LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK ANALISIS DAN APLIKASI ENZIM

PENENTUAN AKTIVITAS DAN KINETIKA ENZIM ALANIN

AMINOTRANSFERASE PADA HOMOGENAT HATI TIKUS

Penyusun :

Indriani Wisnu Susanto Panjaitan

1706121294

Dosen Pengampu :

Dr. dr. Ninik Mudjihartini, MS

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS INDONESIA

JAKARTA

2018

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL i

DAFTAR ISI ii

BAB I PENDAHULUAN 1

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Tujuan Praktikum 2

1.2 Dasar reaksi 2

BAB II ISI 3

2.1 Enzim 3

2.2 Enzim alanine aminotransferase (ALT) 4

2.3 Hati 5

BAB III METODE 7

3.1 Alat dan Bahan 7

3.2 Cara Kerja 7

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 11

4.1 Hasil10

4.2 Pembahasan 17

BAB V PENUTUP 21

DAFTAR PUSTAKA 22

ii

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim adalah suatu protein katalis yang berperan penting dalam metabolisme

dengan mempercepat terjadinya reaksi. Tanpa keberadaan enzim, reaksi biokimia

berjalan sangat lambat, bahkan dapat dikatakan tidak terjadi reaksi. Fungsi suatu enzim

ialah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun luar sel.

Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10-11 kali lebih cepat daripada apabila reaksi

tersebut dilakukan tanpa katalis. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara

lain suhu, derajat keasaman (pH), konsentrasi enzim dan substrat, kofaktor, dan

inhibitor. Enzim terdistribusi di tempat-tempat tertentu di dalam sel yang ditentukan

sesuai dengan golongan dan fungsinya.1

Salah satu golongan enzim yang biasa digunakan sebagai biokatalis adalah

golongan transferase. Enzim golongan ini umum digunakan dalam menilai penyakit hati

seperti alanine aminotransferase (ALT) atau secara spesifik adalah serum glutamate

piruvat transaminase (SGPT). Enzim ALT (alanine aminotransferase) berfungsi untuk

mengkatalisis pemindahan gugus amin dan alanin ke α-ketoglutarat menjadi piruvat dan

glutamat yang berperan pada proses glukoneogenesis dengan memfasilitasi sintesis

glukosa dari bahan non karbohidrat. Proses ini diperantarai oleh adanya koenzim

piridoksial fosfat (Vitamin B6) yang berubah menjadi piridoksamin. Enzim ALT adalah

enzim yang dibuat dalam sel hati (hepatosit), jadi lebih spesifik untuk penyakit hati

dibandingkan dengan enzim lain.2

Hati merupakan kelenjar metabolik terbesar yang penting dalam tubuh, beratnya

rata-rata sekitar 1500 gram atau 2,5% berat badan pada orang dewasa normal. Hati

memiliki peran dalam pertahanan tubuh yang kaitannya dengan proses detoksifikasi

toksin, obat, serta senyawa yang dianggap asing oleh tubuh. Pada pemeriksaan fungsi

hati, analit atau zat yang diperiksa dapat berupa produk metabolisme sel hati (hepatosit).

Sel hepatosit hati yang bekerja untuk fungsi sepesifik tersebut diantaranya adalah sel

Kuppfer. Sel Kuppfer merupakan sistem retikoloendotel dan mempunyai fungsi utama

untuk menelan bakteri dan benda asing lain dalam tubuh. Dengan demikian, hati

merupakan salah satu organ yang berperan untuk menangani infeksi bakteri. Salah satu

1

pemeriksaan fungsi hati yaitu pemeriksaan aktivitas dan kinetika enzim alanine

aminotransferase (ALT) pada homogenat hati tikus.3

1.2 Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk memahami konsep aktivitas spesifik dari enzim

glutamate-piruvat transminase (GPT) atau enzim alanine transaminase (ALT) dan

mengetahui total protein pada homogenat hati tikus. Selain itu, praktikum ini juga

bertujuan untuk menetapkan nilai Km dan Vmax pada reaksi enzimatik enzim ALT.

1.3 Dasar Reaksi

Gambar 1. Reaksi konversi glutamat dan piruvat menjadi alanin yang bersifat bolak-balik2

Eznim ALT mengkatalisis pemindahan amino dari alanin ke α-ketoglutarat.

Dimana alanin berasal dari piruvat dan oksaloasetat oleh transaminasi dari glutamat.

Produk dari reaksi transaminase berisifat reversibel (bolak-balik) menjadi piruvat dan

glutamat. Produk berupat piruvat akan menghasilkan warna coklat yang diamati

absorbansinya pada panjang gelombang 55 5 nm.

2

BAB II

ISI

2.1 Enzim

Enzim merupakan substansi penting dalam setiap reaksi kimia dalam sel. Oleh

karena enzim dapat mempercepat reaksi kimia, berarti enzim merupakan reaksi katalis.

Enzim merupakan katalisator organik dan dibuat dalam sel makhluk hidup sehingga

enzim disebut juga biokatalisator. Enzim juga memiliki sifat diantaranya selektif,

karena enzim hanya dapat bekerja pada substrat tertentu.1

Suatu enzim berfungsi sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam

sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10-11 kali lebih cepat

daripada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Berfungsi sebagai katalis yang

sangat efisien, disamping itu mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Enzim dapat

menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan

energi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan energi/mengeluarkan energi

(eksergonik).

Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat zat yang

bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi. Percepatan terjadi karena

enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah

terjadinya reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis

enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini

disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Kerja enzim

dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain suhu, derajat keasaman (pH), konsentrasi

enzim dan substrat, kofaktor, dan inhibitor.1

Enzim tersusun dari protein, maka enzim sangat peka terhadap suhu. Suhu yang

terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein. Suhu yang terlalu rendah dapat

menghambat reaksi. Pada umumnya suhu optimum enzim adalah 30-40℃. Kebanyakan

enzim tidak menunjukkan reaksi jika suhu turun sampai 0℃, namun enzim tidak rusak,

bila suhu normal maka enzim akan aktif kembali. Enzim tahan pada suhu rendah,

namun rusak diatas suhu 50℃. Jika berada pada suhu yang tidak optimum akan

menyebabkan perubahan bentuk dan enzim tidak bekerja secara optimal atau

strukturnya akan mengalami kerusakan serta kehilangan fungsinya. Enzim juga sangat

3

terpengaruh oleh pH. Perubahan pH dapat memengaruhi perubahan asam amino pada

sisi aktif enzim sehingga menghalangi sisi aktif berkombinasi dengan substratnya. pH

optimum yang diperlukan berbeda-beda tergantung jenis enzimnya. Agar reaksi berjalan

optimum, maka perbandingan jumlah antara enzim dan substrat harus sesuai. Jika enzim

terlalu sedikit dan substrat terlalu banyak reaksi akan betjalan lambat bahkan ada

substrat yang tidak terkatalisasi. Karena semakin banyak jumlah enzim maka reaksi

akan berjalan semakin cepat. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh molekul lain seperti

inhibitor. Seringkali enzim dihambat oleh suatu zat yang disebut inhibitor dengan cara

menurunkan aktivitas enzim secara langsung.

2.2 Enzim alanine aminotransferase (ALT)

ALT (alanin aminotransferase) merupakan enzim aminotransferase yang

berkaitan dengan kerusakan hati. Kerusakan sel atau degenerasi sel menentukan

tingginya angka enzim-enzim yang dilepas dari hati yang rusak. Enzim ini berperan

dalam proses katalisa kelas transferase dengan memindahkan gugus amino dari alanin

ke α-ketoglutarat dengan produk dari reaksi transaminase yang reversibel yaitu piruvat

dan glutamat dan berperan pada proses glukoneogenesis dengan memfasilitasi sinsetis

glukosa dari bahan non karbohidrat. Enzim ALT juga befungsi dalam pembentukan

asam-asam amino yang dibutuhkan untuk menyusun protein di hati. 2

Dua jenis aminotransferase yang sering digunakan dalam diagnosis klinik

kerusakan sel hati adalah aspartat aminotransferase (AST) yang disebut SGOT (serum

glutamic oxaloasetic transaminase) dan alanine aminotransferase (ALT) yang disebut

juga sebagai SPGT (serum glutamic pyruvic transaminase). AST atau SGOT adalah

enzim yang sebagian besar terdapat dalam otot jantung dan hati, sebagian lagi

ditemukan dalam otot rangka, ginjal, dan pankreas. Sedangkan ALT atau SPGT adalah

suatu enzim yang ditemukan pada sel-sel hepar dan sangat efektif dalam mendiagnosa

kerusakan hepatoseluler.

Jika rerjadi kerusakan hati, enzim ALT akan keluar dari sel hati menuju sirkulasi

darah. Kadar enzim ALT normal pada manusia adalah 5-35 U/L dimana pada pria

sebesar 30 U/L dan pada wanita sebesar 10 U/L. Sedangkan pada tikus, kadar normal

ALT sebesar 15-84 U/L. Pada kerusakan hati yang disebabkan oleh keracunan atau

infeksi akan meningkatkan 20 hingga 100 kali batas normal. Aktivitas enzim ALT akan

4

berada pada puncaknya pada hari ke 7 hingga 12 setelah hati mengalami kerusakan, dan

akan menjadi normal kembali dalam waktu 3-5 minggu.3

Enzim ALT berfungsi untuk mengkatalisis pemindahan amino dari alanin ke α-

ketoglutarat. Produk dari reaksi transaminase adalah reversibel, yaitu piruvat dan

glutamat. Enzim ALT memerlukan piridoksal fosfat (Vitamin B6) sebagai kofaktor.4 Zat

ini sering ditambahkan ke reagen pemeriksaan untuk meningkatkan pengukuran enzim-

enzim ini seandainya terjadi defisiensi vitamin B6 seperti hemodialisis dan malnutrisi.

Aminotransferase tersebar luas di tubuh, tetapi terutama banyak dijumpai di hati, karena

peran penting organ ini dalam sintesis protein dan dalam menyalurkan asam-asam

amino ke jalur-jalur biokimiawi lain. Hepatosit pada dasarnyaa adalah satu-satunya sel

dengan konsentrasi ALT yang tinggi, sedangkan ginjal, jantung, dan otot rangka

mengandung kadar sedang. ALT dalam jumlah yang lebih sedikit dijumpai di pankreas,

paru, limfa, dan eritrosit.5

2.3 Hati

Hati merupakan kelenjar metabolik terbesar yang penting dalam tubuh, beratnya

rata-rata sekitar 1500 gram atau 2,5% berat badan pada orang dewasa normal. Hati

memiliki peran dalam pertahanan tubuh yang kaitannya dengan proses detoksifikasi

toksin, obat, serta senyawa yang dianggap asing oleh tubuh. Pada pemeriksaan fungsi

hati, analit atau zat yang diperiksa dapat berupa produk metabolisme sel hati (hepatosit).

Sel hepatosit hati yang bekerja untuk fungsi sepesifik tersebut diantaranya adalah sel

Kuppfer. Sel Kuppfer merupakan sistem retikoloendotel dan mempunyai fungsi utama

untuk menelan bakteri dan benda asing lain dalam tubuh.6 Dengan demikian, hati

merupakan salah satu organ yang berperan untuk menangani infeksi bakteri. Hati juga

menseksresikan kolesterol dan bilirubin sebagai produk penguraian yang berasal dari

perombakan sel darah merah. Seperti ukurannya yang besar, hati juga mempunyai

peranan besar sebagai berikut :

a. Fungsi pembentukan dan ekskresi empedu

Hal ini merupakan fungsi utama hati. Hati mengekskresikan sekitar satu liter empedu

setiap hari. Garam empedu penting untuk pencernaan dan absorbsi lemak dalam usus

halus.

5

b. Fungsi metabolik

Hati berperan penting dalam metabolisme karbohidrat, lemak, protein, vitamin dan

juga memproduksi energi. Hati mengubah amonia menjadi urea untuk dikeluarkan

melalui ginjal dan usus.

c. Fungsi pertahanan tubuh

Hati mempunyai fungsi detoksifikasi dan fungsi perlindungan. Fungsi detoksifikasi

dilakukan oleh enzim-enzim hati yang melakukan oksidasi, reduksi, hidrolisis, atau

konjugasi zat yang kemungkinan membahayakan dan mengubahnya menjadi zat

yang secara fisiologis tidak aktif. Fungsi perlindungan dilakukan oleh sel kupfer

yang terdapat di dinding sinusoid hati.

d. Fungsi vaskuler hati

Pada orang dewasa jumlah aliran darah ke hati diperkirakan mencapai 1500 cc tiap

menit. Hati berfungsi sebagai ruang penampung dan bekerja sebagai filter karena

letaknya antara usus dan sirkulasi umum.7

Sel hepatosit yang mengalami luka akan mengeluarkan enzim berupa

aminotransferase. Aminotransferase merupakan enzim yang dapat digunakan untuk

mendiagnosis kerusakan hati baik inflamasi maupun nekrosis. Peningkatan kadar

aminotransferase dapat menunjukan keabnormalan pada tubuh. Kenaikan kadar enzim

tersebut dapat menandakan pasien mengalami infeksi bakteri, virus, bahkan penyakit

autoimun. Enzim aminotransferase tersebut berupa alanin aminotransferase (ALT) atau

secara spesifik adalah serum glutamate piruvat transaminase (SGPT).8

6

BAB III

METODE

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat yang digunakan pada praktikum yaitu tabung reaksi, pH meter, pipet mikro,

kuvet, penangas air, beaker glass, tissue homogenizer, spektrofotometer UV-Vis,

sentrifugator, neraca analitik, rak tabung reaksi, labu ukur, dan batang pengaduk

3.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan pada praktikum yaitu hati tikus, larutan NaCl 0,9%,

larutan dapar fosfat 0,1 M pH 7,4, larutan standar piruvat 2 mmol/L, larutan dapar

substrat yang mengandung 2mM asam α-ketoglutarat dan 100 mM L-alanin pH 7,4,

larutan pewarna: larutan 1,5 mM 2,4-dinitrofenilhidrazin, larutan NaOH 0,4 N, pereaksi

biuret, larutan standar albumin sapi 0,14 g/ 5 mL, dan larutan PBS (phosphate buffer

saline).

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pembuatan Larutan

3.2.1.1 Larutan NaCl 0,9 %

Sebanyak 0,9 gram NaCl ditimbang dan dilarutkan ke dalam akuades sebanyak 100 mL

3.2.1.2 Larutan NaOH 0,4 N

Sebanyak 1,6 gram NaOH ditimbang dan dilarutkan ke dalam akuades sebanyak 100

mL

3.2.1.3 Larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin

Sebanyak 0,0297 gram serbuk 2,4-dinitrofenilhidrazin ditimbang dan dilarutkan dalam

100 mL HCl 1 N

3.2.1.4 Larutan standar piruvat 2 mmol/L

Sebanyak 0,022 gram serbuk piruvat ditimbang dan dilarutkan dalam PBS 0,1 M pH 7,4

hingga 100 mL ke dalam labu ukur.

3.2.1.5 Larutan dapar substrat yang mengandung 2mM asam α-ketoglutarat dan

100 mM L-alanin pH 7,4

7

Sebanyak 0,809 gram substrat L-alanin ditimbang dan ditambahkan dengan 0,0308

gram α -ketoglutarat, kemudian dilarutkan dalam PBS 0,1 M hingga volume mencapai

100 mL. Setelah itu larutan tersebut diatur pH nya menjadi 7,4.

3.2.2 Persiapan Sampel

3.2.2.1 Pembuatan homogenat hati tikus

Jaringan hati tikus ditimbang dan ditambahkan larutan NaCl 0,9% ke dalam

setiap jaringan dengan perbandingan 100 mg : 100 mL. Kemudian jaringan hati tikus

dilumatkan dengan tissue homogenizer sampai larutan homogen. Setelah homogen,

kedua suspensi disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 2000 rpm. Supernatan

diambil untuk dilakukan analisis selanjutnya.

3.2.3 Pelaksanaan Praktikum

3.2.3.1 Pembuatan kurva standar ALT

Kurva standar ALT dibuat dengan pengenceran larutan standar ALT menjadi

beberapa konsentrasi. Kurva standar dibuat dengan menggunakan aktivitas enzim ALT

sebagai sumbu x dan serapan (A) sebagai sumbu y. Seluruh larutan dipipet ke dalam

tabung reaksi sesuai dengan bahan yang terdapat pada tabel berikut :

Tabel 1. Komposisi larutan standar ALT

Tabung 1 2 3 4 5 6Aktivitas ALT (U/L) 0 14 32 51 69 92Larutan standar piruvat (mL) 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05Larutan dapar substrat GPT (mL) 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05

Larutan dicampur dengan baikPereaksi warna (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Larutan dicampur dan didiamkan selama 20 menitLarutan NaOH 0,4 N (µL) 1 1 1 1 1 1Larutan dicampur dan didiamkan selama 5-20 menit lalu serapan dibaca pada panjang

gelombang 500-560 nm

3.2.3.2 Pengukuran aktivitas enzim ALT

Aktivitas enzim ALT diukur dengan memimpetkan komposisi bahan yang

sesusai pada tabel berikut :

Tabel 2. Komposisi larutan untuk pengukuran aktivitas enzim ALT

Tabung Blanko UjiDapar substrat 0,5 mL 0,5 mL

8

Masing-masing tabung diinkubasi pada penangas 370C selama 5 menitBahan uji (homogenat hati) - 0,1 mL

Masing-masing tabung diinkubasi pada suhu 370C tepat 30 menitPereaksi warna 0,5 mL 0,5 mLBahan uji (homogenat hati) 0,1 mL -

Masing-masing tabung didiamkan pada suhu ruang selama tepat 20 menitLarutan NaOH 5 mL 5 mL

Larutan dihomogenkan dan serapannya dibaca pada panjang gelombang 500-600 nm setiap 5 menit

3.2.3.3 Penetapan kadar protein (Weischelbaum)

Kadar ptotein total dari keseluruhan jaringan diukur dengan metode

Weischelbaum dengan pereaksi biuret. Pembuatan larutan untuk pengukuran kadar

protein terdapat pada tabel berikut :

Tabel 3. Komposisi pembuatan larutan uji Weischelbaum

Tabung Bahan Uji Standar BlankoBahan uji (mL) 0,1 - -Larutan standar (mL) - 0,1 -Akuades (mL) - - 0,1Larutan NaCl 0,9% (mL) 4,9 4,9 4,9Pereaksi Biuret (mL) 5 5 5

Masing-masing tabung diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit kemudian serapannya dibaca pada panjang gelombang 555 nm

3.2.3.4 Penentuan nilai Km dan Vmax

Penentuan nilai Km dan Vmax dilakukan dengan menggunakan variasi

konsentrasi substrat sehingga dapat disubstitusikan ke persamaan Lineweaver-Burk.

9

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Pengukuran kurva standar ALT

Tabel 4. Nilai absorbansi pada pengukuran kurva standar ALT

Aktivitas ALT (U/L) Absorbansi 1 Absorbansi 2 Absorbansi

Rata-rataAbsorbansi

Koreksi0 0 0 0 014 0,151 0,152 0,152 0,04832 0,198 0,201 0,200 0,09651 0,226 0,227 0,227 0,12369 0,273 0,271 0,272 0,16892 0,303 0,306 0,305 0,201

Absorbansi blanko = 0,104

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.00214264112903226 x + 0.0138664314516129R² = 0.980870928227022

Kurva Standar Enzim ALT

Aktivitas enzim ALT (U/L)

Abs

orba

nsi

Grafik 1. Kurva standar enzim ALT

4.1.2 Pengukuran aktivitas enzim ALT

Tabel 5. Hasil pengamatan aktivitas enzim ALT

Sampel Blanko Absorbansi 1

Absorbansi 2 Rerata Koreksi Aktivitas

Enzim

10

ALT (U/L)

Homogenat hati tikus 0,228 0,373 0,375 0,374 0,146 60

Berdasarkan kurva standar ALT, diperoleh persamaan garis lurus y = 0,002x + 0,026

dimana y adalah absorbansi dan x adalah aktivitas enzim (U/L). Maka perhitungan

aktivitas enzim ALT (U/L) dapat dihitung sebagai berikut :

Aktivitas Enzim ALT (UL )= Absorbansi−slope

intercept

Aktivitas Enzim GPT ( unitL )= Absorbansi−b

a

Aktivitas Enzim GPT ( unitL )=0.146−0,026

0,002

Aktivitas Enzim GPT ( unitL )=60 U/L

4.1.3 Penetapan kadar protein (Weischelbaum)

Tabel 6. Perhitungan serapan dalam menetapkan kadar protein hati

Tabung AbsorbansiAbsorbansi

rata-rataAbsorbansi terkoreksi

Uji 1 0,091 0,090 0,036Uji 2 0,089Standar 1 0,177 0,179 0,125Standar 2 0,18Blanko 0,054 0,054 0,054

Perhitungan kadar protein:

Kadar protein( gL )= Au−Ab

As−Abx 28 g

Lbahanuji

¿ 0,0360,125

x 28

= 8,096 g/L

Aktivitas spesifik enzim ALT :

Aktivitas spesifik ALT= Aktivitas enzim ALTKadar protein

11

¿ 60U /L8 ,096 g /L

= 7,411 U/g

4.1.4 Pengaruh waktu inkubasi terhadap kecepatan reaksi ALT

4.1.4.1 Pengukuran kurva standar piruvat

Tabel 7. Nilai absorbansi pada pengukuran kurva standar piruvat

Konsentrasi Piruvat (mM)

Absorbansi 1

Absorbansi 2

Absorbansi rata-rata

Absorbansi terkoreksi

0 (blanko) 0,358 0,278 0,318 0,0000,2 0,392 0,382 0,387 0,0690,4 0,434 0,465 0,450 0,1320,6 0,511 0,520 0,516 0,1980,8 0,558 0,539 0,549 0,2311 0,586 0,573 0,580 0,262

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2-0.05

-4.16333634234434E-17

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

f(x) = 0.265428571428571 x + 0.0156190476190476R² = 0.975498039865795

Kurva Standar Piruvat

Konsentrasri piruvat (mM)

Abs

orba

nsi

Grafik 2. Kurva standar piruvat

4.1.4.2 Pengaruh waktu inkubasi terhadap kecepatan reaksi enzim ALT

Tabel 8. Perlakuan waktu inkubasi terhadap kecepatan reaksi enzim ALT

Waktu (menit) Blanko Uji 1 Uji 2 Absorbansi

rata-rataAbsorbansi koreksi

Konsentrasi piruvat (mM)

Kecepatan reaksi

(mM/menit)

12

10 0,436 0,596 0,591 0,594 0,158 0,535 0,053515 0,429 0,641 0,658 0,650 0,221 0,772 0,051520 0,430 0,613 0,621 0,617 0,187 0,646 0,0323

8 10 12 14 16 18 20 220.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

Pengaruh waktu inkubasi

Waktu inkubasi (menit)

Abs

orba

nsi

Grafik 3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap laju reaksi enzim ALT

Berdasarkan kurva standar piruvat, didapatkan persamaan garis lurus y = 0,2654x +

0,0156 dimana y adalah absorbansi dan x adalah konsentrasi piruvat (mM). Maka pada

menit ke-10, perhitungan konsentrasi piruvat adalah sebagai berikut :

Konsentrasi piruvat (mM )= Absorbansi−slopeintercept

Aktivitas Enzim GPT= Absorbansi−ba

Aktivitas Enzim GPT=0.158−0,01560,2654

¿0,535 mM

Perhitungan laju reaksi, contoh pada data waktu inkubasi 10 menit, dapat dilakukan sebagai berikut:

Lajureaksi= Konsentrasi piruvat (mM )waktu inkubasi (menit)

=0,535 mM10 menit

=0,0535 mM /menit

13

4.1.5 Penentuan Km dan Vmax enzim ALT

4.1.5.1 Pengukuran kurva standar piruvat

Pada pengukuran aktivitas enzim ALT, terlebih dahulu dilakukan pembuatan

kurva standar. Data hasil pengukuran absorbansi larutan standar piruvat pada beberapa

konsentrasi yang akan digunakan untuk pembuatan kurva standar dapat dilihat pada

tabel berikut.

Tabel 9. Nilai absorbansi pada pengukuran kurva standar piruvat

Konsentrasi Piruvat (mM) Absorbansi 1 Absorbansi 2 Absorbansi

rata-rataAbsorbansi terkoreksi

0 0,423 0,417 0,420 0,0000,2 0,498 0,531 0,515 0,0950,4 0,554 0,579 0,567 0,1470,6 0,677 0,619 0,648 0,2280,8 0,788 0,759 0,774 0,3541 0,802 0,813 0,808 0,388

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.20.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.450

f(x) = 0.399428571428571 x + 0.00195238095238093R² = 0.98415464248472

Kurva Standar Piruvat

Konsentrasi piruvat (mM)

Abso

rban

si

Grafik 4. Kurva standar piruvat

4.1.5.2 Penentuan kinetika enzim ALT

Tabel 10. Data absorbansi piruvat dengan perlakuan variasi konsentrasi substrat

14

Konsentrasi

substrat (mM)

Absorbansi 1

Absorbansi 2

Absorbansi rata-

rata

Konsentrasi

piruvat (mM)

10 0,309 0,311 0,310 0,77120 0,488 0,497 0,493 1,22830 0,600 0,592 0,596 1,48740 0,642 0,640 0,641 1,60050 0,677 0,680 0,679 1,69460 0,694 0,701 0,698 1,74170 0,716 0,732 0,724 1,80880 0,720 0,729 0,725 1,80990 0,726 0,727 0,727 1,814100 0,728 0,724 0,726 1,813

Berdasarkan kurva standar piruvat, didapatkan persamaan garis lurus y = 0,3994x +

0,002 dimana y adalah absorbansi dan x adalah konsentrasi piruvat (mM). Maka pada

konsentrasi substrat 10 mM, perhitungan konsentrasi piruvat adalah sebagai berikut:

Konsentrasi piruvat (mM )= Absorbansi−slopeintercept

Aktivitas Enzim GPT= Absorbansi−ba

Aktivitas Enzim GPT=0.310−0,0020,3994

¿0,771 mM

Tabel 11. Perhitungan nilai S. 1/S, v, dan 1/v

s 1/s v 1/v10 0,100 0,051 19,45120 0,050 0,082 12,21430 0,033 0,099 10,08640 0,025 0,107 9,37650 0,020 0,113 8,85660 0,017 0,116 8,61470 0,014 0,121 8,29880 0,013 0,121 8,29290 0,011 0,121 8,269100 0,010 0,121 8,275

15

0 20 40 60 80 100 120-0.02

1.04083408558608E-17

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Kurva Michaelis-Menten

[S] (mM)

v (m

M/m

enit)

Grafik 5. Kurva Michaelis-Menten

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.120,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

f(x) = 124.915278050853 x + 6.51431841407753R² = 0.987346214995169

Kurva Lineweaver-Burk

1/[S]

1/v

Grafik 6. Kurva Lineweaver-Burk

Berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk:

1v= Km

Vmax∙ 1

S+ 1

Vmax

Persamaan garis lurus hasil perhitungan kinetika enzim ALT:

y = 124,92x + 6,5143

16

sehingga

KmVmax

=124,92 dan 1Vmax

=6,5143

Maka diperoleh nilai Vmax untuk ALT yaitu:

V max=1

6,5143=0,154 mM /menit

Nilai Km untuk ALT adalah:

Km=124,92× V max=124,92 ×0,154=19,176

1.2 Pembahasan

Pada praktikum ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas spesifik dari enzim ALT,

total protein pada homogenat hati tikus, dan menetapkan nilai Vmax dan Km pada

reaksi enzimatik enzim ALT. Enzim ALT bekerja dengan mengubah substrat alanin

menjadi piruvat dengan memindahkan gugus amina dari alanin ke α -ketoglutarat. Uji

ini dilakukan dengan mengukur aborbansi larutan enzim ALT yang direaksikan dengan

substrat alanin dan pereaksi 2,4-dinitrofenilhidrazin pada keadaan lingkungan yaitu

suhu 37℃. Pengukuran aktivitas enzim ALT diperoleh dengan mengekstrapolasikan

aborbansi enzim ALT kepada kurva standar enzim ALT. Kurva standar dibuat untuk

menghubungkan antara nilai absorbansi dengan parameter kuantitatif yang telah

diketahui. Pada praktikum ini, kurva standar dibuat dengan menggunakan beberapa

variasi aktivitas enzim ALT antara lain 0, 14, 32, 51, 69, dan 92 U/L sebagai sumbu x

sedangkan nilai absorbansi digunakan sebagai sumbu y. Kurva standar enzim ALT

menghasilkan persamaan garis lurus yaitu y = 0,002x + 0,026. Berdasarkan hasil pada

tabel 4 diperoleh hasil aktivitas enzim ALT pada homogenat hati tikus sebesar 60 U/L.

Aktivitas enzim ALT pada homogenat tikus tinggi karena enzim ALT adalah enzim

intraseluler dan hati merupakan organ yang memproduksi enzim ALT.

Dalam mengukur aktivitas enzim dikenal istilah aktivitas spesifik enzim yang

didefinisikan sebagai besarnya aktivitas enzim per kadar protein total yang terkandung

dalam sumber enzim yang diuji. Satuan aktivitas enzim dinyatakan dalam unit aktivitas

yang menyatakan jumlah enzim yang mengubah 1 µmol substrat per menit pada kondisi

17

optimum. Semakin besar aktivitas spesifik enzim, maka makin besar tingkat kemurnian

suatu enzim.

Pengukuran aktivitas spesifik enzim ALT pada hati tikus dilakukan dengan

menetapkan kadar protein total yang terkandung di dalam homogenat hati tikus.

Penetapan kadar protein dilakukan dengan metode Weischelbaum menggunakan

pereaksi biuret. Penetapan kadar protein didasarkan pada pengukuran absorbansi secara

kualitatif dengan adanya pembentukan senyawa kompleks warna. Reaksi warna terjadi

karena adanya ion Cu2+ pada pereaksi biuret yang akan membentuk kompleks dengan

ikatan peptida pada protein. Dengan reaksi tersebut menyebabkan terbentuknya warna

ungu-violet yang diidentifikasikan dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 555 nm. Pada praktikum kali ini, hasil perhitungan kadar protein pada

homogenat hati tikus diperoleh sebesar 8,096 g/L bahan uji.

Selain pentingnya menentukan kadar protein, namun penentuan aktivitas enzim

per jumlah protein yang terkandung dalam campuran enzim yang diuji juga merupakan

faktor terpenting. Semakin besar suatu aktivitas spesifik enzim, maka semakin besar

tingkat kemurnian enzim. Pada praktikum kali ini diperoleh aktivitas spesifik enzim

ALT pada homogenat hati tikus sebesar 7,411 U/g.

Pada praktikum ini juga dilakukan perlakuan variasi waktu inkubasi untuk melihat

optimasi aktivitas enzim ketika berikatan dengan substratnya yang disebut kecepatan

reaksi. Jika dilihat pada tabel 8 diperoleh absorbansi tertinggi yaitu 0,772 pada waktu

inkubasi 15 menit. Hal ini menyatakan bahwa waktu optimum yang dibutuhkan oleh

enzim ALT adalah pada menit ke-15 untuk membentuk produk dengan hasil yang lebih

besar dengan substrat alanin dan alfa-ketoglutarat yaitu dengan laju reaksi sebesar

0,0535 mM/menit. Selain itu kondisi di luar waktu optimum menyebabkan penurunan

aktivitas enzim dengan cepat bahkan kehilangan aktivitas katalitiknya.

Persamaan garis Michaelis-menten menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat

yang rendah, hanya sedikit substrat yang menempati situs katalitik ini sehingga sedikit

pula komplek ES yang terbentuk. Penambahan substrat akan menyebabkan banyaknya

substrat yang dapat berinteraksi dengan bagian pada enzim tersebut. Dengan demikian,

kompleks ES yang terbentuk akan semakin banyak dan laju reaksi enzimatik juga akan

meningkat. Pada penentuan kinetika enzim diawali dengan pembuatan kurva standar

piruvat. Dalam melihat reaksi enzimatik, hal yang diukur adalah produk sehingga kurva

18

standar diperlukan untuk menghubungkan antara absorbansi dan konsentrasi produk

(piruvat). Pada kurva standar piruvat diperoleh persamaan garis y = 0,3994x + 0,002

dimana x adalah konsentrasi piruvat (mM) dan sumbu y menyatakan absorbansi.

Berdasarkan tabel 10 dapat dilihat bahwa setelah dilakukan penambahan substrat

10-60 mM diperoleh absorbansi yang meningkat secara bertahap. Namun pada

penambahan substrat 70 mM terjadi penurunan aborbansi, begitu pula pada penambahan

subtrat 80, 90, dan 100 mM. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi

substrat alanin akan meningkatkan laju reaksi enzimatik pada enzim ALT. Jika diamati

pada grafik 5 yaitu kurva Michaelis-Menten menunjukkan konsentrasi substrat 70 mM

tidak naik namun membentuk garis parabola. Garis parabola ini mengindikasikan bahwa

pada garis tersebut penambahan substrat tidak lagi mampu untuk meningkatkan laju

reaksi atau kompleks ES pada konsentrasi substrat 70 mM sudah berada dalam keadaan

jenuh.

Pada kondisi dimana penambahan substrat tidak dapat meningkatkan laju reaksi

dan enzim telah mencapai laju reaksi maksimum maka dilakukan pengamatan pengaruh

konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim dapat dilakukan dengan memplot data

kinetik sebagai perbandingan terbalik dari laju reaksi (1/v) pada sumbu y dan

perbandingan terbalik konsentrasi (1/S) pada sumbu x. Persamaan ini dikenal sebagai

persamaan Lineweaver-Burk dan berbentuk sebagai grafik garis lurus. Persamaan garis

lurus Lineweaver-Burk dapat menghitung nilai Km dan Vmax. Km merupakan tetapan

keseimbangan reaksi enzimatik paruh pertama dan menunjukkan tingkat afinitas

substrat terhadap enzim sedangkan Vmax merupakan laju reaksi maksimum dimana

seluruh kompleks ES tidak dapat terbentuk lagi karena sistem sudah berada dalam

keadaan jenuh oleh penambahan substrat.

Hasil praktikum menunjukan bahwa nilai Vmax diperoleh sebesar 0,154

mM/menit. Hal ini menunjukan bahwa pada kecepatan maksimum, enzim alanin

aminotransferase dapat mengubah subtrat sebesar 0,154 mM/menit. Akan tetapi perlu

diperhatikan bahwa peningkatan konsentrasi substrat belum tentu meningkatkan

kecepatan laju reaksi, dimana pada saat enzim akan jenuh oleh substrat sehingga

kecepatan reaksinya teta yangsudah dijelaskan dengan kurva mendatar yang terdapat

pada teori Michaelis-Menten. Hasil praktikum ini juga menunjukkan nilai Km sebesar

19,176. Nilai Km yang diperoleh pada praktikum ini dapat dikatakan kecil sehingga

19

enzim alanin aminotransferase yang digunakan memiliki afinitas yang tinggi terhadap

substrat alanin. Dengan demikian keseimbangan reaksi lebih kearah pembentukan

komplek ES sehingga produk yang dihasilkan tinggi. Hal ini sejalan dengan penjelasan

mengenai nilai Km berbagai enzim yang sangat beragam, yaitu berkisar antara 10-1 dan

10-7. Enzim yang mempunyai nilai Km kecil menunjukan afinitas yang tinggi terhadap

substrat. Demikian pentingnya nilai Km ini sehingga dapat digunakan untuk

mengidentifikasi enzim sekalipun.

20

BAB V

PENUTUP

Kerja enzim sebagai katalisator dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, salah

satunya adalah konsentrasi substrat. Konsentrasi substrat ini akan mempengaruhi

kecepatan reaksi dari enzim. Pada praktikum yang telah dilakukan, diperoleh hasil kadar

protein total homogenat hati tikus yaitu 8,096 g/L dan aktivitas sepesifik enzim alanin

transferase sebesar 60 U/L. Dengan demikian, aktivitas spesifik enzim ALT adalah

7,411 U/g protein yang terkandung di dalam hati tikus. Pengukuran kinetika enzim

memiliki absorbansi tertinggi pada waktu inkubasi 15 menit dan waktu ini digunakan

untuk penetapan Km dan Vmax enzim ALT. Pada konsentrasi substrat 70 mM tidak

dapat meningkatkan laju reaksi dan enzim telah mencapai laju reaksi maksimum.

Perhitungan Km dan Vmax dapat dilakukan menggunakan kurva Lineweaver-Burk dan

diperoleh persamaan garis lurus y = 124,92x + 6,5143 dimana nilai Km pada enzim

ALT di organ tikus diperoleh sebesar 19,176 dan Vmax sebesar 0,154 mM/menit .

21

DAFTAR PUSTAKA

1. Joyce LeFever Kee, Pedoman Pemeriksaan Laboratorium & Diagnostik, Edisi 9,

EGC, Jakarta, 2007.

2. Sadikin, Mohammad.2002.Biokimia Enzim. Widya Medika: Jakarta

3. Soewoto, Hafiz et al. 2000. Biokimia eksperimen laboratorium. Widya Medika:

Jakarta

4. Sacher, Ronald A. dan McPherson, Richard A. 2002. Tinjauan Klinis Hasil

Pemeriksaan Laboratorium Edisi 11. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

5. Kosasih EN, Kosasih AS. 2008. Tafsiran Hasil Pemeriksaan Laboratorium Klinik,

Edisi 2, Karisma Publishing Group, Tangerang.

6. Giboney. P T. 2005. Midley Elevated Liver Transaminase Levels In The

Asymptomatic Patient. Am Fam Physician, 71(6) : 1105-10.

7. Guyton, Ac. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran diterjemahkan oleh Irawati

Setiawan. Jakarta: EGC. Hlm: 1103-1105, 1234-1237.

8. Widman FK. 1995. Tinjauan Klinis atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Edisi 9.

Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC : 331.

22