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Clonación de fragmentos de DNA
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MiniprepsPreparación de plásmido por lisis alcalina
Disolución P1•Tris 50 mM pH 8.0•EDTA 10 mM
+ RNasa 0.1 mg/ml
Disolución P2•NaOH 0.2 N•SDS 1%
Disolución P3•Acetato potásico 3M•Áciso acético 11%
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research 7(6):1513-1522
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for the isolation of plasmid DNA. Methods in Enzymology 100:243-256
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Endonucleasas de restricción
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Reacción catalizada por la DNA Ligasa
Lehninger. Principios de Bioquímica
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La defosforilación con fosfatasa alcalina evita el religado del vector
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La Fosforilación con polinucleótido quinasa facilita la ligación de fragmentos de DNA
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Síntesis en fase sólida de una cadena de DNA por el método del triéster fosfito
(Dimetoxitritilo)
(-cianoetil)
Finalmente se añade NH3 para eliminar los grupos protectores y liberar el oligonucleótido del soporte sólido
SÍNTESIS QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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PUNTOS CLAVE DE UNA DNA POLIMERASA
• Fidelidad. La mantiene en dos etapas:
– Sólo forma enlace fosfodiéster si el nucleótido entrante está correctamente empareado con el molde (error 10-4).
– Si el emparejamiento ha sido incorrecto y aun así se ha formado enlace, lo hidroliza con su actividad 3’ exonucleasa (error final 10-6)
• Eficiencia catalítica.
– Depende fundamentalmente de la procesividad (1minuto asociación-reasociación enzima-DNA; 1milisegundo adición de cada nucleótido)
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COMPARACIÓN DE LAS DNA POLIMERASAS I, II Y III DE E. Coli
Lehninger. Principios de Bioquímica
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Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado
Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A
- DNA polimerasa- Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C -3´
5´--C T T A A G C G A T T A -3´
5´--C T T A A G C G A T T -3´
5´--C T T A A G C G A T -3´
5´--C T T A A G C G A -3´
5´--C T T A A G C G -3´
5´--C T T A A G C -3´
5´--C T T A A G -3´
Detector de fluorescencialáser
Separación de los
fragmentos de DNA
marcados, mediante
electroforesis capilar
-
+
G C G A T T A C G . . .
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1 tggtcttcagATGTCTGATTCGCTAAATCA 150 accagaagtcTACAGACTAAGCGATTTAGT
31 TCCATCGAGTTCTACGGTGCATGCAGATGA 120 AGGTAGCTCAAGATGCCACGTACGTCTACT
61 TGGATTCGAGCCACCAACATCTCCGGAAGA 90 ACCTAAGCTCGGTGGTTGTAGAGGCCTTCT
91 CAACAACAAAAAACCGTCTTTAGAACAAAT 60 GTTGTTGTTTTTTGGCAGAAATCTTGTTTA
121 TAAACAGGAAAGAGAAGCGTTGTTTACGGg 30 ATTTGTCCTTTCTCTTCGCAACAAATGCCc
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Marcaje de sondas de DNA“Random primer”
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
DNA polimerasadATP, dGTP, dTTP, 32P-dCTPOligonucleótidos aleatorios
TAAAGC-5´
5´-GCGCCC 5´-TGGCACCGCATTTCGGA-3´GGTATTCGTAGT
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCG
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Sistemas de expresión bacterianos
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Sistemas de expresión bacterianos basados en la RNA polimerasa de T7
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Sistemas de expresión bacterianos: precipitación de proteínas recombinantes
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Sistemas de expresión bacterianos: “refolding” de proteínas recombinantes
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Utilización de transcriptasa reversa para obtener cDNA
IVIII V VI VIIIVII II I exonesDNA
Pre- mRNA
mRNA maduro AAAA
Transcripción
Maduración
TTTTAAAA
Transcripción reversa
cDNA
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Eliminación en la mayoría de los casos de la formilmetionina en procariotas y de la metionina iniciadora en eucariotas en el extremo N-t.
• Fosforilación de ciertos residuos de Ser, Thr y Tyr en algunas proteínas.
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Unión de grupos lipídicos (isoprenilación, palmitoilación, miristoilación)
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Glicosilación (adición de glúcidos) de residuos de Asn mediante enlaces N-glicosídicos o de residuos de Ser o Thr mediante enlaces O-glicosídicos.
• Formación de puentes disulfuro.
• Modificación proteolítica. Algunas proteínas, como la insulina, la tripsina, la quimotripsina, se sintetizan como precursores inactivos, y han de ser procesadas proteolíticamente para dar sus formas activas, más pequeñas.
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Envío de proteínas al Retículo Endoplásmico
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Sistemas de expresión en células animales
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Introducción de DNA en células animales
• Carácter transitorio. El DNA sólo es introducido en parte de las células del cultivo. No se aplica selección. El cultivo se recoge y analiza al cabo de unos pocos días.
• Carácter estable. El vector debe contener un marcador (p.ej. un gen de resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células en las que se ha introducido el DNA e integrado en el genoma. Se pueden aislar clones individuales o trabajar con toda la población.
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Introducción de DNA en células animales
• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI)
• Fosfato cálcico
• Lípidos catiónicos
• Transducción.
• Partículas virales. Retrovirus
• Microinyección
• Electroporación.
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Introducción de DNA en células animales• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI), FuGENE
• Fosfato cálcico• Lípidos catiónicos (Lipofectamina)
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Introducción de DNA en células animales
• Electroporación.
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Introducción de DNA en células animales• Transfección transitoria: éxito parcial
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Introducción de DNA en células animales
• Transducción
Célula empaquetadora
Célula diana
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Introducción de DNA en células animales
• Transducción
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Sistemas de expresión inducibles
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Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles
collagen II tTA
Collagenase 3TRE
doxicyclin
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collagen II tTA
Collagenase-3TRE
doxicyclin
Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles
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