007 técnicas de dna recombinante.pdf
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06. Tcnicas de DNA recombinante
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Restriction enzymes
- Reconhecem sequencias especificas 4-6-8-10-12 pb- Designadas em relao a bactria ondo foi isolada
- Ao cortar o DNA podem gerar extremidades 3 ou 5
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Restriction enzymes
DNA molecules treated with REs giving 3 or 5 overhang can be put back again
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Restriction enzymes
DNA molecules treated with REs giving no overhang can also be put back again but a low frequency
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Separao eletroforetica de grandes molculas de DNAPulse field eletrophoresis
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Separation of yeast chromosomes
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Caratersticas essenciais:
- Capacidade de incorporara DNA exgeno- Capacidade de replicao autnoma- Locais nicos de corte por ER- Mecanismo de seleo (resistncia antibitico)
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Fcil purificao
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Plasmideo pBR322Seleo por resistncia a antibiticos Amp ou Tet
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Polylinker or Multiple Cloning Site (MCS)
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Seleo por B-galactosidase
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Blue-white plasmid selection
B-gal +
B-Gal -
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Promotores T7 e T3 no polylinker
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CsCl 2 Plasmid purification
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CsCl 2 Plasmid purification
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CsCl 2 Plasmid purification
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Electroporation
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Electroporation
GFP
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Phage DNA as vectors
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Lambda phage life cycles
Lysogeny
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Phage DNA replication and packaging
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Lambda vectors - insertion
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Lambda vectors - substitution
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Cosmid library preparation
Cosmid vectors
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Cosmid vectors
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Bacterial artificial chromosomes (BACs)
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Yeast artificial chromosome vector (YACs)
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Expression of recombinant proteins
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T7 polymerase activation of plasmid transcription
His-tagged fusion proteins
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His tagged fusion proteins
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Purification of HIS-tagged fusion proteins
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DNA libraries
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BibliotecaGenomicaCosmideo
Biblioteca Genomica BAC Digesto parcial
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Biblioteca Genomica BAC
Sau3A 5GATC 3BamHI 5GGATCC 3
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N di ti DNA l b lli
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Non-radioactive DNA labelling
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Labelling DNA ends
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Labelling DNA ends
Chromosome alking
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Chromosome walking
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cDNA libraries
Clonar mRNAs
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Isolamento de mRNA utilizandooligo dT e magnetic beads
mRNA - clula especfica
- tecido especfico- estdio de desenvolvimento- condio especfica
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Genomic e cDNA libraries
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Ratreiro de uma biblioteca de expresso
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Sequenciao do DNA
1. Mtodo qumico Maxam and Gilbert
2. Mtodo enzimtico - Sangres
- 500-800 pb max- Sequencia 1 cadeia de cada vez- DNA cadeia simples
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DNA sequencing gels
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DNA sequencing gels
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Random Shotgun cloning
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DNA de um Bac-recombinante
Digesto parcial
Clonagem numplasmideo em E.coli
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15(n)
1 2 3 4 5 6 7 87 8 9 10 11 12
9 10 11 12 13 14
3 4 5 6 7 8 9 105 6 7 8 9 10 11
10 11 12 13 14
7 8 9 10 11 12
3 4 5 6 7 8 9 10
10 11 12 13 14
10 11 12 13 14
Biblioteca do DNA do Bac
Clones individuais
Sequenciao autom ca DNA
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q
F
R
Fragmento
Sequenciao autom ca DNA
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q
Sequenciao autom ca DNA
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q
Sequenciao autom ca DNA
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q
Sequenciador autom co por capilar
Resultados ob dos no computador
R t d G
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Reconstruo do Genoma
1 3 4 5
5 6 7 8
7 8 9 10
10 11 12
12 13 14
11 12 13
1 3 4 5 9 10 11
18 19 20
20 21 22
22 23 24
21 22 23
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
14 15 16 17
15 16 17 18
Sequncia dos clonesIndividuais
Sequncia nal
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Identification of the ORF
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Northern Blot
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DNA microarrays
Arrayer
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Coleco de DNAs especficos para cada gene(cDNAs, ESTs, fragmentos)
Amplificao por PCR
Printing (glass slide)
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...........
...........
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Cada spot um DNA deum gene diferente
y
Inkjet technology 10000 spots/cm 2
DNA chips
DNA microarrays
Experincia:
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Experincia:
Clulas a crescer na condio
1 2
Gene expresso em 1
Gene expresso em 1 e2
Gene no espresso em 1 e2
Gene expresso em 2
Scanner
DNA microarrays: Computer analysis
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DNA microarrays: cluster analysis
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DNA microarrays: cluster analysis
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Ordenar os resultados do microarray em funo de alguma varivel
Experincia: fibroblastos em culturaretirar soro fetal durante 48 horasadicionar soro ao tempo 0 e recolher amostra de referncia (marcar verde)recolher amostras de cDNAs nos diferentes tempos (marcar vermelho)comparar com uma amostra de referncia (hibridar cada tempo com amostra de referncia)aplicar mistura ao microarray
Vermelho = aumento da expressoVerde = reduo da expressoPreto = sem alterao
Expression of different genes in different cells types
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DNA micro-arrays
Genes 12
(n)
Polymerase chain reaction (PCR)
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DNA footprint
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The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointlyto Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNAinterference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
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Prevent translationPromote mRNA degradation
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Endogenous micro RNAs control many aspects of gene expression
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The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007
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Mario R. Capecchi Sir Martin J. Evans Oliver Smithies
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007 was awarded jointly to Mario R.Capecchi, Sir Martin J. Evans and Oliver Smithies "for their discoveries of
principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells" .Photos: Copyright The Nobel Foundation
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