10/1/17 ts. vũ bích ngọ[email protected] 1 · • Điều kiện thích hợp – phase...
TRANSCRIPT
10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected] 1
SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Đặcđiểmsinhhọccủatếbào
Cácyếutốảnhhưởngđếnsựthànhcôngcủanuôicấytếbào
10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected]
ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Tínhcơhọcyếu(dễvỡ)
Tăngtrưởng,phânchiachậm(20-40giờ)Hiệusuấtsinhchấtcóhoạtcnhsinhhọcthấp
10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected]
4
Chukìtếbào
M Mitosis
G1 Gap1
G2 Gap2
G0
S Synthesis
G1 check point • cell big • environment suitable
G2 check point • DNA replicated • cell big • environment suitable
Metaphase check point • chromosome align on spindle
5
Chukìtếbào
• Interphase:– Nhìnchungkéodàitừ12-14giờtrongmôđộngvậtcóvú– TếbàođangtổnghợpRNA,tạoproteinvàpháttriểnvềkíchthước
• Gap0(G0):tếbàothoátrakhỏichukìtếbàovàkhôngphânchia• Gap1(G1):tếbàogiatăngkíchthước,tổnghợpRNAvàprotein,có1G1
Checkpoint• SPhase:sựnhânđôiDNAxảyra• Gap2(G2):tếbàosẽcếptụcpháttriểnvàsảnxuấtcácproteinmới.Có1G2
Checkpoint• MitosishayMPhase:
– Sựpháttriểnvàtổnghợpprotein– Tếbàochiathành2tếbàogiốngnhau.– Mitosisthườngxảyratừ1-2giờ– CóCheckpointtronggiữakìcủaMitosis(MetaphaseCheckpoint)đểđảmbảo
tếbàohoànthànhxongsựphânchia.
• Làđiểmquantrọngquyếtđịnhsựphânchiacủatêsbaof
• Khitếbàovượtquađiểmnày,đivàophaseS,quátrìnhphânchiakhôngthểđảongược.
Chukìtếbào
• Đảmbảotếbàophânchiathuậnlợi
• Nếutếbàobịlỗihoặctổnthương,G”checkpointsẽdừnglạiđểsửachữa
• Nếutổnthươngkhôngthểđảongược,tếbàođivàoquátrìnhapoptosisàđảmbảoDNAhưhỏngtếbàokhôngtruyềnchothếhệsauàquantrọngtrongngănngừaungthư
Chukìtếbào
9
SỰTĂNGSINHINVITRO
• SựTĂNGSINHcủatếbàotrongnuôicấyphụthuộc:– Trạngtháitựnhiêncủatếbào:
• Vaitròcủabộgen–GiớihạnHayflick• Vaitròcủasựbiểuhiệngen
– Môitrườngnuôicấy• Cơchấttếbàobám• Thànhsinhlívàsinhhoácủamôitrườngnuôi• Thànhphầncủaphasekhí• Nhiệtđộnuôi• Tươngtáctếbào-tếbàovàtếbào-chấtnền
ThờigiannhânđôicủarBMMSCkhôngthayđổitrongsuốtquátrìnhnuôitrongkhiởhASC,rASC,
hBMMSCthờigiannàytănggấp2
IzadpanahR,TryggC,PatelB,etal.BiologicProper�esofMesenchymalStemCellsDerivedFromBoneMarrowandAdiposeTissue.Journalofcellularbiochemistry.2006;99(5):1285
ThayđổikiểugenvàkiểuhìnhDunghợp,biếnnạp,tảinạp…àtếbàothayđổikiểugenvàkiểuhình
• Ởmỗitếbàophânchia,sựtựlàmmớivàbiệthoáđượcquyếtđịnhbởitươngtáccủayếutốbêntrongvàcnhiệuhướngdẫnhoặccnhiệuchọnlọcbênngoài
Thayđổikiểugenvàkiểuhình
• MSCcủacácloàicókhảnăngbiệthoáthànhtếbàomỡnhưnhauởpass5(6-8ngày)
• rASCvàhBMMSCthờigiantạogiọtmỡdàihơnởpass10;khôngcókhảnăngtạomỡsaupass15
• rBMMSCvàhASC:ítthayđổikhảnăngbiệthoá,thờigianhìnhthànhgiọtmỡkhôngkhácnhauchođếnpass20
Thayđổikiểugenvàkiểuhình
• hASCvàrBMMSCbiệthoáthànhdòngtếbàotạoxươngtrongsuốtquátrìnhnuôicấy
• rASCvàhBMMSCmấtkhảnăngbiệthoáthànhdòngtếbàotạoxươngsaupass10
Thayđổikiểugenvàkiểuhình
• Chiềudàitelomeregiảmtheotuổi• Hoạtcnhcủatelomerasecaonhấtởcácpassđầu�ên
• mứcđộhoạtđộngcủatelomerasekhácnhaugiữacácloàivàcácnguồnthu:giảmnhiềunhấtởrASCvàhBMMSC
Yếutốphiênmã• chịutráchnhiệmđiềuhoàđặccnhsinhhọccủatếbào– POUđượcmãhoábởiOct-4– Oct-2,Sox-2vàRex1điềuhoàchặtchẽtrongquátrìnhpháttriểnphôi
à Duytrìcnhđa�ềmnăngcủatếbào• Cácyếutốkhác(bổsungtừngoài):địnhhướngsựbiệthoácủatếbào(BMP-6,TGF-β3,dexamethasone,ascorbate2-phosphate,proline,pyruvate,insulin,transferrin,selenousacid,5aza-cys�dine)
Tínhchấtcầngiáđỡ
-TBbámvàogiáđỡđểcóthểsốngsót,phânchia-Ngoạitrừ:hồngcầu,TBungthư,1sốdòngTBliêntục
10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected]
19
SỰBÁMDÍNHINVITRO
• Sựbámdínhtếbàolàcầnthiếtchosựtăngsinhvàbiệthóa
• Cácphântửbámdínhtếbào:– Tươngtáctếbào-tếbào:CAMs,cadherins– Tươngtáctếbào-chấtnền:integrin,transmembrameproteoglycan
• Phứchợpnốichặt(Tightjunc�onalcomplex)trongtếbàobiểumôchosựtươngtáctếbào-tếbào.
ExperimentalMethods2006 20
Cácnhântốảnhhưởngđếnsựbámdính
• Sựphântáchbằngenzyme�êuhủycácphântửbámdínhvàchấtnềnngoạibào
• Hầuhếttếbàotừmôrắnpháttriểndạngmonolayer
• BềmặtbaophủvớiMatrixkíchthíchsựtăngsinhvàbiệthóa`
21
KÌMHÃMTIẾPXÚC-ĐIỀUHOÀSỰTĂNGSINH
• Kìmhãm�ếpxúc• Kíchthíchsựtăngsinh– Mậtđộthấp– Cáccnhiệutừmôitrường:cácnhântốtăngtrưởng
• Ứcchếsựtăngsinh– Giớihạnmậtđộ:mậtđộtếbàocao– Kìmhãm�ếpxúc:tươngtáctếbào– Cáccnhiệutừmôitrường:p53geneproduct
ExperimentalMethods2006 22
Cácyếutốảnhhưởngđếnsựthànhcôngcủanuôicấytếbào
• Tếbàothíchhợp• Điềukiệnthíchhợp
– Phaserắn• Cơchấthayphasemàtếbàopháttriểneg.glass,plas�c,collagen,agar
– Phaselỏng• Cácđặccnhsinhlívàlíhóacủathànhphầnmôitrườngnuôi
– Phasekhí– Nhiệtđộ– Độvôtrùngcủamôitrường
ExperimentalMethods2006 23
Pharắn
• Tếbàocầnbámdínhvàomộtgiáthểđểsinhtrưởngvàdichuyển
• Dụngcụphổbiếnnâấtlàpolystyreneplas�c
• Nhữngcơchấtkhácnhưglass,filterwells• Bềmặtcótêểđượcxửlívới:
– PhủvớicơchấtnềnnhưCollagen,poly-l-lysine,matrigel
– Lớpfeeder:monolayerofsuppor�ngcells,perhapspromotecellgrowthanddifferen�a�onbycellcontactandsubstancesecreted• Neuronsonglialcellfeederlayers
ExperimentalMethods2006 24
Phaselỏng
• Thànhphầncủamôitrường– Muốivôcơ• Cânbằngápsuấtthẩmthấu• Điềuhòađiệnthếmàng:sodium,potassiumvàcalciumions.• Cầnthiếtchosựbámdínhnhưenzymecofactor.
– Carbohydrate• Hầuhếtchứa4-20mMglucose• Nguồnnănglượng:glycolysis
ExperimentalMethods2006 25
Phaselỏng
– ProteinsandPepcdes• Đượcsửdụngđểthaythếhiệndiệntronghuyếtthanheg.transferrin,fibronec�n
– Aminoacids• Quantrọngchosựtăngsinhvàbiệthóa• glutaminecóthểđivàochutrìnhKreb’scycle
– Fa�yAcidsandLipid• Quantrọngtrongmôitrườngserumfreemediae.g.cholesterolandsteroidscầnthiếtchocáctếbàođặcbiệt.
ExperimentalMethods2006 26
Phaselỏng
– Vitamin• vitaminsBcầnthiếtchosựpháttriểnvàsựtăngsinh• Tiềnchấtchocácco-factors• Vitaminsthườngsửdụnglàthiamine,riboflavinandbio�n
– TraceElement• zinc,copper,seleniumvàtricarboxylicacidintermediates.• SeleniumisadetoxifiervàgiúptáchcácgốcO2tựdo
ExperimentalMethods2006 27
Phaselỏng
– Hệđệm• HầuhếtcáctếbàocầnpHtốiưu:7.2-7.4• KiểmsoátpHcầnthiếtchonuôicấytốiưu:
– Hệthốngđệmbicarbonate/CO2– Hệđệmhóachất:HEPES
• MôitrườngnuôicấythươngmạinhưpHindicator– vàng(acid)hayhồng(alkali)
– Ápsuấtthẩmthấu• Tươngtựápsuấtthẩmthấu290mOsm
ExperimentalMethods2006 28
Phaselỏng
– Huyếtthanh• Nhântốkhôngxácđịnh:albumins,growthfactorsvàgrowthinhibitors• Giatăngkhảnăngđệm• Tăngkhảnăngbámdínhvàtrunghòachấtđộc• Quantrọngchocáctếbàopháttriểnchậmhaykhinuôimậtđộthấp• Biếnthiếntừngmẻ• Huyếtthanhbấthọatnhiệt(incuba�onat56ºCfor30minutes)cóthểgiúpgiảmrủironhiễm
ExperimentalMethods2006 29
Phasekhí
– Carbondioxide• Quantrọngchohệđệm
– 5-10%CO2– Sảnxuấtsảnphẩm:pyruvate
– Oxy• Hầuhếttếbàocầnthiếtphânápoxythấp• anaerobicglycolysis• NồngđộoxycaocóthểgiatănggốcO2tựdo
H3C C C O−
O O
C S
O
H3C CoA
HSCo A
NAD+ NADH
+ CO2
Pyruvate Dehydrogenase
pyruvate acetyl-CoA
ExperimentalMethods2006 30
Hìnhdạngtếbàokhinuôi
• Hìnhdạngtếbàokhinuôicấyở2dạngchính:– Pháttriểnhuyềnphù(nhưmộttếbàođơnhaycáccụmnhỏtếbào)
• Dòngtếbàothutừmáu(leukaemia,lymphoma)– Pháttriểndạngmonolayerbámdínhvàodụngcụnuôi.
• Tếbàothutừcácmôrắn(lungs,kidney),endothelial,epithelial,neuronal,fibroblasts Hela-Epithelial
MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal
BAE1-Endothelial
ExperimentalMethods2006 31
Nhiệtđộ
– Nhiệtđộtốiưuphụthuộcvàoloài• Nhiệtđộcơthểmàtếbàođượcthunhận• Nhiệtđộcủacủavùngmôthunhậntếbào(skintemperaturemaybelowerthantherestofthebody)
ExperimentalMethods2006 32
Kĩthuậtvôtrùng
• Visinhvậtlàvấnđềnguyhạichínhtrongnuôicấytếbào• Ngănngừasựnhiễm:
– Khángsinh– CảithiệnđiềukiệnPTN– Kĩthuậtvôtrùng
• Bềmặtsạchvàgọngàng• Người“sạch”
– Rửatay– Nón,khẩutrang,găngtay
• Hóachấtvàmôitrường• Dụngcụnuôicấy