Mehanizmi genotipske promenljivosti Mutacije promene u broju i redosledu nukleotida u molekulu DNK Horizontalni prenos gena (transformacija, konjugacija, transdukcija) Transpozicije premetanje jednog ili vie gena sa jednog mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi

Tipovi mutacija Takaste mutacije (zamene baza i promene okvira itanja (vanfazne, frameshift) Delecije (gubitak razliitog broja baznih parova) Adicije (dodavanje razliitog broja baznih parova) Insercije (adicija veeg broja baznih parova) Inverzije (deo DNK se iseca i umee u obrnutom smeru) Duplikacije (oblik adicija kod kojih su dodati nizovi baza identini)

Mutacije Mutacije su redak i sluajan dogaaj i uglavnom imaju negativan efekat Promene broja ili redosleda nukleotida u molekulu DNK obino imaju za posledicu izmenu redosleda amino kiselina u proteinu koji postaje nefunkcionalan Mali broj mutacija omoguava evolutivne promene

Zamene baza i efekat na funkciju proteina

Vanfazne mutacije i efekat na funkciju proteina

ReverzijeMutacije koje uspostavljaju fenotip divljeg soja Prave reverzije nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna Supresije nova mutacija je na drugom mestu ali ponitava efekat prethodne Intragenske supresije nova mutacija u istom genu, npr. frameshift Intergenske supresije nova mutacija u drugom genu, npr. supresija nonsense mutacije pomou supresorskih tRNK

Spontane mutacije Greke u replikaciji izazvane teutomerijom baza Proklizavanje DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida Replikacija ili reparacija endogenih oteenja DNK (oksidativna oteenja, depurinacija, itd) Glavni mehanizmi u eliji koji kontroliu nivo spontanih mutacija: Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III Reparacija pogreno sparenih baza MMR Redak dogaaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije Izazvane brojnim hemijskim, fizikim i biolokim agensima, mutagenima, koji mogu izazvati razliita oteenja u molekulu DNK i poveati stopu mutacija Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija: Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi) Hemijska promena baze koja izaziva pogreno sparivanje Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak sposobnosti sparivanja

Fiksacija mutacija Potrebne dve replikacije za fiksaciju mutacija U prvoj replikaciji dolazi do ugraivanja nekomplementarnog nukleotida u novi lanac DNK U drugoj replikaciji dolazi do kopiranja templeta sa pogrenim nukleotidom i stvara se mutirana DNK

MutagenBazni analozi 5-Bromouracil 2-aminopurin Modifikacija baza Azotasta kiselina HNO2 Hidroksilamin NH20H

DejstvoAnalog T, sparuje se sa G Analog A, sparuje se sa C Deaminacija A u H i C u U Reaguje sa C Metiluje G (G me-T) Povezuju lance u dsDNK

Tip mutacijaATGC, GC AT ATGC, GC AT ATGC i GC AT GC AT GC AT Taakste, delecije

Alkilirajui agensi Etil metan sulfonat EMS Mitomicin CInterkalirajui agensi Akridini Etidijum bromid EtBr Zraenja Ultravioletno UV-254 nm Jonizujua (X-)

Ubacuju se izmeu 2 bp

Male insercije i delecije

Formiranje dimera pirimidina Slobodni radikali, prekidi lanaca

U toku ispravke moe doi do takastih mutacija ili delecija

Posledice delovanja mutagena Smrt elije Ispravka oteenja reparacionim mehanizmima koji ne gree Ispravka oteenja reparacionim mehanizmima koji gree - indukcija mutacija Manje od 1/1000 oteenja e biti fiksirano u mutaciju

MutantiJedinke kod kojih je dolo do mutacija i koje se fenotipski razlikuju od roditelja Mutanti u morfologiji Mutanti u ishrani Mutanti rezistentni na antibiotike Mutanti u reparaciji DNK Uslovni mutantu

FenotipAuksotrofiOsetljivi na temperaturu Rezistentni na antibiotike Bez kapsule ili LPS Gubitak flagela, nepokretni

Vrsta promeneOdsustvo biosintetikih putevaPromene u proteinima koji se inaktiviraju na odreenoj temp.

Detekcija mutanataNe rastu na MMNe rastu na temperaturama na kojima roditelji rastu

Izmenjena propustljivost, izmenjeno Rastu na antibiotskim mesto vezivanja ili razgradnja podlogama antibiotika Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili LPS Odsustvo enzima za sintezu flagelina Male, grube (rough) i nepravilne kolonije Kompaktne kolonije Kolonije su drukije boje ili bezbojne Ne menaju pH podloge i boju indikatora

Gubitak pigmenta Odsustvo enzima za sintezu pigmenata Ne fermentiu eere Osetljivi na mutagene Odsustvo enzima za razgradnju eera

Odsustvo enzima za reparaciju DNK Ne rastu na podlogama koje sadre mutagen

Rezistentni na viruse

Gubitak receptora za viruse

Rastu u prisustvu virusa

Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja

Reparacija DNK DNK se mora ouvati dok se ostali molekuli mogu zameniti Raznovrsni reparacioni sistemi su rezultat raznovsnosti oteenja koja nastaju na DNK Isti reparacioni mehanizam ispravlja razliita oteenja Vei broj reparacionih sistema ispravlja esta oteenja Veina reparacionih mehanizama se oslanja na komplementarnost baza, ne grei

Mehanizmi DNK reparacije1. Direktna reverzija oteenja Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin Fotoreaktivacija monomerizuje pirimidinske dimere 2. Eksciziona reparacija - Ekscizija baza (BER) ispravlja abnormalne ili neodgovarajue baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane baze) - Ekscizija nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa - Mismatch repair (MMR) ispravlja greke u toku replikacije, pogreno sparene baze 3. Rekombinaciona reparacija, - ispravlja prekide u DNK 4. Mehanizmi tolerancije oteenja - rekombinacija - DNK PolII zavisan bypass oteenja, inducibilan - DNK PolIV i PolV zavisna replikacija oteenja, translezijska sinteza, inducibilna

Dealkilacija Enzim O6-metilguanin DNK metiltransferaza (produkt ada gena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina to ga inaktivira

Fotoreaktivacija Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2 prepozmaje pirimidinski dimer i vezuje se Kompleks apsorbuje kvant svetlosti 300-500 nm i koristi energiju za razdvajanje dimera Fotoliaza se oslobaa Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i nekih ivotinja

BER Specifine DNK glikozilaze uklanjaju bazu (nastaje AP mesto) AP endonukleaze raskidaju fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5' ili 3' od AP mesta Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom se zamenjuju reparativnom sintezom i ligacijom

NER Prepoznavanje oteenja (dimera) i vezivanje proteinskog kompleksa Dve incizije na oteenom lancu (5' i 3' od mesta oteenja) Uklanjanje oligonukleotida sa oteenjem Popunjavanje nastalog prekida DNK polimerazom Ligacija

MutS protein prepoznaje mismatch MutH endonukleaza prepoznaje hemimetilovanu GATC sekvencu Formira se MutS/MutL/MutH kompleks, MutH endonukleaza iseca nemetilovanu GATC sekvencu Lanac se degraduje egzonukleazama, SSB titi jednolananu DNK DNK Pol III popunjava prekid, a DNK ligaza povezuje lanac Dam metilaza vri metilaciju GATC sekvence

MMR

Postreplikativna rekombinaciona reparacijaProkarioti su razvili mehanizme za ispravku: jednolananih prekida u novosintetisanom lancu (daughter-strand gaps DSG) jednolananih prekida (single-strand breaks SSB) dvolananih prekida (double-strand breaks DSB)

Translezijska sinteza - TSL TLS je alternativni mehanizam ukljuen u toleranciju DNK oteenja TLS-om se popunjavaju prekidi naspram templeta koji sadri oteenje TLS je jedan od SOS odgovora elije koji favorizuje preivljavanje poveanjem kapaciteta reparacije DNK i genetike varijacije SOS odgovor je niz fiziolokih odgovora elije na razliita oteenja molekula DNK i/ili zaustavljanje replikacije

Model SOS indukcije kod E. coli Oteenje ili zaustavljanje replikacije formira signal za SOS indukciju (ssDNK naspram oteenja). RecA protein se vezuje za ssDNK U prisustvu nukleozid trifosfata RecA protein se aktivira (RecA*) RecA* ima koproteaznu ulogu, pomae autokatalitiku razgradnju LexA represora i dolazi do ekspresije SOS regulona Poveava se ekspresija inhibitora elijskih deoba, gena koji uestvuju u NER i rekombinacionoj reparaciji Eksprimiraju se polB (PolII), dinB (PolIV), i umuDC operon (PolV)

SOS mutageneza RecA* koproteaza omoguava post-translacionu obradu UmuD proteina u aktivnu formu UmuD. Kompleks UmuD2C je DNK PolV koja vri TSL Zaustavljanje replikacije naspram dimera Zamena PolIII mutazomom Translezijska replikacija, ugraivanje nekomplementarnih nukleotida naspram dimera Ponovno uspostavljanje replikacije PolIII

Ames-ov test za detekciju mutagena Reverzni test na bakteriji S. typhimurium Auksotrofni mutanti u histidinskom operonu Reverzije his-His+ (bazne zamene i frameshift-i) Osetljivost poveana mutacijama u NER Neki sojevi nose plazmid sa genima za mutagenu DNK polimerazu Za imitiranje sisara dodaju se cytP450 enzimi jetre pacova (S9 frakcija) Bruce Ames (1928)

Spot test Na povrinu agara sa bakterijama postavljaju se filter papiri natopljeni supstancom koja se testira Ukoliko je supstanca mutagena oko natoplenog papira e se pojaviti revertanti u veem broju nego oko kontrolnog filter papira Omoguava i testiranje toksinosti potencijalnog mutagena

Plate incorporation test Testirana supstanca i bakterije se dodaju u soft agar i smea se razliva na povrinu petri olje Na kontroloj petri olji se umesto testirane supstance dodaje rastvara Ukoliko je supstanca mutagena postojae razlika u broju kolonija revertanata u kontrolnoj i test petri olji