09. validacija

Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova

VALIDACIJA FARMACEUTSKIH METODA


Validacija farmaceutskih metoda je postupak

kojim se potvr đuje da je metoda pogodna za

određenu namenu.

Ovde će biti opisana V-TR2AP

(eng. Validated − Transferable, Robust,

Reliable, Accurate and Precise) metodologija.


Sposobnost metode da se ne menja sa malim i namerno izazvanim promenama

Robusnost

Najmanja koncentracija analita koja se može detektovatiLimit detekcije

Najmanja koncentracija analita koja se može kvantifikovati (odrediti)

Limit kvantifikacije

Slaganje u okviru serije merenjaPreciznost

Slaganje između izmerene i teorijske vrednostiTačnost

Interval koncentracija u kome je metoda precizna, tačna i linearna

Opseg

Proporcionalnost između izmerene vrednosti i koncentracije

Linearnost

Mogućnost da se, pod navedenim uslovima, tačno odredi analizirana supstanca u složenom uzorku

Specifi čnost

DefinicijaParametar

Definicije parametara validacije


Planiranje i razvoj metodeU toku planiranja potrebno je:

�Definisati svrhu metode i razmotriti zahteve regulative.

�Prikupiti postojeće informacije o aktivnoj farmaceutskoj supstanci, poznatim srodnim supstancama i komponentama formulacije.

�Razmotriti npr. vreme trajanja i troškove analize, postojeću opremu, dostupnost referentnih standarda, hemikalije koje se koriste, obučenost osoblja, lakoću

primene metode, zahtevanu osetljivost, selektivnost itd.

�Na osnovu rezultata iz studija stabilnosti, utvrditi koje nečistoće se prate kao

specificirane srodne supstance (≥ 0,1 %), a koje kao nespecificirane srodne supstance (njihov nivo je obično između 0,05 % i 0,10 %).

�Razmotriti postojeće podatke, odstupanja i izveštaje koji se odnose na prethodne verzije metode.


(1)procena robusnosti metode,

(2) optimizacija metode,

(3) ispitivanje specifičnosti metode,

(4) provera pogodnosti sistema,

(5) definisanje procedure metode i

(6) uspostavljanje kriterijuma za prihvatanje rezultata

Razvoj metode


1) Procena robusnosti metode

�proizvođač HPLC sistema,

�različite serije kolona,

�dobavljači kolona,

�brzina protoka,

�temperatura kolone,

�pH mobilne faze,

�jonska jačina,

�talasna dužina,

�program gradijenta,

�volumen injektovanja,

�koncentracija uzorka.

Tokom procene robusnosti kod HPLC metode mogu se testirati:


2) Optimizacija metode


3) Specifi čnost metode

Procenom specifičnosti metode osigurava se da je metodom moguće razdvojiti sve prisutne degradacione proizvode kao i nečistoće iz procesa sinteze aktivne farmaceutske supstance.

Specifičnom metodom se postiže tačno određivanje aktivne farmaceutske supstance i nečistoća u prisustvu ekscipijenasa koji ulaze u sastav proizvoda.

Specifičnost metode se određuje preko čistoće pika koja se procenjuje primenom UV detektora zasnovanog na principu fotodioda ili masenogdetektora.


4) Pogodnost sistema

Pri rutinskoj primeni farmaceutske metode očekuje se da ima

karakteristike koje se uklapaju u postavljene zahteve.

Ispitivanje pogodnosti sistema obezbeđuje odgovarajuće

funkcionisanje celokupnog sistema u bilo kom trenutku.

Kriterijumi za prihvatanje rezultata za procenu pogodnosti sistema

treba da budu pravilno izabrani, a u isto vreme ne previše strogi za

rutinske analize.


Kontrolni uzorak ili standard u koncentraciji koja odgovara LOQ; očekuje se odgovor u okviru definisanih granicaKontrolni uzorak – proceniti standarde kao "uzorke“

RSD za pet ili šest injektovanja standarda

Izračunava se:�Retencioni faktor�Broj teorijskih platoa�Tailing faktor�Faktor rezolucije nakon injektovanjaodgovarajuće smeše

Injektovanje razblaženja standarda za potvrdu LOQ/LOD

RSD izračunata za seriju injektovanjarastvora standarda

Linearnost

Tačnost

Preciznost

Selektivnost

LOQ/LOD

Stabilnost rastvora

Test pogodnosti sistema Parametar validacije

Testovi pogodnosti sistema za kontinuirano pra ćenje parametara validacije


Najčešće koriš ćeni parametri za procenu pogodnosti sistema su:

Faktor rezolucije (Rs) je mera razdvojenosti dva pika.

Razdvajanje svih ispitivanih pikova proverava se vizuelno upotrebom

laboratorijske smeše analiziranih supstanci.

Faktor rezolucije ve ći od 1,5 ukazuje da su pikovi razdvojeni na baznoj

liniji.

Faktor rezolucije (R) između dva kritična pika se računa po formuli datoj u

USP i Ph. Eur.

( )21

122

hh

RR

ww

tt

+−

Izraz za izračunavanje Rs po USP glasi :

Rs=

gde je:

– tR1 i tR2 retenciono vreme između 2 susedna pika (tR2 > tR1),– wh1 i wh2 širina pika na baznoj liniji.


Izraz za izračunavanje Rs po Ph. Eur. glasi:

Rs=

gde je:– tR1 i tR2 retenciono vreme između 2 susedna pika (tR2 > tR1),– wh1 i wh2 širina pika na 50 % visine pika.

( )21

1218,1

hh

RR

ww

tt

+−


Relativna standardna devijacija (RSD) koristi se za procenu ponovljivosti. Često

se na početku svake analize računa relativna standardna devijacija za pet ili šest

injektovanja referentnog standarda. RSD se računa prema sledećem izrazu:

1

)(100(%)

2

−−Σ=

n

yy

yRSD i

gde je:– yi – eksperimentalno dobijene vrednosti odgovora (izmerena apsorbancija, površina pika, itd),– – srednja vrednost dobijenih odgovora,– n – broj merenja.

y


Faktor simetrije se koristi za ispitivanje pogodnosti sistema u slučaju da postoji

tendencija razvlačenja pika aktivne supstance ili jedne od srodnih supstanci.

Starenjem HPLC kolone razvlačenje pika postaje sve izraženije, pa se ovaj

parametar tada definiše kao kritični parametar.

Faktor simetrije se računa po formuli datoj u USP i Ph.Eur.

d

wAs 2

05,0=

– w0,05 – širina pika na 1/20 visine pika i– d – rastojanje na 1/20 visine pika od početka eluiranja pika do maksimuma pika odnosno od maksimuma pika do završetka eluiranja pika.

Faktor simetrije - As


Limit kvantifikacije. Injektovanje koncentracije koja odgovara limitu kvantifikacijetokom procene pogodnosti sistema može se koristiti kao provera linearnosti sistema

u okviru opsega od LOQ do 100 % u odnosu na ciljanu koncentraciju aktivne supstance.

Provera referentnim standardima. Za proveru tačnosti standardne procedure merenja mogu se koristiti rastvori referentnih standarda. Sadržaj referentnih

standarda treba da bude od 98,0 % do 102,0 %. Takođe, mogu se pratiti promene u odgovoru sistema preko površine pika referentnog standarda. U toku hromatografske sekvence, promene ne smeju biti veće od ± 2 %, a preporučeno je

da se prate nakon 10 – 12 injektovanja.


5) Procedura metode

1. uvod u kome se definiše namena metode,

2. spisak reagenasa i njihove specifikacije (stepen čistoće); gde je

potrebno navesti odgovarajuće mere opreza,

3. spisak potrebnih standarda,

4. spisak potrebnog laboratorijskog posuđa,

5. spisak potrebne opreme,

6. opis pripreme rastvora (mobilna faza, standardi, uzorci),

7. uslove metode (protok, talasna dužina detekcije, program gradijenta,

proces ekvilibracije, itd),


8. proceduru za pripremu standardnih rastvora i uzoraka,

9. kriterijume za prihvatanje rezultata pogodnosti sistema i način izračunavanja,

10.šemu sekvence, uključujući redosled i broj injektovanja rastvora

standarda, rastvora za proveru pogodnosti sistema, kontrolnih

uzoraka i analiziranih uzoraka,

11.kompletne preračune, uključujući učestalost i način izvođenja kalibracije,

12.tabelu sa relativnim retencionim vremenima analita i relativnim

faktorima odgovora (eng. relative response factors − RRFs),

uključujući i retenciona vremena za pikove ekscipijenasa,

13.reprezentativni hromatogram adekvatno obeležen; može se zahtevati i hromatogram provere pogodnosti sistema.


6) Prevalidacija

Metoda se proverava ispitivanjem:

1. LOQ,

2. Selektivnosti metode nakon:

injektovanja rastvora placeba ili stres uzoraka placeba,

injektovanja rastvora stres uzoraka ispitivane supstance,

injektovanja rastvora poznatih nečistoća i degradacionih proizvoda i

3. Procene čistoće pika uz korišćenje diode array detektora,

4. Linearnosti aktivne supstance u opsegu 50 % – 150 % i

5. Linearnosti srodnih supstanci u opsegu 0,05 % – 2,0 %.


Validacija – eksperimentalni deo


Određivanje specifičnosti metode

Procena specifičnosti se vrši preko "čistoće pika" (eng. peak purity) tj. potvrđuje se da srodne supstance i ekscipijensi ne koeluiraju i ne interferiraju u postupku kvantifikovanja ispitivane komponente.

a. Kada su nečistoće dostupne koriste se za opterećivanje placeba kako bi se odredilo da li postoji interferencija komponenti placeba i ispitivane nećistoće.

b. Kada nečistoće nisu dostupne, FDA smernica Guideline for submitting samplesand analytical data for methods validation navodi nekoliko stres uslova kojima različite aktivne farmaceutske supstance i gotovi proizvodi treba da budu izloženi.


Linearnost i opseg

Opseg za aktivnu farmaceutsku supstancu mora biti najmanje od 50 % do 150 % u

odnosu na ciljanu koncentraciju.

Za nečisto će se pripremaju rastvori standarda u sledećim koncentracijama:

a) koncentracija koja odgovara LOQ,

b) dve intermedijerne koncentracije,

c) koncentracija koja odgovara specifikaciji i

d) koncentracija koja je iznad specifikacijske

(npr. 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% i 1,0%).


Na osnovu dobijenih rezultata, konstruiše se kalibraciona kriva koja

predstavlja zavisnost između eksperimentalno dobijenih rezultata i

koncentracije analita, a matematički se može prikazati na sledeći način:

y = a x + b

gde je:

y – odgovor instrumenta;

x – koncentracija standarda;

a – nagib krive i

b – odsečak na ordinati.


Linearnost se procenjuje na osnovu koeficijenta korelacije i značajnosti

odsečka na ordinati.

Koeficijent korelacije (r) predstavlja stepen rasipanja tačaka oko idealne

prave i mora imati vrednost ≥≥≥≥ 0,9990.

Odsečak b treba što manje da odstupa od nule i njegova značajnost

procenjuje se Studentovim t – testom .

Za svaku tačku na kalibracionoj krivoj treba izračunati odnos površina

pika/koncentracija kao i RSD.


Određivanje limita detekcije i limita kvantifikacije

Limit detekcije (LOD) i limit kvantifikacije (LOQ) određuju se samo za nečisto će i degradacione proizvode.

U protokolu se jasno mora naglasiti kako se određuju LOD i LOQ. Preporuka je da kod eksperimentalnog određivanja LOD bude koncentracija sa odgovorom oko tri puta većim od šuma, a LOQ sa koncentracija sa odgovorom deset puta

većim od šuma.

Prema ICH Q2(R1) smernici ovi parametri se mogu izračunati prema izrazima:

a

SLOD b×= 3,3

a

SLOQ b×

=10

gde je Sb standardna devijacija odsečka kalibracione krive u opsegu

koncentracija od 0,05 %– 1,0 %, a a je nagib ove kalibracione krive.


Procena tačnosti metode

Tačnost metode je mera usaglašenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloženom metodom sa pravim vrednostima. Procena tačnosti često se naziva i Recovery eksperiment . Izražava se kao procenat prinosa (Recovery) određivanja za poznatu, dodatu količinu ispitivanog analitaplacebo smeši.

Tačnost se određuje primenom metode na laboratorijsku smešu ekscipijenasa i dodate određene količine analita.

Preporučuje se da dodate koncentracije analita budu 80 %, 100 % i 120 %u odnosu na propisanu. Potrebno je uraditi najmanje po tri merenja za svaku koncentraciju, izračunati Recovery i prikazati odstupanja koja će odrediti tačnost metode.

Postojanje odstupanja može ukazati na interakcije analita sa ekscipijensima. Dozvoljeno odstupanje iznosi ±±±± 2 %.


Procena preciznosti metode

Preciznost instrumenta ili ponovljivost injektovanja je preciznost procenjena ponovljenim analiziranjem (deset ponavljanja) jednog uzorka radi testiranja karakteristika aparata koji se koristi. RSD mora biti < 1 %.

Ponovljivost (intra–assay precision) dobija se ponovljenim analiziranjem nezavisno pripremljenih homogenih uzoraka u jednojlaboratoriji, od strane jednog istog analitičara, na istoj aparaturi i sa istim setom reagenasa. Procenjuje se u tri koncentracje (80 %, 100 % i 120 % u odnosu na propisanu koncentraciju) sa najmanje tri ponavljanja ili u jednoj koncentraciji sa najmanje šest ponavljanja. Preporuka je da vrednost RSD ne bude veća od 2 %.


Srednja preciznost (intermediate precision) je preciznost procenjena od strane više analitičara, u više različitih dana, na različitim aparaturama, sa različitim setom reagenasa, u jednoj laboratoriji.

Reproduktivnost (inter–laboratory precision) je bitno proceniti ako će se metoda primenjivati u više različitih laboratorija. Izvodi se kako bi se procenilo variranje između rezultata dobijenih u više različitih laboratorija.


Kriterijumi za prihvatanje rezultata

50 % – 150 %70 % – 130 %80 % – 120 %90 % – 110 %

srednja vrednost Recovery za svaki nivo, ukoliko je:0,05 % ≤ x < 0,1 %0,1 % ≤ x < 0,5 %0,5 % ≤ x < 1,0 %x ≥ 1,0 %

Srodne supstance

98,0 % – 102,0 %srednja vrednost Recovery za svaki nivo (80 %, 100 % i 120 %)

Aktivna supstanca

Tačnost

linearnolinearnovizuelna procena linearnosti

≤ 10 %≤ 3 %RSD za RRF

± 15 %± 2 %odsečak na ordinati

> 0,98> 0,99koeficijent korelacije

Linearnost

Nečisto ćeKriterijumi za prihvatanje

rezultata

Aktivna supstancaKriterijumi za prihvatanje

rezultata

Parametar


25 %15 %10 %5 %

RSD, ukoliko je:0,05 % ≤ x < 0,1 %0,1 % ≤ x < 0,5 %0,5 % ≤ x < 1,0 %x ≥ 1,0 %

Srodne supstance (analiza preciznosti – ponovljivosti)

1 %2 %3 %

RSDPreciznost aparataPreciznost – ponovljivostSrednja preciznost

Aktivna supstanca

Preciznost


Ukoliko jedan ili više parametara validacije metode ne zadovolji

postavljene kriterijume za prihvatanje rezultata, rukovodstvo laboratorije treba

da odluči da li:

1. Rezultati ipak mogu biti prihvaćeni uz opravdanje.

2. Treba sprovesti re-testiranje istih uzoraka.

3. Test treba ponoviti (re-analiza).

4. Metoda zahteva ponovni razvoj, jer je odstupanje značajno, nakon čega se

validacija ponavlja.

Odstupanje od rezultata



Dokumentacija za validaciju

Protokol za validaciju treba da sadrži sledeće:

1) Princip/namenu metode;

2) Spisak laboratorija koje su uključene i njihova uloga u validaciji;

3) Kategorizaciju metode u skladu sa ICH ili USP (metoda za identifikaciju,

metoda za određivanje sadržaja, metoda za ispitivanje nečistoća, metoda za

ispitivanje brzine oslobađanja);

4) Spisak reagenasa i standarda, uključujući brojeve njihovih serija;

5) Procedure za procenu svakog parametra validacije i predložene kriterijume za

prihvatanje rezultata;

6) Plan ili proceduru za slučaj da kriterijumi za prihvatanje rezultata nisu

zadovoljeni;

7) Zahteve za finalni izveštaj.


Transfer metoda

Transfer farmaceutske metode se sprovodi kako bi se obezbedilo da:

1. laboratorije koje učestvuju u ispitivanju na pravi način shvate metodu

koja se primenjuje;

2. istraživači u laboratoriji koja primenjuje metodu budu adekvatno obučeni;

3. se pripremi neophodna dokumentacija o uspešnom i potpunom

transferu.


Revalidacija

Izmene metode i dopuna validacije (revalidacija) se mogu zahtevati kada postoje:

1. Izmene opreme (instrumenta);

2. Izmene u sastavu gotovog leka;

3. Izmene u procesu sinteze aktivne supstance;

4. Modifikacije metode;

5. Izmene u analitičkoj proceduri.


Primer validacije RP-HPLC metode

Validacija RP-HPLC metode za odre đivanje

pramipeksola i njegovih ne čisto ća u tabletama


Struktura analiziranih supstanci

pramipeksol dihidrohlorid

Nečisto će

BI-II 751 xx BI-II 820 BS

BI-II 546 CL 2-aminobenzotiazol

BI-II 786 BS


– Tečni hromatograf: Waters Breeze System

– Pumpa: Waters 1525 Binary HPLC Pump

– Detektor: Waters 2487 UV/VIS detector

– Grafička obrada: Breeze Software, Windows XP

Aparatura i reagensi

Hromatografski uslovi

– Kolona: Zorbax Extend - C18 4,6 mm x 150 mm, 5 µm– Mobilna faza: acetonitril–vodena faza (1% TEA, pH 7,0), 15:85 V/V

– Volumen injektovanja: 20 µl– Protok: 1,0 mL min-1

– Temperatura: 25 °C

– UV detekcija: 262 nm za pramipeksol, BI-II 751 xx, 2aminobenzotiazol, BI-II 786 BS i BI-II 820 BS

326 nm za BI-II 546 CL


Hromatogram: BI-II 820 BS (1,435 min), pramipeksol (1,738 min), nepoznata nečistoća 1 (2,010 min), nepoznata nečistoća 2 (2,338 min), BI-II 546 CL (2,929 min), BI-II 786 BS (3,439 min), BI-II 751 xx (5,112 min) i 2-aminobenzotiazol (15,012 min)

Hromatogram smeše standarda


Testiranje robusnosti primenom Plackett-Burman-ovog d izajna

Analizirani faktori i njihovi nivoi

+10–1Dummy 5

+10–1Dummy 4

+10–1Dummy 3

+10–1Dummy 2

+10–1Dummy 1

Zorbax Extend

Zorbax Extend

Zorbax Eclipse

Kolona* C18

302520Temperatura (°C)

1,11,00,9Protok (mL min-1)

7,27,06,8pH mobilne faze

1,11,00,9Sadržaj TEA (%)

161514Acetonitril (%)

Promenljiva

Gornji(+1)

Nominalni(0)

Donji(–1)

Faktorski nivoi

*4,6 mm × 150 mm, 5 µm kolona


Plackett-Burman-ov dizajn eksperimenta

Faktori

+1–1+1+1–1+1–1–1–1+1+112

–1+1+1+1–1+1+1–1+1–1–111

+1+1+1–1+1+1–1+1–1–1–110

–1–1+1+1+1+1+1+1+1+1+19

+1+1–1+1–1–1–1+1+1+1–18

–1+1+1–1+1–1–1–1+1+1+17

–1–1–1+1+1+1–1+1+1–1+16

+1–1–1–1–1–1+1+1+1–1+15

–1+1–1–1–1+1+1+1–1+1+14

+1–1–1–1+1+1+1–1+1+1–13

+1+1–1+1+1–1+1+1+1+1+12

–1–1–1–1–1–1–1–1–1–1–11

LKJHGFEDCBAEksp.


Faktor A – sadržaj acetonitrila (%)

Faktor B – sadržaj TEA (%)

Faktor C – dummy 1

Faktor D – pH mobilne faze

Faktor E – dummy 2

Faktor F – protok mobilne faze (mL min-1)

Faktor G – dummy 3

Faktor H – temperatura (°C)

Faktor J – dummy 4

Faktor L – dummy 5

Faktor K – kolona


Dobijeni odgovori za faktore rezolucije

24,087,901,339,722,6812

20,264,402,007,751,5411

23,292,363,1211,542,0110

14,167,428,0524,264,259

12,914,564,781,192,428

24,011,040,001,911,317

15,204,825,5816,063,636

25,871,584,3715,683,385

22,62,472,1210,342,294

25,4712,343,028,602,203

20,685,110,935,521,472

25,8011,501,706,702,571

R5R4R3R2R1Eksp.

R1 – faktor rezolucije između BI-II 820 BS i pramipeksolaR2 – faktor rezolucije između pramipeksola i BI-II 546 CLR3 – faktor rezolucije između BI-II 546 CL i BI-II 786 BSR4– faktor rezolucije između BI-II 786 BS i BI-II 751 xxR5 – faktor rezolucije između BI-II 751 xx i 2-ABT


Efekti faktora i rezultati za E critical i ME

4,77095,62502,976611,5448

1,6152ME (0,995; m)

3,22473,95472,09278,18101,1446ME (0,975; m)

4,53404,55701,695310,9523

0,4537E critical ( α=α=α=α=0,01)

2,71502,72881,01516,55830,2717E critical ( α=α=α=α=0,05)

1,71200,3670–0,3160–2,4620–0,2380Dummy 5

–1,1400–4,2700–1,8500–7,1280–1,2780Kolona

1,5020–2,68300,12303,74200,0983Dummy 4

–6,62500,48701,39001,62200,3712Temperatura (°C)

–1,45200,11300,73402,7520–0,0017Dummy 3

1,24500,5130–0,44401,4580–0,1750Protok (mL min-1)

0,62500,19000,66304,17200,0850Dummy 2

–4,3480–0,31803,17306,47801,0350pH

–1,1480–1,33700,4160–2,8150–0,1320Dummy 1

–1,31200,99330,2665–1,20500,0917TEA (%)

1,758–3,2770–1,3890–0,1350–0,0383Acetonitril (%)

R5R4R3R2R1Faktori


Procena efekata faktora

D+H–HD+H–DR5

–––K–A+D+KR4

D–DDD+KA+D+H+KR3

–––––KR2

K+D––K––R1

(f)(e)(d)(c)(b)(a)Odgovor

(a) Značajni efekti za α=0,05 procenjeni primenom metode „efekata koji se mogu zanemariti“(b) Značajni efekti za α=0,01 procenjeni primenom metode „efekata koji se mogu zanemariti“(c) Značajni efekti za α=0,05 procenjeni primenom Dong-ovog algoritma(d) Značajni efekti za α=0,01 procenjeni primenom Dong-ovog algoritma (e) Značajni efekti procenjeni primenom half-normal probability grafikona(f) Značajni efekti procenjeni primenom Pareto dijagrama


Intervali „nezna čajnosti“ za zna čajne faktore (dummy promenljive i Dong-ova metoda)

6,85 – 7,1521,35 – 28,65

6,88 – 7,12–

DH

R5

––

14,17 – 15,836,83 – 7,17

AD

R4

–6,87 – 7,13

–

14,27 – 15,736,94 – 7,06

21,35 – 28,65

ADH

R3

–––R2

–––R1

Interval na osnovu Ecritical iz Dong-ovog algoritmaαααα = 0,05

Interval na osnovu Ecritical za dummypromenljiveαααα = 0,05

Značajni faktorOdgovor


OdgovoriFaktori

–1+1+1+1+1Kolona

+1–1–1+1–1Temperatura (°C)

–1–1–1–1–1Protok (mL min-1)

+1–1–1+1–1pH mobilne faze

+1+1+1+1+1Sadržaj TEA (%)

–1+1+1–1+1Acetonitril (%)

R5R4R3R2R1

Faktorski nivoi za „najgori slu čaj“


Vrednosti SST limita za „najgori slučaj“

33333n

0,0950,0850,0760,0560,055Sd

14,261,140,081,241,36Mean

14,271,200,101,301,363

14,351,170,151,231,422

14,161,040,01,191,311

R5R4R3R2R1Eksp.

1,36 –

2,92 3

055,0=

1,27

1,24 –

2,92 3

056,0

= 1,15

0,08 –

2,92 3

076,0 =

0,0

1,14 –

2,92 3

085,0 =

0,99

14,26 –

2,92 3

095,0 =

14,09


Parametri za procenu kalibracionih krivih zapramipeksol i njegove ne čisto će

1,2921,1170,1221,6250,3250,332tb

0,99950,99990,99971,0000,99890,9999r

– 2,260,259– 0,0510,220,516,38Odsečak (b)

166,761,2551,95105,80100,7226,62Nagib (a)

0,02–2,04 – 400Opseg koncentracija

(µg mL-1)

2-aminobenzotiazol

BI-II 751 xx

BI-II 786 BS

BI-II 546 CL

BI-II 820 BS

PramipeksolParametar

a – nagib, b – odsečak prave y = ax + b

r – koeficijent korelacije

tb – statistički parametar sa vrednošću nižom od tabelarne (ttab)

ttab = 2,364 (p = 0,05; n = 8)


Preciznost RP-HPLC metode

1,960,204±0,0040,22-aminobenzotiazol

1,490,201±0,0030,2BI-II 751 xx

2,050,195±0,0040,2BI-II 786 BS

1,970,203±0,0040,2BI-II 546 CL

1,520,198±0,0030,2BI-II 820 BS

0,7739,4±0,31*40Pramipeksol

RSD(%)

Određeno(µg mL -1)

Injektovano(µg mL -1)

Supstanca

* Standardna devijacija, SD (n = 6)

Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaTačnost RP–HPLC metode

102,20,245±0,0030,24

101,10,202±0,0020,20

98,20,157±0,003*0,162-aminobenzotiazol

98,50,236±0,0040,24

101,00,202±0,0040,20

101,60,163±0,004*0,16BI-II 751 xx

100,70,242±0,0020,24

101,60,203±0,0020,20

101,40,162±0,003*0,16BI-II 786 BS

98,90,237±0,0070,24

101,20,202±0,0080,20

100,10,160±0,004*0,16BI-II 546 CL

100,40,241±0,0050,24

97,90,196±0,0050,20

103,20,165±0,001*0,16BI-II 820 BS

102,649,25±0,4348

100,740,28±0,0540

102,232,70±0,13*32Pramipeksol

Recovery(%)

Određeno(µg mL -1)

Injektovano(µg mL -1)

Supstanca


Za sve nečistoće: LOD je 5 ng mL–1, a LOQ 15 ng mL–1.

Limit detekcije i limit kvantifikacije

Na kraju, validirana RP–HPLC metoda je primenjena za analizu pramipeksola i

njegovih nečistoća u Mirapexin® tabletama.

Sadržaj pramipeksola bio je 96,8 %.

Utvrđeno je da je sadržaj nečistoće BI-II 820 BS 0,46 %, što je u skladu sa

zahtevanim okvirima (< 0,5 %).

Sadržaj ostalih nečistoća bio je ispod limita detekcije predložene i validirane

RP–HPLC metode.

Primena metode na tablete


09. validacija

Documents