1 aufnahmestudien orthotopes tumormodell stand: 29.05.2006
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Aufnahmestudien
Orthotopes Tumormodell
Stand: 29.05.2006
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Durchführung I
• Tier: Maus c57/B16
• Tumorzellimplantation: 2·105 MB 49-Zellen
• Makrohämaturie intermittierend (zeitweilig aussetzend) bei allen
Tieren nach 20 Tagen, nur Maus 2 noch am Therapietag
• Therapiebeginn:
• Tag 26
• Narkose mit Pentobarbital, Kathetereinlage
• Therapie mit Instillation und sofortiger Katheterentfernung
(entspricht Wirkdauer von etwa 1h)
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Durchführung II
Therapie:
• Maus 1 50 µl intravesikal 10 µM siRNA
• Maus 2 50 µl intravesikal 1 µM siRNA
• Maus 3 50 µl intravesikal 0,25 µM siRNA
• (Bemerkung: bei Maus 3 para gelaufen daher
fragliche Therapie)
• Maus 4 50 µl intravesikal 10 µM siRNA + DOTAP (1:1)
• Maus 5 50 µl intravesikal 1 µM siRNA + DOTAP (1:1)
• Maus 6 50 µl intravesikal 0,25 µM siRNA + DOTAP (1:1)
• Maus 7 50 µl intravesikal PBS
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Durchführung III• Opferung:
• Tag 27, 12h nach Therapie
• Blasengewicht
• Maus 1 25 mg
• Maus 2 63 mg
• Maus 3 40 mg
• Maus 4 19 mg (wahrscheinlich kein Tumor)
• Maus 5 49 mg
• Maus 6 28 mg
• Maus 7 45 mg
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Durchführung IV
• Aufarbeitung:
• Kryokonservierung von Blase und Nieren (jeweils mit Harnleiter)
• Blasen aufgeschnitten Tumor nach oben auf Korkblättchen
• Gefrierschnitte
Bemerkung: aufgrund der gewellten Gewebe konnten nie vollständige
Schnitte angefertigt werden und innerhalb der Schnitte sind z.T. alle
Schichten der Blasenwand vertreten
• Fluoreszenzmikroskopie
• von einigen Ebenen HE-Färbungen und Begutachtung durch Pathologen
• die Nieren und Harnleiter wurden noch nicht aufgearbeitet
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Fluoreszenzmikroskopie• DAPI-Färbung der Zellkerne
• Detektion der FITC- und DAPI-Fluoreszenz mittels
Fluoreszenzmikroskopie
• Deutlich sichtbar: Bereiche stark vergrößerter, verdichteter Zellkerne
Vergleich mit HE-Färbungen zeigte, dass es sich um Tumorbereiche
handelt
HE-FärbungenAusbreitung der Tumoren:
• Tumoren wachsen hauptsächlich oberflächlich; bei Maus 7 aber
definitiv muskelinvasiv; bei anderen Mäusen z.T. nicht genau
feststellbar
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200 µm 200 µm
200 µm200 µm
A
B
C
D
A Maus 1, B Maus 2, C Maus 3,
D Maus 2, HE (gleicher Ausschnitt wie Fluoreszenzbild)
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200 µm200 µm
Maus 1:Maus 1:
links: Fluoreszenzmikr., rechts: HE-Färbung (gleicher Ausschnitt)
FITC in Muskelschicht
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Maus 7, 100fache Vergrößerung
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Ergebnisse• Maus 1 bis 3: deutlich sichtbar Abnahme der FITC-Fluoreszenz in der
Blasenwand (Folie 7)
• Sichtbar am HE der Maus 2: FITC nur in Urothelschicht (Folie 7)
• Bei Maus 1 konnte geringe FITC-Intensität auch in Muskelschicht detektiert
werden (Folie 8)
• Maus 4 bis 6:
• ns-siRNA + DOTAP
• geringere Fluoreszenzintensität als bei Maus 1 bis 3 (ohne Lipidcarrier
applizierte Konstrukte) alle Bilder liegen bei
• Maus 7:
• PBS-behandelt keine FITC-Fluoreszenz detektiert (Folie 9)
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Bemerkungen
• alle aufgenommenen Fluoreszenz- und HE-Bilder liegen bei
die Vergrößerung und die Schnittebene („E“; Blasen wurden von oben {E.1} in
Richtung Korkblättchen geschnitten) sind jeweils im Dateinamen angegeben
Fluoreszenzaufnahmen: es wurden jeweils die DAPI- (c2) und FITC-
Fluoreszenz (c1) extra aufgenommen und übereinander gelegt (c1+c2)
• HE-Färbungen: hier wurden jeweils Fotos von den Bildausschnitten gemacht,
von welchen auch Fluoreszenzaufnahmen vorlagen;
von Maus 3 liegen keine HE-Bilder vor, da die Schnitte größtenteils vom
Objektträger abgespült waren