限制性内切酶片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism

一 基本原理 RFLP 标记是发展最早的 DNA 标记技术。 RFLP

是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

限制性核酸内切酶（ restriction end nuclease ）能够识别 DNA 双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。

在同源染色体相应的 DNA 区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的 DNA 探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组 DNA 碱基序列 组 成是否存在差异。

这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示 DNA 碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（ Restriction Fragment Length Polymorp hism ，缩写为 RFLP ）技术。

这一技术主要包括三大步骤： 　　 1 、靶 DNA 的准备 先将基因组 DNA 抽提

出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA ， 将酶解出来的具有各种长度的 DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将 DNA 片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（ Southern b1ot ）转移，并在 80℃ 烘烤 或用长波紫外线照射，将 DNA 固定在膜上。

　　

二 RFLP 技术的基本步骤

2 、核酸探针的标记 将准备作为探针的 DNA 片段纯化（这些 DNA 片段可以是基因组 DNA 的 一个片段，或是 cDNA ，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如 α － 32p ）或非放射 性元素（如 Dig － dUTP 等）标记，经纯化后再用。

探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA 获得DNA 片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA 的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化 DNA 片段的过程称做 DNA克隆 ,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。　

3 、杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交 的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分 析。

三 RFLP 技术的应用实例

1. paternity Case Let's use RFLP technology to determine if Jack is the father of Jill's child named Payle. In this scenario, DNA was extracted from white blood cells from all three individuals and subjected to RFLP analysis. The results are shown below:

2.Disease Status

RFLPs are known for CF 囊性纤维化 ( 属遗传性胰腺病 ) and so it would be easy to determine if a person were homozygous wild-type (wt), heterozygous "carrier", or homozygous disease alleles and thus have CF.

if both parents were heterozygous, they could have children with any of the three genotypes, though heterozygous children would be twice as likely as either of the homozygous genotypes.

3. Genetic Mapping

To calculate the genetic distance between to loci, you need to be able to observe recombination. Traditionally, this was performed by observing phenotypes but with RFLP analysis, it is possible to measure the genetic distance between two RFLP loci whether they are a part of genes or not.

In this example, 70% of the progeny were produce from parental genotype eggs and 30% were produced by recombinant genotype eggs. Therefore, these two RFLP loci are 30 centiMorgans apart from each other.

四 RFLP 技术的优点及注意的问题 1 、 RFLP 技术的优点 　　第一，标记数目可以是无限的： RFLP 揭

示的是 DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的。

　　第二，大部分标记为共显性：表现 RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因 (其显性 )。遵循孟德尔式遗传，因而 RFLP 标记图也可用传统的基因标图方法来构建。

第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA 分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。

　　第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的 RFLP 图谱。

2 、在做 RFLP 分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：

　　第一，作为检测对象的 DNA 分子必须保持大分子，在抽提 DNA 的过程中避免人为地将 DNA 分子 机械性切割成小片段的 DNA ，否则最终显示的 RFLP 图谱可能是一种假象；

　　第二，在用限制性内切酶消化大分子 DNA时，要使 DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ；

第三，被消化的 DNA浓度不能太高； 第四，电泳时要用低压电泳； 第五，杂交前探针必须充分变性； 第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶 DN

A 间序列互补的程度和G、 C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件；

第七，作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。

五 RFLP 在作物遗传育种上的应用 1 、分子水平上选择目的性状 2 、 RFLP遗传标记与作物数量性状基因定位 3 、进行品种或品系遗传纯度的测定 4、改良回交育种技术 5、建立不相容的作物间的遗传关系，进行作

物间基因组同源性的测定