LAPORANPRAKTIKUM PEMISAHAN DAN PENGUKURAN

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN DENGAN TEKNIK HPLC

Diajukan untuk memenuhi mata kuliah Praktikum Pemisahan dan PengukuranDosen Pengampu :

Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si

Disusun oleh : Hesti Kusumaningtyas (1307031) Ida Khoerunnisah (1302021) Ikhlas Fathurohman (1301508)

Jurusan Pendidikan KimiaFakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIABANDUNG

2014

Tanggal Praktikum : 17 Februari 2015

Judul Praktikum :

Penentuan Kadar Paracetamol dan Kafein dengan Menggunakan Metode HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

1. Tujuan

1.1 Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC

1.2 Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat mengikuti

manual pengoperasian HPLC.

1.3 Dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan kafein dalam sampel obat.

2. Tinjauan Pustaka

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi

elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan oleh para

kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau

senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada

kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran

dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya

dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis

fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:

a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair

b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair

c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion

d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)

e) Kromatografi Afinitas

f) Kromatografi Kiral

Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis

dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau

campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik.

1

Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu

sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari

kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan

program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan

secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan

efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC

modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan

cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara

terus menerus.

(Skoog, 2004: 973-977)

Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari

variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven

yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai,

yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur

pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan

di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang

menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila

detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan

2

akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh

tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga

sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom

berikatan dengan NH2).

(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)

Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

Reservoir (wadah pelarut / cairan)

Pompa

Sistem injeksi sampel

Kolom, terdiri dari

1. Kolom Analitik / Kolom Utama

2. Kolom Guard

3. Termostat

Detektor

Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir

3

dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur

cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.

Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.

Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa

yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:

1) Harus memiliki aliran terkontrol yang ‘reproducible’

2) Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas pulsa, tidak menghasilkan

gelembung)

3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil

(R.P. Budhiraja, 2004: 172)

Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat

diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel

dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume

0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa

gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari

loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel

dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30

mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel

silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai

tempat pemisahan berlangsung.

Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa

hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan

performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material

partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari

itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-

masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam

yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5

4

mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard

digunakan sebagai “tumbal” dan diganti secara berkala.

Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini

berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-

detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:

Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)

Detektor elektrokimia

Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index

refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-

komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.

(Harvey David, 2000: 578-585)

Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang

sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat

yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau

tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT

menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis

laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat

digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,

antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat

diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu

analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai

5

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi

selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;

pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak

pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang

diinginkan.

Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat

mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.

Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai

picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks

Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,

kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan

dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven

dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat

yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi

untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal

sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak

menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena

itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati

detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi

penukarion memerlukan prosedur khusus.

(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis

kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit

dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,

pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar.

6

Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva

kalibrasi.

Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet

obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya

menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini

memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18

dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.

(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)

Paracetamol

Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan sebagai penawar rasa sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini dikenal sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171

. Daya larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3, tetapi jauh lebih larut dalam air panas yakni 5 g/100 cm3 dan dalam etanol kelarutannya 14 g/100 cm3.

(Frank Ellis dkk, 2002: 1)

Kafein

7

Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik yang majemuk,

yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan lingkar pirimidin). Dengan

rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji kopi dan daun teh. Kristal

kafein berbentuk jarum-jarum berwarna putih, tidak berbau, dan berasa pahit. Kafein

yang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 238 . Kafein larut dalam larutan

pirol dan tetrahidrofuran. Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asam-

asam organik.

(Damin Sumardjo, 2009: 447)

Asetonitril

Metil Sianida CH3CN, zat cair toksik, disediakan dari asetilena dan amonia atau oleh

dihidrasi asetamida, digunakan untuk melarutkan senyawa organik ataupun anorganik.

(Hadyana Pudjaatmaka, 2002: 76)

Isopropil Alkohol

Propil Alkohol mempunyai rumus CH3CH2CH2OH . Isopropil alkohol merupakan

isomer propil alkohol dengan rumus (CH3)2CHOH. Banyak digunakan untuk

membuat minyak wangi, pelitur dan sebagai pelarut.

(Hadiat Moejadi,dkk, 2004: 179)

8

Alat dan Bahan Praktikum

2.1 Alat Praktikum

Perangkat HPLC 1 set

Spatula 1 buah

Labu ukur 50 mL 1 buah

Labu ukur 10 mL 6 buah

Neraca analitik terkalibrasi 1 set

Corong pendek 1 buah

Pipet tetes 2 buah

Gelas kimia 50 mL 3 buah

Ultrasonic vibrator 1 set

Pipet Ukur 1 ml 1 buah

Pipet Ukur 2 ml 1 buah

Pipet Ukur 3 ml 1 buah

Pipet Ukur 4 ml 1 buah

Pipet Ukur 5 ml 1 buah

Pipet Ukur 6 ml 1 buah

Ball Filler 1 buah

Filter Membran Selulosa Nitrat 1 set

Botol Vial 2 buah

2.2 Bahan Praktikum

Parasetamol p.a 25 mg

Kafein 12,5 mg

Asetonitril 30 ml

KH2PO4 420 ml

Iso propil alkohol 30 ml

Metanol secukupnya

Sampel obat Bodrex 4,1 mg

Aquades secukupnya

Aquabides secukupnya

9

Membran PTFE/selulosa nitrat buah

Kertas saring 1 buah

3. Prosedur Kerja Praktikum

3.1 Pembuatan fasa gerak (Pelarut).

Sebanyak 420 mL KH2PO4- 0,01 M, ditambahkan metanol 20 mL, ditambahkan

asetonitril 30 mL, ditambahkan isopropil alkohol 30 mL, disaring menggunakan

membran whatman filter PTFE 0,2 μm, disonikasi selama 30 menit. (Larutan Fasa

Gerak sudah tersedia)

3.2 Pembuatan larutan induk parasetamol

Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a dan 12,5 mg kafein

p.a dimasukkan kedalam labu 50 mL

Tambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi selama 15 menit,

diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda batas..

Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan kafein

3.3 Pembuatan deret larutan standar parasetamol + kafein

Pipet larutan induk parasetamol dan kafein masing-masing sebanyak 1 ; 2 ; 3 ;

4 ;5 dan 6 mL, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL.

Tambahkan pelarut(fasa gerak yang tersedia)hingga tanda batas

Lakukan sonikasi selama 5 menit.

Dilakukan degassing apabila masih terdapat gelembung dalam larutan

Injeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 μl

Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi

3.4 Pembuatan larutan sampel obat bodrex

Tentukan berat rerata tablet(10 tablet)

10

Menimbang 4,1 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan

pelarut(aquabides) hingga setengah volume labu ukur), disonikasi selama 5

menit,

Encerkan dengan pelarut(aquabides) hingga garis tanda, dikocok lalu disaring

menggunakan kertas saring

Dipindahkan ke dalam botol vial

Kemudian proses melakukan penyaringan kedua menggunakan membran

whatman PTFE 0,2 μm (filtrat pertama dibuang(digunaakan untuk membilas

filter/injektor, kemudian ditampung filtrat selanjutnya).

Injeksikan sampel obat ke dalam HPLC.

3.5 Penyiapan Instrumen HPLC

Kondisi Analisis parasetamol dan kafein

Fasa gerak : KH2PO4 0,01 M 420mL, 20 ml metanol, 30 asetonitril

30 mL isopropil alkohol

Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)

Panjang gelombang : 215 nm

Laju alir : 1 mL/menit

Volume injeksi : 20 µL

Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.

Tekan tombol “ON” pada sakelar listrik.

Isi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan botol

penampung.

Tekan tombol “ON” pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan

pompa.

Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti langkahnya sesuai instruksi

dalam komputer.

Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi

instrumen.

Alirkan fasa gerak.

11

Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah

menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan.

Injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi terendah), dan

terakhir larutan sampel

Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya.

Setelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti tanda pompa

dalam computer.

Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.

Untuk mematikan, tekan tombol “Off” pada pompa, detector dan power secara

berurutan. Putuskan sambungan listrik.

3.6 Perhitungan hasil analisis

Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva kalibrasi

diperoleh dengan koefisien regresi > 0,997 anda boleh melanjutkan perhitungan

kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah kadarnya dalam satuan % b/b. Bila

tidak diperoleh kurva yang linier, maka lakukan diskusi untuk mencari

penyebabnya.

12

Hasil dan Analisis Data

Tabel Penimbangan 1 Tablet Obat Bodrex

No Berat Setiap 1 Tablet Obat

Bodrex

1. 0,8321 g

2. 0,8530 g

3. 0,8407 g

4. 0,8326 g

5. 0,8350 g

6. 0,8315 g

7. 0,8418 g

8. 0,8568 g

9. 0,8321 g

10. 0,8427 g

Rata-

rata

0,84016 g

Sampel Obat

Diduga zat yang terkandung Waktu Retensi (menit) Luas Area

Paracetamol 2.38 11705288

Kafein 3.62 2164128

Deret Standar Paracetamol

Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)

50 2252106 2.38

100 4239085 2.38

150 6208253 2.38

200 7979072 2.38

13

250 10093086 2.39

300 12261550 2.38

Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga

paracetamol (11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol (10093086-

12261550). Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan

garis

y = 39646 x + 234188

Sehingga,

y = 39646 x + 234188

11705288 = 39646 x + 234188

x =

x = 289,3381 ppm

mg paracetamol = ppm V (L)

= 289,3381 ppm 0,01 L

= 2,8934 mg

Bobot sampel = 4,1 mg

Berat Rata- rata penimbangan obat bodrex = 840,16 mg

Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan

14

Deret Standar Kafein

Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)

25 2164416 3.64

50 4252400 3.62

75 6242196 3.6

100 7989484 3.58

125 10033548 3.59

150 12097707 3.56

Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga kafein

(2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar kafein

dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel, yaitu

konsentrasi dan luas areanya.

15

=

[Sampel] =

[Sampel] =

[Sampel] = 24,9967 ppm

Mg kafein = ppm V (L)

= 24,9967 ppm 0,01 L

= 0,2500 mg

Kadar mg Kafein dalam Hasil percobaan

Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar paracetamol dan kafein

dalam sampel obat menggunakan instrumen HPLC (High Performance Liquid

Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi komponen-

komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase diam. Fase gerak yang

digunakan berupa campuran senyawa KH2PO4, methanol, asetonitril, dan isopropyl

alkohol dengan perbandingan 42 : 2 : 2 : 3. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah

kolom C-18 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan

metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan

fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis

digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.

16

Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan menggunakan

aquabidest. Digunakan aquabidest karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan

pelarut dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan dianalisis

jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20µl) sehingga apabila digunakan pelarut dengan

kemurnian kurang akan dapat mengganggu hasil pemisahan. Sebelum pengenceran

sampel sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua komponen dalam

sampel larut dan homogen. Setelah diencerkan sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan

sampel disaring sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan menggunakan kertas

saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam obat tidak hanya mengandung

paracetamol dan kafein, namun terdapat zat penyusun lain yang belum larut seluruhnya

yang masih berupa partikel-partikel padat dalam larutan. Selanjutnya filtrate disaring

kembali menggunakan membran selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa

ada partikel-partikel pengganggu /pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan.

Apabila langsung dilakukan penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat,

dikhawatirkan partikel-partikel yang tidak larut dalam larutan sampel akan menyumbat

pori-pori membran sehingga penyaringan akan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum

ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang dimaksudkan untuk membilas

membran agar dapat dipastikan tidak ada zat kontaminan dari membran yang dapat ikut

tertampung.

Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis

kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam sampel

dengan waktu reteensi standar. Puncak yang akan muncul pada kromatogram adalah

puncak komponen paracetamol terlebih dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan

struktur kimia dari masing-masing komponen.

17

Gambar Struktur Paracetamol

Gambar Struktur Kafein

Dapat dilihat bahwa paracetamol memiliki gugus hidroksi (-OH) yang dapat membentuk

ikatan hidrogen dengan air sehingga lebih mudah larut dalam air atau senyawa polar

lainnya sedangkan kafein memiliki struktur yang relatif lebih non polar dibandingkan

dengan paracetamol sehingga akan tertahan lebih lama di kolom yang sifatnya non polar.

Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan kafein

dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan

derat standar yang dibuat dari pengenceran 1-6 ml larutan induk paracetamol 500 ppm

dan kafein 250 ppm dalam 10 ml larutan. Kadar analit dapat ditentukan dengan

menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis y = mx + b yang diperoleh

dari kurva kalibrasi deret standar. Namun, apabila luas area puncak analit tidak masuk

dalam area deret standar maka digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret

standar dengan sampel.

Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada

keadaan optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik. Kemudian baik sampel

maupun deret standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing

untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat terkumpul di

kepala pompa ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.

18

Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam

sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil

tersebut mendekati data kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu paracetamol

sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.

Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di

antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang yang tidak ikut dilarutkan

sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih terdapat gelembung setelah

dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga

mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, diperoleh kadar paracetamol

dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293

mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu

paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.

Daftar Pustaka

Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International (p) Ltd.

David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill

De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi

Jurnal, hlm. 5-8.

Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom : Royal Society of Chemistry

Moejadi, Hadiat. (2004). K amus S ains . Jakarta : Balai Pustaka

Pudjaatmaka, Hadyana. (2002). Kamus Kimia. Jakarta : Balai Pustaka

Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson Brooks/Cole

Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa

Kedokteran. Jakarta : EGC

Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015). Instruksi Kerja Penentuan

Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI

19

Lampiran

Langkah Kerja & Tabel Pengamatan

No Langkah Kerja Data Pengamatan

1. -Fasa Gerak Sudah

disediakan

-Fasa Gerak : Cairan Tidak Berwarna

2. Pembuatan Larutan Induk Paracetamol & Kafein

-Paracetamol : Serbuk berwarna putih keruh

-Kafein : Serbuk berwarna putih keruh

-Fasa Gerak : Cairan tidak berwarna-Disonifikasi agar larutan menjadi homogen

-Larutan Induk Paracetamol + kafein : Tidak berwarna

- Konsentrasi Paracetamol : 500 ppm- Konsentrasi Kafein : 250 ppm

20

Pembuatan Fasa Gerak (Pelarut)

-diambil 420 mL KH2PO4 0,01 M pada gelas kimia- ditambahkan Metanol 20 mL- ditambahkan Asetonitril 30 mL- ditambahkan Isopropil Alkohol 30 Ml- disaring menggunakan membran whatman filter

PTFE 0,2 m- disonifikasi selama 30 menit

Fasa Gerak (Pelarut)

Paracetamol

- ditimbang sebanyak 12,5 mg

Kafein

- ditimbang sebanyak 25 mg

Kafein + Paracetamol

- keduanya dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL- ditambahkan pelarut (fasa gerak)- disonifikasi selama +/- 5 menit- diencerkan dengan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas

Larutan Induk Kafein + Paracetamol

- disonifikasi selama 5 menit- dihitung konsentrasi larutan induk paracetamol & kafein

Konsentrasi Larutan Induk

3. Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein & Paracetamol

-disonifikasi agar homogen- didegasing dengan membuka tutup labu ukur,agar gelembung yg ada dapat hilang- deret larutan standar = tidak berwarna

21

Larutan Induk Kafein + Paracetamol

Deret Larutan Standar

- dipipet sebanyak 1ml;2ml;3ml;4ml;5ml;6ml- dimasukkan masing-masing ke dalam labu ukur 10 ml- ditambahkan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas- disonifikasi selama 5 menit- didegasing

- diinjeksikan larutan sebnayak 20 L

- dibuat kurva kalibrasi

Kurva Kalibrasi

4. Pembuatan Larutan Sampel-Obat Bodrex : Serbuk Berwarna jingga- Data Sampel Obat pada kemasan mengandung paracetamol 800 mg dan kafein 50 mg

-Rata-rata berat penimbangan sampel obat = 0,84016 g-Berat Kertas Timbang = 0,1219 g- Hasil penimbangan Kertas Timbang + Sampel Obat = 0,1260 g- Massa Obat = 0,0041 g/ 0,41 mg- Pelarut = Aquabides

- Larutan sampel saat penambahan hingga setengah volume labu ukur = berwarna jingga- Larutan sampel saat ditanda bataskan = tidak berwarna

-Kertas Saring = Berwarna Putih

-Membran Selulosa Nitrat = Berwarna Putih- Volume yg

diinjeksikan = 20 L

22

Serbuk Tablet Obat

- ditambahkan pelarut hingga setengah volume labu ukur- disonifikasi selama 5 menit- ditambahkan pelarut hingga tanda batas- dikocok- disaring menggunakan kertas saring

Labu Ukur 10 ml

- ditentukan berat rata-rata tablet obat- ditimbang sebanyak 4 mg- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL

Hasil Filtrat

- ditampung dalam botol vial- disaring menggunakan membran selulosa nitrat- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL

Hasil Filtrat ke-2

- 1ml filtrat dibuang (digunakan untuk membilas injeksi, botol vial) - 1 ml berikutnya ditampung- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL- siap untuk diinjeksikan

Sampel Siap untuk Diinjeksikan

5. Penyiapan Instrumen HPLC

Kondisi Analisis Paracetamol & Kafein

23

Fasa Gerak

- KH2PO4 0,01 M 420ml - 20 ml metanol- 30 ml asetonitril- 30 ml Iso Propil Alkohol

Kolom (Fasa Diam)

- panjang 15 cm- C-18- panjang gelombang 215 nm- laju alir 1 ml/menit

-Volume injeksi 20 L

Preparasi Sistem HPLC

- dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar- ditekan tombol “on” pada sakelar listrik- diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan botol penampung- ditekan tombol on pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa-dilakukan pemrograman alat dengan komputer, ikuti langkahnya sesuai instruksi dalam komputer -dipilih mode yg akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen- dialirkan fasa gerak- apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan- injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi rendah) dan terakhir larutan sampel- dicetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya- setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam komputer- tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan komputer- untuk mematikan, tekan tombol off pada pompa, detector dan power secara berurutan-putuskan sambungan listrik

Analisis dilakukan oleh operator dan praktikan

Perhitungan

Pembuatan Larutan Induk

Larutan Induk

Larutan Deret Standar Paracetamol

a. 1 ml larutan induk

b. 2 ml larutan induk

c. 3 ml larutan induk

d. 4 ml larutan induk

e. 5 ml larutan induk

f. 6 ml larutan induk

Larutan Deret Standar Kafein

a. 1 ml larutan induk

24

b. 2 ml larutan induk

c. 3 ml larutan induk

d. 4 ml larutan induk

e. 5 ml larutan induk

f. 6 ml larutan induk

25

Lampiran Foto Selana Praktikum

1. Alat yang dibutuhkan selama

praktikum

2. Pelarut/ Fasa Gerak

3. Pelarut/ Aquabides

4. Instrumen HPLC

5. Instrumen HPLC tampak samping

6. Penimbangan Sampel untuk membuat larutan Induk dan Larutan sampel

7. Sampel Obat Bodrex

8. Data pnimbangan 10 tablet obat bodrex

26

9. Penambahan pelarut(aquabides/ fasa gerak)untuk membuat larutan induk, larutan sampel

10. Hasil pembuatan deret larutan standar 1 mL;2 mL; 3 mL;4 mL ; 5 mL ; 6 mL

11. Hail penambahan pelarut (aquabides) pada sampel obat, hingga setengah volume ukuran labu ukur

12. Proses Sonifikasi pada Ultrasonic Vibrator

13. Larutan Sampel Obat

14. Penyaringan Sampel Obat menggunakan kertas saring

27

15. Hasil Penyaringan menggunakan kertas saring

16. Penyaringan kedua menggunakan membran selulosa nitrat

17. Hasil penyaringan menggunakan membran selusosa nitrat

18. Penginkjeksian Deret larutan standar/ Larutan sampel

19. Deret Larutan Standar/ Larutan sampel siap diinjeksikan, sudah tidak terdapat gelembung dalam syringe.

20. Proses Penginjeksian

21. Hasil Pemisahan ditunjukan dalam bentuk kromatogram dalam komputer

28