1. espectrofotometría libro
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7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
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en
el
diagnóstico
clínico.
Clínica.
Barcanova,.
Diagiróstico
y
trata-
laboratorio.
Salvaf
19gg.
Gómez
C.
procedi-
Cl"ínica.
Recogid4
tans-
las
muestras.
SEMC;2003.
SánchezJE,
Gómez-Lus
López
I,
To¡¡eblanca
Gil
Microbiología
Clínica.
Reco-
de
las
muestras.
l.INTRODUCCIÓN
Hoy
en
día,
el laboratorio
dínico
dispone
de
una amplia
variedad
de
técnicas instrumentales
que
utilizan
distintos
métodos
para
la
medición
de
una
gran
variedad
de analitos.
El
obietivo
de este
tema
es
explicar,
de
forma
breve, los
principios
fisicos y
quimicos
de los mé-
todos analíticos.
2.
PRINCIPIOS DE INSTRUMENTACIÓN
2.1.
Técnicas
espectrales
2.L. 1.
Espectrofotometría
de
absorcién
La
absorción
espectrofotométrica
en
las re-
giones
visible
y
ultravioleta
del espectro electro-
magnético
es
un
método
cuantitativo habitual-
mente
empleado
para
sustancias orgánicas
e
inorgánicas. Con
esta
técnica
se
mide la absor-
bancia
o
transmitancia
de una solución, antes
y
después
de
hacerla
reaccionar
con
un
reactivo
(Figura
1).
La espectofotomehía
de absorción
de
inftano-
ios
es
adecuada
para
el análisis de sustancias
or-
gánicas,
ya que
los
enlaces
en
alquenos,
ésteres,
alcoholes y
otros
grupos
funcionales, absorben la
radicación
infrarroja
en
una gran diversidad
de
frecuencias,
refleiándose
ésta
en
el
espectrógrafo
en foima
de
picos.
Esparcimiento
lumini{cenca
Figura
1..
Fundamento
de
la
espechofotometría,
2.
1.
1-. 1. F
otómetros
y
espectrlfltómetros
Se
denominan
fotómetros
o colorímetros a los
instrumentos
que
uülizan
filtros
para
aislar una
región
o
parte
del espectro¡
mientras
que
los
ins-
trumentós
que
emplean
redes
de
difracción
o
pris-
mas
son
llamados
espectrofotómetros.
2.1.1.2. Absorción
de
luz y lE
de
Beer
La
radiación electromagnética
está
caracteri"
zadapor
mediode.la longitud
de
onda
(1,)
y
de
la ftecuencia
(u).
La
relación
entre
la
energía
de
los fotones
y
la frecuencia
está representada en
11
Principios
de
instrumentacién.
Metodologías
instrumentales
en
el laboratorio
clínico, Selección,
evaluacién
y compamción
de
métodos
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
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12. BioquÍmica
clínica:
de ia
patologÍa
al
laboratorio
Fuente
de luz
Filtro
o
monoc¡omador
lt
f
I >l
----1--'
Luz
monocromática
Detector/fotomultiplicador
^--)
L>('-t
_/
Luz
monocromáüca
transmitida
§dectms de
lo
¡rrr¡r¡én
de b l6qg
r¡*r:r
por
medio
l¡ftu
sm dispo§t
rnsolomataial,
hhngitrd&ond
&tongiardes.
Figura
2. Esquema
de
un
Muestra
la ecuación:
E
=
hu, donde
h
es
la constante
de
Plank.
La frecuencia
está
relacionada
con la lon-
gitud
de
onda por
medio
de
la siguiente
ecuación:
u
=
c/L.
El ojo
humano
es
sensible
a luz
de longitud
de
onda
entre
380
y
750
nmr pero
los
instrumentos
actuales
permiten
realizar medidas,
tanto
< 380
nm
(ultravioleta,
UV) como
a
>
750
nm
(infra-
noio,IR).
Los
métodos
fotométricos
o colorimétricos
de-
terminan
la concentración
de
una sustancia
en
solución
a
partir
de la
medida
de la luz absorbida
a
una
determinada
longitud
de
onda.
La
ley
de Lambert-Beer
establece que
la con-
centración
del
analito
es directamente
proporcio-
nal
a
la cantidad
de
luz absorbida
(absorbancia)
o
inversamente proporcional
a la
canüdad de
luz
transmitida
(transmitancia)
hasta
un
detector.
A
=
abc
=
Iog 100/T.
A
es la
absorbancia,
a
es
el
coeficiente
de
absorción, b
es
el paso
de
luz
en
cm,
c
es la
concentración
del
analito
y
T la trans-
mitancia
en
0/o
(definida
como
la
relación
en
por-
centaje
entre la
intensidad
de
luz transmitida
I
e
incidente
Io).
Hay que
tener
en
cuenta
que
la
ab-
sorbancia
no
es
directamente
cuantificable,
sino
que
es calculada por
la fórmula
matemática
an-
teriormente
expuesta.
Esta
ley tiene varias
limitaciones.
Las desvia-
ciones
de Ia
misma
son
variaciones
en
la linea-
lidad
de
la
absorbancia
contra
la concentración
y
ocurren
cuando:
.
Se
miden
concentraciones
muy
elevadas.
'
La
radiación
incidente
ilo
es
monocromática.
.
La absorción
dei
solyente
es significativa.
.
Existencia
de fenómenos
de luz
enáüca
(ener-
gía
radiante
que
alcanza
al
detector
a
longitu-
des de
ondas
distintas a
las establecidas
por
el
monocromador).
.
Los lados
de
la
celda no son paralelos.
2.1.1.3
.
Componentes
de
un espectrofltómetrl
La
radiación
es emitida por
una
fuente
de
¡a-
diación,
el
monocromador
selecciona
una deter-
minada longitud
de onda que
incidirá sobre
la
cubeta
de análisis,
donde
se
producirá
Ia absor-
ción
de
parte
de la
radiación,
el resto de
Ia misma
alcanzará
el
detecto¡
donde
se
transforma
enuna
señal
eléctrica cuantificable (Figura
2).
,
2.I.1.3.7.
Fuentes de
radiación
.
La
fuente
de luz
más empleada
en el espectro
visible
es la
lámpara
de
tungsteno.
.
La
lámpara
de cuarzo
halógeno
se
caracteriza
porque
el
filamento
se
encuentra
en
una
at-
mósfera
de
vapor
de
yodo
o
bromo
a baia
pre-
sión,
que
aumenta
la
üda
útil
de
la misma
y
proporciona
una intensidad
adecuada
en el es-
pectro
visible.
.
Las
lámparas
de hidrógeno
o deuterio
emi-
ten
un
espectro continuo,
siendo utilizadas
para
realizar
determinaciones
en
la
región
ul-
travioleta
(220
a
360
nm).
.
Las lámparas de vapores
de
mercurio produ-
cen
un
espectro
discontinuo
o de
líneas
(313,
365, 405, 436
y
546
nm).
.
Las
fuentes
láseq
por
su
parte,
permiten
dis-
poner
de
radiación
monocromática
y
cohe-
reilte
eü
la
región
visible-IR.
hhmmmomdon
Qlm¿a
por
una red
tfurenmespecroyla
*r¡ida
por
medio
de
Cmscepción de lo¡
n
lr
luz
obtenida
por
u
&mde
no
es
monocro,
GEes
un intervalo
de
GÍe
causa,
se
hafi
definid
r
¡*nchodebanda(eselr
de
onda que
salen
de
de
longitudes
de
onda
.
Lm¡gitud
de
onda no¡
onda donde
se
produc
hrminosa
del haz
de
h
titr-o selector de
longin
Fxisten diferentes
disp
nes
de
lentes y
espejos
p
tfi¡s atravesar
la cubeta d
{§
(habituaknente,
de
plá
finalmente
el detector.
[,os espectrofotómeto
cionan una
mayor calida
miten
la corrección
auto
deficiencias
ópticas
(Figu
2-1.1.3.3.
Detectores
L,os
detectores común¡
.
[¿s
celdas
con
capa de
o
fotocélulas).
Estan
«
mina
de cobre
o hierrc
locado
una
lámina
sen
cuproso
o
selenio.
Esta
una lámina de metal
t
como
electrodó colectr
resistentes, relativamer
sibles
desde
la
región
1.000 nm.
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
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Principios de instrumentación.
Metodoiogias instrumentales
en el
laboratorio
clÍnico...
.
13
2.1.1.3.2.
Selectores
de longitud de
onda
La
selección
de la
longitud
de
onda deseada se
puede
realizar
por
medio
de filtros
o monocro-
madores.
Los
filtros son dispositivos sencillos, compues-
tos
por
un
solo
material,
que
transmite
selectiva-
mente
la
longitud
de
onda
deseada,
absorbiendo
el
resto
de
longitudes.
En
los
monocromadores,
la
energía
radiante
es
dispersada
por
una
red de difracción o
por
un
prisma
en
un
espectuo
y
la
longitud
de
onda
dese-
ada
se aísla
por
medio
de
hendiduras
mecánicas.
Con
excepción
de
los
disposiüvos ópticos
lá-
se¡
la luz
obtenida
por
un
selector de longitud
de
onda
no es
monocromática, sino
que
real-
mente
es un intervalo
de
longitudes
de
onda.
Por
esta
causa, se
han
definido diferentes
términos:
.
Ancho
de
banda
(es
el
intervalo
de
longitudes
de
onda
que salen
de
un
dispositivo
selector
de
Iongitudes
de onda).
.
Longitud
de
onda
nominal
(es
la longitud
de
onda donde
se
produce
el
pico
de
intensidad
luminosa del
haz
de
luz
que
sale
del
disposi-
tivo
selector
de longitud de onda).
Existen diferentes dispositivos
y
confi
guracio-
nes
de
lentes
y
espejos
para asegurar que Ia luz,
tras ahavesar la cubeta donde se realiza el
análi-
sis
(habitualmente,
de
plástico
o cuarzo),
alcance
finalmente el detector.
Los
espectrofotómetros
de
doble haz
propor-
cionan una mayor
calidad analítica
ya que
per-
miten
la corrección automática
de
los
errores
o
deficiencias ópticas
(Figura
3).
2.1.1.3.3. Detectores
Los
detectores
comúnmente utilizados son:
.
Las celdas
con
capa
de
barrera
(fotovoitaicas
o fotocélulas).
Están constituidos
por
una lá-
mina de cobre o
hierro
sobre
el
que
se
ha
co-
locado una iámina semiconductora de
óxido
cuproso
o
seienio. Esta capa está cubierta
por
una lámina
de
metal transparente
que actúa
como
eiectrodo colector.
Estos
detectores son
E F
=
_Absorción
ffi tf
de
la
muestra
Muestra Referencia
Figura 3. Esquema de espectrofotómetro de doble
haz.
l/
ffi^)_1
¡\
Lampara
(fuente
de luz)
'ffi+,
uestra
i
:.:;
.:i
Ir
=r:ática
(ener-
a longitu-
por
el
:e:i"Jos.
r-.r
fuente
de
ra-
una
deter-
-=ddirá
sobre
la
la
absor-
=so
de
la
misma
enuna
a
el
espectro
§e
caracteriza
if,?
en
una
at-
:r--{tro
a
baja
pre-
Je
la
misma
y
¡e:¡ada
en
el es-
:
Jeuterio
emi-
=--..do
utilizadas
:e la región
ul-
-¿ra¡rio
produ-
:
de
líneas (313,
permiten
dis-
:.
t
J
1
:1
{
t
,
i
t
i
¡
t
,'
¡
I
I
I
t
I
¡
.
Los
clásicos tubos fotomultiplicadores.
Es
un
tubo electrónico
capaz
de ampiificar
la co-
rriente, Presentan un tiempo muy corto
de
respuesta.
.
Fotodiodos: son semiconductores
que
cam-
.
bian su
volta¡e
de carga
cuando
les
incide
la
",
luz. Los cambios de
voltaje
se
transforman
en
li
corriente
y
la corriente es cuantificada.
Un
fo-
todiodo está compuesto
por
una
mah'iz bidi-;i
mensional
de
cientos
de
finos semiconducto-';
res colocados
muy
cercanos
entre
sí.
La
señal eléctrica
producida
por
el
detector
es analizada
en
un microprocesador
y
regis-
trada.
A la
hora
de establecer cuál es
la
longitud
de
onda idónea
para
medir un analito, hay
que
te-
ner
en
cuenta
que, si
encontramos
en el
espec-
tro
de
absorción
(absorbancia
frente
a longitud
de
onda),
un
pico
bien definido,
es
meior utili-
zar la longitud de
onda
a la
cual
se obtiene la
absorbancia máxima de
ese
analito,
ya que
el
análisis,
realizado
en
esta longitud de
onda
es
más sensibie
y
específico
que para
otras longi-
tudes
de
onda.
Para corregir Ias
interferencias
de
fondo
se
puede
utilizar
la
corección
de
Allen,
que
consiste
en determinar
la absorbancia
ala
Iongitud
de onda
máxima
y
a
otras
dos longi-
tudes de
onda
habitualmente
equidistantes, cal-
resistentes,
relativamente económicos
y
sen-
culándose
Ia
media
de las
dos
últimas
para ob-
sibles
desde
la
región ultravioleta
hasta
los
tener una
línea base
balo el
pico
que puede
1.000
nm.
sustraerse de
la abso¡bancia
máxima.
:'rática
y cohe-
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14
.
Bioquímica
clínica:
de
la
patología
al
laboratorio
Sincronizados
Lámpara
de
cátodo
hueco
,/
Choppet
giratorio
Registrador
Combustible
oxrdañte
Monocromador
,
Muestra
Figura
4. Esquema
de
un
espectrofotómetro
de absorción
atómica-
2.1.2.
Espectrofotometría
de
reflectancia
Es
una
variante
de
la espectrofotomeüía
de ab-
sorción,
la
única
variación consiste
en
que
la
luz
remanente es
refleiada
y
esta
luz
refleiada
es
Ia
que
se
mide.
En
este caso se
utiliza
el
término
de
densidad
de
reflacción
o
de
reflección
para des-
cribir
la
absorción
de
luz
por
los cromóforos.
La
densidad
de
reflección
está
relacionada
con
la
intensidad de
luz reflejada
por
una
muestra.
La
ecuación
que
relaciona
esto es
la
siguiente:
Dn
=
log
Go/Rr)
Siendo
Du
la
densidad
de
reflección;
Ro, la
luz
refleiada
por
un
material
estándar (usualmente,
sulfato
de
bario)
y
R1,
la
luz reflejada
por la mues'
tra
estudiada.
2.1.3.
Espectrofotometría
de
absorción
qtómica
La
espectrofotometría
de absorción
atómica
es
usada
en
el
laboratorio
clínico
para
la
determina-
ción
de
calcio,
litio,
plomo,
cinc
y
otros
metales.
Los
elementos
a
estudiar son
átomos disociados
en estado
basal
(no
excitados
y
no
ionizados)
en
el
que pueden
absorber
radiación
en
un
estrecho
paso de banda.
Estos
átomos
vaporizados en
es-
tado
basal absorben
luz
en intervalos
de
longitud
de
onda definidos
muy
estrechos.
La
energía
de
éstos
es
similar a
la
que el elemento
emitiría
si
fuese
previamente excitado.
Las
bandas de
absc.,r-
ción
son
de
0,001
a
0,01
nm
de ancho,
por
lo
que
el espectro
completo del elemento
a
estudiar
se
denomina
espectro
de línea.
La
espectrofotome-
tría
de
absorción
atómica
se
diferencia
de
la emi
sión
en
que
todos
los átomos
disociados
pueden
absorber
radiación
mientras
que,
en el
de
emi-
sión,
sólo
una
pequeña
proporción
de
átomos
re-
sultan excitados
y
son
los
que pueden emitir.'
2 .1
.3.1. Espectrofotómetros
de
absorción
stómica
Básicamente
está
constituido
por una fuente
de
radiación,
un
mechero,
un filtro monocromá-
tico
y
un detector
(Figura
4).
2.1.3.L.1.
Fuente
de
radiación
La Iámpara
de cátodo
hueco
es
la forma
más
práctica
de
generar
un
espectro
de
Iínea.
Las
Iám-
paras
tienen
un
cátodo hueco o en
forma de
copa,
que está
recubierto
con
el
metal
puro
del ele-
mento a
estudiar
o de
una
aleación apropiada.
Se
utiliza
una lámpara
diferente
para cada
elemento,
excepto
en
algunos
casos
en
que
el
cátodo
está
fabricado
de
forma
que
sirve
para
dos o
tres
ele-
mentos
diferentes.
Cuando se
aplica una corriente
entre
los electrodos
situados
en
una
atmósfera de
un
gas
inette,
como
neón
o argón
a
baia
presión,
se
produce una radiación
de
longitud
de
onda
es-
pecífica del
metal o
aleación
de
que
está
formado
ei
cátodo.
?,.1.3.1.2.
Quemador
La
muestra
debe
Pasar
ser
utilizada
en
el
esPecfiof
atómica.
La
muestra
se
co
rosol
mientras
se
introdu
Droceso
se
le
denomina
n
,udor
se
considera
Parte
d
terior
de
la
llama,
el
solve
dose
Partículas
micrr
desintegradas
baio
la
in
producir
átomos.
El
aceü
más
usado
en
el
quemad
En
las
muestras
clínica
tipos
de
mecheros:
.
Mecheros
de
Premez
tra
es
asPirada,
volati
.
Mecheros
de
consur
muestra
es
asPirada
a
un
fluio
de
gas
de
al
Porcionan
mayor
te
aseguran
la
comPleta
Puestos
aunque
son
primeros.
Como
alternativa
al
desarrollado
oüos
Proce
mar
la
muestra
en
vaPo
plazada
la
llama
Por
o
ción:
.
Uno
de
estos
Procesc
el
mercurio
en
vapo
de
reacciones
quím
.
En
otra técnica emP
en
un
tubo
o
Plataf
cla
se
vaPoriza
en
un
una
corriente
elécüi
Para
crear
instantán
lo
suficientemente
zar
el
comPuesto
a
En
estos
equiPos
si
un
método
de
conecc
basada
en
el
efecto
Ze
mientos
se
melora
la
la
determinación
de
t
ñas
muestras
de
sang
F,l
filtro
monoüor
nar
la
radiación
Pro<
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
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Principios de
instrumentación. lvfetodologías
instrumentales
en el
laboratorio
clínico...
'
15
nm
de
ancho,
por
lo
que
elemento
a
estudiar
se
La
espectrofotome-
se diferencia
de
Ia emi-
disociados
pueden
que,
en
el
de
emi-
de
átomos
re-
pueden
emitir.,
de
absorción
atómica
por
una
fuente
un
filtro
monocromá-
4).
hueco
es la
forma
más
de
línea.
Las lám-
o
en
forma
de
copa,
el
metal
puro
del
ele-
aleación
apropiada.
Se
para
cada
elemento,
en
que
el cátodo
está
dos
o
tres
ele-
se aplica
una
corriente
en
una
atmósfera
de
o
argón
a
baia presión,
de
longitud
de
onda
es-
de
que
está
formado
Ll.3.l.Z.
Quemador
l¿
muestra
debe
pasar
al
estado
gaseoso
para
sutilizada
en el especrrofotómetro
de absorciÓn
¡tómica.
La
muestra
se
conYierte en
un
fino ae-
rcsol
mientras
se
introduce
en
la llama. A
este
proceso
se Ie
denomina
nebulización. EI
nebuli-
zador
se considera parte del quemador. En
el
in-
tsior
de
la llama,
el solvente
se evapora,
Iiberán-
dose
partículas
microscópicas
que
son
desintegradas
bajo
la
influencia
del calor
para
producir
átomos.
El acetileno
es
el
combustible
más
usado
en el
quemador.
En
las
muestras
clínicas
se sueien emplear
dos
tipos
de mecheros:
.
Mecheros
de
premezcla
en
los
que la
mues-
tra es
aspirada,
volatilizada
y
quemada.
.
Mecheros
de consumo
total en
los
que
la
muestra
es
aspirada
al
interior
de
la llama
por
un
fluio
de
gas
de
alta velocidad.
Estos
pro-
porcionan mayor
temperatura
y,
por
tanto,
aseguran
la completa
disociación de
los com-
puestos
aunque
son
menos sensibles
que
Ios
primeros.
Como
alternativa
al empleo
de
llamas
se
han
desarrollado otros
procedimientos
para transfor-
mar
ia
muestra
en
vapor atómico,
siendo reem-
plazada Ia
llama
por otros
procesos de atomiza-
ción:
.
uno
de
estos
procesos consiste
en
transformar
el
mercurio
en
vapor atómico mediante
el uso
de
reacciones
químicas.
.
En
otra técnica empleada,
Ia
muestra
se
deseca
en un
tubo
o
plataforma
de
carbón. La
mez-
cla se
vaporiza
en
una
atmósfera
inerte cuando
una
corriente
eléctrica
pasa
a través
del soporte
para
crear
instantáneamente
una
temperatura
lo
suficientemente
elevada como
para
vapori-
zar el
compuesto
analizado.
En
estos
equipos
sin llama se
ha introducido
un método
de
corrección
de
fondo
de absorción
basada
en
el efecto
Zeeman.
Con estos
procedi-
mientos
se
mejora
Ia
sensibilidad,
y
es
posible
la determinación
de
trazas de
metales
en
peque-
ñas
muestras
de sangre
o
de
tejido.
El filtro
monocromático
se
utiliza
para
elimi-
nar la radiación
procedente
de
la
llama
en los
equipos
que
utilizan
mecheros.
Como
detector
se usa un
tubo fotomulüplicador.
2. 1.3.2.
Interferencias
en
ab
sorción
atómica
Existen
tres
tipos
generales
de
interferencias:
1.
Interferencias
químicas,
producidas
por
la
incapacidad para
disociarse
la
muestra
en
átomos
neutros
por
la
presencia
de
ciertos
aniones,
como
ocurre con
los fosfatos,
que
pueden
interferir
en lá
determinación
del
cal-
cio.
2. Interferencias
por
ionizaciín,
que
se
produ-
cen
cuando los
átomos
son
ionizados
y,
a1 di-
sociarse,
en lugar de
permanecer
en
el
estado
basal,
emiten en
la misma
longitud de
onda
en Ia
que
se
va
a
determinar
la absorbancia.
Es
habituai
int¡oducir
una sustancia
fácilmente
ionizable
que
absorba
parte
del exceso
de ener-
gía de
la llama.
3. Interferencia
de
matriz.
Los
átomos
pueden
absorber
más
radiación
cuando la
muestra
se
,.
encuentra
en un
disolvente orgánico.
,;'
2.7.4. Espectrometríq
de masas
il
La
espectrometría
de masas
utiLiza
la formaÍi
ción
y
análisis de iones
para
el estudio
de una
gran variedad
de
moléculas
Los espectrómetros
de masas
son
instrumen-
tos
que
emplean
el
principio de
que
las
partícu-
las
ionizadas
que
se
mueven
a través
de
un
campo
eléctrico
o
magnético
se
pueden separar de otras
partículas ionizadas
según
sus
relaciones
masa-
carga.
Cuando
las moléculas
no están ionizadas,
se
les
induce
la misma.
Las
moléculas
ionizadas
no
son
estables
y
pueden perder
la
carga
al
interac-
tuar con
otras superficies
o moléculas.
En
esta es-
pectrometría
se asume
que los
productos ioniza-
dos se
forman de manera
reproducible si se
mantienen
constantes
las
condiciones
de
separa-
ción
iónica
y
de
detección.
Cada
ión
resultante
üene
una
carga
y
una
masa
molecular
específica.
La
separación
resultantg
se
presenta
en
forma
de
líneas
espectrales
de inien-
sidad,
que
es
proporcional
al
número
de
iones de
ese
tipo
que
aicanzan
el
detector
(Figura
5).
/
Registrador
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
http://slidepdf.com/reader/full/1-espectrofotometria-libro 6/10
16
.
BioquÍmica
ciÍnica: de la
patología
al
iaboratorio
10070
90
80
70
i6A
50
40
30
20
10
0
Figura 5. Espectro de masas.
180
70
6050
40
3000
00
0
0
o
110 120
m/seg
nE6-
Fmóme*¡o
de lkr
X¡fumelría
de
lt¡rn
rledeteminación
d
Ésdb
y
potasio,
ya
Ülb,rn
r¡na
llamaye
fudereftrencia
p
hhtfuetro
&
Ilen
ürEpmrmatomiñ
ümrr-¡OmártOsimil
Todos los espectrómetros de masas
tienen
un
sistema
para
hacer
y
mantener el vacío, un dis-
positivo
de
introducción
de
muestras, una cámara
de
ionización, un filtro de masas o analizador
donde
las
partículas
ionizadas
son separadas
de
acuerdo
a
sus
relaciones masa-carga
y
dispositi-
vos para
la recolección,
amplificación
y
detección
de iones.
La
separación
de
los iones'en el filtro
de
ma-
sas se
puede hace¡
mediante
separación electró-
nica o magnética.
Aparte de
poder
elucidar la estructura de
mo-
léculas orgánicas
y
biológicas,
Ia
espectrometría
de masas
(EM,
nos
permite
la
determinación
del
peso
molecular
de
péptidos, proteínas
y
de oli-
gonucleótidos,
la identificación
de
compuestos
obtenidos
por
cromatografÍa en
capa
fina
y
pa-
pel, preparativa,
la determinación
de secuencias
de
aminoácidos
en
muestras de
polipéptidos
y
proteínas,
la detección
e
identificación de
espe-
cies separadas
por
cromatografía
y
electrofore-
sis
capilar, el
controi
de
gases
en
enfermos
res-
piratorios
durante 1os
procesos
quirúrgicos,
pruebas
para
confirmar
la
presencia
de drogas
en sangre
en atletas
y
caballos
de carreras,
data-
ción
arqueológica,
análisis
de aerosoles,
deter-
minación
de
pesticidas
en alimentos, control
de
compuestos orgánicos
volátiles en el agua de
red, o en
el
campo
de
la Microbiología,
el
apprte
importante
al
conocimiento
y
clasificación
ta-
xonómica
de
ciertas bacterias,
por
la identifica-
ción
de componentes
parietales,
entre otras
apli-
caciones.
2.L.5.
Fotometría
de
llama
La
fotometría de llama
se
basa en
la
excita-
ción
de los electrones de un
átomo mediante
Ia
energía
térmica obtenida
de
una llama.
Los elec-
trones
excitados, al
volver
a
su
estado
inicial,
ce-
den el
exceso
de energía
en
forma
de
radiación
luminosa de
longitudes de
onda
discretas,
dando
Iugar a
un
espectro característico
para
cada ele-
mento.
En
condiciones
controladas,
la intensidad
de
luz
a
una dete¡minada
longitud de onda típica,
resulta
proporcional
al
número
de
átomos
que
emite
energía
y,
por
tanto,
a
la
concentración
de
la sustancia
de
interés
en
ia
muestra.
*esEm
filErrfurlE¡gunt
BErI¡lelüPlEo
dEio,
r
&
r¿rfur
¿l
mínirnl
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EFOFF
¡-h&
-Éq
&tu
d
C
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
http://slidepdf.com/reader/full/1-espectrofotometria-libro 7/10
Principios de instn¡mentación.
Metodologías instrumentales en
ei
laboratorio clínico...
.
17
Llama
Registrador
Monocromador
Combustible+
oxrdante
Egura
6. Fotómetro
de llama.
Muest¡a
de
carreras,
data-
de
aerosoles,
deter-
alimentos,
control de
volátiles
en
el agua de
Microbiología,
el aporte
y
clasificación ta-
por
la
identifica-
entre
otras
apli-
se
basa
en la
excita-
un átomo mediante la
de
una
llama.
Los elec-
a su
estado
inicial,
ce-
en forma
de
radiación
e onda discretas, dando
para
cada
ele-
Ia
intensidad
de
de onda típica,
número
de
átomos
que
a
la
concentración
de
la
fotometría
de llama ha
sido muy empleada
para
la determinación
de iones
alcalinos,
sobre
todo
sodio
y potasio,
ya
que son fácilmente
ex-
citables
en
una llama
y
es considerado
un
proce-
dimiento
de referencia
para
los mismos.
Un
fotómetro
de
llama
está
constituido
bási-
cz¡mente
por; un atomizador
y
una llama, un
fil-
tro
monocromático
similar
a los
utilizados
en los
espectrofotómetros
y
un detector
que,
en la
ac-
tualidad,
suele
estar constituido
por
un
tubo fo-
tomultiplicadot
(Figuta
6),
Es
habitual
el empleo
de
un
estándar
interno,
como
el
litio,
y
de
varios
detectores,
1o
que per-
mite reducir
al
mínimo
los errores debidos
a las
fluctuaciones
de la
llama
o
de Ia
velocidad
de
as-
piración
de
Ia muestra.
2.1.6. Fluoromeffia
La
fluorescencia
se
produce cuando
las
molé-
culas de
ciertas substancias
absorben
luz, pueden
pasar
a
un nivel superior
de energía
y
emitir a un
aivel de energía
ligeramente
más
alto
que
el
ori-
ginal.
Como
resultado
la
radiación reemiüda
(fluo-
rescencia),
tras
un
peúodo
de
108-10-4 segundos,
tiene
menor
energía
y,
por
tanto, una mayor ion-
gitud
de
onda
que
ia absorbida.
2.1.6.1.
Fluorómetros
Las
partes
esenciales
de
un
fluorómetro son
simiiares
a
los
de un
espectrofotómetro
de ab-
sorción
y
consta
de
fuente
de
energía,
mono-
cromadores, la
cubeta de
análisis
y
el
detector.
La
principal
diferencia
es
la infroducción
de
un
Detector
Figura
7.
Esquema
de
un
fluorómetro.
grupo
de filtros o
monocromadores
antes
y
des-
pués de la celda
para
aislar
la
luz
emitida
(Fi-
gura
7).
2.1.6.1.7.
Fuente
de
energía
Las
más
habituales
son las
lámparas
de
arco
de me¡curio
o
de
xenón
(fuente
continua),
que
producen
radiación suficientemente
energética
para excitar los electrones
de las
moléculas fluo-
rescente§.
2.L.6.1.2. Ivf onocromadores
Seleccionan
la
iongitud
de onda incidente
y
eliminan
las
radiaciones no
deseadas antes
de
que
éstas
puedan
incidir
en el detector.
Los
fluorómetros
se
diseñan con
un
monocro-
mador secundario.
180
70
J
t'
,i
iil
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
http://slidepdf.com/reader/full/1-espectrofotometria-libro 8/10
IS
.
ll¡-rg:¡rc
r*;z
dE X¡
-rdúÉ
al láor¿orio
2-1.6.1.3.
Detector
Normalmente
en
ángulo
recto
respecto
del haz
de
luz
incidente
para
impedir
que
la luz
de la
lám-
para
llegue
al detector.
2.1,6.L.4.
Limitaciones
La
señal
fluorescente
se
ve afectada
por mu-
chas
varlables, que:
.,
Dependen
del
solvente.
.
Del
pH
de
la
solución.
.
De la
temperatura.
.
De
la absorbancia.
¡
De
la presencia
de sustancias
interferentes.
Además,
la fluorescencia
vaúa
dependiendo
de
la
intensidad
de
la luz
incidente
sobre
la mues-
tra,
la
cantidad
de
luz interceptada
por
el detec-
to¡, del ancho
de
banda de
lalluz
analizada
y
de
la eficiencia
del detector.
2.7,6.7.5.
Aplicaciones
Muy
pocas
moléculas
son
fluorescentes
direc-
tamente
y,
por
ello,
se suele
emplear
la formación
de complejos
fluorescentes
para poder
medir
las
sustancias
aanallzal
La ventaia
de
la
fluorometría
estriba en
su
enorme
sensibilidad
del orden
de 1.000 veces
su-
perior
a
Ia
de
los
métodos
colorimétricos.
2.1.6.2.
Fluorimetrís
de
polarización
La
luz
puede
polarizarse (el
campo
eléct¡ico vi-
bra
en un
solo
plano)
al
atravesar algunas
subs-
tancias cristalinas denominadas polarizadores.
Cuando
una molécula
fluorescente
absorbe
luz, excita
un cromóforo
que
tiene una
orienta-
ción
específica, produciendo
la transición
de
un
electrón
a
un nivel
de energía
superior.
La mo-
lécula
excitada
emite
luz
a
medida que
el
elec-
trón regresa
al
nivel
de
energía
inferior.
Las
mediciones
de
la
fluorescencia
polarizada
requieren
un
colorante
con
una
orientación
eiec-
trónica.
Como ejemplo
de
este tipo
de molécu-
las
tenemos:
la
fluoresceína.
Si
se
utiliza
luz
po-
larizada para
excitar
las
moléculas
de
tluoresceína,
la fluorescencia
reemitida
estará
polarizacla.
Sin
embargo,
cuando
la molécula
de
fluoresceína
se
une
a
otra de
gran
tamaño
(inmunoglobulina),
la capacidad
de
despolarizar
Ia
luz desaparece.
Este
principio
se
ha
aplicado
en los
instrumentos
que
utilizan
luz
fluorescente
polarizada
y
cuan-
tifican
el
cambio
en la
despolarización
que
se
pro-
duce
tras una
reacción
inmunológica.
2.1.6.3.
Fluorescencia
de
resolución
tardís
Es
una
aproximación
que
puede
usarse para
mejorar
la
sensibilidad
de
ias
técnicas
de
fluores-
cencia.
El tiempo
de
emisión
de
la
fluorescencia
en
muchas
moléculas
fluorescentes,
como la
fluores-
ceína, está
en el
rango
de
nanosegundos.
Algunos
compuestos,
como
el
quelato
metálico
dicetona-
europio, tienen
una
üda
media
de fluorescencia
muy larga
(10-1.000
microsegundos).
Los
instrumentos
que
usan
esta
técnica
ilumi-
nan la muestra por
un período
de
tiempo,
luego
detienen
la
iluminación y
después
miden
la
fluo-
rescencia
emiüda
en
un
tiempo
especificado
des-
pués
de la
iluminación.
Un
gran
inconveniente
de
esta
técnica
es
la
necesidad
de
pasos
intermedios
de
separación, ya
que
los
compuestos
quelados
no
pueden
medirse
directamente
en los
líquidos
biológicos.
:
2.
1. 6.4.
Quimi
o
luminiscencia
Quimioluminiscencia
es cualquier
reacción
química
en Ia
cual,
uno
de
los
productos
es el
productor
de
luz.
La enzima
peroxidasa
puede
reaccionar
con
moléculas
como el
luminol
(5-
amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona)
o
ésteres
de
acridinium
para
producir
luz
como uno
de los
productos
de Ia reacción.
La del
luminol produce
emisión
de fotones
en
el
intervalo
de
40G450
nm.
Esta
reacción
implica
la
oxidación
de
un agente
como
el isoluminol
o
los
ésteres
de acridinium
por
un
oxidante
(pe-
róxido
de hidrógeno)
en
presencia
de
una
enzima
(fosfatasa
alcaiina
o la
peroxidasa).
Esta técnica presenta
el inconveniente
de
su
limitada
sensibilidad,
debido
a
la
baja
produc-
ción
de
fotones.
Para
corregir
esta
limitación,
se
pueden
adicionar
moléculas reforzadoras,
como
el 6-hidroxibenzotiazol
para
aumentar
la emisión
de fotones.
hk
que
incide
sobre la
hodryosada
(a)
üegaa
t&h
diftrencia
entre
h
dpor
ta
muestra-
Ll
-6
5
-
Ek¡-bolwninisra
Se
düerencia
de
la
q
pe las
sustancias que
¡
cie
¡on
generadas
electr
&
precursores
estables
e
tlodo.
Se
pueden
utilizar
(¡[
tanismos como
la óxid
tID
tra
(dipirilo)
y
tripr
cst€
proceso
es
la
meiorz
Eactivos
y
Ia
gran
sens
¡rrede
obtener.
Z7-7. Turbidirnetría
y
Cuando un
haz
de
lu
en suspensión,
parte
de
oarte
dispersada, parte
tra[smitida.
Pueden
ocurrir tres
ti
la
relación
entre
el
tama
la
longitud
de
onda
de
l
.
Si
la longitud
de onda
tamaño
de
la
partícuf
persará
simétricamen
oria,
ocurriendo
un
n
de
dispersión
a 90
gra
cidente,
como fue
des
¡
Si
la
longitud
de
ond
iguai
al
tamaño
de
la
rece
más luz dispersad
hacia
atrás,
según
lo d
.
Si
la
longitud
de ond
el tamaño
de
las
par
parte
de
luz
aparecerá
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
http://slidepdf.com/reader/full/1-espectrofotometria-libro 9/10
la luz
desaparece.
en
los
instrumentos
polarizada
y
cuan-
que
se pro-
resolución
tardía
que
puede
usarse
para
las técnicas
de
fluores-
de la
fluorescencia
en
como
la
fluores-
nanosegundos.
Aigunos
metálico
dicetona-
media
de
fluorescencia
usan
esta
técnica ilumi-
de
tiempo,
luego
y
después
miden
la
fluo-
especificado
des-
de esta
técnica
es la
de separación,
ya
no
pueden
medirse
biológicos.
es
cualquier reacción
de
los
productos
es el
peroxidasa
puede
como el
luminol
(5-
o
ésteres
luz como
uno
de los
emisión
de
fotones en
Esta
reacción
impiica
como
el
isoluminol
o
por
un
oxidante
(pe-
presencia
de
una enzima
el inconveniente
de
su
a
la
baia
produc-
esta
iimitación,
se
reforzadoras,
como
aumentar
la
emisión
)/
/-\
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q-
-/-
;
:
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-
l/
ffi:)_1
1
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Principios
de
instrumentación.
) fetodologías instrumentales
en
el Iaboratorio
clÍnico...
.
19
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Flf+r'.isaJ
TEffi€
A
\
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\.-/
5
t>
.,
--r¡ura
8.Turbidimetría. El emisor
(1)
emite
un
haz de
.
-
,
2)
que
incide
sobre
1a
muestra (3), la atraviesa y la
..
-
no
dispersada
(4)
Ilega al detector
(5)
donde se
cuan-
-¡a
la
diferencia
entre
ia luz
incidente
y
la
no
disper-
,.::a
por
la muestra.
-.
1
.6. 5. Electroluminiscencia
5e
diferencia de la
quimioluminiscencia
en
:'-ie
las sustancias
que
producen
la
luminiscen-
--e
son
generadas
electroquímicamente
a
partir
-:
precursores
estabies
en
la
superficie
de un
elec-
::odo.
Se
pueden
utilizar
diferentes moléculas y me-
:¡nismos como
ia
óxido-reducción
con rutenio
ll) tris
(dipirilo)
y
triptolamina.
La
ventaja
de
=jte
proceso
es
la
mejora en la estabilidad
de
los
:¡activos
y
la
gran
sensibilidad de
fmol/l
que
se
:uede obtener.
l. 1.7. Turbidimetría
y
nefelometría
Cuando un haz
de
luz incide
sobre
partícuias
:n suspensión, parte
de
la misma
será refleiada,
:arte
dispersada,
parte
transmitida y parte
no
:lansmitida.
Pueden ocu¡rir tres tipos
de
dispersión
según
-a
¡elación
entre
el
tamaño
de
las
partículas
(d)
y
-a
longitud de
onda
de Ia
luz incidente
(),):
.
Si
la longitud de
onda
es
mucho rnayor
que
el
tamaño
de la
partícula
(d
<
0,1 ),),
1a luz
se dis-
persará
simétricamente
alrededor
de la
parti
cula, ocurriendo
un
mínimo
en la intensidad
de
dispersión
a 90
grados
respecto
a1
rayo in-
cidente, como
fue descrito
por Rayleigh.
.
Si
la
longitud de
onda
es
aproximadamente
igrrai al tamaño
de las
partículas
(d
=
),),
apa-
rece más
1uz dispersada
más hacla delante
que
hacia atrás,
según
io
describe Rayleigh-Debye.
.
Si la longitud de
onda
es
mucho
menor
que
el tamaño
de
las
partículas
(d
> ).),
Ia mavor
parte
de
luz
aparecerá
dispersada hacia delante
Figura 9. Nefelomet¡ía.
El
emisor
(1)
emite un
haz
de
luz
(2)
que
incide
sob¡e 1a muestra
(3),
la
atraviesa y
la
luz dispersada
(4)
llega
al
detector
(5)
donde se
cuan-
tifica
la diJerencia
entre la Iuz incidente
y
la dispersada
por
la muestra.
por
causa de
una retrodispersión destructiva
fuera
de fase, tal
como
describe
Ia
teoría
de
Mie.
La
luz
dispersada de acuerdo a
estos modelos
va
a
depender del ángulo
de
medida
y
de
otros
factores,
como la
concentración
de
las
partículas,
el
índice
de
refracción
y
la intensidad de
la luz
incidente.
2. 1 .7
.
1.
Turbidimetría
Mide
la
turbidez
o disminución
de
intensidad
que
se
produce
en
la radiación que
atraviesa
una
suspensión
de
partículas
(Figura
8).
El
detector
se
situa en
la
dirección
de Ia
luz in-
cidente.
La
turbidez
es
directamente proporcio-
nal
a
ia
concentración
de
partículas
dispersantes
y
es inversamente
proporcional
a
la longitud
de
onda elevada que,
a su vez, depende
de
la
rela-
ción
entre
ei
tamaño
y
forma
de
la
partícula.
2.1.7.2.
Nefelometría
En
nefelometría
se
cuantifica la intensidad
de
radiación dispersada
en
un
cierto
ángulo
respecto
a
la dirección
de
la luz incidente
(Iigura
9). En
este caso, los
tratamientos
matemáticos
de
Ray-
leigh
o de Rayleigh-)vfie
permiten
relacionar
la
intensidad
de
luz
dispersada
con
Ia
concentra-
ción
del agente dispersante.
La sensibilidad
de la nefelomet¡ía
es teóri"
camente
superior
a
la alcanzable
en tu¡bidime-
7/25/2019 1. Espectrofotometría Libro
http://slidepdf.com/reader/full/1-espectrofotometria-libro 10/10
20
.
Bioquímica
clínica: de la
patología
al iaboratorio
tria,ya
que
en ella Ia
cuantificación
de
la luz dis-
persada
se
produce
frente a una débil
señal
de
fondo.
2.1.7.3.
Otros
procedimientos
Actualmente
existen
sistemas
que
uülizan
am-
bos
tipos
de señal:
dispersión
y transmisión
de
luz,
corúo es el utilizado
en
la denominada: me-
dida
de
la turbidez
en
una
esfera
integrada.
Otro
procedimiento
basado
en
la determinación
de
la
constante
de
difusión
de las
partículas
en suspen-
sión
a partir
de las
fluctuaciones
de la
luz
disper-
sada
por
las
mismas
en
varios
ángulos
es
la lla-
mada dispersión
de
luz
cuasi-elástica.
2.2.
Métodos electroquímicos
La
electroquímica
consiste en la medición
de
las
señales
eléctricas'asociadas
con
los sistemas
químicos
que están
dentro
de
una
celda electro-
química.
La
electroquímica analítica
hace
uso
de
la
electroquímica
para
realizar los análisis.
Las
mediciones
se
pueden
realizar en
volúmenes
de
muestra
muy
pequeños,
del
orden de microlitros.
En
el
laboratorio
clínico
es
utilizado
rutinaria-
mente
para
la
determinación
de
iones,
drogas,
hormonas,
metales
y gases.
Existen varios
tipos de
procedimientos
analí-
ücos
que
se
basan
en el
fenómeno electroquímico
como:
2.2.1.
Potenciometría
Los métodos
potenciométricos
están basados
en la medida de la
diferencia
de
potencial
(vol-
taie) existente entre
dos electrodos,
un
electrodo
indicador
y
otro de referencia,
en una solución
de
una
dete¡minada
sustancia.
El
electrodo
de referencia
estándar
es
el
elec-
trodo estándar
de hidrógeno, pero
es muy
poco
utilizado,
ya
que
existen
otros
electrodos de
¡e-
ferencia más fáciles
de fabricar
y
usar. Los elec-
trodos
de
referencia
más utilizados
son el
elec-
trodo
de
calomelanos
saturado
y
el electodo
de
plata/cloruro
de
plata.
Los eleclrodos
indicadores
están
formados
por
varillas
metálicas
(platino)
o de carbón. La ecua-
ción de
Nernst
permite
relacionar el
potencial
con la concentración:
E
=
Eo +
0,059/n log
Ox/Re,
en donde Eo
es
el
potencial
estándar, n
es
el
nú-
mero de electrones implicados,
y
Ox/Red
es
la
re-
lación entre las concentraciones
de
las formas
oxidada
y
reducida.
La
potenciometría
es
utilizada
para:
7.
La
medicíón
del
pH, ul.lizando un
electrodo
in-
dicador
de
vidrio.
2.
La medición
de ionesmediante
la
utilización
de
electrodos selectivos. Algunos
están
basados
en ia medición
de
la
diferencia
de
potenciai
originado
por
la
difusión
del
ión
que
quere-
mos
medir
(Na*,
H.,
NH*+)
a través de una
membrana selectiva hidratada
de üdrio. El
po-
tencial
generado
es
proporcional
a
la concen-
tración
del ión
que queremos
medir.
Otros es-
tán
constituidos
por
membranas
de
intercambio
iónico
líquido
en
los
que
un
sol-
vente inerte
e
insoluble
en
agua
contiene un
portador
selectivo de
iones,
como
vaiinomi-
cina
(para
medida de K-) o
dioctil-fosfato
(para
la medida
de
Ca2').
3.
Lamedición
específica
de
gases
utilizando
elec-
trodos, como la medición
de
dióxido
de
car-
bono
mediante
la
medición
del
pH
en una
so-
lución
de
bicarbonato
que
acepta
el
CO2
que
atraviesa una membrana
permeable
al
mismo
desde
la
muestra.
2.2.2.
Culombimetría
La culombimetría
es un
método útil para
el
análisis
cuantitativo.
Las
aplicaciones clínicas
que
emplea
esta
técnica
se
basan
en la
utiliza-
ción
de
una corriente
constante para generar
un
agente
valorante.
En
principio,
se
mide
el
tiempo
necesario
para
titular
una muestra
a corriente
constante.
Este tiempo
está
relacionado
con
Ia
concentración del
compuesto analizado
en
la
muestra.
La
relación
entre la
carga
en culombios y
la
concentración
se
obtiene
a
partir
de la
ley
de Fa-
ruday.
Q=
it
=
nFN
donde
Q
es
la
carga
que
pasa
en
un
tiernpo
de-
terminado; t: tiempo; i: la corriente constante;
n
ard
núrmero
de electrone
rriorr
eleclroquímica;
rdryyli
es
el aúmerc
d
ffi
enlamuestra.
f,remárodo
se ha
usa
t&ru¡os
empleando
e
2.2,iXtE*tneaíc
Leamperimetría
emP
qr¡ñrf
demnienteqrle
IEIrIúmicacuando
se
aP
ffietrfuelos
electrodo:
[.m *nsores
de ampa
lilen
la corriente
gene
&icamente
activoen
-rral
fiio.
Ura
aplicación
típica
6m
(dectrodo
de
Cladt)
r
^
elda
electroquímic
ptr
un
pequeño disco d
"rrno
cátodo,
y
un
elect
&enrmampónfút
fuoquínica
está
sep
m¡
membrana
permeab
cÉe
de oxígeno,
la
irite-n
Fúxima
a
cero
pues
el
c
cn
presencia de oxÍgeno,
c
proporcional
a
la
pOz
Omopaámetoquep
o¡lmna
por amperim€t
ufutrodo
amperimé
Eo66 rrriliza
la glucosa
o
trdffimembranas.
Esta
¡fomadelamuffia,ge
üógmo
y ácido
gluconic
cs
permeable
al
peróxid
&¡minada
amperimé
uodo
de
platino.
?J:l-
Conductimetría
La
conductimeEía
eu
&corriente
elffic¡
en
hizadm,
cuando
entre
rrx.i¡l
electrico-
[¿
intsr
¡mporcional
a
la condu
&la concentración
de I