redalyc.los microorganismos en la digestión anaerobia y la
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ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de
Azúcar
ISSN: 0138-6204
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba
Ferrer, Yoandy; Pérez, Heidy
Los microorganismos en la digestión anaerobia y la producción de biogás. Consideraciones en la
elección del inóculo para el mejoramiento de la calidad y el rendimiento
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. 43, núm. 1, enero-abril, 2010, pp. 9-20
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Ciudad de La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120681002
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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
ICIDCA 43 (1) 2010 9
Yoandy Ferrer, Heidy Pérez
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de AzúcarVía Blanca 804 y Carretera Central, San Miguel del Padrón. La Habana, Cuba
RESUMEN
Se realiza una disertación sobre la importancia de desarrollar un inóculo debidamentecaracterizado e identificado, para lograr un biogás con la calidad energética óptima. Sepropone una hipótesis sobre la relación de inóculos empíricos a base de excreta de cerdo,con los problemas de rendimiento de metano, debido la competencia de las bacteriasreductoras de sulfatos y las arqueas metanógenas acetoclásticas, por el acetato. Se con-sideraron las características fisiológicas, metabolismo, mecanismos enzimáticos y rela-ciones ecológicas de los principales grupos de los lodos anaerobios. Se analizaron lasespecies más comunes en reactores y se expuso una estrategia mediante un esquemageneral, para la confección de metodologías y para una correcta selección de cepasmetanógenas de ambientes autóctonos. Se enumeran y explican brevemente los diferentes métodos de aislamiento e identifica-ción establecidos para un estudio taxonómico polifásico, que permita obtener cepasautóctonas de ambientes naturales o fermentadores, a fin de propiciar el diseño de tec-nologías que consideren un escalado de inóculo con los microorganismos de mejores ren-dimientos en la degradación de materiales residuales y alta producción de metano.
Palabras clave: metanógeno, inóculo, digestión anaerobia, biogás, calidad.
ABSTRACT
This work is aimed to identify the specific characteristics of inoculums for obtaining a bio-gas with the desired energy quality. A hypothesis about the relationship of empiric ino-culums formed by pigs excretes with the problems of methane yield; due the competitionof the reducing bacteria of sulfates and acetoclastic methanogenic archeas by the aceta-te was proposed. The physiologic characteristics, metabolism, enzymatic mechanismsand ecological relationships of the main groups of anaerobe muds were considered. The
INTRODUCCIÓN
El creciente desarrollo de la humanidad,asociado a la continua industrialización,urbanización y el empleo de motores detodo tipo, ha conducido a un incremento dela contaminación ambiental, convirtiéndoseésta en uno de los principales problemasambientales de la sociedad contemporánea.Adicionalmente, contribuye a la generaciónde focos de infección que perjudican lasalud humana como consecuencia de lafalta de control, de alternativas de trata-miento y la ausencia de leyes reguladoras(1, 2).
La agroindustria azucarera y sus deriva-dos en Cuba, aportan un elevado volumende aguas residuales. En el año 2000, sealcanzaron cifras de 36 millones de metroscúbicos de residuos líquidos, con una cargamedia de más de 5 kg de Demanda Químicade Oxígeno (DQO)/m3 lo que representa unimportante impacto ambiental (3).
Los mayores problemas de contamina-ción que se producen en esta industria sedeben a la generación de residuales líqui-dos, provenientes fundamentalmente de loscentrales azucareros productores de azúcarcrudo y refino, fábricas de levadura forraje-ra y destilerías, distribuidas por todo el paísque inciden directa o indirectamente en lascuencas, bahías, zonas costeras, ríos, suelosy aguas subterráneas entre otros, lo que hadado lugar a que se tome una serie de medi-das dentro del Ministerio de la IndustriaAzucarera encaminadas a disminuir estacontaminación.
Para establecer un sistema de produc-ción eficiente y ecológicamente sostenible
es imprescindible el empleo de tecnologíasque incrementen la eficiencia energética.Las vías de aprovechamiento de los residua-les a escala industrial ha sido el desarrollode tecnologías para la producción de biogás.
El biogás es el producto principal de ladigestión anaerobia, proceso biológicodegradativo en el cual parte de los materia-les orgánicos de un sustrato son convertidosen una mezcla de CO2, hidrógeno, metano,sulfuro de hidrógeno y trazas de otros ele-mentos. En este interviene un consorcio debacterias y arqueas metanógenas, estas últi-mas muy sensibles al oxígeno. De ahí queeste proceso sea estrictamente anaerobio.En comparación con las digestiones aero-bias, la fermentación anaerobia permiteconvertir gran cantidad de residuos, efluen-tes de las industrias papelera, alimentaria,fermentativa y química, en energía, al trans-formar casi totalmente la carga contaminan-te en metano.
La producción de metano es un resulta-do directo de la reducción de DQO dentrodel sistema metanogénico. El tratamientoanaeróbico es frecuentemente usado paratratar aguas residuales con una elevadaDQO, para una eficiencia de remoción de71-97% (4).
Los principales problemas en la produc-ción de biogás están relacionados con altageneración de sulfuro de hidrógeno y dióxi-do de carbono, lo que implica un menorrendimiento neto de metano. La inestablecomposición de los residuales sustratos y laineficiente adaptabilidad de los gruposmicrobianos a los cambios, en las condicio-nes de fermentación, contribuyen a lamerma en la calidad de la mezcla de gases.
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most common microorganisms that appear in reactors were exposed. A general strategywith a diagram for making a correct selection of autochthonous methanogenic stumpsfrom environment was proposed.Different isolation and identification methods were enumerated and explained for a taxo-nomical poliphasic study that allows to obtain autochtonous stumps of natural environ-ments or reactors, and propitiate the design of technologies with an inoculum climbedusing the better yields microorganisms in residual degradation and high methane pro-duction.
Key words: methanogens, anaerobic digest, biogas, quality.
Existen varias técnicas microbiológicasy moleculares descritas para la identifica-ción y caracterización de microorganismospresentes en los lodos anaerobios de lasplantas de tratamiento de residuales, asícomo en reactores para la producción debiogás. Estos métodos pueden constituiruna herramienta valiosa a la hora de elegirun buen inóculo para una producción efi-ciente y rentable de biogás, teniendo encuenta que dicho proceso biotecnológico sebasa siempre en las bondades metabólicasde los microorganismos. Por tanto unabuena selección de cepas, con altos rendi-mientos de generación de metano y altasremociones de DQO, garantiza un mejoraprovechamiento de las plantas de biogásexistentes en el país y un diseño más eficazde reactores futuros, al contar con lodossemilla de microorganismos, altos produc-tores de metano.
Consideraciones metabólicas en la produc-ción de biogás por los grupos de microor-ganismos anaerobios
La digestión anaerobia de residuales,con la consecuente producción de biogásacompañante, comprende un conjunto dereacciones de oxidación-reducción media-das por complejas enzimas especiales, queposeen los microorganismos capaces dedegradar estos sustratos. Entre ellos existeuna estrecha interdependencia fisiológica,que implica la necesidad nutricional de ungrupo respecto al producto metabólico deotro, de manera que se establece un equili-brio ecológico que permite una considerabledisminución de la Demanda Bioquímica deOxígeno (DBO) y DQO de la carga contami-nante del sustrato (5).
Se pueden generalizar al menos tres gru-pos metabólicos esenciales, ecológicamentepredominantes en medios ausentes de oxí-geno, ricos en sales y compuestos orgánicos:las bacterias homoacetógenas (BHA), lasbacterias sulfato reductoras (BSR) y lasarqueas metanógenas (6).
Globalmente el metabolismo de estosgrupos, genera acetato, H2 y CO2, por partede las BHA y las BSR, las cuales consumenindistintamente dichos metabolitos, aunquela producción neta está favorecida termodi-námicamente hacia la formación de metano,
el que unido al H2S acompañante liberadopor las BSR, completa así la mezcla de gasesque compone el biogás (7). Ver esquema 1.
Bacterias homoacetógenasEl grupo de las BHA generan acetato
como producto principal. En dependenciade la especie pueden utilizar como donan-tes de electrones el H2, azúcares, ácidosorgánicos, aminoácidos, alcoholes y algu-nas bases nitrogenadas. Estas bacteriaspueden reducir CO2, NO3 y S2O3.Probablemente la principal reacción ecoló-gica en este grupo sea la reducción del CO2
en acetato a expensas de H2 en los homoa-cetógenos autótrofos por la vía del acetil-CoA mediante la monóxido carbono deshi-drogenasa, una enzima clave utilizada porvarios microorganismos anaerobios, pararealizar esta reacción reversible como unmecanismo de conservación de energía (6).Al grupo de las BHA pertenecen variosgéneros de Acetobacterias y Clostridios quecrecen bien por la vía glicolítica de fer-mentación de azúcares en piruvato, que estransformado en acetato con formación deATP, liberando CO2 y H2. Esta producciónconcomitante de CO2 y H2 es vital paraabastecer las necesidades de fuente de car-bono y electrones del resto de los grupos.Debido a su amplio consumo, el gradientetermodinámico se mantiene hacia la gene-ración continua de hidrógeno molecular, auna baja concentración neta, aunque sufi-ciente para satisfacer la demanda y retroa-limentar el sistema (8, 9). Ver esquema 2.
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Esquema 1. Grupos metabólicos en la produc-ción de biogás.
Bacterias reductoras de sulfatosLa utilización de sulfato (SO4
2-) comoaceptor de electrones para generar energíametabólica, implica una reducción a granescala de este ión hasta sulfuro de hidróge-no (H2S), proceso que en la naturaleza estáconfinado exclusivamente a este grupo debacterias, cuyos miembros más representa-tivos pertenecen a los desulfovibrionales ydesulfobacteriales (6). Para que sea meta-bólicamente utilizable, el sulfato debe serpreviamente activado por su unión conATP. Valiéndose de estos enlaces de altaenergía se realiza la reducción a H2Smediante la enzima sulfito reductasa. Lareducción de sulfato puede ser asimiladoracuando el azufre se incorpora en compues-tos orgánicos como cisteina o metionina, obien puede ser excretado al medio demanera desasimiladora, y en esta últimavariante las reacciones de transporte deelectrones propician la formación de ungradiente protónico que impulsa la síntesisde ATP por medio de una ATPasa hidroge-nasa de membrana (10). La síntesis de ATPpuede estar mediada también por la oxida-ción de piruvato en acetato y CO2 por la víadel acetil-CoA. Esta vía puede seguir lareacción inversa, por lo que varias BSRpueden oxidar completamente el acetatohasta CO2, de manera que algunas sulfatoreductoras autótrofas pueden crecer enmedios anóxicos a expensas de esta víametabólica, regulada por la monóxido car-bono deshidrogenasa. Este proceso ocurrede manera similar a ciertos miembros delgrupo BHA, usando solamente el CO2 comofuente de carbono, H2 como donante de
electrones y reduciendo el SO42- como
aceptor electrónico. Además lactato, buti-rato, etanol y metanol son sustratos comu-nes en la degradación anaerobia por lasBSR (10).
Realizando un análisis de la composi-ción de los efluentes usados como sustratosen nuestro país para la producción de bio-gás, resalta la presencia notable de sulfatos.Es en efecto, esta característica la que favo-rece la producción adicional de sulfuro dehidrógeno por las BSR.
En medios ricos en compuestos orgáni-cos, las BHA heterotrofas pueden crecerbien a expensas de la vía glicolítica y eldióxido de carbono generado sería usadopor las BHA autotrofas por la vía de forma-ción del acetil- CoA. En balance neto favo-recería en definitiva la acumulación deacetato en el medio. Por tanto, la vía máseconómica para las BSR sería mediante lapropia enzima monóxido de carbono des-hidrogenasa, usando su reacción inversa.Para crecimiento de las BSR se requierenecesariamente una fuente rica en sulfatos,que hace de aceptor de electrones. Portanto, de manera global estará comprome-tido el acetato para generar sulfuro dehidrógeno, un gas corrosivo e indeseable,en lugar de ser aprovechado en la forma-ción de metano. Ver esquema 3.
Arqueas metanógenasLos metanógenos son procariontes anae-
robios que pertenecen al dominio Archaea,el tercer dominio de vida en adición aEucarya y Bacteria (11). Este es el únicogrupo metabólico capaz de obtener energíade compuestos carbonados de bajo pesomolecular e hidrógeno con producciones
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Esquema 2. Vías metabólicas para la formaciónde acetato.
Esquema 3. Vía metabólica favorecida en BSR.
estequiométricas de metano. La producciónbiológica de metano se realiza por un grupode arqueas anaerobias estrictas. La metano-génesis tiene lugar mediante una serieexclusiva de reacciones en las que intervie-nen coenzimas. En el crecimiento autótrofode los metanógenos, la reducción de CO2
depende de la donación de electrones por eldihidrógeno y en algunas especies el aportelo realiza el formiato, el CO y algunos alco-holes orgánicos (12, 13). Mediante la vía delacetil- CoA el CO2 es reducido a formilo, yluego a metileno y metilo, previa activación,transferencia y deshidratación por enzimasque contienen las coenzimas metanofurano,metanopterina y F420, respectivamente. Elgrupo metilo se transfiere a una enzima quecontiene CoM y el complejo es reducido ametano por el sistema metil reductasa,donde están implicadas F420 y CoB (14). Verfigura 1.
También se puede generar metano a par-tir de compuestos metilados y acetato. Losgrupos metilo resultantes de la catálisis delmetanol y otros compuestos orgánicos soncargados a una proteína corrinoide, (proteí-
na sulfato corrinoide donde es enlazado alcobalto del grupo prostético de la cobalami-na, por la enzima metiltransferasa) y luegocedidos directamente a CoM para entoncesser reducidos a moléculas de metano.Cuando el sustrato es acetato, este es activa-do a acetil-CoA interaccionando con laenzima monóxido carbono deshidrogenasa,y el grupo metilo del acetato es transferido ala proteína corrinoide, para incorporarse alpaso final de la metanogénesis (15, 16). Verfigura 2.
A modo de resumen se pueden agrupartres tipos de vías metanogénicas, las quedifieren en la utilización de sustratos (17):• Metanógenos hidrogenotróficos: Crecen
con hidrógeno molecular (H2) como dona-dor de electrones y CO2 como aceptor deelectrones. Algunos hidrogenotróficospueden usar formiato, el cual es la fuentede CO2 y H2.
• Metanógenos acetoclásticos: Rompen elacetato en grupos metilo y carbonilo, oxi-dando el grupo carbonilo hasta CO2 y pro-porcionando el potencial de reducciónpara reducir el grupo metilo a metano.
• Metanógenos metilotrópicos: Crecen encompuestos metilados como metanol,metilaminas y metilsulfuro, los cualesactúan como donantes o aceptores de elec-trones o son reducidos con H2.
Consideraciones en la elección de un bueninóculo
Una posible hipótesis de los fundamen-tales problemas en la producción de biogás,como son las elevadas concentraciones desulfuro de hidrógeno y los bajos rendimien-tos de metano, se puede esbozar de las rela-ciones ecológicas que se establecen entrelos grupos microbianos de los lodos y susparticularidades metabólicas.
En reactores sometidos a grandes cargasde materia orgánica, las bacterias fermenta-doras homoacetógenos, generan concentra-ciones considerables de acetato. En presen-cia de sulfatos, se favorece el crecimiento delas BSR, que debido a la disponibilidad deacetato, consumen preferentemente estesustrato. Estos factores son comunes en laproducción de biogás en nuestro país,donde se utilizan vinazas de destileríascomo sustrato a degradar.
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Figura 1. Vía de los metanógenos hidrogenotró-ficos.
En cultivos mixtos en dichas condicio-nes, los metanógenos acetoclásticos ten-drían que competir con las bacteriasreductoras de sulfatos por el consumo delacetato. Esta competencia sería desfavora-ble a los metanógenos por su lento creci-miento y por el inóculo utilizado en lamayoría de las fermentaciones industria-les. Este inóculo empírico a base de excre-tas de cerdo, tiene una composición muyheterogénea de microorganismos, siendoabundante en coliformes y sulfatorreduc-toras.
De ello se deriva la importancia en pro-fundizar en las relaciones ecológicas de losmicroorganismos involucrados en las fer-mentaciones anaerobias y la necesidad deaislar metanógenos de altos rendimientosde metano, con el fin de confeccionar bue-nos inóculos que propicien una producciónóptima de metano. Con ello se sentarían lasbases para el diseño de tecnologías que con-sideren las particularidades de este comple-jo ecosistema y su impacto en la producciónde biogás.
Taxonomía de los metanógenos
Taxonómicamente los metanógenos for-man 5 órdenes (18):
• Methanosarcinales (9 géneros).• Methanomicrobiales (8 géneros).• Methanobacteriales (5 géneros).• Methanococales (4 géneros).• Methanopyrales (1 género).
La mayoría de los metanógenos son capa-ces de producir CH4 y CO2. Los órdenesMethanomicrobiales, Methanococales yMethanopyrales contienen solamente hidro-genotróficos, así como los miembros deMethanobacteriales excepto el género metilo-trófico Methanosfera. Los demás metilotrofosy todos los acetoclásticos pertenecen a losMehanosarcinales, incluyendo los únicosacetoclásticos obligados conocidos, que for-man la familia Methanosaetaceae. El ordenMethanosarcinales incluye los más versátilesmetanógenos, varios miembros de la familiaMethanosarcinaceae poseen las tres rutasmetabólicas de la metanogénesis (19, 20).
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Figura 2. Vías de los metanógenos acetoclásti-cos (a partir de acetato y/o metanol).
Metanógenos acetoclásticos más frecuentesen reactores
Los metanógenos acetoclásticos inclu-yen numerosas especies las que son subdi-vididas en diferentes cepas. Los miembrosmás representativos de este orden son losgéneros Methanosaeta y Methanosarcina.Cada uno posee características fisiológicas yfísicas únicas. El crecimiento y la produc-ción de metano es afectado por varias con-diciones, como tipo de organismo presente,temperatura, pH, concentración de acetato,utilización de nutrientes y agitación. Lainhibición del crecimiento y la producciónpuede ser causada por la presencia de oxí-geno (21).
Las especies más comúnmente observa-das de los géneros Methanosaeta sp. yMethanosarcina sp. son Methanosaetasoehngenii y Methanosarcina barkeri, res-pectivamente (22).
Son los miembros de este grupo los quecon más frecuencia se aíslan de los fermen-tadores. Esto se debe fundamentalmente aque los sustratos con alta DQO favorecen elcrecimiento del resto de los grupos tróficosno metanógenos capaces de degradar sus-tratos complejos y producir abundante ace-tato, a expensas del cual Methanosaeta sp. yMethanosarcina sp. pueden desarrollarsefavorablemente y producir grandes volúme-nes de metano.
Entre ellos se destacan algunas diferen-cias, como la menor afinidad por el sustratode Methanosarcina, que favorece su creci-
miento en altas concentraciones de acetato,frecuente en reactores de gran escala y altaDQO, así como una mayor velocidad de cre-cimiento y mejor rendimiento biomasa-sus-trato, medido en peso seco/ mol de acetato(23-29). Ver tabla 1.
Por tanto Methanosarcina barkeri es unmejor candidato a la hora de elegir uninóculo, considerando otras características,según la estrategia diseñada, que se proponeen el esquema 4.
Siguiendo la estrategia general de esteesquema, se pueden confeccionar metodo-logías para el aislamiento de buenos meta-nógenos tanto acetoclásticos, como hidroge-notróficos, de ambientes autóctonos: aguasresiduales estancadas, plantas de tratamien-to, reactores anaerobios, pantanos, etc.
Luego del aislamiento, es reco-mendable identificar debidamen-te las cepas seleccionadas utili-zando varias técnicas de taxono-mía polifásica.
MÉTODOS CONVENCIONALESDE IDENTIFICACIÓN DE META-NÓGENOS
Existen varias técnicas gene-rales para la determinación delnúmero y actividad de las pobla-ciones microbianas, como son latécnica de cuantificación porNúmero Más Probable (NMP),actividad deshidrogénica, activi-dad metanogénica específica,
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Esquema 4. Metodología para el aislamiento debuenas cepas metanógenas.
Tabla 1. Diferencias entre Methanosaeta soehngenii y Methanosarcina barkeri
Especie Methanosaeta soehngenii
Methanosarcina barkeri
Morfología Bacilos Cocos gram- Organización Cadenas o
filamentos
Paquetes esféricos
Dimensiones 1-2 μm de longitud
2-3 μm el paquete
Afinidad x acetato
Alta (Ks = 0,5 Mm)
Baja ( Ks=3-5mM )
Tiempo de duplicación
2-12 días (1 ,4 g PS/ mol acetato)
~ 1día (2,0 g PS/ mol acetato)
pH 6,8 - 8,2 6 - 8 (óptimo 7) Temperatura 35 - 40ºC 35 - 37ºC
conteo en placas y detección de coenzimaF420 por autofluorescencia bajo luz ultra-violeta.
Para la determinación cuantitativa delNMP en condiciones anaerobias se usandiferentes medios de cultivo con los reque-rimientos necesarios para el crecimiento delas bacterias anaerobias hidrolíticas, sulfo-rreductoras y arqueas metanógenas presen-tes en los lodos anaerobios. Se estima lacomposición aproximada de la muestra ana-lizada en cuanto a grupos tróficos. Se consi-dera rentable y fácil de aplicar el métododescrito por Millar, como modificación a latécnica de Hungate, con sus respectivosmedios y soluciones (30).
Sin embargo, este método presenta algu-nas desventajas: es necesario resembrar enplacas bajo la atmósfera anaerobia, para ais-lar las colonias y realizar su caracterizacióne identificación a niveles más específicos.Además, se ha reportado que el número demetanógenos viables con dicha técnica esde 10 a 1000 veces menor que el resultantedel conteo microscópico (31).
Conteo directoLa enumeración de células totales para
determinar el fondo de muestra y el conteoespecífico de metanógenos hidrogenotrófi-cos se realiza en microscopio epifluorescen-te de lámpara de alta presión de mercuriousando Cámara de Newbauer. Para la detec-ción de metanógenos se utiliza la propiedadde estos microorganismos de autofluorescera 420 nm bajo luz emitida de esta longitudde onda, a expensas de la coenzima F420
característica de su metabolismo, que actúacomo un fluorósforo. Para determinar elnúmero de no metanógenos se procede a lasustracción del conteo de totales realizadobajo luz directa (31).
Aislamiento de colonias en placasUsando los mismos medios estableci-
dos para la cuantificación por el métododel NMP, se puede adicionar 2% de agar ydejar solidificar en placas Petri bajo laatmósfera anaerobia. Luego de burbujearcon nitrógeno las muestras, se preparandiluciones decimales seriadas, se siembraa superficie en las placas a razón de 0,5 mLde cada dilución y se distribuye homogé-neamente con la espátula. Paralelamente,se puede sembrar a profundidad inoculan-
do 1 mL de cada dilución en las placas,luego se añade el medio fundido previa-mente atemperado y se agita lentamentepara su homogenización.
Las placas se sellan con parafina y sonincubadas de 7 a 20 días a 30 y 55ºC para elcrecimiento de mesófilos y termófilos. Sereporta el conteo de colonias aisladas enUFC/mL y se caracteriza su apariencia, tex-tura, tamaño y color para considerar losdatos reportados en la taxonomía conven-cional. Como complemento, se observan losmicroorganismos de cada aislado en micros-copio de epifluorescencia y se caracteriza lamorfología y apariencia bajo luz blanca yluz UV (32).
Análisis de gasesEs posible estimar los incrementos en la
biomasa de una población de metanógenasmediante un acoplamiento del cultivo a unsistema de medición de la composición degases, como cromatografía gaseosa o unmedidor portátil específico para la detec-ción y cuantificación de gases metano, H2,CO2, sulfuro y CO. De esta manera se puedeanalizar el crecimiento y los factores fisioló-gicos que influyen en el mismo, así comolas actividades metanogénica y deshidrogé-nica del cultivo.
IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS MOLE-CULARES
El uso de las técnicas tradicionales demicrobiología en la determinación y carac-terización de poblaciones celulares, estálimitado por el hecho de que muchos micro-organismos poseen una morfología indefini-da o no son cultivables en medios selectivos(33). Además, esta metodología presentapoca inespecificidad y fiabilidad, teniendoen cuenta que la mayoría de los caracteresque influyen en la fisiología se encuentran anivel molecular.
De manera, que en la taxonomía polifá-sica se complementa la caracterización con-vencional (morfología, cultivo, tipo de colo-nia, metabolismo, características tintoriales,etc.) con estudios moleculares por secuen-ciación o hibridización in situ del ARNr 16So mediante la identificación de moléculasespeciales que pueden aportar un criteriodiferencial.
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Identificación de genes específicosComo un método relativamente simple
de identificación de grupos hidrogenotrófi-cos predominantes en ambientes anóxicos,se ha utilizado la técnica de la Reacción enCadena de la Polimerasa (PCR), para deter-minar la presencia de genes específicos quecodifican para enzimas clave del metabolis-mo de BSR, BHA y arqueas metanógenas(34, 35).
La tabla 2 muestra varias secuencias decebadores y los genes diana más frecuente-mente usados en la identificación de losgrupos de los lodos anaerobios por técnicasde biología molecular (35, 36, 37).
Análisis de la secuencia del ARNr 16S dearqueas metanógenas
El ARN ribosomal 16S de las comunida-des de arqueas metanógenas ha sidosecuenciado y depositadas las secuenciasen bases de datos especializadas como elGenBank, por lo que resulta relativamentesencillo ubicar taxonómicamente a un orga-nismo, si se cuenta con un purificadosecuenciado del gen, por una simple com-paración con las librerías genéticas y ladeterminación del porciento de homología,construyendo un árbol filogenético por elmétodo del "vecino cercano" (38).
Como posible oligonucléotido para laamplificación por PCR del ARNr 16S dearqueas se puede usar el 5`AAAG-GAATTGGCGGGGGAGCAC 3` (35), mien-tras que las metanógenas pueden amplifi-carse exitosamente con los cebadores 5`-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGGGCG GGG GCA CGG GGGG CCC TAC GGGGCG CAG CAG-3`/ 5`-GGA TTA CAR GAT
TTC AC-3` (39). Se puede realizar un análi-sis de la secuencia resultante del PCR porelectroforesis en gel de gradiente desnatura-lizante (PCR-DGGE) (40), con el objetivo decomparar la huella o patrón de bandas deADN generadas en la electroforesis de lasmuestras a caracterizar, con las huellas decepas de referencia provenientes de colec-ciones internacionales, establecidas comopatrones para una tentativa ubicación taxo-nómica (41). Ver figura 3.
También se pueden identificar las pobla-ciones mediante la técnica de polimorfismode los fragmentos largos terminales de res-tricción (T-RFLP) y por hibridación in situcon sondas fluorescentes (FISH) (42, 38,35). Ver figura 4.
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Tabla 2. Secuencia de cebadores y genes diana más frecuentes en la identificación por grupos.
mcrA: metil-coenzima M reductasa; dsrAB: desasimiladora sulfito reductasa; fhs: formal tetrahidrofo lato sintetasa. Y=C/T; R= A/G; N=A/C/G/T; S=C/G; B=C/G/T; W=A/T.
Grupo Secuencia de oligos (5`- 3`) ADN diana (talla en pb)
Metanógenos
GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC/ TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT
TAYGAYCARATHTGGYT ACRTTCATNGCRTARTT
mcrA (464) mcrA (?) mcrA (?)
BSR
CTGGAAGGAYGACATCAA/ GTGTAGCAGTTACCGCA dsrAB (1,400)
BHA
TTTACAGGTGACTTCCATGC/GTATTGDGTYTTRGCCATACA fhs (1,100)
Figura 3. PCR-DGGE de gránulos de lodo de unreactor UASB vs. Metanógenos patrones.
CONCLUSIONES
Las complejas relaciones ecológicasentre los microorganismos en la degrada-ción anaerobia, mediadas por sus requeri-mientos metabólicos y sus particularidadesfisiológicas, influyen en la composición degases del biogás.
Teniendo en cuenta las rutas metabóli-cas utilizadas, se observa la posible com-petencia entre el grupo de BSR y lasarqueas metanógenas acetoclásticas, por elacetato generado en la fermentación de lasBHA.
El lodo semilla de excretas de cerdo uti-lizado para la inoculación de las plantas ennuestro país, pudiera ser responsable de lospersistentes problemas en la calidad y elrendimiento en metano del biogás.
Existen varias herramientas de micro-biología y biología molecular, para el aisla-miento, caracterización e identificación demicroorganismos autóctonos, capaces deproducir un biogás con mejor calidad.
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