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MolekularbiologischeGrundlagen

Ulf Leser, Sommersemester 2008

Silke Trißl

Ulf Leser, Proseminar Bioinformatik, SoSe 2008 2

Überblick – Biologie

n Organismenn Aufbau von Zellen

– Prokaryoten und Eukaryoten

n Genom und DNAn Transkription

– DNA → RNA → Protein

n Proteinen Regulatorische und metabolische Netzwerken Human Genome Project

n 2. Teil: Überblick – Techniken


Organismen

Ursprünglicher Organismus

Protozoa(Einzeller) Tiere

Algen

EukaryotenProkaryoten

gram pos.Bakterien

Cyano-bakterien

Archaea

halophilMethano-bakterien

PflanzenPilze

Zeit


Aufbau von Zellen

n Prokaryoten– Ringförmiges Genom– kann Plasmide enthalten

n tragen auch Informationen (DNA)

n wichtig für das Klonieren

n Eukaryoten– Genom im Zellkern– besitzt noch weitere

Kompartementen Robosomenn Mitochondrienn Proteasomn Et.c


Funktion der DNA

n DNA: Träger von Erbinformationen– Codiert für funktionelle Produkte wie Proteine oder RNA

n Genom: Gesamtheit der DNA in einer Zelle– Sprich: alle Gene in einer Zelle

n Millionenfach kopiert – Ohne wesentliche Veränderung– Wird an Tochterzellen weitergegeben


Struktur der DNA

n DNA – Desoxyribonucleic acidn Doppelsträngig

– Komplementäre Basenn Adenin – Thymin (A – T)n Guanin – Cytosin (G – C)

n Allgemeiner Aufbau– Zuckerphosphat-Gerüst– Basen

n Besitzt Richtung– 5‘ → 3‘ (sprich: drei-Strich)

n Windet sich um sich selbst


Gen

n Abschnitt auf dem Genom– Vorlage zur Herstellung eines funktionellen Produkts

n Nur RNA oder weiter zum Protein

– Alle direkt daran beteiligten Sequenzenn 5‘ UTR, 3‘ UTR (Untranslatierte Region)

n Aber: Nur der Abschnitt zwischen Start- und Stopcodonwird in mRNA übersetzt

5‘

5‘

3‘

3‘

Enhancer Promotor

Startcodon Stopcodon

Vorlage für Primärtranskript

5‘ UTR 3‘ UTR

TATA

Intron Exon


Von der DNA zum Protein

n Transkription– Gen abschreiben– DNA → m(essenger)RNA– DNA ↔ RNA

n Doppel- ↔ einzelsträngign Thymin (T) ↔ Uracil (U)n Desoxyribose ↔ Ribose

n Translation– Übersetzen– mRNA → Protein– RNA ↔ Protein

n 3 Basen → 1 Aminosäuren Σ = 4 ↔ Σ = 20 „Central Dogma in Molecular Biology“


Transkription

n DNA → primäre mRNA– Durch RNA Polymerase

n Präprozessierung– poly-A-Schwanz am 3‘ Ende– ‚Cap‘-Struktur am 5‘ Ende– Entfernen der Introns und

zusammenfügen der Exonsn alternatives Splicen

– Unterschiedliche Exons können kombiniert werden

– Ergibt Proteine mit unterschiedlicher Funktion

n Transport der mRNA ins Cytoplasma

Nur bei Eukaryoten


Von der DNA zum Protein

n Transkription– Gen abschreiben– DNA → m(essenger)RNA– DNA ↔ RNA

n Doppel- ↔ einzelsträngign Thymin (T) ↔ Uracil (U)n Desoxyribose ↔ Ribose

n Translation– Übersetzen– mRNA → Protein– RNA ↔ Protein

n 3 Basen → 1 Aminosäuren Σ = 4 ↔ Σ = 20 „Central Dogma in Molecular Biology“


Translation

n Übersetzung – Nukleotidsequenz der mRNA – zu Aminosäuresequenz der Proteine

n Je 3 Basen (Codon) codieren für 1 Aminosäure

n Wie viele mögliche Kombinationen?– Triplett → 3 Stellen– 4 mögliche Buchstaben (A, T (U), G, C)– 43 = 64 mögliche Kombinationen– Aber nur 20 Aminosäuren

n Redundanz im genetischen Code


Aminosäuren

n 20 verschiedene Aminosäuren– Hydrophil (wasserliebend)– Hydrophob (wasserabstoßend)– Sauer (geladen, hydrophil)– Basisch (geladen, hydrophil)

n Redundanz im Genetischen Code

n Base Nr. 3: wobble– Kann häufig ausgetauscht

werden ohne Konsequenzen

hydrophil hydrophob sauer basisch


Redundanz im Code

Org1: AUU AGU UGG GAU AAA UUA GCUOrg2: AUA UCU UGG GAC AAG CUG GCCOrg3: AUC UCU UGG GAU AAG CUU GCGOrg4: AUU AGC UGG GAC AAA CUC GCAOrg5: AUC UCC UGG GAU AAG UUG GCU

Protein: Ile Ser Trp Asp Lys Leu Ala


Proteine Grundgerüst

n Synthese erfolgt am Ribosom– tRNA

n Besitzt Anticodonn Hat Aminosäure

n Einzelne Aminosäuren durch Peptidbindung verbunden– kovalente Verbindung

n Abfolge an Aminosäuren= Primärstruktur

mRNA

Ribosom

Anti-codon

Amino-säure

tRNA


Sekundärstruktur von Proteinen

n a-Helix– Wasserstoffbrücken

n ß-Faltblatt– Wasserstoffbrücken


Tertiärstruktur

n Tertiärstruktur: Räumliche Anordnung der Sekundärstrukturelemente

1b71 aus Protein Data Bank


Mutationen in DNA – Auswirkungen

n Stille Mutation – keine Auswirkung auf Protein

n Echte Mutation– Ersetzen von Aminosäuren

n durch Ähnliche– keine Auswirkung auf Struktur– keine Auswirkung auf Funktion

n durch ‚Unähnliche‘– Auswirkung auf Struktur– Verlust / Verbesserung der Funktion


Regulatorische Netzwerke

n Einflüsse regulieren die Transkription von Genen– Äußere (Chemische Stoffe, Temperaturen, Strahlung)– Innere (Stoffwechselprodukte)

n Gene haben einen unterschiedlich hohenExpressionslevel– Menge an vorhandener

mRNA– Ändert sich über Zeit

und Zellart


Metabolische Netzwerke

n Glykolyse– Umwandlung von Glukose

zu Pyruvat unter Engergiegewinnung

n Start-, Zwischen- und Endprodukte regulieren auch die Transkription

n Enzyme katalysieren die Reaktionen– Enzyme ⊆ Protein


Human Genome Project

n Begonnen 1986– Geplante Fertigstellung 2005 – Ziel: Finden aller Gene des Menschen

n Weltweite Kollaboration– 20 große Institutionen– In Deutschland: seit 1996 etwas 60 Mbp

n Fertiggestellt– Draft im Jahr 2000: (90% draft, 30% finished, 99.99%

accuracy)– Beinahe fertig 2001 (analyzed draft)– Wirklich fertig 2003


Menschliche Genom

n Menschen – Homo sapiens– ~ 3.100.000.000 bp (Basenpaare)

n Entspricht ~ 2 m DNA

– Verteilt auf n 22 Chromosomenn + 2 Geschlechtschromosomenn Länge: 50–250 Mbp

– ~ 25.000 Genen (war mal bei ~100.000)

– ~ 150.000 Proteine– ~ 500.000 Proteinformen


Menschliche Gene

n ~ 25.000 Gene– Niemand weis wirklich wie viele

n Länge zwischen 100bp und 2Mbp (Introns+Exons)n Durchschnittliche Länge der codierenden Region: 1400 bps

– Durchschnittliche Proteinlänge 447 Aminosäurenn Durchschnittliches Gen hat 9 Exonsn Nur wenige Prozent des menschlichen Genoms ist

kodierend– Rest: „junk“?– Viele Repeats, Transposons– Regulatorische Elemente– Pseudogene– Chromosomale Struktur: Zentromere und Telomere


gatcaattatagttgacttcagtcctgcctgattcatctccaaaaatgtagtctgcctgattcatctcccaaaaatgtagctccgcttaaaggagctttcaagttgggggtggtgggccattcagtgttgtcactaacagatgcatcttgtgggggtaaaatgtcccaaagtatcttttcttgcttatgttcataagggcgctggtctggaatgtgccacatctgttctcactctgccatggactcctggaccctctgtgtgtccctttgtatcctggtagcgagtgagtcctcatgatttatcatcctcatgctgggcctctgtatagatga

Genomsequenzierung

n Jedes Chromosom isolierenn Chromosom in kleine Stücke brechenn Jedes Stück DNA sequenzierenn Die einzelnen Stücke zu einem zum Chromosom

zusammenfügen (Assembly)


DNA schneiden

n Restriktionsenzyme– Erkennen Sequenzabschnitte

auf der DNA– Schneiden an der Stelle

n Blunt (gerader Schnitt)n Sticky (überhängende Enden)

n Länge der Erkennungssequenz steuert die DNA Fragmentgröße– 4 Basen → 256 bp Fragmente– 6 Basen → 4,000 bp Fragmente– 8 Basen → 65,000 bp Fragmente


Chromosome zerschneiden

n Chromosom mit einem ‚rare Cutter‘ behandeln– Erkennungssequenz 8 bp

n Enzym- und DNA Konzentration steuern, so dass– Nicht alle Stellen schneiden– In jedem Strang andere Stellen

n DNA Stücke voneinander trennen– jedes einzeln in Zellen klonieren

schneiden

klonieren

Chromosom

DNA Stücke

Hefezellen


Chromosomen zerkleinern

n YAC – Yeast ArtificialChromosome– Enthält < 1.000.000 bp

chromosomale DNA– Je YAC nur einen Abschnitt

n BAC – Bacterial ArtificialChromosome– < 250.000 bp erneut

geschnittene DNA

n Plasmid– < 4.000 bp– Wird in Bakterien eingebracht


Klonieren – cont. –

n Jedes Bakterium nimmt nur ein Plasmid aufn Ausplattieren der Bakterien

– Auf Nährbodenn Agarn Nährstoffen Antibiotikum

n Inkubieren (wachsen lassen)– E. coli: 37 °C, über Nacht

n Jede einzelne Bakterie wächstzu einer sichtbaren Kolonie (Klon)– Nur Bakterien mit Plasmid können wachsen


DNA Sequenzierung (nach Sanger)

n Abfolge von Basen in DNA Sequenz lesenn Sequenzierreaktion (basiert auf PCR) mit

– DNA Template (doppelsträngig)– 1 Primer– DNA Polymerase– dNTP‘s– ddNTP‘s (Didesoxynukleotide)

n Brechen Kettenverlängerung abn Sind markiert

– Früher: radioaktiv– Heute: fluoreszent (1 Farbstoff je Base)


DNA Sequenzierung – cont. –

n PCR ergibt DNA Stücke mit unterschiedlicher Länge– Markiert

n Werden über ein Acrylamid-Gel aufgetrennt-

+ Laser


DNA Sequenzierung – cont –

n Markierten Basen werden durch Laser detektiert– Ergibt 4 Tracefiles (Für jede Base eines)

n Tracefiles werden zum Chromatogrammzusammengesetzt– Leseweite ~ 500 bp


Großer Fortschritt

n Früher:– Radioaktiv– Handarbeit

n Heute:– 4 Floureszensfarbstoffe– vollautomatisch


Zur Erinnerung

n YACs und BACs so geschnitten, dass überlappende Stücke entstehen

schneiden

YAC1 YAC2 YAC3

YAC4YAC5

YAC6YAC7


Assembly

n Wir haben jetzt sequenzierte Stücke DNA– ~ 500 bp groß– Überlappend

n Wir wissen, sie kommen aus einem BAC, bzw. einem YAC

n Algorithmisches Problem: Sequence assembly– setze die 500 bp großen Stücke wieder zu einem BAC

bzw. YAC zusammen

n Aber: nicht überall funktioniert diese Strategie– Chromosome walking


Auswirkungen vom HGP

n Datenflut– Datenbanken & Bioinformatik

n Datenbasis für Finden von Genen– Alle Gene finden– Zusammenwirken von Genen erkennen– Erkennen von Genen, die mit Erbkrankheiten in

Verbindung stehen

n Erkenntnis über ähnliche/gleiche Gene in anderen Organismen– Experimente mit Modellorganismen

n Maus, Hefe, E. coli


Expressionslevel von Genen

n Microarrays– enthält kurze Abschnitte von bekannten Genen– 30.000 – 100.000 Spots (Proben) pro Array– jeder Spot enthält mehrere Kopien

Array mit DNA Proben


Microarray-Experiment

n mRNA in cDNA umschreiben– von gesunden und kranken Zellen– cDNA dabei markieren (fluoreszent)

n cDNA auf Chip auftragen und hybridisieren– cDNA Stücke an Proben binden

n restliche cDNA abwaschenn Messen der Intensität je Spot

– Vergleichn Gesund – Krank


Ergebnis von Microarray-Experimenten

n Image mit Intensitäten für jede Probe– Rot: Kontrolle– Grün: Sample

n Interpretation der Ergebnisse– Vergleich von

vielen Patienten– Vergleich von

Genen


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