病理組織学的検査病理組織学的検査～適切な固定とは～～適切な固定とは～

愛知医科大学病院・病院病理部愛知医科大学病院・病院病理部

酒井酒井 千早千早

固定とはなんだろう？

固定とは組織や細胞の自家融解による腐敗固定とは組織や細胞の自家融解による腐敗をおさえて、生きていた状態になるべく近い状をおさえて、生きていた状態になるべく近い状態の組織や細胞の種々の構造をとらえるた態の組織や細胞の種々の構造をとらえるために行なう。そのために、組織や細胞の主要めに行なう。そのために、組織や細胞の主要構造成分である蛋白質を安定化させて、蛋白構造成分である蛋白質を安定化させて、蛋白質の分解作用を止めて不溶解性にすること質の分解作用を止めて不溶解性にすることである。である。

速やかに固定液に浸漬しなければならない。

自家融解が早い膵臓は・・・

標本の良し悪しは固定によって決まってしまう！！

固定の原理について固定の原理について

成人の固体の化学的組成

水 70％ 50％（細胞内）

20％（細胞間） 5％（血液 ）

15％（組織液）

蛋白質 15％

脂肪 10％（30％は水を含む）

電解質 5％（糖質も含む）

固定の主な目的は、細胞組織内の水の処理と蛋白質の凝固である。

蛋白質の固定蛋白質の固定

生の細胞組織の蛋白質は巨大な蛋白質分子が水と帯電によって、流動性のゾル状態にあるが、固定液によって蛋白分子の周囲にある水分の除去と帯電性の変化のためにゲル状態に変わる 蛋白質の固定

蛋白質の固定蛋白質の固定

凝固型凝固型：分子内結合を示した基が分子間相：分子内結合を示した基が分子間相互で結合して絡み合う場合に蛋白質に凝固互で結合して絡み合う場合に蛋白質に凝固が起こる→が起こる→アルコール固定アルコール固定

変性型変性型：ルーズになった蛋白構造に分子結合：ルーズになった蛋白構造に分子結合を示した基が表面に露出して、固定液の間にを示した基が表面に露出して、固定液の間に化学反応が起こり、分子相互間の結合が起化学反応が起こり、分子相互間の結合が起こらない場合→こらない場合→ホルマリン固定ホルマリン固定

固定の目的固定の目的

可能な限り、速やかに組織片の自家融解過可能な限り、速やかに組織片の自家融解過程を停止させる。程を停止させる。

組織や細胞の主要成分である蛋白質を安定組織や細胞の主要成分である蛋白質を安定化、不溶化することで、細胞内成分の流出を化、不溶化することで、細胞内成分の流出を防ぎ、形態を保持する。防ぎ、形態を保持する。

標本作製過程における薬品、熱などの影響標本作製過程における薬品、熱などの影響による組織片の変質、変形をできるだけ少なによる組織片の変質、変形をできるだけ少なくすること。くすること。

固定の要点について

固定液の選択固定液の選択

固定材料の大きさ固定材料の大きさ

固定液の量固定液の量

固定時間固定時間

固定に使用する容器固定に使用する容器

固定の温度固定の温度

固定材料の変形防止・固定促進法固定材料の変形防止・固定促進法

固定液の選択①

目的の染色法に適した固定液を選ぶことが目的の染色法に適した固定液を選ぶことが大切である。大切である。

例）・乳腺のＨＥＲ例）・乳腺のＨＥＲ22－ＦＩＳＨを目的とした場合－ＦＩＳＨを目的とした場合

→→1010％緩衝ホルマリン使用％緩衝ホルマリン使用

・脂肪染色を目的とした場合・脂肪染色を目的とした場合

→アルコールやアセトンが入っていない→アルコールやアセトンが入っていない

固定液固定液

固定液の選択②

固定液の比較固定液の比較

アルコール固定 ホルマリン固定 生食固定

アルコール固定

生食固定 ホルマリン固定

固定液の比較

緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの違い違い

ホルムアルデヒド（ホルムアルデヒド（HCHO)HCHO)11、常温では気体、水溶性、弱酸性、常温では気体、水溶性、弱酸性

22、還元剤としての性質が強い、還元剤としての性質が強い

33、カニツアロ反応、カニツアロ反応

ホルムアルデヒドホルムアルデヒド++水⇔蟻酸水⇔蟻酸++メタノールメタノール

PH4 程度

（20％非緩衝ホルマリン）

緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの違い違い

ホルマリン色素ホルマリン色素

蟻酸を含む非緩衝ホルマリンは固定時間が蟻酸を含む非緩衝ホルマリンは固定時間が

長くなると、ホルマリン色素が目立つ長くなると、ホルマリン色素が目立つ

脾臓、骨髄などの血液成分の多い組織で認められやすい傾

向にある

緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの違い違い

蟻酸を含む酸性ホルマリン蟻酸を含む酸性ホルマリン

赤血球中のヘモグロビンからヘマチンを遊出赤血球中のヘモグロビンからヘマチンを遊出

酸化ヘマチン、一部の顆粒球の酵素をコアにし酸化ヘマチン、一部の顆粒球の酵素をコアにした茶褐色～黒褐色の顆粒・針状物質た茶褐色～黒褐色の顆粒・針状物質

蟻酸

緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの緩衝ホルマリンと非緩衝ホルマリンの違い違い

サクラ標本道場 固定より

中性緩衝ホルマリン中性緩衝ホルマリン

長所：非緩衝ホルマリンと比較して抗原性の長所：非緩衝ホルマリンと比較して抗原性の保持が良好保持が良好

ホルマリン色素の沈着が少なく、長期ホルマリン色素の沈着が少なく、長期固定・保存に適する固定・保存に適する

短所：組織への浸透は非緩衝ホルマリンより短所：組織への浸透は非緩衝ホルマリンよりも劣るも劣る

コストが高いコストが高い

非緩衝ホルマリン非緩衝ホルマリン

長所：組織への浸透性が良い長所：組織への浸透性が良い

作製が簡易である作製が簡易である

短所：細胞質・核が収縮気味になる短所：細胞質・核が収縮気味になる

ホルマリン色素が付着しやすいホルマリン色素が付着しやすい

保存中に蟻酸の生成による酸性化の保存中に蟻酸の生成による酸性化の影響により、染色性が低下影響により、染色性が低下

固定材料の大きさ

組織片はなるべく薄く、小さくして固定液が浸組織片はなるべく薄く、小さくして固定液が浸透しやすいようにする。透しやすいようにする。

標準的には標準的には11時間当たりで１ｍｍ浸透する。時間当たりで１ｍｍ浸透する。

→材料の厚さは→材料の厚さは5mm5mm以下が良い以下が良い

→体積に比してホルマリン液に接する表面→体積に比してホルマリン液に接する表面積を増やすと浸透がよい積を増やすと浸透がよい

固定液の量

固定液の量は豊富に使用し、組織片の固定液の量は豊富に使用し、組織片の55～～1010倍あれば充分である。倍あれば充分である。

固定液が混濁した場合は新鮮なものに取り固定液が混濁した場合は新鮮なものに取り替える。替える。

固定の時間

固定液の種類や組織片の大きさ・性質により固定液の種類や組織片の大きさ・性質により異なる。異なる。

固定が不充分な場合→組織収縮固定が不充分な場合→組織収縮

細部構造の崩壊細部構造の崩壊

固定が過剰な場合→組織片の脆弱化により固定が過剰な場合→組織片の脆弱化により

収縮や膨化収縮や膨化

固定時間の過不足はいずれの場合も染色が阻害される。

固定の時間

固定が過剰なケース（ホルマリン固定固定が過剰なケース（ホルマリン固定22年）年）

ホルマリン固定２年以上 ホルマリン固定１～２日

固定の時間

固定時間の違いにより、染色による影響が大固定時間の違いにより、染色による影響が大きい。（特に免疫染色において）きい。（特に免疫染色において）

固定時間は８時間以上24時間未満

を推奨する。（生検）

固定の時間

広島市医師会だよりより

固定良好 固定不良

固定の時間

広島市医師会だよりより

固定良好（２４時間） 過固定（６ヶ月）

固定に使用する容器

組織の大きさによって、固定容器を変える。組織の大きさによって、固定容器を変える。

固定に使用する容器

口の広いビンを使用する。口の広いビンを使用する。

リンパ節・肺など浮いてしまうものは十分に固リンパ節・肺など浮いてしまうものは十分に固定されない可能性があるため、上にキムワイ定されない可能性があるため、上にキムワイプなどを置くもしくは、包むことで全体に液がプなどを置くもしくは、包むことで全体に液が浸透するようにする。浸透するようにする。

固定の温度

通常は室温で行う。通常は室温で行う。

高温になれば、固定時間は短くなるが、あま高温になれば、固定時間は短くなるが、あまり高い温度では組織が硬化してしまうので、り高い温度では組織が硬化してしまうので、注意が必要である。注意が必要である。

固定材料の変形防止と固定促進法①

臓器別で固定方法の注意点がある。臓器別で固定方法の注意点がある。

脳：変形しやすく固定しにくい。固定液中に宙脳：変形しやすく固定しにくい。固定液中に宙吊りにする。吊りにする。

固定材料の変形防止と固定促進法②

肺：気管支内よりホルマリンを注入し、肺胞内肺：気管支内よりホルマリンを注入し、肺胞内まで固定促進し、肺の整形を行う。まで固定促進し、肺の整形を行う。

ホルマリン注入後ホルマリン注入前

固定材料の変形防止と固定促進法③

胃・腸：内腔を切り開いた後、板にピンなどを胃・腸：内腔を切り開いた後、板にピンなどを利用し、貼り付ける。利用し、貼り付ける。

OWOW（口腔側断端）、（口腔側断端）、AWAW（肛門側断端）を分か（肛門側断端）を分か

るようにする。るようにする。

固定材料の変形防止と固定促進法③

食道：食道は縮みやすいため、伸ばして板張食道：食道は縮みやすいため、伸ばして板張りをする。りをする。

固定材料の変形防止と固定促進法④

肝・脾臓：血液量が多く、浸透しにくいため、肝・脾臓：血液量が多く、浸透しにくいため、厚さ厚さ11ｃｍほどの割を入れる。ｃｍほどの割を入れる。

固定材料の変形防止と固定促進法⑤

乳腺：そのままホルマリンの浸漬では内部固乳腺：そのままホルマリンの浸漬では内部固定が不充分のため、注射器に入れたホルマ定が不充分のため、注射器に入れたホルマリンを全体にまんべんなく、注入してからホルリンを全体にまんべんなく、注入してからホルマリン容器で固定するのがよい。また、浮きマリン容器で固定するのがよい。また、浮きやすいため、ガーゼなどを上からかけておく。やすいため、ガーゼなどを上からかけておく。

固定材料の変形防止と固定促進法⑥

子宮：子宮癌の手術摘出臓器は子宮膣部か子宮：子宮癌の手術摘出臓器は子宮膣部から頚部を広げるように板に貼り付ける。ら頚部を広げるように板に貼り付ける。

固定材料の変形防止と固定促進法⑥

子宮膣部円錐切除の場合子宮膣部円錐切除の場合

切り離した箇所を記載する。

固定材料の変形防止と固定促進法⑦

板と組織の間は組織の密着により、固定不板と組織の間は組織の密着により、固定不充分になりやすいため、組織と板の間にペー充分になりやすいため、組織と板の間にペーパーなどを挟む。パーなどを挟む。

よい組織標本を作製するための固定条件

材料が小さいこと（表面積が大きいこと）材料が小さいこと（表面積が大きいこと）

材料は新鮮で自家融解がないもの材料は新鮮で自家融解がないもの

切り出しは鋭利の刃物を使用し、組織の圧挫切り出しは鋭利の刃物を使用し、組織の圧挫を生じないものを生じないもの

材料を水などに入れて、組織に浸透圧の差材料を水などに入れて、組織に浸透圧の差による障害が生じないものによる障害が生じないもの

材料は乾燥させない材料は乾燥させない

材料の表面より血液、粘液などを除去し、固材料の表面より血液、粘液などを除去し、固定液の浸透性のよいもの定液の浸透性のよいもの