfectées
Surveillance del’hygiènecorporelle ainsique l’efficacitédu nettoyage dumatériel par lalaveuseplateaux
Quotidienne - Eviter de laisserles fromagesdémoulés à latempératureambiante pendantune duréeprolongée- Rénovation dela démouleuse
- Vérificationde l’efficacitédu nettoyage- Vérificationde l’hygiènecorporellesurtout le portdes gantsjetables qui estobligatoire
- ResponsableA.Q- Maintenance- Responsabled’atelier- Responsablede production
Tableau 3 (suite): Détermination des points critiques relatifs au Mucor et mise en place d’un plan HACCP au cours dela fabrication d’un fromage à pâte molle type camembert
ResponsableassurancequalitéOpérateur deproduction
Vérification delaconcentrationen sel(1.7à1.8%Nacl/100g defromage
Fermeture de lasalle de salageCouvrir lasaumure aprèschaqueopération avecun couverclespéciale
Pour chaquelot
Le trempagedes piles dansle bain àsaumuress'effectue avecagitationcontinue
Respect de laconcentration du selet la durée de salage
OuiTraitement etrenouvellement dela saumure
Vecteur decontamination et dedissémination de spores
Salage
Opérateur deproductionTechniciende qualité
Vérificationdesenregistrements et ladésinfection dela salle
Fermeture de lasalle deressuyage
QuotidienneEnregistrements des lots,de latempérature etde l'humidité
12 à 15°C et85%humiditérelative
OuiMaîtrise de latempérature et del'humidité relativede la salle
Présence de mucor(ambiance)
Ressuyage
ResponsableassurancequalitéOpérateur deproductionTechniciende qualitéMaintenance
VérificationdesenregistrementsEvaluationmucorale desfromagesjeunes
Isolement du lotinfecté en casd'anomaliePort de la tenueobligatoireRénovation dumatériel decontrôle nonfonctionnel
QuotidienneContrôleambiance etpersonnelEnregistrementtempérature ethumiditérelative dechaque lot etde chaquehâloir
12 à 13°C et90%humiditérelative
ouiRespect des bonnespratiques de lafabricationMaîtrise de latempérature etl'humidité relativede chaque hâloir
Présence de mucor(murs, ambiance)
Affinage
Tableau 3 (suite): Détermination des points critiques relatifs au Mucor et mise en place d’un plan HACCP au cours de lafabrication d’un fromage à pâte molle type camembert
V-1 Caractérisation des levains industriels
Après culture sur milieu M17, les examens macroscopiques et microscopiques
des colonies isolées et purifiées ont révélé un aspect rond, lenticulaire,
blanchâtre à opaque et à Gram (+). Le dénombrement a donné en moyenne 7.109
germes/ml pour les mésophiles et 4.1010 germes /ml pour les thermophiles.
Selon Christophe, (1994), la concentration bactérienne des levains lactiques
concentrés lyophilisés varie de 109 à 1011 germes/ml.
Les tests physiologiques et biochimiques ayant servi à l’identification des
souches constituant les levains mésophiles et thermophiles sont regroupés dans
le tableau 4.
Le test d’interaction entre les souches du levain mixte mésophile
Lactococcus lactis subsp lactis et Lactococcus lactis subsp cremoris a révélé
une absence d’inhibition, ceci justifie donc leur association en culture mixte.
Les levains industriels utilisés actuellement en industries de
transformation du lait sont sous forme de cultures concentrées lyophilisées
généralement très actives qui n’exigent pas de cultures intermédiaires, ce qui
permet de les inoculer directement dans la cuve de fabrication (ensemencement
direct).
Tableau 4 : Résultats des tests d’identification des levains industriels
Type de levainMésophile Thermophile
Caractère
Gram + + +Catalase - - -Croissance à :45°C30°C10°C
-++
-++
++-
Croissance à :6.5% Na Cl4% Na Cl
-+
--
-+
Croissance à pH 9.6 - - -Type fermentaire Homo Homo HomoCroissance sur lait au bleude méthylène (1%) + + -Hydrolyse de l’arginine
+ - -Citratase - - -Lait tournesolé ARC ARC ACFermentation des sucres
- Glucose- Galactose- Lactose- Maltose- Mannose- Arabinose- Raffinose- Xylose- Tréhalose- Ribose- Cellobiose- Amidon- Dextrine
+++++--++++-+
+++-+--+--+++
+++-+-+---++-
Espèces Lactococcuslactis subsplactis
Lactococcus lactissubsp cremoris
Streptococcussalivarus subspthermophilus
V-2 Evolution du pouvoir acidifiant des levains industriels
L’acidité du lait comprise entre 18 et 20 °D reste inchangée après 01
heure d’incubation pour les deux types de levain. Ceci correspond à la phase de
latence nécessaire à leur adaptation aux conditions de culture. Au-delà de cette
phase, les niveaux d’acidité augmentent avec des différences assez nettes entre
les espèces mésophiles et thermophiles. Après 02 heures d’incubation, les
niveaux d’acidité atteints sont de l’ordre de 30°D pour Streptococcus
thermophilus et 24°D pour Lactococcus lactis. Ces valeurs sont assez
comparables aux niveaux d’acidité atteints dans le lait lors de la phase de
maturation. Après 24 heures, les teneurs en acidité atteignent des niveaux de
l’ordre de 82 et 98°D pour respectivement Lactococcus lactis et Streptococcus
thermophilus (Figure 23). Selon De Roissart, (1986), l’aptitude acidifiante est
une caractéristique propre à chaque souche bactérienne car elle est liée aux
aptitudes particulières qu’elle possède à dégrader les composés du milieu pour
les rendre assimilables et à transporter les éléments nutritifs dans le cytoplasme.
Ces valeurs d’acidité correspondent aux valeurs limites de pH compris entre 4 et
5 (niveaux atteints au démoulage), d’où une incidence négative sur la croissance
des bactéries lactiques. Au dessous de pH 4.5, l’activité et la stabilité de
nombreuses enzymes est fortement réduite (Choisy et al., 1987). Les
lactocoques ont pH optimal d’action de 6.5 et un pH minimal de 4.5 (De
Roissart, 1986). Des pH plus inférieurs provoquent des dommages cellulaires
(Novel, 1993).
Figure 23 : Evolution de l’acidité Dornic en fonction du temps pour les
souches mésophile et thermophile
V-3 Comparaison des paramètres de coagulation et de salage
Au cours des essais expérimentaux de fabrication du camembert, certains
paramètres ont été mesurés particulièrement au cours des étapes de coagulation
et de salage. Selon les résultats mentionnés dans le tableau 5, on en déduit que
les temps de prise et de coagulation sont écourtés chez le lot II réalisé à partir de
souches thermophiles. L’autre constatation est le degré d’acidité atteint dans les
caillés après le démoulage largement supérieur dans le lot II par rapport au lot I.
Cela confirme les données selon les quelles les bactéries lactiques thermophiles
sont beaucoup plus acidifiantes (Ramet, 1997a). Enfin la durée de salage dépend
de l’acidité atteinte au démoulage, en effet lorsque l’acidité diminue, la durée de
salage augmente et inversement.
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 24
Temps (heures)
Acid
ité
(°D
)
L,lactis S,thermophilus
Tableau 5 : Les principaux paramètres de coagulation et de salage
Lots
Paramètres
I
MES
II
THE
Temps de prise (en min) 12 9
Temps de coagulation (en min) 36 27
L'acidité (en°D) 92 125
Durée de salage (en min) 27 20
V-4 Evolution de la flore mucorale
L'évolution de la flore mucorale au cours de l'affinage est caractérisée par
une baisse progressive mais assez importante depuis le 3 èm jour jusqu'au 12
èm jour pour le lot I ensemencé par des mésophiles affinés à 12°C/85% HR avec
cependant une absence totale dans le lot II ensemencé exclusivement par des
souches thermophiles à partir du J6 d’affinage (p<0.01). Par contre, chez les
lots affinés à 12°C/95% HR une légère baisse a été enregistrée allant de J3
jusqu’au J9 d’affinage, suivie d’une remontée des valeurs des échantillons des
deux lots. Selon Le Bars-Baily et al., (1999), le Mucor apparaît au bout de 2 à 3
jours d’affinage, c'est-à-dire 4 à 5 jours après l’emprésurage et que son
développement gène considérablement la flore normale d’affinage constituée
principalement de Penicillium à cause de la vitesse de germination de ces
spores.
Par ailleurs, il faut noter également que les valeurs moyennes atteintes
dans les fromages affinés à 12°/ 95% HR sont beaucoup plus importantes
(p<0.01) par rapport à celles obtenues à 12°C 85% HR soit une différence de
l’ordre de 45% en moyenne (Figure 24a, 24b). Ces résultats rejoignent en partie
ceux obtenus par Bergere et Lenoir, (1997) qui notèrent qu’une hygrométrie
trop importante, supérieure à 85% dans les salles de ressuyage et au-delà de 91%
dans les locaux d’affinage constituent les conditions favorables à l’apparition de
cette altération.
Figure 24a : Evolution de la flore mucorale au cours de l’affinage
à 12°C/85%HR
Figure 24b : Evolution de la flore mucorale au cours de l’affinage
à 12°C/95%HR
V-5 Evolution du pH et effet sur la flore de Mucor
Concernant le paramètre pH, les valeurs notées suivent une allure
décroissante chez les deux lots expérimentaux du fait de la production de l’acide
lactique par les ferments ensemencés avec cependant des valeurs de pH
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
3 6 9 12
Durée d'affinage (jours)
UF
C/g
Lot I MES Lot II THE
01000200030004000500060007000
3 6 9 12
Durée d'affinage (jours)
UF
C/g
Lot I MES Lot II THE
beaucoup plus basses chez le lot II ensemencé avec des souches thermophiles
(figure 25a). Ces résultats peuvent expliquer vraisemblablement en partie
l’évolution des Mucor durant la phase d’affinage. Or, les ferments thermophiles
ont une propriété reconnue liée à leur métabolisme qui est très actif
comparativement aux ferments mésophiles se traduisant par une consommation
importante du lactose avec pour conséquence une acidification accélérée et
intense (voir résultats des paramètres de coagulation dans tableau 4). Les levains
thermophiles seraient moins sensibles aux valeurs basses de pH que les
mésophiles (Turner et al, 1983). Une baisse rapide du pH influe alors
négativement sur le développement et la germination des spores mucorales.
Selon Béliard et al., (1991) L’effet inhibiteur spécifique des acides
organiques est attribuée à leur forme non dissociée qui pénètre librement dans la
cellule où elle s’ionise, provoquant un abaissement de pH interne et le blocage
de certains mécanismes de transport. Par ailleurs, Baired-Parker, (1980) rapporte
les concentrations d’acide lactique non dissocié nécessaire pour provoquer une
inhibition de l’ordre de 1 mM pour les levures et les Entérobactériaceae contre
2 mM pour les moisissures. Il en est ainsi à la fin de la coagulation où le pH
enregistré montre une nette différence significative (p<0.01) entre les deux lots,
le plus bas 5.75 est le lot II obtenu par les ferments thermophiles soit une
différence de l’ordre de 0.50 unités pH par rapport au lot I ensemencé par des
ferments mésophiles. Selon Le Bars- Bailly et al., (1999), il existe une
corrélation positive entre la fréquence de la contamination par le Mucor sp et le
pH au démoulage s’il est supérieur à 4.8. Cette variabilité entre les deux lots se
poursuit durant toutes les étapes de fabrication, et qui atteint 0.40 unités pH au
premier jour d’affinage. Après 3 jours d’affinage, le pH diminue légèrement
chez les deux lots expérimentaux. Par ailleurs, l’augmentation de pH est très
rapide entre j6 et j9 ou les fromages passent d’un pH acide (pH=5) à un pH
proche de la neutralité (pH compris 6.68 et 6.78). La pente d’évolution la plus
rapide appartient au lot II, estimée à environ 1.47 et la plus lente est de 1.23
représentée par le lot I. Cette remontée du pH est la conséquence de
l'implantation des levures et de Géotrichum candidum (Lenoir et al., 1992 ;
Amrane et al., 1999).
Ces microorganismes très abondant au début d'affinage consomment
l'acide lactique et le pH du caillé s'élève progressivement (Desmazeau,1997 ;
Berger et al.,1999). Au-delà du 5èm jour d'affinage, un fin tapis de Pénicillium
camemberti apparaît et le pH de surface du fromage augmente rapidement car en
plus de la consommation du lactate, il y'a production d'ammoniac par
désamination de certains acides aminés (Greenberg et Ledford; Desmazeau et
Cogan, 1996 ; Molimard et spinler, 1996).
Après 12 jours d'affinage, le pH moyen de l’ensemble des lots atteint une
valeur de l'ordre de 7.02 (Figure 25b, 25c). Or ces valeurs seraient assez
éloignées du pH optimum de croissance du Mucor telle que cela été démontré
dans une étude sur des fromages expérimentaux ou le Pénicillium camemberti
pouvait s'adapter à une large gamme de pH comprise entre 3.5 et 9,
contrairement à une souche de Mucor de contamination qui ne se développait
bien que dans une gamme de pH beaucoup plus étroite aux environs de 4.9
(Hardy et al,1982 cité par Desmazeau,1997).Notons enfin qu’aucune différence
significative de valeurs de pH n’a été décelée entre les lots affinés à 12°C/85%
et ceux à 12°C/95% durant toute la période d’affinage.
Figure 25 a : Evolution du pH durant le process de fabrication jusqu’à l’étape de
ressuyage
Figure 25 b : Evolution du pH durant l’affinage à 12°C/85%HR
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
Laitcru
Coa
gulatio
n
Tran
chag
e
Mou
lage
Egou
ttage
1er r
etou
rnem
ent
Egou
ttage
2èm
retour
nemen
t
Dém
oulage
Salage
Res
suya
ge
Etapes de fabrication
pH
Lot I MES Lot II THE
44,5
55,5
66,5
77,5
3 6 9 12Durée d'affinage (jours)
pH
Lot I MES Lot II THE
Figure 25 c : Evolution du pH durant l’affinage à 12°C/95%HR
V-6 Evolution de l’extrait sec et effet sur la flore de Mucor
L’évolution des valeurs moyennes des taux d’extraits secs est caractérisée
globalement par une augmentation chez les deux lots expérimentaux quelque
soit les conditions hygrométriques testées depuis le début jusqu’à la fin de la
période d’affinage. Néanmoins, les valeurs enregistrées montrent des différences
significatives entre les lots. Les taux d’extrait secs seraient beaucoup plus
augmentés (p<0.01) chez le lot I ensemencé avec les thermophiles que le lot II
ensemencé avec les mésophiles. Par ailleurs, l’effet de l’humidité relative de
l’ambiance d’affinage devient perceptible à partir de J3 d’affinage
significativement (p<0.01) entre les échantillons affinés 12°C/85% et ceux à
12°C/95% soit une différence moyenne de l’ordre de 6.52%.
De ce fait, la disponibilité de l'eau nécessaire pour la croissance du Mucor
apparaît alors comme un facteur déterminant justifiant son installation et son
évolution. Selon les résultats mentionnés sur les figures (26a et 26b), les
mesures effectuées du taux initial d’extrait sec varient significativement selon
les lots (p<0.01). Il est de 50.3% pour le lot II (thermophiles) contre 42.3%
pour le lot I (mésophiles). Or, les lots ayants les taux de M.S les plus élevées
44,5
55,5
66,5
77,5
3 6 9 12Durée d'affinage (jours)
pH
Lot I MES Lot II THE
sont ceux qui ont les pertes de masse les plus importantes et inversement, ce qui
est d’ailleurs une conséquence logique, car la masse perdue correspond
essentiellement à une perte d’eau importante par exsudation lors de l'égouttage
du caillé d'ou une baisse de l'aw disponible pour le Mucor. De plus l’humidité
relative de la chambre d’affinage de 85% est très basse et donc l’échange entre
celle ci et la surface des fromages expérimentaux est faible et ce contrairement
aux lots affinés à 95% d’HR. Les résultats de l’évolution du taux de M.S sont
en accord avec ceux obtenu par Agioux, (2003) ou des fromages expérimentaux
affinés dans une enceinte à 96% d’HR présentent des taux de M.S très faible et
donc moins d’eau perdue par rapport a ceux affinés dans une atmosphère de
92%d’HR. Selon Mescle et Zuca,(1996),une baisse d'aw entraîne une baisse de
la pression osmotique voire un choc osmotique entraînant des stress divers pour
les microorganismes. Le taux de M.S augmente environ de 4% durant les trois
premiers jours et continu d’augmenter jusqu’à j12 d’affinage pour atteindre des
valeurs de 59.29% et 62.22% pour les lots I et II respectivement. Cette
augmentation du taux de M.S correspond à une évaporation de l’eau à la surface
des fromages. Dans une autre étude, il a été montré que la souche de Mucor de
contamination mise à l'essai était très rapidement inhibée par un abaissement de
l'activité de l'eau, en dessous d'aw 0.92 aucun développement n'était constaté,
même après 14 jours d'incubation. Par contre la souche de Penicillium pouvait
encore se développer avec une vitesse ralentie jusque vers 0.85.
A tous ces facteurs cités, la température d'affinage pratiquée de 12°C est
aussi un paramètre contribuant à ralentir le développement du Mucor dont
l'optimum de croissance se situe aux alentours de 24°C (Martley &Crow,1993)
Figure 26 a: Evolution de l’extrait sec au cours de l’affinage
à 12°C/85%HR
Figure 26 b: Evolution de l’extrait sec au cours de l’affinage
à 12°C/95%HR
V-7 Analyse statistique
L’analyse de variance du paramètre pH montre un effet dominant et
hautement significatif (p<0.01) du facteur substitution des ferments MES/THE
particulièrement durant les étapes coagulation, moulage et égouttage.
0
20
40
60
80
3 6 9 12Durée d'affinage (jours)
ES
ec
%
Lot I MES Lot II THE
0
20
40
60
80
3 6 9 12Durée d'affinage (jours)
ES
ec
%
Lot I MES Lot II THE
Concernant les paramètres extrait sec et flore mucorale l’analyse de
variance a montré un effet hautement significatif (p<0.01) des facteurs étudiés à
savoir substitution de des ferments MES/THE, de l’hygrométrie et du temps
(Tableau 6a, 6b, 6c).
Une corrélation significative (p<0.05) a été obtenue entre l’évolution de la
flore mucorale et le taux d’extrait sec pour les échantillons affinés à 12°C/85%
HR. En revanche, la relation entre l’évolution de la flore et le pH n’a pas été
établi et ce quelque soit les conditions d’affinage (Tableau 7).
Tableau 6 a : Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur
Substitution ferments MES/THE
Lots
Paramètres
Lot IMES
Lot IITHE
Analyse de variance
Effet facteur
Extrait sec 48,31±0.93a
51.81±0.64b
**
Flore mucorale 4325±144.46a
475±65.93b
**
pH lait cru 6.39±0.01a
6.38±0.01a
NS
pH coagulation 6.25±0.02a
5.75±0.01b
**
pH égouttage 2èretournement
5.70±0.01a
5.00±0.01b
**
pH salage 4.82±0.02a
4.59±0.01b
**
pH affinage 5.98±0.01a
5.88±0.01b
*
NS : Non significatif
* : significatif au seuil de 5% (p≤0.05)
** : significatif au seuil de 1% (p≤0.01)
a et b : Groupes homogènes selon le test de Newman-Keuls au seuil du risque
p≤0.05
Tableau 6 b: Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur
Hygrométrie
NS : Non significatif
** : significatif au seuil de 1% (p<0.01)
a et b :Groupes homogènes selon le test de Newman-Keuls au seuil du risque
p≤0.05
Tableau 6 c: Analyse de variance avec comparaison des moyennes du facteur temps
(durée d’affinage)
Temps(jours)
Paramètres
3 6 9 12 Analysede
varianceEffet
facteurpH 4.66±0.014
a5.40±0.011b
6.74±0.009c
7.03±0.009d
**
Extrait sec 43.47±0.81a
47.41±0.56b
52.87±0.34c
56.73±0.71d
**
Floremucorale
3662±135.33a
3154±130.77b
2800±138.31c
2841±19.01c
**
NS : Non significatif
* : significatif au seuil de 5% (p<0.05)
** : significatif au seuil de 1% (p<0.01)
HR(%)
paramètres
85 95 Analyse devariance
Effet facteurpH 5.96±0.012
a5.966±0.01a
N.S
Extrait sec 53.38±0.833a
46+.86±0.69b
**
Flore mucorale 2225±109.15a
4004±143.41b
**
a,b,c et d : Groupes homogènes selon le test de Newman-Keuls au seuil du
risque p<0.05
Tableau 7: corrélation entre paramètres flore mucorale et extrait sec
12°C/85% HR 12°C/95% HR
r - 0.634 * -0.093 ns
* : Significatif au seuil de 5%
ns : Non significatif
VI-1 Estimation du taux de croissance en fonction des différents paramètres
physico-chimiques
Les courbes de croissance basées sur les diamètres des colonies sont
typiques à une croissance fongique linéaire après une courte période de
germination qui varie de 6 à 7 jours.
L’estimation de la croissance maximum des colonies selon les différentes
combinaisons de pH, de température et de concentration en NaCl est
représentée dans le tableau 8 ; Figure27. Il ressort à travers les résultats, les
constatations suivantes :
- Lorsque la concentration en NaCl augmente graduellement de 1.5%
jusqu’à 3%, le taux de croissance diminue.
- Concernant le pH, les valeurs expérimentales choisies sont rangées dans
la gamme optimale – super optimale, c’est la raison pour la quelle aucun effet
sur la croissance maximale des colonies (µmax) n’est apparu évidente.
Néanmoins à la concentration minimale de 1.5% NaCl, le taux de croissance
maximum des colonies varie très peu avec un léger pic aux valeurs de pH égales
4.5 et 5.
- En revanche l’effet des températures expérimentales a été clairement
démontré. Les taux de croissances maximales ont été atteints aux alentours de
20-25°C.
Figure 27 : Evaluation de diamètre des colonies de Mucor racemosusà pH =5, concentration en NaCl de 2 % et à T° 15°C.
Tableau 8 : Evaluation du taux de croissance en fonction de la T°, pH, NaCl et aw
Température
°C
pH NaCl % aw bw µmax
10101010151515152020202025252525303030301010101015151515202020202525252530303030101010101515
4.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.5
1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.52.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.52.52.52.52.52.5
0.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9870.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9500.9350.9350.9350.9350.9350.935
0.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.1140.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2230.2540.2540.2540.2540.2540.254
2.6402.1102.2801.4315.2316.3406.4526.2218.75110.62210.5409.28110.46911.05214.11812.1098.1197.2207.4556.3562.5422.2102.0421.3444.7835.6305.7844.7967.9809.87510.4386.8759.87210.32411.5306.4808.6889.1249.2305.7562.3202.4102.4651.1154.1564.142
15152020202025252525303030301010101015151515202020202525252530303030
5.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.04.04.55.06.0
2.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.53.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0
0.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9350.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.9100.910
0.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.2540.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.3000.300
4.2103.8546.6528.2438.5406.1127.8789.54510.0108.5326.7317.0127.1546.5201.9801.9852.0451.0083.2853.3103.6572.8551.7181.9081.9191.0491.7951.9671.9781.7741.3541.4431.4291.149
VI-2 Le modèle polynomial
Le comportement de l’espèce mucorale en fonction des paramètres
environnementaux étudiés a été quantifié par l’application de différents modèles.
Le premier consiste à modéliser le logarithme népérien de la croissance
maximale des colonies (ln µmax) en fonction du pH, de la température et de
l’activité de l’eau exprimée par bw, par l’application du modèle quadratique de
surface de réponse (modèle polynomial de l’équation N°2).
Les réponses exprimées par les surfaces des figures 28a, 28b, 28c et 2 8d
donnant les taux de croissance maximum obtenus selon la gamme des conditions
expérimentales sont représentés par différentes courbes ayant une forme de
parabole avec des positions relativement parallèles, ce qui implique que les
facteurs expérimentaux (pH, aw et température) agissent indépendamment et
posent des effets additifs.
Il a été également observé que les taux de croissance sont meilleurs dans
la région optimale de température (20-25°C), de concentration en NaCl de 1.5%
et de pH (4.5-5). En revanche, dans les régions qui s’éloignent des conditions
optimales, température (10-15°C), un taux de NaCl de 2.5 à 3% et de pH =6, les
taux de croissance sont à leurs plus bas niveaux.
Figure28a : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw surlogarithme népérien de croissance maximum µ max de Mucor racemosus)
(Taux Nacl : 1.5%)
Figure28b : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw surlogarithme népérien de croissance maximum µ max de Mucor racemosus)
(Taux NaCl : 2%)
Figure28c : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw surlogarithme népérien de croissance maximum µ max de Mucor racemosus
(Taux Nacl : 2.5%)
Figure28d : Model quadratique de surface de réponse (effet de la T°, pH et aw surlogarithme népérien de croissance maximum µ max de Mucor racemosus
(Taux Nacl : 3%)
VI-3 Le modèle de Davey
Le second modèle est une modification de la version du modèle
d’Arrhenius (Equation 3 ; figure 29a, 29b) tel qu’il a été proposé par Davey
(1989).
Figure 29a : Courbes adaptées du modèle de Davey exprimant le logarithme népérien
de la croissance maximale (µ max) en fonction de l’inverse de la température (°K)
1,5 % NaCl
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
32 33 34 35 36
pH = 4
pH = 4,5
pH = 5
pH = 6
Ln µ max
1/T.10-3 (°K)
2% NaCl
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
32 33 34 35 36
pH = 4
pH = 4,5
pH = 5
pH = 6
Ln µ max
1/T.10-3 (°K)
Figure 29b : Courbes adaptées du modèle de Davey exprimant le logarithme népérien
de la croissance maximale (µ max) en fonction de l’inverse de la température (°K)
2,5 % NaCl
0
0,5
1
1,5
2
2,5
32 33 34 35 36
pH = 4
pH = 4,5
pH = 5
pH = 6
Ln µ max
1/T.10-3 (°K)
3 % NaCl
0
0,5
1
1,5
2
2,5
32 33 34 35 36
pH = 4
pH = 4,5
pH = 5
pH = 6
Ln µ max
1/T.10-3 (°K)
L’utilisation de ce modèle était limitée à la croissance bactérienne et a été
appliqué avec succès pour prédire la croissance de Bacillus circulans,
Escherichia coli et lactobacillus delbruckii en combinant pH, aw et température.
Les courbes des figures 29a-b montrent qu’à partir des données acquises à
une température, on peut déterminer le paramètre cinétique considéré (µmax) à
d’autres températures et donc de prédire les niveaux de contamination mucorale
atteint après un certain temps de conservation.
VI-4 Les modèles et la prédiction de croissance de Mucor racemosus
Le Mucor est un champignon à croissance rapide. Etant donné que
l’espèce Mucor racemosus a été isolée à partir des fromages à pâte molle de
type camembert, il serait important afin de l’étudier que les conditions
expérimentales soient plus proches de l’environnement de fromagerie. C’est
ainsi que la concentration en NaCl utilisée dans la fabrication varie
généralement de 1.5 à 3%.Concernant la température, elle s’étend de 10 à 30°C
étant donné que le processus de fabrication du camembert passe par plusieurs
phases qui se déroulent aussi bien à température ambiante qu’aux basses
températures entre 8 et 15°C (ressuyage et affinage). Enfin pour le pH, il a été
étendu de 4 à 6 car après une fermentation (coagulation), on s’attend à ce que le
pH atteigne des valeurs qui se situent au alentours de 4.3-5.5, et durant
l’affinage ; il remonte pour se situer aux environ de 7.
Les résultats obtenus expérimentalement corroborent ceux de Le Bars-
Bailly,(1999) en rapportant les conditions optimales de croissance de Mucor
racemosus , se situant à une température de 22°C, à un pH de 4.5 et une faible
teneur en sel (<1.5%).Par ailleurs selon Pitt et Hocking, (1999), la plupart des
moisissures sont capable de croître en dessous de 0.80 aw, en revanche, les
zygomycètes comme le Rhizopus et le Mucor et certaines Deutéromycètes
comme Fusarium et Trichoderma ne peuvent se développer en dessous de 0.90
aw. Hardy et al., (1982) rapportent l’optimum de croissance de certaines souches
de Mucor de contamination sur des fromages expérimentaux se situe entre 20 et
24°C.
La quantification des résultats observés a été obtenue par l’intermédiaire
des modèles prédictifs. L’utilisation du modèle primaire développé par Baranyi
et al.,(1993) a permis de déterminer les taux de croissance maximum atteints
par Mucor racemosus en fonction des différentes combinaisons de paramètres
(T°, pH et taux de sel). Le même modèle a été appliqué sur certaines espèces
fongiques comme Pénicillium roqueforti (Valik et al.1999), Aspergillus flavus
(Gibson et al., 1994) et Pénicillium brevicompactum (Membre et Kerbackza,
2000) Le modèle polynomial constitue une approche de modélisation empirique
pour les champignons (Gibson et al., 1994) et sont fréquemment préférables
que les modèles mécanistes (Box et Draper, 1987). Dans le cas de nos essais, ce
modèle a montré de bonnes performances en terme de r2 (coefficient de
corrélation) et de SRCE (somme des racines carrées des écarts) entre les
valeurs expérimentales et théoriques (prédites) et ce comparativement au
second modèle appliqué de Davey (tableau 9). Des résultats similaires ont été
obtenus par Panagou et al.,(2003) ; Valik et al., (1999) ; Valik et Pieckova,
(2001).Cependant les deux modèles secondaires font ressortir l’absence d’effet
significatif du pH sur le taux maximum de croissance de Mucor racemosus, cela
a été aussi bien confirmé par les résultats de l’analyse de variance (Tableau
10).
Tableau 9 : Estimation des valeurs statistiques des coefficients de deux modèles de
régression aux différentes conditions (T°, pH, aw)
Equationtype
Paramètres Valeurs estiméesdes coefficients de
régression(p<0.05)
Coefficientde corrélation
r2
dl SRCE
Polynomial a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10
-16.24051.53345.1914
-0.1232 ns
-1.24650.1044
0.0029ns
0.0907-0.0010-0.0067
0.953 66 0.192
Davey a1a2a3a4a5a6a7
2.6486-2.1870ns
4.527ns
0.1461-1.08540.0383-0.0032
0.910 69 0.315
ns : Non significatif dl : Degré de libertéSRCE : Somme des racines carrées des écarts
L’analyse de variance a donc montré un effet hautement significatif de la
température, de l’activité de l’eau (p<0.01) et leur interaction sur le taux de
croissance maximal (µmax). Par contre aucun effet du au pH n’a été décelé
(tableau 10).
Tableau 10 : Analyse de variance du taux de croissance
Source de
variation
S.C.E ddl Test F Probabilité
Variance
totale
744.258 79
Température 58.848 4 22.616** 0
pH 0.62 3 0.318 ns 0.814
aw 32.536 3 16.672** 0
Temp X pH 616.93 12 79.03 ns 0
Temp X aw 7.916 12 1.014 ** 0.457
pH X aw 3.989 9 0.681 * 0.721
SCE : Somme des carrées des écarts
ddl : Degré de liberté
ns : Non significatif
* : Significatif (p<0.05)
** : Significatif (p<0.01)
Conclusion générale
Le fromage est un substrat particulièrement favorable au développement
des moisissures. Si certaines espèces utiles exercent un rôle fondamental dans
l’élaboration d’un fromage lui permettant d’acquérir l’ensemble de ces
caractéristiques organoleptiques, d’autres au contraire sont indésirables et leur
développement peut rendre le produit invendable en altérant son aspect et son
goût, c’est le cas de nombreuses espèces de Mucor. Ce sont des moisissures
ubiquistes capables de s’adapter rapidement aux conditions du milieu, toute
modification des paramètres physico-chimiques du substrat favorisent leur
développement aux dépend de la flore fromagère utile. La prévention de tels
accidents de fabrication passe impérativement par la maîtrise de l’hygiène, pour
éviter la contamination par des espèces indésirables, et également par la
maîtrise de la technologie fromagère, de manière à empêcher la multiplication
des moisissures contaminantes éventuellement présentes. La mise en place
d’une démarche HACCP peut aider les producteurs, d’une part à mieux cerner
les étapes à risque et d’autre part, à définir les mesures à mettre en œuvre pour
éviter ces accidents de fabrication. C’est ainsi que le choix des souches
lactiques lors de l’ensemencement du lait est une étape qui présente un haut
risque qui va influencer les possibilités de multiplication ultérieure des espèces
mucorales contaminantes. Dans ce cadre, l’emploi des ferments thermophiles
qui apportent une garantie en terme d’acidification, peut aider à l’amélioration
des paramètres technologiques grâce à la baisse rapide du pH et à une
diminution importante de l’activité de l’eau, ceci se traduit par une forte
diminution de l’exposition aux Mucor. Par ailleurs, la microbiologie
prévisionnelle s’avère un outil indispensable aidant à prévenir les dangers
microbiologiques imputés aux Mucors et à éliminer les risques. Les outils de
modélisation et de simulation ont permis d’évaluer les prédictions possibles du
taux de croissance maximum de ces espèces fongiques dans un milieu
synthétique de laboratoire. L’influence des facteurs environnementaux (aw et
température) sur la prédiction de croissance a été clairement démontrée,
contrairement au pH qui semble n’avoir que très peu d’influence sur la
croissance mucorale (fongique) par comparaison à la croissance bactérienne.
En perspective,les résultats de ces simulations pourraient apporter une
aide assez intéressante aux unités de fromagerie particulièrement de camembert
leur permettant d’estimer et de prévoir les risques associés à cette espèce
mucorale en ayant des connaissances assez détaillées sur les conditions
permettant sa croissance et sa survie, ce qui leur facilite également la mise en
place des démarches HACCP en identifiant l’ensemble des points critiques pour
la maîtrise de la sécurité alimentaire du produit.
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ANNEXE 1
Tableau 1 : Résultats du niveau de contamination par le Mucor au niveau du matériel
Point de prélèvement *Nombre de Mucor en UFC/US
Bac de réception de laitIntérieur
000
Extérieur000
Tank de stockage de laitpasteurisé
000
240025002300
Tank de préparation de levainTank de Maturation du lait
000
000
Bassines de coagulation 000
600700500
Tranche-caillé 000
600060505950
Mouleuse 000
600700500
Laveuse des bassines decoagulation
120013001100
500040006000
Retourneuse (1er retournement) 800075507000
000
Retourneuse (2èm retournement) 720074506950
000
Laveuse des plateaux 900095008500
700069507050
Table de coagulation 130012001400
Plateaux avant moulage 830081008500
Plateaux après moulage 250027002300
Empileur 550054005600
Table d’égouttage 250024002600
Table de démoulage 750077007200
Chariot de salage 600057006300
Chariot de ressuyage 500048005200
Tableau 2 : Résultats du niveau de contamination atteint par le Mucor(Ambiance, sols, murs et rigoles d’égouts)
Etapes Nombre de Mucor en UFC ou UFC/USAmbiance Sols Murs Rigoles
d’égoutsMaturation 1200
13001100
120014001000
300 310030003200
Coagulation 800850750
400500300
200 80060001000
Tranchage 600700500
600500700
- -
Brassage 200018002200
600650550
- -
Soutirage 140015501250
10000955010050
- -
Moulage 320032503150
790078008000
- 540053505450
Retournements 250026002400
800700900
320034003000
980099009700
Egouttage 250025502450
8001000600
240022002600
440042504550
Démoulage 800700900
600400800
180017001900
120001210011900
Lavage desplateaux
10001150900
800950650
260027502450
770079007500
Salage 800900700
400300500
600500700
200100300
Ressuyage 500550450
200250150
200250150
10050150
Affinage 000
000
600500700
000
Tableau 3 : Evaluation de la contamination des mains du personnel par le Mucor
Personnel exerçant aux étapes Nombre de Mucor UFC/USRéception lait cru 6300
62006400
Préparation des levains et lait dematuration
000
Coagulation 750076507350
Brassage 400042003800
Soutirage 120011001300
Moulage 000
Retournements 000
Démoulage 350035503450
Salage 750074007600
Ressuyage 750075507450
Affinage 750074007600
ANNEXE 2
Tableau 1 : Résultats des valeurs de pH au cours de la fabrication
Etapes Lot I MES Lot II THELait cru 6.39
6.406.39
6.386.406.37
Coagulation 6.256.276.27
5.755.775.72
Tranchage 6.206.196.22
5.705.725.68
Moulage 6.216.226.23
5.655.645.67
Egouttage1er retournement
5.715.705.71
5.455.485.42
Egouttage2èm retournement
5.705.695.72
5.005.104.90
Démoulage 4.934.954.92
4.624.604.58
Salage 4.824.844.81
4.594.614.58
Ressuyage 4.824.814.83
4.504.514.49
Tableau 2 : Résultats des valeurs de pH au cours de l’affinage à 12°C/85%HR
Lot II THELot I MESEtapes4.404.414.39
4.804.824.78
J3 Affinage
5.315.295.30
5.445.425.43
J6 Affinage
6.776.796.75
6.686.696.67
J9 Affinage
7.057.047.06
7.017.027.00
J12 Affinage
Tableau 3 : Résultats des valeurs de pH au cours de l’affinageA 12°C/95%HR
Lot II THELot I MESEtapes4.434.424.44
4.814.804.81
J3 Affinage
5.325.335.33
5.425.435.41
J6 Affinage
6.776.756.78
6.716.726.72
J9 Affinage
7.047.047.05
7.027.017.03
J12 Affinage
Tableau 4 : Résultats des valeurs d’extrait sec à 12°C/85%HR
Lot II THELot I MESEtapes49.3050.2551.35
42.3041.3042.30
J3 Affinage
52.2451.2353.26
46.5044.5048.50
J6 Affinage
59.1658.1760.15
53.7550.8056.70
J9 Affinage
62.2262.1062.34
59.2957.2761.32
J12 Affinage
Tableau 5 : Résultats des valeurs d’extrait sec à 12°C/95%HR
Lot II THELot I MESEtapes42.3041.5543.10
39.2540.2541.35
J3 Affinage
45.7545.7645.70
44.3544.6544.54
J6 Affinage
48.2049.2548.20
49.3849.2849.42
J9 Affinage
54.2954.2754.29
53.2553.4053.25
J12 Affinage
Tableau 6 : Résultats des valeurs de la flore de Mucor à 12°C/85%HR
Lot II THELot I MESEtapes200350350
460047004500
J3 Affinage
000
340036003200
J6 Affinage
000
290029002700
J9 Affinage
000
260026002500
J12 Affinage
Tableau 7 : Résultats des valeurs de la flore de Mucor à 12°C/95%HR
Lot II THELot I MESEtapes800900800
540053005700
J3 Affinage
500700700
520053005600
J6 Affinage
900800
1000
490052005200
J9 Affinage
110014001200
520053005400
J12 Affinage
TRAVAUX SCIENTIFIQUES
Publications internationales
1- Bekada.AM.A.; Bensoltane.A. ;MedouakhL. ;Benakriche.B&Ait
saada.DJ.,(2004) : Determination of the critical points relating to Mucor
sp contamination during the manufacture of soft cheese standard
camembert. Egyptian journal of applied sciences. VOL 19. N° 11B
.NOV,2004.
2- Medouakh L.; Tabak S ; Bekada A.M.A. ; Mahi M ; Rouissat L. ;
Yagoubi M and Bensoltane A., (2006): Isolation and characterization of
Helicobacter pylori from patients suffering from gastroduodenal ulcer
disease. Egyptian journal of applied sciences. VOL 12. N° 1B.MAR,2006.
3- Bekada.A.M.A & Bensoltane.A.,(2007) : Effet de substitution de
ferments lactiques mésophiles par les thermophiles sur le développement
des Mucors sp. dans la fabrication du camembert. Sous presse
Séminaires
1- Bekada.A.M.A & Bensoltane.A.,(2006) : Mise en place d’un plan Haccp
dans une restauration collective. Premières journées nationales sur
l’hygiene et la santé dans les résidences universitaires. Oran, Mai 2006.
2- Bekada.A.M.A &Bensoltane.A.,(2006) : Modélisation de l’effet combiné
du pH, de l’activité de l’eau (aw) et de la température sur la croissance de
Mucor racemosus dans une pâte molle type camembert.
Journées scientifiques de Biologie. U- Mostagenem, Mai 2006.