אינטראקציות בין חלבוניםProtein – protein interactions

מיכל ליניאל פרופ'מנחה

אלעד מזומןמגיש

אבל למה?!?

הבנה מלאה של תהליכים ביולוגיים.•

קומפלקסים חלבוניים.•

מסלולים תאיים.•

הכרת החלבונים בלבד איננה מספיקה.•

העלאת השערות לגבי תפקידי חלבונים לא •ידועים.

מה נשתנה?

שיטות לגילוי קשרים קיימות מזה זמן רב –•

.Immunoprecipitationלדוגמא -

גילוי חלבונים חדשים פתירת גנומים שונים •בקצב מהיר.

.high throughputדרושות שיטות •

צורך לשלב שיטות גנומיות, ביוכימיות •וביופיזקליות

התוכנית להיום

הכרת שיטות למיפוי אינטראקציות.•

השוואה בניהן.•

הצגה של מחקר מקיף על אינטראקציות •בשמר.

הצגה של מחקר פחות מקיף על אינטראקציות •באדם.

הצגת השיטות

מבוסס על המאמרים:

• Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet;17(6):346-52.

• von Mering C. et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403

Hybrid proteins

Fishing for proteins that interact with bait domain

Yeast 2 Hybrid Assay

Lodish 5th

11-39

Transcriptional activation by hybrid proteins in yeast

Lodish 5th

11-39

Lodish 5th

11-39

Auto activator

sticky

Matrix approach

Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet

Matrix approach

רק חלבונים מוכרים נבדקים.•

הבדלים משמעותיים בין שני מחקרים שנעשו – • חופפים.141 ורק 692 מול 841

•Sticky preys

•Auto activators

•Pools לעומת array

Screening of fragment libraries

Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet

Screening of fragment libraries

אין צורך בחלבונים מוכרים.•

.interacting domainמציאת ה •

עלות גבוה – הכנה דורשת הרבה משאבים.•

טעויות בתוצאות

•False negativeלא שובטו כמו PCR ) 13%הגברת טעויות ב –

שצריך). מהאינטראקציות הידועות פוספסו.90%–array ישנן פחות תוצאות משיטת ה poolsב –

•False positivesקשרים שאין להם משמעות ביולוגית.––Sticky, auto activators.

ספרייהמטריקס

פחות – ישנן יותרהרבה יותר

תוצאות

False negatives

יותר – קשרים פחותבלי חשיבות

ביולוגית

False positives

עלותגבוההנמוכה יותר

Y2H

•In vivoמאתרת "קשרים שבירים" – עדינה.•לא מוטת לטובת חלבונים נפוצים.•

עשוי להפריע לאינטראקציה.fusion proteinה • חלבונים נבדקים באותו זמן – אין בדיקה של 2רק •

אינטראקציה שיתופית.מתרחשת בגרעין.•לא בודקת תנאים פזיולוגים.•

ANALYSIS OF PROTEINS AND PROTEOMES BY MASS SPECTROMETRYMatthias Mann et alAnnu. Rev. Biochem. 2001.

Epitope Tagging

Epitope Tagging + MS (Mass Spectrometry)

•Internal check for consistency.

קומפלקסים אמיתיים בתנאים פיזיולוגים.•

מגלה רק קומפלקסים שמתארגנים בתנאים •הנבדקים.

הסימון יכול להפריע.•

בזמן השטיפה יתכן ונאבד חלבונים.•

MS vs. Y2H

MSY2H

קשרים בינאריםקומפלקסים שלמים

מגלה קשרים "שבירים"חלבונים אובדים בשטיפה

הבדיקה מתאימה לתנאים מסוימים

בדיקה "אוביקטיבית"

מדויקמקיף

A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration

Guillaume Rigaut et al

1999 Nature America

TAP -

Tandem Affinity Purification

HMS-PC High-Throughput Mass-Spectrometric

Protein Complex Identification

• - החלבון של יתר inducibleביטוי overexpression

HMS-PCTAP

הקטנת השפעת התנאים הפיזיולוגים

העלאת הדיוק

Correlated mRNA expression (Synexpression)

) clustering קיבוץ (mRNA בדיקת ביטוי •גנים ע"פ הביטוי.

מהירה ונוחה.•מכסה הרבה מצבים פיזיולוגים.•

רק רומזת על אפשרות לקשרים.•תלויה מאוד בקריטריונים לקיבוץ.•

Genetic Interactions(Synthetic lethality)

שתי מוטציות לא לתאליות בנפרד אך לתאליות • קשר בתפקוד ותתכן אינטראקציה.ביחד

סריקה של גנום מלא ללא הטיית התוצאות.•

לא מעידה על קשר באופן ישיר.•

In Silico Predictions Through Genome Analysis

בפרוקריוטים : השתייכות לאותו אופרון.•הימצאות או העדרות באותם אורגניזמים. •.fusion proteinהימצאות כ •

מהיר וזול.•כיסוי גדול וממשיך לגדול באופן מהיר.•רק מנבאת.•תלויה בהשוואה מוצלחת בין אורגניזמים.•עד כה התמקדות בפרוקריוטים.•

Comparative assessment of large-scale data sets of protein-

protein interactionsvon Mering C. et al. (2002)

Nature

אז איזה בעיות יש לנו?

תנאים שונים, פורמטים בעיות בהשוואה:•שונים, השוואה מול מאגר ידוע.

לצורך ההשוואה נבחרו קשרים בינארים.•

אינטראקציות נתמכו 80,000 מתוך 2,400רק •ביותר משיטה אחת.

השיטות עדין לא הגיעו לרוייה.•

•False positives.

בעיתיות לסוג מסוים של קשרים.•

Counting interactions

פיזור האינטראקציות ע"פ תפקידי החלבונים

Transport and sensing

חלוקה ע"פ רמות ביטוי חלבונים

חלוקה ע"פ מיקום בתא

חלוקה ע"פ מיקום בתא

סיכום ההשוואה

הערכה שפחות משליש מהאינטראקציות •ידועות.

.false positives 50%הערכה של יותר מ •

שילוב שיטות מגדיל את הדיוק.•

בעיתיות בשימוש בתוצאות ממחקר אחד.•

Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.

Rual, J. et al (2005). Nature 437

קשרים בין חלבונים באדם

מהלך הניסוי

- Human ORFeome v1.1מבוסס על ה • 22,000 (הערכה היא כי בגנום ORFs 8,100בערך

גנים מקודדים)..8,100X8,100בדיקת אינטראקציות בין כל זוג- • אינטראקציות במרחב 4,000בספרות ידוע על כ •

תוצאות .2,750המדגם, בניסוי נמצאו כ משופר.Y2Hשימוש ב •).55% גבוה (reproducibilityאחוז • - מדגם מהתוצאות נבדק False positivesמעט •

בשיטה נוספת* והראה תוצאות טובות.*Co-affinity purification GST pull down assay in human 293 cells.

חפיפה

אדום - מחקר

כחול - ספרות

משמעות ביולוגית

קורלציה בביטוי של גנים שהראו אינטראקציה.•

upstreamגני האינטראקציות עשירים ברצפי •משותפים ששמורים באדם עכבר חולדה

וכלב.

.Gene Ontology termsאותן מילות מפתח. •

אינטראקציות בין חלבונים שהתפתחו באותו •שלב באבולוציה.

גרף האינטראקציות (ספרות + מחקר)

אדום - מחקר

כחול - ספרות

נטייה ל"שכונות הומולוגיות"

ירוק - אקראיחום - מחקר

טופולוגיה של הגרף

– ים אחרים.iteractomeדומה ל •

.Hubsמספר קודקודים בעלי דרגות גבוהות – •

).No high clusteringקשה לקבץ (•

•Subgraphs – complexes - - 102 172 מתוך זוהו ככאלה שבהן מילה מפתח אחת מופיעה

מרנדומלית).10ביתר (פי

סיכום המחקר

הערכה כי נמצא אחוז מהאינטראקציות •הקיימות באדם.

ניתן ליחס משמעות ביולוגית לחלבונים שיש •בניהם קשר או שנמצאים באותו תת גרף.

מפתח להבנת מחלות.•

Proteome survey reveals modularity of the yeast cell

machinery

Gavin AC et al. (2006)

Nature.

על המחקר

•TAP•6,466 ORF כל ה - ORF.הידועים בשמר . + )MIPS( מהקומפלקסים הידועים 73%נמצאו • החסרים – תנאים פיזיולוגים שונים או הפרעה של הסימון.74•עם התקדמות הבדיקות פחות חלבונים חדשים זוהו – רוייה.• מהקומפלקסים המוכרים זוהו מספר פעמים – כיסוי 64%•

נרחב של קומפלקסים ידועים.•Socio affinity index אינדקס שמכמת את הנטייה של זוג –

חלבונים להיקשר זה לזה. מבוסס על מספר הפעמים שכל חלבון נלכד ולכד בנפרד מול מספר הפעמים שהאינטראקציה

הספציפית אובחנה.

Coreנוכח ברוב האיזופורמים –

Attachment.נוכחים רק בחלק מהאיזופורמים –

Modules 3.3 – מספר חלבונים שתמיד ביחד. (בממוצע מתחברים עם )1.6ליבות, בסטייה של

פונקציות מזוהות נמצאים או חסרים ביחד

Y2Hקישור ב cell cycle ביטוי משותף ב

מודולים שונים מצטרפים במיקומים שונים בתא

Attachments מספקים פונקציה מסוימת

מודולים וליבות מתחברים באותם איזורים פונקציונלים

Core module cross talk

מיפוי פנטופים לקומפלקסים

סיכום המחקר

המחקר הינו מקיף תחת השלבים השונים של • . cell cycleה

חלוקת האינטראקציות למודולים הראתה •משמעות ביולוגית.

מיעוט ה"ליבות" קטן יחסית לתהליכים התאיים •אבל הוא מוסבר באמצעות הרכבת "תוספות"

שונות.יש מקום להמשיך למפות את האינטראקציות •

תחת תנאים פיזיולוגים שונים.

אינטראקצית על הרשת

/http://string.embl.deנלקח מ

אתר נוסף של אינטראקציות: www.ebi.ac.uk/intact

Attachments specify a particular function

מבט קדימה

גרפים לא סטטים – מתי ואיפה •האינטראקציות, רגולציה.

מאגרי מידע זמינים ועם כל הנתונים.•

יצוב רפרנס אמין.•

הנבת פירות.•

מקורות

• Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet;17(6):346-52.

• von Mering C. et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403.

• Gavin AC et al. (2006) Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature.

• Rual, J. et al. (2005). Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437, 1173 - 1178