1- Spektroskopi: Işın-madde etkileşmesini inceleyen bilim dalına

spektroskopi denir.

• UV Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon Spektroskopisi

• IR Spektroskopisi

• Raman Spektroskopisi

• NMR Spektroskopisi

• X-Işınları Spektroskopisi

• Radyokimya

• Kütle Spektroskopisi

• Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi

• Atomik Emisyon Spektroskopisi

2- Elektrokimyasal Metodlar:

• Elektrokimyasal Hücre, incelenen maddeyi içeren bir çözelti

ya da erimiş tuz, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrotlar

ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir dış devreden oluşur.

• Voltametri

• Polarografi

• Amperometri

• Kondüktometri (İletkenlik)

• Potansiyometri

3- Kromatografik Metodlar:

Sıvı Kromatografisi

HPLC Kromatografisi

Katı-Sıvı Kromatografisi

İyon Kromatografisi

Gaz Kromatografisi

Kromatografi: Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını

gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır.

4-Termal Analiz Yöntemleri:

Örneğe ait bir fiziksel özelliğin sıcaklığın bir fonksiyonu olarak

ölçüldüğü veya bir tepkimede absorplanan veya açığa çıkan

ısının izlendiği yöntemlere Termal Analiz Yöntemleri denir.

Termogravimetri: Sıcaklık artışına karşı örneğin kütlesindeki

değişim ölçülür. Elde edilen sıcaklık-kütle eğrilerine Termogram

denir.

Erime gibi kütle değişimine neden olmayan faz değişimleri TG

ile incelenmez.

Işın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR spektroskopisi...

Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger,) Floresans, Fosforesans ve

Lüminesans Spektroskopisi

Işın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi

Işın Kırılması Refraktometri, interferometri

Işın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri

Işın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizm

Elektrik potansiyeli Potansiyometri, Kronopotansiyometri

Elektrik yükü Kulometri

Elektrik akımı Amperometri, Polarografi

Elektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)

Kütle Gravimetri

Kütle/yük Kütle spektroskopisi

Tepkime Hızı Kinetik yöntemler

Termal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik

Radyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri

Ölçülen Özellik Aletli Analiz Yöntemi

Analiz Süreci

Analizde Temel Bileşenler

Enerji

Kaynağı

İncelenen

Numune Analitik Bilgi

Analitik Yöntem Seçimi

Beklenen doğruluk,

Numune miktarı,

Numunedeki analit (analizi istenen madde) konsantrasyonu,

Numunedeki diğer maddelerin cevap durumu,

Numune ortamının fiziksel ve kimyasal özellikleri,

Kaç numune analiz edileceği

Ayrıca hız, kolaylık, maliyet de yöntem seçimini etkiler

ELEKTROMANYETİK SPEKTRUM

UV-GÖRÜNÜR BÖLGE MOLEKÜLER SPEKTROSKOPİSİ

Esası: Lambert-Beer eşitliğine göre moleküllerin monokromatik ışınları absorplamasına

dayanır.

Alet: Işık Kaynağı Monokromatör Örnek Dedektör Kaydedici

Moleküler absorpsiyon spektroskopisi 160-780 nm dalga boyları arasındaki ışığın

b ışın yoluna sahip bir hücredeki çözeltinin geçirgenliğinin (T) veya absorbansının

(A) ölçümüne dayanır

UV/GB spektroskopisi çok sayıda organik ve inorganik bileşiğin analizinde

kullanılmaktadır.

Mor ötesi (ultraviole UV) görünür bölgeden daha kısa dalga boylarına sahiptir. Bu

dalgalar her ne kadar insan gözüyle görülemeseler bile, eşek arısı gibi, bazı

böcekler tarafından görülebilir

Dünyanın çevresinde bulunan ozon tabakasının insanları UV ışınlarından koruması

insanın yaşamını sağlıklı bir şekilde sürdürmesi için çok iyidir fakat astronomlar

için bu evrenden bilgi toplamak için engel teşkil etmektedir.

Yaymış oldukları UV ışınımlarının incelenmesiyle yıldız ve galaksiler hakkında

çeşitli araştırmalar yapabiliriz.

INFRARED SPEKTROSKOPİSİ

Moleküllerin IR ışığını (0,78 – 1000 µm dalga boylu veya 12800 – 10 cm-1 dalga

sayılı) absorpsiyonuyla titreşim ve dönme enerji seviyelerine uyarılmalarının ölçümüne

dayanır.

ÖRNEK IR SPEKTRUMLARI

Kırmızı altı bölgeye karşılık gelen elektromanyetik dalga ışınımı, elektromanyetik

spektrumun mikrodalga spektrumu ile görünür bölge spektrumları arasında kalan

bölgedir.

İnfrared ışınımının temel kaynağı, ısı ve ısı ışınımları olduğu için, herhangi bir cisim,

infrared olayında bir sıcaklık yayar.

Normal vucut sıcaklığına sahip insanlar, yaklaşık 10 mikron büyüklüğündeki bir

dalgaboyuna sahip olan çok güçlü bir infrared ışınımı yaymaktadır.

i. İnsanlar infrared ışınımını göremeyebilirler fakat çıngıraklı yılan ailesine ait olan,

engerek yılanları, infrared ışınımlarını kullanarak görüntü oluşturmaktadırlar.

ii. İnsan ve hayvan vucutlarının infrared ışınları yayması yanında, Dünya, Güneş, yıldız

ve galaksiler gibi uzak cisimler de infrared ışınları yaymaktadırlar.

iii. Görünür bölge ışınımları ile karalar ile bulutları kolaylıkla ayırt edilmesine rağmen,

infrared ile daha ayrıntılı detaylar elde edilmektedir

RAMAN SPEKTROSKOPİSİ

Bir numunenin GB veya yakın-IR monokromatik ışından oluşan güçlü bir lazer

kaynağıyla ışınlanmasıyla saçılan ışının belirli bir açıdan ölçümüne dayanır.

Işık Kaynakları olarak lazer kullanılır. Lazer (L.A.S.E.R.), zorlanmış emisyon ile

ışık çoğaltılması anlamına gelen "Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiation" sözcüklerinin baş harflerinden türetilmiş bir kısaltmadır.

Raman spektroskopisi yöntemi ile katı sıvı ve gaz örnekler incelenebilir.

Bir molekülün Raman ve infrared spektrumlarının birlikte değerlendirilmesi ile nitel

analiz daha kolaylaşır.

İnfrared spektroskopisinde çözücü olarak kullanılamayan su, Raman

spektroskopisinde sık kullanılır.

NMR SPEKTROSKOPİSİ

Çalışma ilkesi: Çekirdeklerin 4-900 MHz (75m -0,33m) aralığındaki Radyo frekansı

aralığındaki elektromanyetik ışınların absorpsiyonuyla dönme enerji seviyelerine

uyarılmalarının ölçümüne dayanır. NMR spektroskopisi kovalent bileşiklerin

yapılarının aydınlatılmasında kullanılır. 1H, 11B, 13C, 15N, 31P3, 19F vb. NMR ları

vardır.

Organik maddelerin büyük bir kısmında hidrojen atomu bulunduğundan, yöntem önce

protonlar için uygulanmıştır. Böylece NMR yöntemiyle örnekte hidrojen olup

olmadığı, varsa ne kadar bulunduğu ölçülebilir.

Organik ve inorganik bileşikler hidrojenden daha az karbon içerdiklerinden 13C-NMR

spektrumu daha sadedir.

Atomlardaki iç kabuklarda oluşturulan boşluğa dış kabuk elektronunun geçişi

sırasında yayılan ve λ = 0,01 – 10 nm arasında değişen ışınlara X ışınları denir.

Işığın dalgaboyu azaldıkça, enerjileri artmaktadır. X- ışınları, oldukça küçük dalga

boylarına sahip olduğu için, bunların enerjileri ultraviole (morötesi) ışınlarından

daha büyüktür.

X-ışını Dünya atmosferinden yüzeyine nufus edemez. Bu bizim yaşamımızı

sürdürmemiz için oldukça iyidir.

Herhangi bir hastanede X-ışınları çektirilirken, vucudunuzun bir yanı üzerine X-

ışınlarına hassas bir film koyulur ve sonra X-ışınları sizin vucudunuzdan geçip film

üzerine düşecek şekilde ayarlanarak cıhaz çalıştırılır.

Kemikler ve dişlerin yoğunluğu derinizden daha fazla olduğu için X-ışınlarını

derinin soğurduğundan daha fazla soğurmaktadır ve deri bu ışınları tamamıyla

geçirirken, kemikler ve dişler çoğunu soğurduğu için film üzerine kemik ve dişlerin

bir silüeti düşer.

X-IŞINLARI SPEKTROSKOPİSİ

RADYOKİMYA

Kararsız çekirdeklerin bozunmalarını ve bu bozunma ürünlerini inceleyen bilim dalına

Radyokimya denir.

Bir elementin tanecik veya elektromanyetik ışıma yayan izotopuna Radyoizotop denir.

Dedektör: Sintilasyon dedektörleri, Ge(Li) yarıiletken dedektör.

KÜTLE SPEKTROSKOPİSİ

Atom veya moleküllerden gaz fazında iyonlar oluşturularak, bu iyonlar kütlelerine

göre ayrılır ve kaydedilir. İyonların bağıl miktarlarının (kütle/yük) oranına göre

çizilen grafiğine kütle spektrumu denir. + veya – iyonlar incelenebilmelerine karşın

genellikle + iyonlar incelenir. Katı, sıvı ve gaz örnekler incelenebilir.

ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROSKOPİ

Atomik absorpsiyon spektroskopisinde metallerin çoğu ile az sayıda ametal analiz

edilir.

Atomik absorpsiyon spektroskopisinde element elementel hale dönüştürüldükten

sonra

buharlaştırılır ve kaynaktan gelen ışın demetine maruz bırakılır Aynı elementin ışın

kaynağından gelen ışınları absorplar. Sulu Numune Bir alev içine yükseltgen gaz

karışımı ile püskürtülür. Bu şekilde 70 kadar element(metal/yarı metal) analiz

edilir.

Ametallerin absorpsiyon hattı vakum UV bölgeye düştüğünden bu elementler bu

metotla analiz edilemez.

Metodun hassasiyeti yüksektir. Eser miktarda madde analizi yapılabilir.

Işığı absorplayan atomlarda temel seviyedeki elektronlar, kararsız uyarılmış enerji

düzeylerine geçerler ve absorpsiyon miktarı, temel düzeydeki atom sayısına

bağlıdır.

Temel düzeydeki element atomlarının UV-Gör. Bölgedeki monokromatik ışınları

Lambert-Beer yasasına göre absorplaması ilkesine dayanmaktadır.

Işık Kaynağı

Atomlaştırıcı

Monokromatör

Dedektör

kaydedici

Alevli Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi

Oyuk

Katot

lambası

ATOMİK EMİSYON SPEKTROSKOPİSİ

Uyarılmış enerji düzeyine çıkarılan atomların ve tek atomlu iyonların daha düşük

enerjili düzeylere geçişlerinde yaydıkları ultraviyole ve görünür bölge" ışımasının

ölçülmesi, yaygın olarak kullanılan bir atomik spektroskopi yönteminin temelini

oluşturur.

Eğer atom veya iyonların uyarılmış enerji düzeylerine çıkmaları bunların

ultraviyole veya görünür bölge ışımasını absorplamaları dışında bir süreçle

gerçekleşmişse yayılan ışımanın ölçülmesi yöntemine atomik emisyon

spektroskopisi (AES) adı verilir.

Atomik emisyon spektroskopisi uyarmayı sağlayan enerji kaynağının türüne göre

sınıflandırılır. Analiz örneğini atomlaştırmak ve uyarmak için alevin kullanıldığı

yöntem Alev emisyon spektroskopisi adını alır. Atomlaşmanın ve uyarmanın

elektriksel boşalım veya plazma gibi bir enerji kaynağı ile gerçekleştirildiği yöntem

ise sadece atomik emisyon spektroskopisi veya optik emisyon spektroskopisi

olarak adlandırılır.

ELEKTROKİMYASAL METODLAR

i. Elektrokimyasal Hücre, incelenen maddeyi içeren bir çözelti ya da erimiş tuz,

maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrotlar ve bu elektrotları birbirine

bağlayan bir dış devreden oluşur. Bu elektrotlardan indirgenmenin olduğu

elektroda katod yükseltgenmenin olduğu elektroda Anot denir.

ii. Böylece meydana gelen elektron iletilmesi sonucu elektrik akımı oluşur.

Metallerde metalik iletkenlik çözeltilerde ise iyonik iletkenlik söz konusudur.

iii. Elektrik akımının birimi olan amper birim zamanda (sn) elektrik yük miktarı

(culomb) olarak tanımlanır.

iv. Elektrik akımının akması için gerekli olan 2 nokta arasındaki gerilim

(potansiyel) (E) farkının birimi Volttur. E = IR eşitliğiyle gösterilen ilişkide E

= Volt, I = Amper ve R orantı katsayısı olup değeri ohm ile verilir.

v. Elektrik enerjisi birimi olan joule=volt X culomb

i. Bir elektrokimyasal hücrede 2 elektrot birleştirildiğinde bir kimyasal

reaksiyon oluşuyor ve akım geçiyorsa böyle hücrelere Galvani Hücresi denir.

Dıştan elektrik enerjisi verilmek suretiyle kimyasal reaksiyon oluşuyorsa

elektrolitik hücre ve olaya da elektroliz denir.

ii. Elektrolizde 1 eş-gr maddenin tepkimesine neden olan elektrik yük miktarı

96487 culomb dur.

iii. 96487 C luk bu yüke 1 Faraday (F) denir. Cl2, Al metali, Naylon hammaddesi

olan adiponitril, saf Cu, Ag, Au, Ni ve Cr kaplamaları PbSO4 ile akünün

doldurulması elektrolizle olur.

iv. Elektrokimyasal bir hücrede bulunan tuz köprüsü hem elektrik yük dengesini

dengeler hemde iyonların hareket hızlarının farklı olmasından kaynaklanan

yük dengesizliğini ifade eden sıvı bağlantı gerilimini azaltır. Bu nedenle tuz

köprüsünde anyon ve katyonların hareket hızları yaklaşık

v. eşit olan KCl,NH4NO3 veya KNO3 kullanılır. İndirgenme potansiyeli pozitif

ve büyük olan elektrodun e- alma eğilimi (katod olması) daha fazladır.

Bir elektrokimyasal hücrede çalışma esnasında madde elektrot yüzeyine 3 yolla

aktarılır. Bunlar; Elektriksel göç (migrasyon), difüzyon ve karıştırma

(konveksiyon)dur.

Elektriksel Göç : Katot ve anot arasında uygulanan gerilim farkı elektriksel bir

alan oluşturur. İyonlar bu alan etkisiyle ters yüklü elektrotlara doğru göç ederler.

İyonların elektriksel alandaki hareket hızları iyonun yüküne, büyüklüğüne ve

çalışılan ortamdaki yönlenme biçimine bağlıdır.

Difüzyon : Derişim farkından kütle aktarımıdır.

Faraday olayları : Elektrot - çözelti ara yüzeyinde elektron aktarılmasıyla

yürüyen olaylardır

Voltametri:

Voltametride, Mikro çalışma elektrodu ile karşılaştırma elektrodu arasına uygulanan

ve değeri zamanla değişen gerilime karşı hücrede çalışma elektrodu ile karşıt elektrot

arasında geçen akım ölçülür. Gerilim – Akım grafiğine Voltamogram denir. Çalışma

elektroduna uygulanan gerilim – yönde değiştirilirse indirgenme tepkimesi hızlanır ve

katod olarak davranır. Katodik akım oluşur. Voltametri, bir indikatör ya da çalışma

elektrodunun polarize olduğu şartlar altında akımın, uygulanan potansiyelin bir

fonksiyonu olarak ölçülmesinden faydalanarak, analit hakkında bilgi edinilen bir grup

elektroanalitik metotlara verilen isimdir. Voltametri, potansiyometrik ölçümlerden

farklı olarak tam konsantrasyon polarizasyon şartlarında bir elektrokimyasal hücrede

oluşan akımın ölçülmesine dayanır (Potansiyometrik ölçümler, akımın sıfıra

yaklaştığı ve polarizasyonun olmadığı şartlarda yapılır). Ayrıca elektrogravimetri ve

kulometriden farklı olarak konsantrasyon polarizasyonunun etkilerini en aza indirmek

için kullandığı tedbirler daha değişiktir.

POLAROGRAFi:

Voltametride kullanılan mikro elektrot iç çapı 0,03 – 0,05 mm cam bir kapiler

borudan akarak büyüyen ve belli bir büyüklüğe geldiğinde koparak düşen bir

civa damlası ise yöntemin adı polarografidir. Elde edilen akım – gerilim eğrisi

de POLAROGRAM olarak adlandırılır.

Civanın damlama hızı (10 – 60 kez/dk) civa haznesinin yüksekliği ile ayarlanır.

Civa mikro elektroda uygulanan gerilim taraması 50 – 200 mV/dk olduğundan 1

damla süresi içerisinde hemen hemen sabit kalır. Hg yükseltgenmesi kolay

olduğundan + 0,4 V tan daha pozitif gerilimlerde çalışılamaz. Yani

yükseltgenme olaylarının büyük kısmı incelenemez. Göç akımını minimuma

indirmek için ve analizlenen (elektroaktif) maddenin elektrot yüzeyine sadece

diffüzyon akımla aktarılması için kullanılan destek elektrolit bazen bir tampon

veya bazı iyonları maskeleyici görevi de yapar. Artık akıma neden olan O2; N2

gazının geçirilmesiyle uzaklaştırılır.

AMPEROMETRİ :

V = IR eşitliğinde sabit gerilim uygulamasıyla akım ölçülmesine dayanır.

Cihaz : Polarografide kullanılan cihaza mikro civa elektrodun daldırıldığı kapta

bir mikro büret eklenmiştir. Eklenen titrant’a karşı hücreden geçen akım ölçülür.

Bu yöntem en çok O2 tayininde kullanılır.

KULOMETRİ :

Bir elektrokimyasal hücredeki elekroaktif madde veya maddelerin elektroliziyle

harcanan madde miktarı, harcanan elektrik yükü miktarıyla doğru orantılı

olmasına dayanır. Voltamogramın plato bölgesinde seçilen bir gerilimde

elektroliz gerçekleşirse Gerilim Kontrollü Kulometri denir.

.

KONDÜKTOMETRİ (İLETKENLİK)

Bir elektrolit çözeltisindeki elektrik iletimi, pozitif yüklü taneciklerin katoda,

negatif yüklü taneciklerin de anoda göç etmeleri olayıdır. "İletkenlik" akım

ölçüsüdür ve çözeltideki yüklü taneciklerin sayısı ile doğru orantılıdır. İyonların

tümü iletkenliğe katkıda bulunur; herhangi bir taneciğin taşıdığı bir akım, o

taneciğin konsantrasyonuna ve ortamdaki hareket yeteneğine bağlıdır.

Analizlerin doğrudan doğruya iletkenlik ölçümlerine dayanılarak yapılması,

taneciklerin özellikleri nedeniyle, sınırlıdır. Bir çözeltinin toplam iletkenliğine

çözeltideki her tür iyonun katkıda bulunması nedeniyle iyon karışımlarının

bulunduğu çözeltilerde doğrudan iletkenlik ölçümünün seçici özelliği yoktur.

Ancak yöntemin hassasiyeti yüksek olduğundan bazı uygulamalarda çok

önemlidir.

Yöntemin en önemli avantajı, çok seyreltik çözeltilere ve reaksiyonun tam

olmadığı sistemlere de uygulanabilmesidir. Örneğin, seyreltik fenol (Ka 10-10)

çözeltisinin, potansiyometrik veya indikatör dönüm noktası yöntemi ile

yapılamayan analizi bu yöntemle yapılabilir.

POTANSİYOMETRİ

Galvanik bir pil sisteminde iki elektrot arasındaki potansiyel farkını sıfır yada çok

küçük akım altında saptamaya dayalı olarak yapılan ölçüm yöntemine

potansiyometri denir. Potansiyelden gidilerek derişim saptanması, elektrotlardan

birinin potansiyelinin değişmez olmasıyla mümkündür. Potansiyeli değişmez olan

elektroda karşılaştırma elektrodu, potansiyeli değişen elektroda da göstergen

elektrot denir. Göstergen elektrodun potansiyeline bağlı olarak derişim

saptanabilir. Ayrıca titrasyonlarda indikatör gibi eşdeğerlik noktasının

saptanmasında kullanılabilir. Böyle ölçümlere potansiyometrik titrasyonlar denir.

KROMATOGRAFİK METODLAR

Kimyasal bileşik karışımlarını ayırmak ve arıtmak için, analitik kimyacıların

kullandıkları iki önemli teknik vardır: Damıtma ve kromatografi. Damıtma, farklı

sıcaklıklarda kaynayan bileşikleri ayırır. Ne var ki, birçok karışımın bileşenleri

(özellikle biyolojik örnekler), ısıtıldıkları zaman bozulurlar. Bazıları aynı sıcaklıkta

kaynar, bir bölümü de çok küçük miktarlarda bulunur. Bu nedenle, karışımların,

sıvılardaki çözünürlüklerinden ya da katı maddelerin yüzeylerine tutunma

farklılıklarından yararlanarak ayrılmasını sağlayan kromatografi geliştirilmiştir.

Kromatografi, Yunanca chroma (renk) ve graphein (yazmak) sözcüklerinin

birleşmesiyle oluşmuş olup, ilk kez 1903 yılında Rus botanikçi Michael Tsvett

tarafından renkli bitki pigmentlerini ayırma amaçlı kullanılmıştır. Daha sonraları,

çeşitli çok bileşenli numûnelerdeki bileşenlerin ayrılması ve saflaştırılmasında

kullanılmaya başlanmıştır.

Kromatografi: Bir sâbit faz üzerinden hareketli faz geçirilerek, bir numûnedeki

bileşenlerin dağılma ve adsorpsiyon gibi mekanizmalar yoluyla farklı zaman

süreçlerinde taşınma ve ayrılması işlemidir.

Bütün kromatografik metotlar numûne içerisindeki maddelerin sâbit ve hareketli fazla

etkileşimi sonucu ayrışmaları esasına dayanır. Bu ayrışmanın nedeni, maddelerin

hareketli veya sâbit faza olan farklı ilgileridir.

Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır;

Sâbit faz: Kromatografide, bir kolon içerisine veya düz bir yüzeye tutturulmuş faza,

sâbit faz ( hareketsiz faz; durgun faz; stasyoner faz) denir. Bu faz daima bir “katı” veya

bir katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından” oluşur.

Hareketli faz: Sâbit fazın üzerinden veya arasından geçen faza ise hareketli faz

(sürükleyici faz, mobil faz) denir. Bu faz daima bir “sıvı” veya “gazdan” oluşur.

Sâbit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin

türü: Kromatografi de “yüzey tutunması veya adsorpsiyon” ile “çözünürlük” olguları

temel etkileşim türlerini oluştururlar.

KROMATOGRAFİ ‘NİN SINIFLANDIRILMASI

�Analizde etkin olan mekanizmalara göre çeşitli kromatografik yöntemler

geliitirilmiştir. Birbirlerinden farklı yöntemler olsalar da kromatografik yöntemlerde

genellikle ayrımı yapılacak karışım; bir hareketli ve bir de sâbit faz ile

etkileştirilerek bileşenlerine ayrılır. Bu nedenle kromatografi kısaca, sâbit ve

hareketli fazların yarışı olarak özetlenebilir.

Ayrılma Mekanizmalarına Göre;

� Uygulama Biçimine Göre;

� Faz Tiplerine Göre;

1-ayrılma Mekanizmalarına Göre Sınıflandırılması

Adsorpsiyon kromatografisi:

Katı veya sıvı moleküllerin, sıvı veya gaz moleküllerini çekim kuvvetleri yardımıyla

yüzeyde tutmasına adsorbsiyon denir. Burada sözü edilen adsorbsiyon fiziksel

adsorbsiyondur. Zayıf Van der waals, elektrostatik çekimler ve dipol-dipol

etkileşimlerine dayanır, tersinirdir.

Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı faz

üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin dolgu

maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen bir ayırma

işlemidir. Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya

gaz olan hareketli faz arasında etkileşir.

Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı , gaz-katı kromatografisidir.

Sabit faz : Durgun veya hareketsiz fazdır

Hareketli faz : Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin ayrılmasını

sağlayan fazdır.

Şeker, nişasta, selüloz, kalsiyum karbonat, magnezyum sülfat, alümina, silika jel

ve kil gibi birçok madde adsorban katı faz olarak kullanılabilmektedir. Hareketli

faz olarak ise alkol, aseton, kloroform gibi bütün organik çözücüler kullanılabilir.

Partisyon (dağılma) kromatografisi;

Dağılım, bir karışımdaki maddelerin birden fazla çözücü içerisindeki

çözünürlükleri oranında dağılmasıdır. Her madde, fiziksel ve kimyasal

özelliklerine, yapısında bulundurduğu fonksiyonel gruplara göre farklı

çözünürlüğe sahiptir.

.Bu yöntemde, sâbit sıvı faz, yüksek yüzey alanlı gözenekli bir katı destek

maddesine emdirilmiştir. Hareketli faz ise sıvı veya gazdır. Ayırımı

gerçekleştirilecek bileşikler hareketli ve sâbit faz sıvılarında farklı çözünürler.

Çözünürlük farkından dolayı bileşikler sistemi önce veya sonra terk ederler.

Çözünürlüğü sâbit fazda olan bileşikler sistemde daha uzun süre tutulduğu için

sistemi daha geç terk eder.

iyon değiştirme kromatografisi:

• Benzer yüklü iyonların tersinir şekilde yer değiştirmesine iyon değişimi denir.

iyon değişimi; sâbit fazın yüzeyinde kimyasal bağlarla bağlanmış yüklü

grupların hareketli faz ile sürüklenen karışımda bulunan ve kendileriyle benzer

yüke sahip gruplarla yer değiştirmesi üzerine kurulmuş bir mekanizmadır.

• şehir kullanım sularının temizlenmesinde ve yumuşatılmasında bu kromatografi

mekanizması etkin bir şekilde kullanılmaktadır.

Jel filtrasyon ( moleküler eleme ) kromatografisi;

Jel filtrasyon mekanizması ile karışımdaki bileşenler büyüklük farkına dayanılarak

ayrılırlar. Herhangi bir karışım gözenekli bir jel içerisine döküldüğünde, karışım

içindeki küçük moleküller gözeneklere tutunurken büyük moleküller jelden akarak

geçerler. Böylece özellikle kromatografik saflaştırma sırasında bozunabilecek

biyolojik bazı karışımlar (protein, enzim, vb.) bu mekanizmanın etkin olduğu jel

geçirgenlik kromatografisi ile ayrılabilir.

iyon çifti kromatografisi:

Bu teknik, özellikle iyonlaşabilen asidik veya bazik maddelerin ayrılmasında

kullanılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çifti reaktif, sâbit faz tarafından

adsorplanır ve iyonize olmuş maddeler iyon çiftleri ile iyonik etkileşime girerek

birbirinden ayrılır.

Afinite kromatografisi:

Afinite, moleküllerin birbirine duyduğu ilgiyi ifade eder. Afinite kromatografisi, ise

moleküllerin bu özelliklerinden faydalanılarak yapılan ayırma ve saflaştırma

işlemlerine verilen genel addır. Afinite kromatografisi, bioteknolojide yaşanan

gelişmelere paralel olarak önemi hızla artan ve biomakromoleküllerin ayırma-

saflaştırma işlemlerinde kullanılan bir tekniktir. Bu teknikte, biomakromolekülleri

tanıyan ve ligand adı verilen moleküller katı bir destek üzerine tutturulur ve

biomoleküller ile etkileşmeleri sağlanır.

SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

Tıpta Biyokimyanın Amacı

Bir molekülün

• Var olup olmadığını

(ne olduğu - işlevi)

• Miktarını

belirlemektir

Tıpta temel araştırmalar

• Sağlıklı durumun nasıl işlediği

• Hastalıkların nasıl oluştuğu

• Hastalıkların nasıl önlenebileceği

• Hastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleri

Tıpta günlük kullanımda

• Ayırıcı tanı TANI

• Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi

• Hastalığın seyrinin takibi

• Tedavi seçimini yönlendirir

• Tedavinin etkili olup olmadığının takibi

• Tedaviye ait yan etkilerin takibi

• ŞİKAYET

• SORGULAMA (ANEMNEZ)

• SİSTEMİK MUAYENE

• OLASI TANILAR

A X

B Y AYIRICI TANI

C Z

TANI

Tıpta günlük kullanımda

• Ayırıcı tanı TANI

• Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi

• Hastalığın seyrinin takibi

• Tedavi seçimini yönlendirir

• Tedavinin etkili olup olmadığının takibi

• Tedaviye ait yan etkilerin takibi

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Varlığı ya da miktarı araştırılan molekül ile

OLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİME

giren bir araç gereklidir !

Spektrofotometrik yöntemlerde bu araç

kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için

yöntemlere eklenen immunolojik veya enzimatik

tepkimelerdir

ANTİKOR ENZİM

genellikle

• Renkli

• Berrak

Çözeltiler elde ederiz

Elektromanyetik ışıma,

uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerji türüdür

Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdır

Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki

elektromanyetik radyasyon enerjisidir.

Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki

genellikle nanometre (nm), bazen angström (Ao) ve

milimikron (mµ) olarak ifade edilir.

Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık,

insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga

boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.

İnsan gözü, yaklaşık 380-750 nm arasında dalga boylarına sahip olan ışık

enerjilerine cevap verebilmektedir.

<380 nm dalga boyundaki ışık Ultraviyole (Mor-ötesi, U.V.)

380-440 nm dalga boyundaki ışık Menekşe

440-500 nm dalga boyundaki ışık Mavi

500-580 nm dalga boyundaki ışık Yeşil

580-600 nm dalga boyundaki ışık Sarı

600-620 nm dalga boyundaki ışık Turuncu

620-750 nm dalga boyundaki ışık Kırmızı

>750 nm dalga boyundaki ışık İnfraruj (Kırmızı-ötesi, IR) olarak

tanımlanır.

Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-

750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini

geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini

soğuruyorsa (absorpluyorsa) siyah görünür.

Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı

renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür.

yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı

rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür.

Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin

görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler

olarak adlandırılır.

Sarı-Mavi

Kırmızı-Yeşil

Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:

• Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)

• Yayılım (emisyon)

• Geçiş (transmittans)

• Tutulum (absorbans)

• Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

Ölçülen Özellik Aletli Analiz Yöntemi

Işın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi

Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans,

Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi

Işın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi

Işın Kırılması Refraktometri, interferometri

Işın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri

Işın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizm

Elektrik potansiyeli Potansiyometri, Kronopotansiyometri

Elektrik yükü Kulometri

Elektrik akımı Amperometri, Polarografi

Elektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)

Kütle Gravimetri

Kütle/yük Kütle spektroskopisi

Tepkime Hızı Kinetik yöntemler

Termal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik

Radyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri

Lambert-Beer kanunu:

Bir çözeltiden

geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı,

emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır

İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UV-

görünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir

kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise

çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).

Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan

ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io)

daha küçüktür.

Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık

şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak

tanımlanır.

Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak

ifade edilir.

Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik

dansite, A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden

geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin

(soğurulduğunun) ifadesidir.

Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya

konsantrasyonu ile %Transmittans (%T) arasında

doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A)

arasında doğrusal bir ilişki vardır.

Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki

maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-

Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir

küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu

veya küvet çapının (l) artmasıyla azalır; ayrıca dilüe

çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu

(c) ile doğru orantılıdır. absorpsiyon katsayısı

(ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert-

Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur.

Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.

Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır

Görünen

renk

Absorbe edilen

renk

Işık (nm)

- - 220-380

Sarı-yeşil Menekşe 380-440

Sarı Mavi 440-475

Portakal Yeşil-mavi 475-495

Kırmızı Mavi-yeşil 495-505

Mor Yeşil 505-555

Menekşe Sarı-yeşil 555-575

Mavi Sarı 575-600

Yeşil-mavi Portakal 600-620

Mavi-yeşil Kırmızı 620-700

Dersin Akışı

• Biyokimyanın Amacı

• Biyokimyada ölçüm yapmanın temeli

• Spektrofotmetri ile ilgili tanımlar

• Spektrofotometrenin bölümleri

• Spektrofotometre ile ölçüm yapılması

• Özet

Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya

çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme

işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da

fotometre denir.

Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu

da ölçülebilir.

Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak

ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak

adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler

spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir

standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans,

optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin

absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.

Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin

kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin

kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli

sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı

dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda)

ışık seçilir.

Özet • Miktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğince

ÖZGÜN ETKİLEŞİM

• Emilen (absorbe olan) ışık miktarı konsantrasyonla doğru orantılıdır