12

. A

rbeit

stagung

12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005

ContestProteomanalyse von 10.000 Zellen

12

. A

rbeit

stagung

Analyse eines Zellpellets aus 10.000 Zellen

• Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µl eingestellt.

• Zellen wurden aliquotiert und in der SpeedVac eingeengt.

• Menschliche Zellinie aus embryonalen Nierengewebe

• HEK 293 Zellen wurden unter Standardbedingungen kultiviert.

• Zellen wurden bei 4°C geerntet und 3 mal mit PBS-Puffer gewaschen

12

. A

rbeit

stagung

Reproduzierbarkeit der Aliquotierung der Pellets von 10.000 Zellen

• Reproduzierbarkeit der Erzeugung der Zellpellets wurde mittels SDS-PAGE überprüft

1 2 3 4 5 6 7

1 Marker2-7 Pellets von 10.000 Zellen

12

. A

rbeit

stagung

Optimierung der Verdaubedingungen

• Für die Optimierung des Verdaus wurden verschiedene Bedingungen getestet

• Ansätze wurden mittels SDS-PAGE verglichen

Marker

A Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall/Benzonase -/+ Trypsin

B Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall -/+Trypsin

C Phosphat-Puffer /CHAPS/95°C/Benzonase -/+ Trypsin

D Phosphat-Puffer/CHAPS/ 95° -/+Trypsin

E 1 M Harnstoff-Puffer/CHAPS -/+ Trypsin

Bedingungen: A B C D E - + - + - + - + - +

12

. A

rbeit

stagung

Herstellung des Verdaus von10.000 Zellen

• Ausgangsmaterial: Zellpellet aus 2 Millionen Zellen• In 20 µl Lysis-Puffer (TrisHCl 30 mM; Thioharnstoff 2M; Harnstoff

7 M; CHAPS 4 %) aufgenommen• 6 x 10 Sekunden Ultraschall lysiert• 1:10 verdünnt mit 10 mM NH4HCO3-Puffer• 100 µl Trypsinlösung (0,06 µg/µl) zugegeben • Inkubation über Nacht• Volumen auf 2 ml gebracht (Wasser)• In 10 µl Aliquots aufgeteilt; entsprechend 10.000 Zellen• Aliquots in der SpeedVac eingeengt

12

. A

rbeit

stagung

Reproduzierbarkeit der einzelnen Contest-Aliquots

RT: 0.00 - 65.04

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

58.50953.6

61.06989.6

48.22831.6

31.81816.5

43.40914.4

39.85715.6

58.161314.5

49.30912.6

37.76844.5

29.061168.526.17

712.522.78981.617.82

901.615.531003.6

7.89615.4

3.87819.4

NL:6.52E7

Base Peak MS LCQ11138

RT: 0.00 - 64.99

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

60.60953.6

63.16989.6

43.73640.7 45.34

914.541.42688.533.78

816.550.13831.6

55.101180.6

39.70844.5

31.251168.426.00

981.522.58901.719.51

1003.616.77594.6

1.691015.6

7.251577.5

NL:7.23E7

Base Peak MS LCQ11137

RT: 0.00 - 65.07

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

60.28953.6

60.40953.6

62.92989.6

49.94831.6

41.39715.6

42.00850.4

56.85977.833.56

816.5 41.03688.5

50.911161.440.90

688.6

30.801168.4

25.79981.522.18

901.619.241003.5

15.35831.6

7.47615.4

3.34860.1

NL:7.07E7

Base Peak MS LCQ11139

RT: 0.00 - 65.07

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

58.33953.6

48.11831.6 61.03

989.6

54.88978.131.69

816.543.33914.439.32

688.5

54.76977.9

43.70664.0

32.171134.428.92

1168.525.87712.5

22.51981.4

17.80901.7

17.02943.60.83

948.713.26594.5

NL:6.65E7

Base Peak MS LCQ11140

Basepeak-Chromatogramme von vier Contest-Verdau Proben

LCQ classicSäule: C18; Ø 75 µm x 25 cm Gradient Ameisensäure, 90 min

12

. A

rbeit

stagung

2D-PAGE von 10.000 Zellen, 2 µg Protein, Cy3-markiert

(40 cm x 30 cm) 3.100 Proteinspots

12

. A

rbeit

stagung

Verdau Pellet

Methode Methode Methode Such-

maschineDatenbank

Agilent Technologies

3 Läufe 1D-LC-MS/MS (HPLC-Chip/MS XCT Ultra)

Spectrum Mill (A03.01.037a)

IPI.human.v306

Applied Biosystems

2 Läufe LC MALDI –MS/MS(4800 TOF/TOF Analyzer)

1 Lauf LC-MS/MS(MIDAS; 4000QTRAP)

MASCOT CDS

Bruker Daltonics

1 Lauf LC-ESI-IT MS(HCT)

1 Lauf LC-MALDI-MS/MS (Ultraflex)

2 Läufe LC-MALDI-MS/MS (Ultraflex)

MASCOT (v2.1.0)

Swissprot (21.06.2005)

GE Healthcare 3 Läufe 1D-LC-MS/MS (LTQ)

3 Läufe 2D-LC-MS/MS (LTQ)

Sequest NCBI

Protana Inc.3 Läufe LC-MS/MS( LTQ, "Proteome Reactor“)

3 Läufe LC-MS/MS( LTQ, "Proteome Reactor“)

MASCOT (v2.1.0)

NCBI (June 2005)

Thermo Electron

3 Läufe LC-MS/MS (LTQ)

Turbo-Se-quest v27 (rev.13)

NCBI (Mai 2005)

Contest-Teilnehmer

12

. A

rbeit

stagung

6fach3%

5fach4% 4fach

6%

3fach10%

2fach14%1fach

63%

Insgesamt 1757 nicht-homologe

Sequenzen

Übereinstimmung (Homologiecluster) der identifizierten Proteine

zwischen den Contest-Teilnehmer

52+64

+110

+171

+2511109

Nature Methods Vol. 2,9, Sept. 2005, 647-48

12

. A

rbeit

stagung

How to deal with data & results performing high-throughput proteomics

Experiments – irrespective of their size and effort and of the amount of the acquired data - have to be repeated independently several times to demonstrate their reproducibilty to get significant results

This will remove most of the „1hit wonders“

One-time experiments can not elucidate quantitative differences in two different proteomes, therefore, they should not be named quantitative!

We have to go back to scientifically sound experimental work & strategies to create value(s) for ourself and for the society who gives us

the money and deserves that we do our best.

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. A

rbeit

stagung

Anja Tatzel - BiochemiestudentinChristian Stephan - BioinformatikChristian Scheer –Protagen, Bioinformatik Christian Bunse – LC-MS/MSOliver von End – Nierenzellen

Kai Stühler

Danksagung