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Ecología en Bolivia N° 14, 13-23

EFECTO DE INOCULACION DE 3 CEPAS DE RHIZOBIUM LUPINIEN LUPINUS MUTABILIS EN CONDICIONES DE LABORATORIO

por Zulema Bustamante y María Cristina RuizInstituto de Ecología, UMSA, La Paz

1. Introducción

Lupinus mutabilis, conocido como tarhui, es una leguminosaanual, importante desde el punto dé vista nutricional, asícomo por el mejoramiento de los suelos mediante la rotaciónde cultivos. Se adapta a diversos climas y a alturas quevarían desde los 2000 a 3800 m s.n.m., cultivándose en losAndes desde Venezuela hasta Bolivia (TAPIA, et al., 1978).Como ocurre con otras especies andinas, son los campesinoslos que han mantenido el cultivo tradicional en pequeñasparcelas, encontrándose también en estado silvestre (TAPIA,1982). El grano es utilizado como un alimento ocasionalen la dieta del hombre y puede servir como alimento balan-ceado para animales, al igual que las tortas de soya.(ROMERO, 1980).

Al igual que muchas otras leguminosas, se caracteriza porformar nódulos y vivir en simbiosis con Rhizobium, lo cualpermite una fijación biológica del nitrógeno atmosférico,razón por la cual presenta un alto contenido de proteína,que varía entre 25 y 427.. del peso seco (GROSS, 1982).

La síntesis de proteína en las leguminosas depende delabastecimiento de N en la planta, que proviene de lasimbiosis con Rhizobium, permitiendo de esta manera unahorro en el uso del capital de N del suelo, por lo que nose requiere la utilización de abonos químicos ricos en N.GROSS (1982) indica que este ahorro de fertilizante rebajalos costos de producción, no sólo para el tarhui sinotambién para los cultivos sucesivos. Según TAPIA (1978),el Lupinos en simbiosis llega a fijar de 80 a 120 kg porhectárea de N por año, lo que permite el enriquecimientodel suelo. ROMERO (1980) sugiere aprovechar esta legumino-sa para la rotación de cultivos en suelos agotados detierras altas.

El efecto de la inoculación de leguminosas con Rhizobiumse conoce desde hace mucho tiempo, ya que la producción deinoculantes se inició en Estados Unidos en 1904 segúnBORENSTEIN (1982), encontrándose un mayor rendimiento enlas plantas inoculadas.

HUBBELL (1985) indica que la inoculación asegura un buenrendimiento, bajo condiciones limitantes de nitrógeno.

En Bolivia, la utilización de ese procedimiento para lainoculación de semillas de leguminosas y la producción deinoculantes es muy incipiente (BORENSTEIN, 1982), por locual sólo se emplea para plantas de soya.

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Existen pocos trabajos relacionados al aislamiento deRhizobium lopini y su efecto de inoculación tanto enlaboratorio como en el campo. Según GROSS (1992), lasemilla no requiere ser inoculada cuando se siembra ensuelos utilizados tradicionalmente para ese cultivo, peroindica que los rendimientos disminuyen cuando se siembransemillas sin inocular, en suelos donde no se cultivóLupinos anteriormente.

El mismo autor sugiere que los investigadores de todo elmundo debieran interesarse por los cultivos andinosprecolombinos, partiendo principalmente del tarhui, antesde que se pierda un alimento tan importante para lahumanidad.

Por la importancia socio-económica que tiene esta legumi-nosa, considerada como planta promisoria para Bolivia, yviendo la necesidad de realizar estudios relativos al man-tenimiento y mejora de los cultivos del tarhui, en estetrabajo intentamos conocer el efecto que tiene la inocula-ción de 3 cepas de Rhizobium en caldo y turba, aisladas apartir de Lupinos altimontanus (silvestre) y de Lupinosmutabilis en la especie mejorada de Lupinos mutabilisSweet, para así conocer la capacidad de infección yespedificidad de estas cepas bacterianas.

Descripción de la bacteria

Las cepas de Rhizoblum utilizadas en este ensayo fueron lascepas 88-E2 y F5, aisladas de nódulos de Lupinos mutabilis,que fueron sembradas sin inoculante en Viacha (provinciaIngavi, La Paz) y las cepas PAN, aisladas de Lupinosaltimontanus (especie silvestre). Las características deestas cepas fueron descritas en SIVILA (1989) (pág. 1-12de este número).

Materiales y métodos

3.1 Materiales

Semillas:

Las semillas utilizadas para el presentetrabajo fueron de Lupinos mutabilis Sweet,obtenidas de Puno (Perú).

Bacterias:

Se trabajó en un ensayo preliminar, conc ep as 'se 1 ec c Tonadas; éstas fueron nominadascomo 88-E2, F5 y PAN.

"Jarras botella" de Leonard: En este ensayo se utiliza-ron estos recipientes, sugeridos porVINCENT, 1975.

Arena:

Se utilizó arena de río de aproximadamente2 mm de diámetro, previamente lavada yesteril izada.

Solución de Norris: Se utilizó la solución de Norriscarente de nitrógeno como medio nutritivo.

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3.2 Métodos

Preparación de semillas. Las destinadas a la germi-nación fueron desinfectadas primero con etanol yluego, por un tiempo de 3 minutos, con cloruro demercurio al 0,2% que fue previamente acidificado con5 ml de ácido clorhídrico concentrado. Posteriormen-te, las semillas fueron lavadas con agua destiladaestéril,

Germinación. Las semillas desinfectadas se las llevóa germinación en placas petri sobre algodón húmedoy papel filtro, previamente esterilizados; al cabode 7 días se las transfirió a las "Jarras botella"de Leonard, que también estaban esterilizadas.

Preparación de las "jarras botella" de Leonard. Seutilizaron frascos de boca ancha y botellas cortadaspor la base como recipiente superior, estas botellasfueron primeramente esterilizadas en estufa a 170°Cdurante tres horas, posteriormente se las llenó conarena también esterilizada en las mismas condiciones.El recipiente inferior fue llenado con la soluciónde Norris estéril en un volumen de 600 cm 3 , todo elconjunto se volvió a esterilizar, pero esta vez enautoclave a 120°C durante dos horas.

Inoculante. Se obtuvo a partir de cepas de Rhizoblum88-E2, F5 y PAN, en caldo y turba en polvo. La turbautilizada para su producción fue obtenida a partirde inoculantes ya vencidos, previa su esterilización.Ambos inoculantes contenían 6 x 10 9 bacterias por mly g, respectivamente.

Transplante de plantas. A los 7 días después de lagerminación, 3 plántulas fueron transplantadas a cadajarra botella de Leonard.

Infección. La infección de las plantas se realizóa los 7 días después de su •trañsplante a las jarrasbotella de Leonard, utilizándose en el caso de caldo2 ml por planta y en caso de inoculante en turba 2ml de la dilución de 10-2.

3.3 Métodos de evaluación

La evaluación se realizó a los dos meses de la siembra,considerando los siguientes parámetros:

Peso seco de planta y nódulos. Se determinó la can-tidad de materia seca de la parte aérea de la plantay el peso seco de los nódulos por el método de secadoen horno a 70°C, hasta peso constante.

Efectividad de nodulacióri. Los nódulos efectivos sedeterminaron por la coloración interna de color rojo.

Determinación del contenido de nitrógeno. Se deter-minó por el método oemimicrokjeldahl, que consisteen la disgregación de la muestra seca y molida con

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ácido sulfúrico concentrado, destilación y suposterior titulación con ácido sulfúrico 0,01 N.

3.4 Tratamientos

Los tratamientos del trabajo fueron planteados de lasiguiente manera:

Plantas inoculadas con Rhizobium cepa 88-E2 en caldo.

PLantas inoculadas con Rhizobium cepa 88 E2 en turba.

Plantas inoculadas con Rhizobium cepa F5 en caldo.

Plantas inoculadas con Rhizobium cepa PAN en caldo.

V. Plantas inoculadas con Rhizobium cepa PAN en turba.

Por cada tratamiento, se tuvieron dos jarras botella deLeonard testigo y tres inoculadas, con tres plantas cadauna y un total de 25 jarras botella.

4. Resultados y discusión

Los resultados del presente trabajo en laboratorio estánexpresados en las tablas 1 a 5 y en la fig. 1. Se indicaque el trabajo de inoculación en laboratorio es un pasoprevio para continuar con un ensayo de campo (ver BUSTAMAN-TE y RUIZ, pág. 25-33 de este número).

Tabla 1:

Peso seco de plantas, nódulos y contenido denitrógeno en plantas de Lupinos mutabilisinoculadas con cepas 88-E2 en caldo. Cadaresultado es el promedio de dos determinaciones.

Planta Peso seco Peso seco Contenido de N Contenido depor planta de nódulos en la parte proteínas en

(parte aérea) por planta aérea la parte aérea

9 g % %

Testigo 0,65 - 1,14 7,15Testigo 0,70 0,007 1,10 6,80Inoculada 1,70 0,050 3,05 19,00inoculada 1,50 0,080 2,87 17,90Inoculada 1,65 0,080 2,74 17,15

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Tabla 2: Peso seco de plantas, nódulos y contenido denitrógeno en plantas de Lupinas mutabilisinoculadas con Rhizobium lupini, cepa 88-E2 enturba. Cada resultado es el promedio de dosdeterminac iones.

Planta Peso secopor planta

(parte aérea)

g

Peso secode nódulospor planta

g

Contenido de Nen la parte

aérea%

Contenido deproteínas en

la parte aérea%

Testigo 0,79 - 1,14 7,10Testigo 0,98 - 1,05 6,58Inoculada 1,55 0,110 2,69 16,84Inoculada 1,32 0,070 2,79 17,45Inoculada 1,58 0,090 2,73 16,94

Tabla 3: Peso seco de plantas, nódulos y contenido denitrógeno en plantas de Lupinas matabilisinoculadas con Rhizobium lupini, cepa F5 enturba. Cada resultado es el promedio de dosdeterminac iones.

.

Planta

.

Peso secopor planta

(parte aérea)g

Peso seco -de nódulospor planta

g

Contenido de Nen la parte

aérea%

Contenido deproteínas en

la parte aérea%

Testigo 0,75 - 0,93 5,86Testigo 0,75 0,003 1,76 10,80Inoculada 1,70 0,110 2,72 17,00Inoculada 1,55 0,070 2,96 13,50Inoculada 1,76 0,093 3,01 18,87

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Tabla 4: Peso seco de plantas, nódulos y contenido denitrógeno en plantas de Lupinus mutabilisinoculadas con Rhizobium 1 upin , cepa PAN caldo.Cada resultado es el promedio de dosdeterminac iones.

Planta Peso secopor planta

(parte aérea)

g

Peso secode nódulospor planta

g

Contenido de Nen la parte

aérea

%

Contenido deproteínas en

la parte aérea

%

Testigo 0,65 - 1,14 7,15Testigo 0,70 - 1,10 6,80Inoculada 1,40 0,070 3,05 19,00Inoculada 1,50 0,081 2,37 17,90Inoculada 1,55 0,080 2,74 17,15

Tabla 5: Peso seco de plantas, nódulos y contenido denitrógeno en plantas de Lupinus mutabilisinoculadas con Rhizobium lupini, cepa PAN enturba. Cada resultado es el promedio de dosdeterminac iones.

Planta Peso secopor planta

(parte aérea)

g

Peso secode nódulospor planta

g

Contenido de Nen la parte

aérea

%

Contenido deproteínas en

la parte aérea

%

Testigo 0,75 - 1,04 6,50Testigo 0,70 - 1,20 7,50Inoculada 1,50 0,070 3,03 18,90Inoculada 1,60 0,090 2,90 18,10Inoculada 1,55 0,082 2,80 17,50

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Fiq. 1: Plantas de Lupinos mutabilis inoculadas conRhizobium lupini (izquierda) y plantas testigono inoculadas (derecha)

Los resultados de este ensayo nos permiten observar laefectividad de cepas infectivas, en relación con losdiferentes parámetros de evaluación.

Esos parámetros son considerados los más importantes parala evaluación de la infectividad de una cepa. HUBBELL(1985 a) indica que el potencial relativo de cada cepapuede ser evaluado en función del grado de nodulación.Además, la coloración y el peso seco de la parte aéreaindican el contenido de nitrógeno en la planta. Así seobtiene una idea más clara sobre la capacidad fijadora delRhizobium en simbiosis.

En nuestro trabajo encontramos que las plantas infectadascon Rhizobium de cepas 88-E2 y 88-F5 presentan mayor canti-dad de materia seca en relación con las plantas testigo,con valores promedio de 1,50 g por planta y en testigos de0,80 g.

En relación al peso seco de nódulos también existe dife-rencia entre las plantas inoculadas y las testigo, con pe-sos de aproximadamente 0,075 g y 0,007 g, respectivamente.

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Debemos señalar que se presentó nodulación en las plantastestigo de una sola jarra, lo que posiblemente se deba acontaminación.

Como parámetro importante de la efectividad de las cepas,se ha tomado el contenido de nitrógeno de la parte aéreade la planta. En relación con ese parámetro, se encontróuna marcada diferencia entre las plantas inoculadas, convalores de N entre 2,70 y 3,05 7., y las plantas testigo con1,00 a 1,10% de N. En un trabajo realizado en campo porVILLARROEL y AUGSTBURGER (1986), se encontraron contenidosde nitrógeno de 3,02 a 3,47% al final del cultivo, en plan-tas con nódulos.

No se encontraron diferencias entre las cepas 88-E2 y F5,ni entre los métodos de inoculación (caldo y turba).

En cuanto a la infección con cepa PAN proveniente deLupinos altimontanus (silvestre), se encontraron tambiénresultados importantes. En primer lugar, se verificó lapresencia de nódulos efectivos en relación con los testi-gos; por lo tanto, en la determinación de materia seca dela parte aérea de la planta, se encontraron valores de 1,50g en cada una, al igual que en las plantas que fueron in-fectadas con cepas 88-E2 y F5, y en las testigo se hallaronvalores de 0,70 g por planta.

El contenido de nitrógeno en las plantas es alto, convalores que varían de 3,05 a 2,74%, semejantes a los conse-guidos en las plantas infectadas con cepas 88-E2 y F5.

Los resultados de este estudio nos permiten deducir que losnódulos de Rhizobium, obtenidos de ambas especies deLupinos, tenían la misma capacidad de infección. Esteresultado es muy interesante, puesto que existía un desco-nocimiento sobre las bacterias noduladoras en relación altarhui (CORNEJO DE ZVIETCOVICH,1982). Recomendamos que paraestudios microbiológicos posteriores, se deben realizarensayos de inoculaciones cr. uzadas entre los dos huéspedesmencionados.

Es importante continuar con una fase de campo, para veri-ficar la nodulación y fijación de nitrógeno, cuando seinocula Lupinos mutabilis con cepas de Rhizobium lupinibajo condiciones naturales y en presencia de competenciabacteriana.

Resumen

Efecto de inoculación de 3 cepas de Rhizobiom lupini enLupinos mutabilis, en condiciones de laboratorio.

Lupinos mutabilis es una planta de mucha importancia parala región andina; por esta razón, es necesario realizartrabajos sobre la simbiosis con Rhizobium en estaleguminosa.

En esta investigación evaluamos cepas de Rhizobium lupini,aisladas a partir de 2 especies de Lupinos, cuya efectivi-

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dad fue estimada en base a la presencia de nódulos activosy el contenido de nitrógeno en la planta. Los valores denitrógeno en las plantas inoculadas fueron de 3% aproxima-damente, mientras que las plantas no inoculadas tuvieronvalores de 1,07., encontrándose también un aumento de un 607.de la materia seca en plantas inoculadas en relación conlos testigos.

Igualmente, se pudo determinar que existe también nodula-ción y fijación biológica de N en Lupinus mutabilis, cuandose inoculan cepas de Rhizobium aisladas de Lupinusaltimontanus. No se encontraron diferencias'de efectividadentre las tres cepas utilizadas de Rhizobium Iupini, comotampoco entre los métodos de aplicación.

Zusammenfassunq

Ergebnisse einer Beimpfung von Lupinus mutabilis mit dreiStámmen von Rhizobium lupini unter Laborbedingungen.

Lupinus mutabilis ist eine sehr wichtige Pflanze für dieAndenregion, deshalb ist es notwendig, Untersuchungen überdie Symbiose dieser Pflanze mit Rhizobium durchzuführen.

In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir Stámme vonRhizobium lupini die aus 2 Lupinenarten isoliert wurden;ihre Wirksamkeit wurde an der Anwesenheit von aktivenKnótchen und dem Stickstoffgehalt in der Pflanze abgelesen.Die beimpften Pflanzen enthielten annáhrend 3% Stickstoff,wáhrend die nicht beimpften nur etwa 1% Stickstoffaufwiesen. Die beimpften Pflanzen produzierten 60% mehrTrockenmasse als die nicht beimpften.

Es wurde festgestellt, dass auch Stámme von Rhizobiumlupini, die aus Lupinus altimontanus isol iert worden waren,Knótchenbildung und biologische Stickstoffbindung beiLupinus mutabilis bewirkten.

Es zeigten sich weder Unterschjede in der Wirksamkeitzwischen den drei benutzten Stámmen von Rhizobium, nochzwischen den benutzten Impfmethoden.

Abstract

Inoculation of 3 Rhizobium lupini strains in Lupinusmutabilis in laboratory conditions.

Lupinus mutabilis is a very important plant for the Andeanregion. For this reason, it is necessary to accomplishresearch on Rhizobium symbiosis with the mentionedleguminosa (legume).

The present investigation evaluates isolated Rhizobiumlupini strains, starting from two Lupinus species. Theireffectivity was estimated by the presence of active nodulesand nitrogen content in the plant. The nitrogen value inthe inoculated plants reached aproximately 3% while non-inoculated plants contained only 1%. A 60% increase of dry

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matter was also found in inoculated plants. Nitrogen nodu-lation and biological fixation also occurred in Lupinasmutabilis when Rhizobium strains were inoculated fromLupinas altimontanus. No apparent differences were foundbetween the 3 Rhizobium lupini strains used, nor betweenthe applied methods.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Lic. Ruth Sivila de Cary, porhaber proporcionado las cepas de Rhizobium utilizadas eneste trabajo.

Referencias

BORENSTEIN, E. 1982: La fertilización biológica denitrógeno. Rhizobium - leguminosa y la proteccióndel medio ambiente.- En: GEYGER y ARZE (Eds.) 1982:Ecología y recursos naturales en Bolivia, 221-225.Edición Centro Pedagógico y Cultural de Portales,Cochabamba e Instituto de Ecología, UMSA, La Paz.

CABRERA, A.L. 1967: Flora de la provincia de Buenos Aires.Buenos Aires: Colección científica del INTA.

CIAT, 1988: Simbiosis leguminosa-rizobio.- Manual de mé-todos, evaluación, selección y manejo agronómico, 20-23.

CORNEJO DE ZVIETCOVICH, G. 1982: Inoculación de Rhizobiumlupini a diferentes ecotipos de la especie de Lupinasmutabilis Sweet.- Tercer congreso internacional decultivos andinos. La Paz: MACA, IBTA, CIED, 249-257.

GROSS, R. 1982: El cultivo y la utilización del tarwi(Lupinas mutabilis Sweet). Estudio FAO: Produccióny protección vegetal.- Roma: FAO, 236 p.

HUBBELL, D. 1985 a: El proceso de infección de leguminosaspor Rhizobium.- Primer seminario centroamericanosobre fijación biológica de nitrógeno. CEIBA, 27 N°1, 5-15.

HUBBELL, D. 1985 b: Producción y uso de inoculantes.- Pri-mer seminario sobre fijación biológica de nitrógeno.CEIBA 27, N° 1, 17-21.

ROMERO, R. 1980: Tarhui (Lupinas sp.) como fuenteproteínica en raciones para cerdos en crecimiento yacadabo.- Tercera reunión nacional del tarhui.Cochabamba: Ministerio de Planeamiento y Direcciónde alimentación y nutrición CORDECH, IBTA. 43-44.

TAPIA, M.; BLANCO, O. y REA, J. 1978: Informe preliminarsobre Tarwi (Lupinas mutabilis Sweet).- La Paz: IBTA,6 p.

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TAPIA, M. y CHAQUILLA 0. 1979: Los lupinos silvestres delaltiplano de Puno.- Segunda reunión nacional delTarwi. Cochabamba, 26-27. Junio de 1979. 9 p.

TAPIA, M. 1982: El medio, los cultivos y los sistemasagrícolas en los Andes del sur del Perú.- Primercongreso taller de agricultura andina. Comisióncoordinadora de tecnología adecuada en el Perú.Universidad Nacional de Cajamarca, 53-57.

VILLARROEL, J. y AUGSTBURGER, F. 1986: El tarhui (Lupinusmutabilis Sweet), fijación y aporte de nitrógeno alsuelo y su efecto residual en cebada (Hordeumvulgare). V Congreso Internacional de AgriculturaAndina.- Puno, Perú, 20 p.

VINCENT, J.M. 1975: Manual práctico de Rizobiología.-Buenos Aires: Ed. Hemisferio Sur, 175 p.

Dirección de los autores:

Instituto de EcologíaCasilla 10077Correo CentralLa Paz, Bolivia