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SECONDA UNIVERSITA’ degli STUDI di NAPOLI
ESPOSIZIONE A XENOBIOTICI:
Aspetti Tossicologici,
Monitoraggio Ambientale e Biologico,
Interpretazione di Dati Analitici
Nadia Miraglia
Dipartimento di Medicina Sperimentale –Sezione di Medicina del Lavoro, Igiene e Tossicologia Industriale
ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
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Scopo• Sapere se una patologia può derivare
dall’esposizione a uno xenobiotico
• Saper collaborare col Medico del Lavoro, parlando lo stesso linguaggio!
Esposizione ambientale e/o professionale
Soprattutto nel caso di sostanze cancerogene•Processo multistadio•Eziologia multifattoriale•Lunga latenza
Rame (Cu) Morbo di Wilson, ipertensione…
Solventi organici
• tossicità ematopoietica (benzene)• epatotossicità (etanolo, idrocarburi clorurati)• tossicità oculare (metanolo)• tossicità riproduttiva (eteri, glicole etilenico)
• depressione del SNCgenerici:
organo-specifici:
EFFETTI
Valore limite biologico, emivita, monitoraggio, tossicocinetica, tossicodinamica ecc..
ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
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AssorbimentoProcesso per cui le sostanze chimiche, passando attraverso le barriere esterne entrano nel circolo sanguigno dell’organismo
DistribuzioneProcesso per cui le sostanze passano dal circolo sanguigno ad organi e tessuti (nelle cellule)
EscrezioneEliminazione delle sostanze dall’organismo
MetabolismoBiotrasformazione di sostanze chimiche
• RR Lauwerys (trad M Carrara), Cap 33 Tossicologia Industriale (pag 1311) in: Casarett & Doull’s – TOSSICOLOGIA: I fondamenti dell’azione delle sostanze tossiche - CD Klaassen. Ed Mc-Graw-Hill Companies, Inc. – New York; Ed. Italiana, EMSI (Edizioni Medico Scientifiche Internazionali) – Roma (2000) ISBN 88-86669-11-9
Escrezione(urine)
biotrasformazione
metabolitiattivi
distribuzione(sangue, tessuti)
in dipendenza del tempo di vita
metabolitiinattivi
distribuzione(sangue, tessuti)
in dipendenza del tempo di vita
proporzionalitàAddotti
con molecole bersaglio non critiche
Addotti con molecole
bersaglio critiche
• Diverse sostanze (tal quale o metaboli)• Si ritrovano in diverse matrici• In momenti diversi
ASSUNZIONEESPOSIZIONE
Sostanza “tal quale”nel sangue o nelle urinedistribuzione
(sangue, tessuti)in dipendenza del tempo di vita
Escrezione(urine)
Metaboliti:sangue o urine
Addottisostanza (metaboliti)/macromolecole
nel sangue
proporzionalitàAddotti
con molecole bersaglio non critiche
Addotticon molecole
bersaglio critiche
biotrasformazione
metabolitiattivi
metabolitiinattivi
distribuzione(sangue, tessuti)
in dipendenza del tempo di vita
Escrezione(urine)
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ESPOSIZIONE
MALATTIA
Interazione con molecole
bersaglio
Assorbimento e trasformazione metabolica
Alterato rapporto struttura/funzione
Effetti biologici precoci
Sostanza tal quale
M.A.
Sostanza o suo metabolita
M.B.
Addotti DNA, proteici
MBDosimetria Molecolare
MutazioniTraslocazioni
Amplificazione genica
Delezioni
Indicatori di alterazioni
morfologiche e/o funzionali
dovute all'interazione
cellula-genotossico
-attività enzimatica-test comportamentali-parametri elettrofisiologici-secrezioni ghiandolari-alterazioni di regolazione e sintesi
-risposte immunitarie
CANCRO:mutazioni SCE, Micronuclei, Gene p 53, Oncogeni ras, HPRT, HLA
Indicatori di eventi molecolari dovuti
all’interazione cellula-genotossico
Continuum degli eventi
Monitoraggio Ambientale e Monitoraggio Biologico
SUSCETTIBILITA'INDIVIDUALE
Considerazioni generali
Diversa pericolosità a seconda pesticidi
piombo, cromo, rame• della dose
• delle sostanze
Cu: elemento essenziale
Cr
Cr (III) (elemento essenziale)
Cr (IV) cancerogeno
[Pb] Interferisce con al sintesi dell’eme
• SNC: effetti neurologici• Reni: nefropatie e interferenza
nel metabolismo vitamina D
• Sistema riproduttivo• Ipertensione
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ORGANOFOSFORICI
Proprietà tossicologiche Inibiscono le Colinesterasi = enzimi necessari al funzionamento del SNC e del periferico
Assorbimento Via Inalatoria, cutanea, digestiva
Eliminazione•80-90% entro 48h nelle urine sottoforma di alchilfosfati e metaboliti
urina, feci, aria espirata
Inibizione attività colinesterasica ad opera degli organofosforici
•L’impulso nervoso si trasmette mediante l’acetilcolinaLa colina è localizzata in prossimità delle giunzioni neuromuscolari. Quando arriva l’impulso nervoso si forma Acetilcolina, che si lega al suo recettore polarizzando la membrana e trasmettendo, in tal modo, l’impulso. Una volta trasmesso l’impulso, l’Acetilcolina viene ritrasformata in colina ad opera delle colinesterasi
•L’inibizione avviene perchél’enzima viene fosforilato(aging) e non è più in grado di essere riattivato
• Quando le AChE vengono inibite, l’acetilcolina si accumula:
- l’impulso nervoso non si trasmette correttamente (effetto clinico)
- l’attività dell’AChE, serica e eritrocitaria, diminuisce
•In condizioni normali, dopo l’impulso:
acetilcolinaAcetilcolinesterasi (AChE)
idrolisiAcido acetico + colina
Acetilcolinestaerasi
AcetilcolinaComplesso
enzima-substrato Enzima acetilato
Meccanismo dell’azione enzimatica
Paraoxon Enzima fosforilatoComplesso
enzima-inibitore
Meccanismo di inibizione enzimatica
Colina
Acido Acetico
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Pesticidi ADI (mg/Kg)
0,10Tolylfluanid
0,002Propargite
0,03Metalaxyl
0,05Cypermethrin
0,06Dimethomorph
0,005Hexaconazole
Gas nervini
sarin General Population Limit (GPL):
1 x 10-6 mg/m3
Considerazioni generali
Diversa pericolosità a seconda
Diverso assorbimento a seconda del tipo di esposizione (anche a parità di sostanza)
pesticidi
piombo, cromo, rame• della dose
• delle sostanze
per via inalatoria
per via cutanea
per via digestiva
Assorbimento per via inalatoria• E’ dovuto alla presenza nell’aria
inspirata di agenti tossici sottoforma di aerosol (nebbie, polveri e fumi) o sotto forma di vapore
• E’ importante nel caso di esposizioni a sostanze estremamente volatili
Assorbimento per via cutanea• E’ dovuta alla contaminazione con
agenti tossici a livello delle mani e di altre parti di cute scoperta non adeguatamente coperta da indumenti protettivi
Assorbimento per via digestiva• E’ legato alla deglutizione di particelle che durante la
respirazione si depositano a livello delle prime vie aeree
• E’ legato alla dieta con cibi contaminati• Può essere rilevante in presenza di cattive abitudini
igieniche (es: mangiare e fumare sul luogo di lavoro)
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ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
MONITORAGGIO
Sorveglianza sistematica dei rischi ai quali i lavoratori sono esposti. Essa si può effettuare misurando definiti parametri dell’ambiente di lavoro e in particolare la concentrazione di sostanze tossiche in sospensione nell’aria, ovvero misurando prestabiliti parametri biologici e in particolare la concentrazione delle sostanze tossiche o dei loro metaboliti o le relative reazioni organiche, nelle urine, nel sangue o nell’aria espirata
[Ufficio Internazionale del Lavoro, 1977]
Attivitò sistematica, continua o ripetuta mirata ai fini della salutee progettata per portare, se necessario, ad azioni correttive
[NIOSH, OSHA, Commissione Salute e Sicurezza della CEE, 1984]
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Quantificazione di sostanze nell’aria o in matrici biologiche:
MONITORAGGIOAMBIENTALE
Aria-ambienteLuoghi di lavoro (aria, superfici)
aria
SangueUrineCapelli
matrici biologiche
MONITORAGGIOBIOLOGICO
Assunzione (volontaria):droghe, farmaci
Esposizione (ambientale e/o professionale):agenti tossici, cancerogeni, mutageni ecc.
sostanze
ESPOSIZIONEPERSONALE
CAMPIONATORI PERSONALI
CAMPIONAMENTI DI ARIANELLA ZONA RESPIRATORIA
DEL LAVORATORE
VALUTARE L'ESPOSIZIONE
INQUINAMENTO CONNESSOALLA LAVORAZIONE
CAMPIONATORI D'AREA
CAMPIONAMENTI NELLE ZONE CENTRALIDEI LOCALI DI LAVOROE IN VICINANZA DELLE
SORGENTI DI INQUINAMENTO
INDICAZIONI SULLA DISTRIBUZIONEDEGLI INQUINANTI
MAPPA SPAZIALE EDEVOLUZIONE TEMPORALE
DELL'INQUINAMENTO
SCOPO M.A.
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•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio Ambientale- Misura della concentrazione di un agente di
rischio in matrice ambientale
- Misura di prevenzione
- Verifica dei livelli di inquinamento
- Verifica dell’efficacia di misure di prevenzione
•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio BiologicoSorveglianza sistematica dei rischi ai quali i lavoratori sono esposti attraverso la misura di parametri biologici
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ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
ESPOSIZIONE
MALATTIA
Interazione con molecole
bersaglio
Assorbimento e trasformazione metabolica
Alterato rapporto struttura/funzione
Effetti biologici precoci
Sostanza tal quale
M.A.
Sostanza o suo metabolita
M.B.
Addotti DNA, proteici
MBDosimetria Molecolare
MutazioniTraslocazioni
Amplificazione genica
Delezioni
Indicatori di alterazioni
morfologiche e/o funzionali
dovute all'interazione
cellula-genotossico
-attività enzimatica-test comportamentali-parametri elettrofisiologici-secrezioni ghiandolari-alterazioni di regolazione e sintesi
-risposte immunitarie
CANCRO:mutazioni SCE, Micronuclei, Gene p 53, Oncogeni ras, HPRT, HLA
Indicatori di eventi molecolari dovuti
all’interazione cellula-genotossico
SUSCETTIBILITA'INDIVIDUALE
Indicatori di Dose
Biologicamente Efficace
Indicatori di Effetto
Indicatori di Dose Esterna
Indicatori di Dose Interna
Indicatori di Suscettibilità
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Significatoprognostico
Markers di effetto
Espo
sizio
ne
Dose Doseinterna biologicamente
efficace
Effettibiologiciprecoci
Alteratorapportostrutturafunzione
Malattiaclinica
…...…....
Markers di suscettibilità
Markers di: esposizione, effetto, suscettibilità
Markers di esposizione
•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio Biologico
•Come si fa
•Come si interpreta
Sorveglianza sistematica dei rischi ai quali i lavoratori sono esposti attraverso la misura di parametri biologici indicatori biologici
•Cosa si “dosa”
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•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio BiologicoSorveglianza sistematica dei rischi ai quali i lavoratori sono esposti attraverso la misura di indicatori biologici
Per chiarire “a che serve” il monitoraggio biologico, ènecessario prima qualche cenno circa:
• Tossicocinetica e tossicodinamica
• Significato molteplice,qualitativo e quantitativo degli indicatori
•Cosa si “dosa”
Tossicocinetica
Rappresentazione qualitativa e quantitativa dell’andamento temporale dei processi di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione delle sostanze chimiche nell’organismo
Tossicodinamica
Studio dei meccanismi molecolari che portano all’ effetto
La tossicodinamica studia la relazione quantitativa fra la dose del tossico e l’entità dell’effetto), indipendentemente dal tempo.
La tossicocinetica può essere definita come la relazione quantitativa tra la dose e l’andamento della sostanza tossica nel sangue e /o i tessuti, indipendentemente dagli effetti.
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Significato “qualitativo” e “quantitativo” degli indicatori
Presupposto necessario per effettuare ed interpretare un monitoraggio:
conoscenza dei processi tossico-cinetici, -dinamici
Presenza dell’indicatore : Significato qualitativo
Correlazioni significative: Significato quantitativo
Significatoprognostico
Espo
sizio
ne
Dose Doseinterna biologicamente
efficace
Effettibiologiciprecoci
Alteratorapportostrutturafunzione
Malattiaclinica
Slide 1 e 2
Ruolo degli Indicatori Biologici nella Valutazione del Rischio
•Se è nota solo la relazione tra esposizione e dose interna, l’indicatore esprimerà correttamente l’esposizione dell’individuo, ma non sarà in grado di dare informazioni circa il rischio per la salute
•Se invece è nota la relazione dose interna e effetti, l’indicatore sarà espressione del rischio e consentirà una diretta prevenzione degli effetti nocivi per la salute
ESEMPI
n-esano e metilbutilchetone
Esposizione a Significato
(in base alle conoscenze tossicologiche disponibili)2,5-esandioneIndicatore
Il 2,5-esandione è responsabile degli effetti neurotossici dei due solventi, quindi la sua misura riflette sia l’esposizione sia l’effetto nocivo per la salute
benzene acido t,t muconico
riflette l’esposizione, ma non il rischio di contrarre leucemia
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Significato molteplice degli indicatori
stima dell’accumulo
Esempio 1: ADDOTTI al DNA
non possono formarsi in assenza di assorbimento della sostanza che li genera
indicatori di esposizione
la loro formazione richiede l’interazione con una macromolecola cellulare, la cui modificazione indica un
effetto biologico
la loro persistenza riflette le capacitàindividuali di riparazione del danno al DNA
indicatori di suscettibilità
Anche il MOMENTO di CAMPIONAMENTO di un indicatore può conferire diversi significat
Esempio 2:la determinazione di un solvente volatile nel sangue o nell’aria espirata
durante l’esposizione o subito dopo
assorbimento in atto
il mattino seguente
•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio Biologico
•Come si fa
•Come si interpreta
Sorveglianza sistematica dei rischi ai quali i lavoratori sono esposti attraverso la misura di indicatori biologici
Stima dell’esposizione, dell’assorbimentoEfficacia dei processi di attivazione Interazioni efficaci con le macromolecoleEffetti dovuti all’esposizioneSignificato predittivo
•Sorveglianza sanitaria•Tutela della salute
•Cosa si “dosa”
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ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
STRATEGIE di MONITORAGGIO AMBIENTALE o BIOLOGICO : procedimento
RACCOLTA INFORMAZIONI
Caratteristiche chimico-fisiche, informazioni tossicologiche
Individuazione delle fonti di inquinamento
Personale esposto e caratteristiche dell’esposizione
MODALITA’ di MONITORAGGIO
Momento di campionamento Modalità del monitoraggio
Verifica dell’esistenza di Metodi Ufficiali e di Normativa specifica
Campionamento (frequenza, durata) quando
dove e come
(matrice, supporto di captazione)
Analisi EstrazioneSeparazioneRivelazione
Quantificazione
come(metodo delle aggiunte, rette di taratura, standard interno, standard esterno…)
(liquido/liquido, SPE, HS, SPME…)(HPLC, GC)(UV, MS, ECD…)
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Perché sono necessarie informazioni circa le Proprietà chimico-fisiche
Misure Operative
• Quantità da adoperare• Trasporto• Manipolazione• Stoccaggio• Dispositivi di Protezione
Monitoraggio biologico o ambientale
• es: aerosol o vapore, come diffonde: dove e come dosare
• come la sostanza da dosare può essere estratta dalla matrice e rivelata:
quale metodica adoperare per dosare
Dove reperire le informazioni:
Scheda di sicurezza
International Chemical Safety Card
Metodi di analisi:GC/FPDLC/UV (294nm) LC/MS
metribuzindeltametrina
Metodi di analisiGC/MSGC/ECD
Toss
icoc
inet
ica
/ To
ssic
odin
amic
a
Dove, cosa e quando dosare (nel Monitoraggio Biologico)
Via di penetrazione preferenziale
Distribuzione, metabolismo, cinetica di eliminazione
Meccanismo di azione
Effetti, Sorveglianza Sanitaria, Monitoraggio Biologico
Informazioni tossicologiche:
Cara
tter
isti
che
chim
ico-
fisi
che Metodo di analisi
Modalità di campionamento, estrazione e rivelazione
Contenitori da adoperare
Condizioni di stabilità nel trasporto e nello stoccaggio dei campioni
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Individuazione fonti di inquinamentoCome: mappe, ciclo produttivo e/o modalità operative
Scopo: individuare punti e mansioni per cui si prevede un elevato livello di esposizione
impianto industrialeSISTEMA CHIUSO
campo agricoloSISTEMA APERTO
Campionatore a portata costante per campionamenti ambientali in postazione fissa. Idoneo per i campionamenti di polveri totali, polveri respirabili , gas e vapori tossico nocivi dispersi in aria e campionamenti da camino.
Personale esposto
Stato fisiologico e di salute del lavoratore
Abitudini di vita (dieta, fumo, alcol, farmaci, droghe)
Età, sesso
Caratteristiche dell’esposizione
• Continua o discontinua (tempo necessario alla detossificazione)• Sorgenti di esposizione (via di penetrazione)• Coesposizione
Variabili che influenzano il monitoraggio biologico
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STRATEGIE di MONITORAGGIO AMBIENTALE o BIOLOGICO (come si fa)
RACCOLTA INFORMAZIONI (Monitoraggio ambientale)
Caratteristiche chimico-fisiche, info tossicologiche ed ecologiche
Individuazione delle fonti di inquinamento
Personale esposto e caratteristiche dell’esposizione
MODALITA’ di MONITORAGGIO
Momento di campionamento
Verifica dell’esistenza di Metodi Ufficiali e di Normativa specifica
Campionamento
Analisi
Quantificazione
CAMPIONAMENTO
DOVE
COME
QUANTI PRELIEVI
DURATA
FREQUENZA
Quando
Progettazione del momento del campionamento: AMBIENTALE
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LIMITI DI ESPOSIZIONE PROFESSIONALE ACGIH
TLV (Threshold Limit Value)
concentrazioni delle sostanze aerodisperse alle quali si ritiene che la maggior parte dei lavoratori possa rimanere
esposta ripetutamente, giorno dopo giorno, per otto ore al giorno, per 5 giorni la settimana,
senza effetti nocivi per la salute
TLV-TWA (Time Weighted Average)
Concentrazione media ponderata nel temposu una giornata lavorativa
di 8 ore e su 40 ore lavorative settimanali
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tempo
Concentrazione
tempo
CAMPIONAMENTO SINGOLO COMPLETO
CAMPIONAMENTO MULTIPLO COMPLETO
CAMPIONAMENTO MULTIPLO PARZIALE
CAMPIONAMENTO MULTIPLO ISTANTANEO
CAMPIONAMENTO MULTIPLO BREVE
MOMENTO DI CAMPIONAMENTO
Concentrazione
Cadmio: emivita = 10 anni
Il CdU dipende dalla durata dell’esposizione:
La [CdU] riflette la [Cd]atmosf solo quando i lavoratori sono esposti da più di 6 mesi (in tal caso, il sampling time non è critico) perché il Cd si lega (e si accumula) sui siti leganti di tessuti (fegato)
Momento di campionamento
MBHSE (Health Safety Exetutive), 1992:
Cr (CrU): il Cr viene eliminato in tre fasi, una rapida, le altre lente (accumulo nel rene):
[CrUft–CrUit] = ∆CrU = indicatore di esposizione
CrUftfs = indicatore di accumulo
Toluene Emivita di 3h, eliminazione completa in 18h
Toluene in aria espirata, ac. Ippurico e mercapturico urinari di fine turno = indicatori di esposizione
Il sampling time dipende dall’emivita
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INDICI BIOLOGICI DI ESPOSIZIONE (IBE) ACGIH
CAMPIONAMENTO A FINE TURNO LAVORATIVO
RAPIDAtempo di emivita biologica inferiore a 5 ore
CAMPIONAMENTO A FINE SETTIMANA LAVORATIVA
LENTAtempo di emivita biologica superiore a 5 ore
ESCREZIONE
L’ACGIH indica per ciascuna sostanza
l’indicatore biologico da ricercare
il campione da prelevare (matrice)
il periodo di prelievo
i valori di riferimento e/o valori limite biologici
INDICI BIOLOGICI DI ESPOSIZIONE (IBE) ACGIH
Perché il momento di campionamento è importante nel Monitoraggio Biologico
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ACGIH 2001Indicatori biologici di esposizione adottati (n°42 )
Sostanza CAS (Anno) Indicatori Biologici Periodo Prelievo
IBE Notazioni
Benzene (71-43-2) (1997) Acido S-Fenil mercapturico nelleurine
Ac. t,t-muconico nelle urine (2000)
Fine turnoFine turno
25 µg/g creat500 mg/g creat
BB
Clorobenzene (108-90-7) (1992) 4-clorocatecolo totale nelle urineP-clorofenolo totale nelle urine
Fine turnoFine turno
150 mg/g creat25 mg/g creat
NSNS
n-Esano (110-54-3) (1987) 2,5 esandione nelle urineN-esano nell’aria di fine espirazione
Fine turno 5 mg/g creat NSSQ
Metil isobutil Metil isobutil chetone nelle urinechetone (108-10-1) (1993)
Fine turno 2 mg/l --
Nitrobenzene (98-95-3) (1991) P-nitrofenolo totale nelle urineMetemoglobina nel sangue
f t.f.s.l.Fine turno
5 mg/g creat1,5% di Hb
NSB, NS, SQ
Percloroetilene Percloroetilene nell’area di fine espirazione (127-18-4) (1997) Percloroetilene nel sangue
Acido tricloroacetico
p.u.t.s.l.p.u.t.s.l.f.t.f.s.l.
5 ppm0,5 mg/l3,5 mg/l
----
NS, SQ
Stirene (100-42-5) (1986) Acido mandelico nelle urine Fine turnop.t. successivo
800 mg/g creat300 mg/g creat.
NSNS
Toluene (108-88-3) (1999) O-cresolo nelle urineAcido ippurico nelle urine
Toluene nel sangue
Fine turnoFine turnop u t s l
0,5 mg/l1,6 g/g creat0 05 mg/l
BB,NS
--
STRATEGIE di MONITORAGGIO AMBIENTALE e BIOLOGICO (come si fa)
RACCOLTA INFORMAZIONI
Caratteristiche chimico-fisiche, info tossicologiche ed ecologiche
Individuazione delle fonti di inquinamento
Personale esposto e caratteristiche dell’esposizione
MODALITA’ di MONITORAGGIO
Momento di campionamento Modalità del monitoraggio
Verifica dell’esistenza di Metodi Ufficiali e di Normativa specifica
Campionamento
Analisi
Quantificazione
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Campionamenti ambientali
superfici personalearia
ambiente
WIPE-TEST PADS FILTRI FILTRI
Valutazionedell’esposizione
cutanea
Valutazione dell’esposizione
inalatoria
TECNICHE DI MONITORAGGIO AMBIENTALE
Campionamenti ambientali
superfici personalearia
ambiente
WIPE-TEST PADS FILTRI FILTRI
TECNICHE DI MONITORAGGIO AMBIENTALE
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Indicatori di Effetto
SUSCETTIBILITA'INDIVIDUALE
Indicatori di
Suscettibilità
ESPOSIZIONE
MALATTIA
Interazione con molecole
bersaglio
Assorbimento e trasformazione metabolica
Alterato rapporto struttura/funzione
Effetti biologici precoci
Sostanza tal quale
M.A.
Sostanza o suo metabolita
M.B.
Addotti DNA, proteici
MBDosimetria Molecolare
MutazioniTraslocazioni
Amplificazione genica
Delezioni
Indicatori di alterazioni
morfologiche e/o funzionali
dovute all'interazione
cellula-genotossico
-attività enzimatica-test comportamentali-parametri elettrofisiologici-secrezioni ghiandolari-alterazioni di regolazione e sintesi
-risposte immunitarie
CANCRO:mutazioni SCE, Micronuclei, Gene p 53, Oncogeni ras, HPRT, HLA
Indicatori di eventi molecolari dovuti
all’interazione cellula-genotossico
Indicatori di Dose
Biologicamente Efficace
Indicatori di Dose Esterna
Indicatori di Dose Interna
Modalità del monitoraggioBIOLOGICO
Le modalità di campionamento, così come quella di analisi dipendono dal tipo di indicatore, anzi dal tipo di sostanza o test che si effettua, quindi …
Modalità del monitoraggioBIOLOGICO
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Esposizione a benzene: Monitoraggio Biologico
Aria espirata •Benzene tal quale
Sangue •Benzene tal quale
•Addotti DNA, proteici
Urine
•Benzene tal quale
Metaboliti
•Acido t,t muconico•SPMA
Matrice Indicatore
STRATEGIE di MONITORAGGIO BIOLOGICO (come si fa)
RACCOLTA INFORMAZIONI (Monitoraggio ambientale)
Caratteristiche chimico-fisiche, info tossicologiche ed ecologiche
Individuazione delle fonti di inquinamento
Personale esposto e caratteristiche dell’esposizione
MODALITA’ di MONITORAGGIO
Verifica dell’esistenza di Metodi Ufficiali e di Normativa specifica
Campionamento
Analisi
Quantificazione
EstrazioneSeparazioneRivelazione
(liquido/liquido, SPE, HS, SPME…)(HPLC, GC)(UV, MS, ECD…)
(metodo delle aggiunte, rette di taratura, standard interno, standard esterno…)
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Metodi Analiticiestrazione dalla matrice ambientale / biologica
analisi strumentale
•Liquido-liquido•Solid Phase Extraction•Solid Phase MicroExtraction (Head Space)
•Bagno ultrasuoni, Soxhlet
Separazione cromatograficaLiquida: HPLC (High Performance Liquid Chromatography)Gassosa: GC (Gas Chromatography)
RivelazioneUV (Ultraviolet Detection)FL (fluorescenza)ECD (Electron Capture Detector)FID (Flame Ionisation Detector) FPD (Fluorine Phosphourous Detector) NPD (Nitrogen Phosphouros Detector)AAS (Atomic Absorption Spectroscopy)MS (Mass Spectrometry)
xenobiotico
Metodo diCampionamento
Metodo di Analisi
Metodo di Estrazione dalla matrice
Tecniche di estrazione: SP MicroExtraction
BB B
B
TT
TT
BB
B
TT
BTBT
adsorbimentodesorbimento
e analisi
ripartizione
quantificazione
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Fattori che limitano la pratica del monitoraggio biologico
• Esistenza di un numero limitato di indicatori disponibili
• Non sempre sono note le caratteristiche tossicocinetiche e
tossicodinamiche di uno xenobiotico, conoscenze necessarie per
l’impiego corrente dell’indicatore biologico
• Il progressivo miglioramento delle condizioni dei luoghi di lavoro ha
determinato la progressiva diminuzione dei livelli di esposizione;
quindi sono necessarie tecniche e strumenti altamente sensibili
Informazioni ricavate dal MA
Informazioni ricavate dal MB
• Esposizione, assorbimento
• Efficacia dei processi di attivazione
• Interazioni efficaci con le macromolecole
• Effetti dovuti all’esposizione
• Significato predittivo
• Livelli di esposizione (personale)
• Livelli di inquinamento
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•Che cos’è
•A che serve
Monitoraggio Ambientale e Biologico
•Come si fa
•Come si interpretano
ArgomentiAspetti Tossicologici
Monitoraggio
Interpretazione dei Dati
•Diagramma di Lauwerys
•Continuum degli eventi
•Considerazioni generali
•Definizioni e finalità
•Indicatori ambientali e biologici
•Procedure di Monitoraggio
•Informazioni ricavate dal monitoraggio
•Qualità del dato analitico (validazione)
•Dati di Monitoraggio Ambientale
•Dati di Monitoraggio Biologico
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Qualità del dato analiticoNon solo bisogna valutare se il campionamento rappresentativo (momento e
modalità e strategia in generale),
….ma anche che il risultato analitico sia affidabile
Requisiti minimidi una risposta analitica
•Errore analitico
•Tecnica adoperata
•Limite di sensibilità della tecnica
Validazione dei Metodi Analitici
Bioanalytical Method Validation
Analytical Procedures and Method Validation
Il protocollo di validazione prevede, quindi, l’effettuazione di una serie di esperimenti tesi a valutare numericamente:
La “validazione” di un metodo analitico consiste in una raccolta di dati sperimentali allo scopo di dimostrare l’adeguatezza e l’attendibilità della procedura analitica adoperata per identificare e/o quantificare una sostanza di interesse.
In altre parole, affinché i risultati forniti dall’analisi di un campione incognito mediante l’applicazione di una specifica procedura analitica siano accreditati e abbiano validità generale, indipendentemente dal laboratorio di analisi, la procedura analitica adoperata deve soddisfare specifici requisiti(parametri di validazione), stabiliti a livello internazionale, i quali attestano, appunto, la “bontà” dell’analisi.
• Stabilità•Recupero•Sensibilità•Accuratezza•Precisione•Selettività•Robustezza
Accettabilità del dato analitico ottenuto
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Parametri di Validazione
STABILITÀ
Short – term
Stabilità degli analiti durante il tempo impiegato per l’analisi
6 e 24 ore, temperatura ambiente
Long – term
Stabilità degli analiti durante la conservazione dei campioni
1 settimana e 1 mese, -20°C3 Livelli di concentrazione: A, B, C
RECUPERO
LOD LLOQ
ACCURATEZZA
PRECISIONE
Percentuale di recupero degli analiti dalla matrice complessa rispetto alla risposta analitica fornita dalle sostanze analizzate in solvente (Rec% = 100%)
Rapporto percentuale tra i coefficienti angolari delle curve di calibrazione in matrice e in solvente
Campo di misura: range di concentrazioni indagato
Minima concentrazione di analita rilevabile (LOD) e quantificabile (LLOQ)
Analisi di 6 bianchi di matrice. Misura dell’area del picco cromatografico (rumore) al tr dell’analita. Calcolo della concentrazione media fittizia e della deviazione standard.
LOD = [analita]M + 3 SD LLOQ = [analita]M + 5 SD
STABILITÀ
Short – termStabilità degli analiti durante il tempo impiegato per l’analisi
Long – termStabilità degli analiti durante la conservazione dei campioni
RECUPERO
LOD LLOQ
ACCURATEZZA
PRECISIONE
Percentuale di recupero degli analiti dalla matrice complessa rispetto alla risposta analitica fornita dalle sostanze analizzate in solvente (Rec% = 100%)
Minima concentrazione di analita rilevabile (LOD) e quantificabile (LLOQ)
Differenza tra la concentrazione misurata e il valore veroAcc% = (CM – CNOM) / CNOM*100
Riproducibilità della misura: coefficiente di variazioneCV % = SD / CM*100
Parametri di Validazione
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•Valori di Riferimento•Valori Limite Biologici
Come si interpretano i dati di monitoraggio
biologico:
confronto del dato con
Normativa nazionaleNormativa europeaAgenzie accreditate
•Valori di Riferimento•Valori Limite Ambientali•Valori Limite Occupazionali
Come si interpretano i dati di monitoraggio
ambientale:
confronto del dato con
Normativa nazionaleNormativa europeaAgenzie accreditate
Materiale
•Casarett & Doull’s – TOSSICOLOGIA: I fondamenti dell’azione delle sostanze tossiche - CD Klaassen. Ed Mc-Graw-Hill Companies, Inc. –New York; Ed. Italiana, EMSI (Edizioni Medico Scientifiche Internazionali) – Roma (2000) ISBN 88-86669-11-9
•Advances in Occupational Medicine, Aggiornamenti in Medicina Occupazionale - L Alessio, PA Bertazzi, A Forni, G Gallus, M Imbriani. Maugeri Foundation Books PI-ME Press, Viale Sardegna 64, PAVIA, Italy, Vol 1, (2000) ISBN 88-7963-113-6
•Linee Guida SIMLII I Libri della Fondazione Maugeri PI-ME Editrice s.r.l
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