13 questions and challenges in bioanalytical study -...

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Japan Bioanalysis Forum http://bioanalysisforum.jp/

生体試料中薬物濃度測定における疑問・難問ー困った時の道しるべー

Questions and Challenges in Bioanalytical Study

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DG2015-13

山田直人1、青山昭則2、五十嵐春江3、川端光彦4、小粥亮平5、須田裕輔6、出口修平7、橋本雅世8、匹田久美子9、細川裕矢10、松井誠一11、三浦奈津子5 日本たばこ産業株式会社1、科研製薬株式会社2、グラクソ・スミスクライン株式会社3、株式会社新日本科学4、テバ製薬株式会社5、日本新薬株式会社6、沢井製薬株式会社7、大日本住友製薬株式会社8、田辺三菱製薬株式会社9、小野薬品工業株式会社10、株式会社住化分析センター11

Naohito Yamada1, Akinori Aoyama2, Harue Igarashi3, Mitsuhiko Kawabata4, Ryouhei Kogai5, Yusuke Suda6, Shuhei Deguchi7, Masayo Hashimoto8, Kumiko Hikida9, Yuya Hosokawa10, Seiichi Matsui11, Natsuko Miura5 1 Japan Tobacco Inc., 2 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., 3 GlaxoSmithKline K.K., 4 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd., 5 Teva Pharma Japan Inc., 6 Nippon Shinyaku Co., Ltd., 7 Sawai Pharmaceutical Co., Ltd., 8 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd., 9 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, 10 Ono Pharmaceutical Co. Ltd., 11 Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.

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概説 Overview

Purpose バイオアナリシスにおける日ごろ持たれている疑問・難問について深く議論を行い，解決策や推奨案を提案し情報共有をする。 To share the solutions and recommendations for questions and challenges in bioanalysis for drug development

Discussion 低分子化合物の定量分析に関する疑問 Small-molecule analysis

ただし，内因性物質（バイオマーカー）を除く

Topics 1. 検量線に関する疑問 Calibration curve

2. ISRとデータの評価に関する疑問 ISR and Data assessment

3. その他の疑問 Others

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活動内容 Activity

「困っていること」を調査 2015年5月にDGサポーターを中心に「疑問・難問」を調査

新規メンバー募集延べ12名で活動（途中交代1名）

Kick off Meeting 2015年7月14日

アンケートの実施 2015年9月に検量線及びISRに関する疑問のアンケートをDGサポーターを中心に実施

ディスカッション Web meeting を1-2回/月，e-mail で議論

Face to Face Meetingの実施 2015年11月13日（秋葉原にて）

アンケートにご協力いただきありがとうございました。

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回答者背景 Background

検量線及びISRに関するアンケート

「疑問・難問」の収集に関するアンケート Q1: 分析業務において「困っていること」などありますか？

収集した疑問：45件

疑問件数

検量線 6

ISR 及びデータ評価 13

その他 20

（安定性） 6

6

75

0 20 40 60 80

No

Yes

Number of voters

Q2: あなたの所属についてお聞かせください。

New drug manufacturer (Japan), 73

New drug manufacturer

(Foreign owned), 3

Generic drug manufacturer (Japan), 12

Generic drug manufacturer

(Foreign owned), 1

CRO (Japan), 25

Others, 2

Q3: 基本的に従っている規制要件は何ですか。（複数回答可）

8

58

106

0 50 100 150

Others

GLP

Article 43

Number of voters Number of voters

*The reliability standard for application materials in Japan.

*

Do you have a question?


検量線に関する疑問

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Single analyte Priority Number of voters 1 2 3 4 5 6 7 8 never

60% 25% 10% 1% 1% 2% 0% 0% 0% 85 26% 55% 6% 6% 2% 1% 0% 0% 4% 88 12% 13% 32% 19% 5% 14% 1% 2% 2% 85

4% 5% 22% 23% 24% 9% 1% 3% 10% 79 1% 4% 18% 24% 18% 16% 4% 3% 14% 80 1% 1% 12% 21% 17% 13% 1% 3% 32% 78 0% 3% 3% 3% 1% 3% 14% 3% 71% 72

10% 2% 0% 0% 0% 5% 2% 2% 78% 41

Two analytes

Priority Number of voters 1 2 3 4 5 6 7 8 never

19% 34% 15% 11% 9% 4% 0% 0% 9% 85 33% 27% 17% 10% 5% 2% 0% 0% 5% 88 27% 16% 20% 16% 6% 11% 1% 1% 2% 85

4% 7% 12% 14% 19% 21% 1% 3% 19% 80 1% 7% 7% 11% 24% 6% 7% 0% 37% 78

23% 12% 19% 16% 9% 9% 1% 1% 9% 79 0% 3% 1% 1% 4% 1% 16% 3% 69% 72

14% 5% 2% 2% 0% 2% 2% 2% 69% 41

検量線：「頭打ち」への対処法 Approach of Non-linear response

Q1: 分析法の開発において検量線の頭打ちが認められた場合、どのように対応していますか。優先順位と共にお答え

下さい。上段：単一成分分析、下段：2成分の同時分析で1成分のみ頭打ち

Decrease injection amount

Change calibration range Change monitor ion Change Mass spectrometer Change mobile phase Use non-linear calibration curve Others

Use diluted sample

Decrease injection amount

Change calibration range Change monitor ion Change Mass spectrometer Change mobile phase Use non-linear calibration curve Others

Use diluted sample

(One of the two is non-linear response)

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Q2-2: 「使用した経験がある」方に伺います。その検量線でバリデーション試験を実施した経験がありますか。

Yes: 72.7%

No: 27.3%

Number of voters: 22

検量線：直線「以外」の検量線 Non-linear calibration curve

Q2: 原点を通らない直線（Linear，y=ax+b）以外の検量線を使用した経験がありますか。または試験報告書等で目にしたことがありますか（複数回答可）。

Have used: 23.2%

Have seen in the report:

21.2%

Not either: 55.6%


Q2-3: 「目にしたことがある」方に伺います。バリデーション試験は実施されていましたか。

Yes: 68.2%

No: 31.8%


Q2-1: 「目にしたことがある」方に伺います。それはどの地域の分析法でしたか（複数回答可）。

1

5

10

11

0 2 4 6 8 10 12

Unidentified

EU

US

JP


Using the Non-linear calibration curve

Validated using the Non-linear calibration curve?

What region of the report?

Validated using the Non-linear calibration curve in the report?

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使用不可（5件、9.4%） Not usable (5 voters, 9.4%)

一般的に再現性がなく、不可科学的に妥当ではない使用できると考えたことがないほか

0 0 1 1

0 0

4 0

23 0

0 5 10 15 20 25

Others

Input coefficient manually

Locally Weighted

Point-to-Point

Mean Response Factor

Linear or Quadratic Log-Log

Power

Cubic Spline

Quadratic

Linear through the origin

Number of voters: 29 0

0

1

1

0

2

1

2

15

4

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Others

Input coefficient manually

Locally Weighted

Point-to-Point

Mean Response Factor

Linear or Quadratic Log-Log

Power

Cubic Spline

Quadratic

Linear through the origin

Q2-5: 「目にしたことがある」方に伺います。それはどのような検量線でしたか（複数回答可）。


Q2-4: 「使用した経験がある」方に伺います。それはどのような検量線でしたか（複数回答可）。

Q3: 原点を通らない直線（Linear，y=ax+b）「以外」の検量線を使用することについて、科学的な妥当性を含めてど

のように考えますか（自由記載）。 Opinion of the Non-linear calibration curve

使用可（条件付きを含む）：（36件、67.9%） Usable or Conditionally usable (36 voters, 67.9%) バリデーションがクライテリアを満たすならば問

題ないと考える（ほぼ全て）

What type of Non-linear calibration curve was used in the report? What type of Non-linear calibration curve did you use?

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できれば使用したくない（8件、15.1%） Usable but not preferred (8 voters, 15.1%) 使用は可能であるとは思うが、誤差が大きく出てしまうので、できるだけ避けたい直線関係に比べて，濃度－レスポンスが急峻あるいは緩慢な部分があることを理解した上で，その部分の

QC濃度を多く設定することで適切に精度管理をすれば科学的な妥当性は主張できると考える．ただし，直線関係の範囲内出の測定のほうが質が高いと考えられるので，可能な限りそのような対応をすべきと考える．それを踏まえると規制当局に対して，非直線回帰の検量線を提出することを積極的には薦めない．（当局が受け入れないことはないと思うが）ほか

前提として直線を用いるべきだが、科学的根拠がある場合は使用可能科学的根拠は別途示す必要がある例：AIC（赤池の情報量規準Akaike’s Information Criterion）による統計モデルの選択方法を用いてAICの値が最小とな

る統計モデル（回帰式）が，最も尤もらしい統計モデルと判断する。

AIC 𝑚 =n log𝑆𝑒(𝑚)𝑛 + 2 𝑚 + 1

n：データ数、Se(m)：残差平方和、m：m次式 http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf から引用

【DGからの推奨直線「以外」の検量線】

コメント：懸念事項適切なモデルの選択が困難適切な重み付けの判断が困難再現性・頑健性に不安が残る（非直線性が

吸着やサプレッション等に起因する場合） Over ULOQサンプルの希釈倍率が不明

コメント：使用条件など P1以前は検量範囲が広いのでQuadratic、その後

は検量範囲が狭いためLinearを用いるべき変曲点付近の検量・QCサンプルを適切に増やす

必要がある AIC、BICなどを指標に直線よりも良いモデルであ

ることを示すことができれば、使用可

e.g.: Akaike’s Information Criterion (AIC) is one of the approach to evaluate scientific validity

Recommendation from DG: Non-linear calibration curve

http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf

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検量線：定量範囲の設定 Range of calibration curve

Q4: 非臨床PK/TK測定では、それぞれ異なる（適切な）定量範囲を設定し、

バリデーション試験を実施していますか。

13

39

15

35

0 10 20 30 40 50

D

C

B

A

Number of voters

Calibration range for PK and TK

A： Use same calibration range for PK and TK

B： Use two range of calibration curves (high and low)

C： Separate PK and TK validation

D： Others

「その他」の回答者コメント TK用のバリデーション試験を先に行い（高濃度）、PK試験を行う段階でpartialバリデーション

として低濃度用の試験を行う。 5000倍程度の検量線範囲で収まるのであれば兼用可。ケースバイケース。それぞれの投与量の違いに依存する。

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【DGからの推奨】

PK/TK兼用の検量線を使用する場合、検量線の頭打ちやキャリーオーバーなどを回避できる検量線範囲に設定する（例：1000～5000倍程度）。また、操作が煩雑になるとミスを招きやすくなるため、希釈は1000倍及び3段階程度（10倍×10倍×10倍希釈など）に抑えることが望ましい。

高濃度域で定量範囲を設定する場合、分析装置の汚染を防ぐためサンプルを前処理の段階で希釈し、打ち込み量は低濃度域で定量範囲を設定した分析法と同程度にする。

Case Pros Cons PK/TK兼用の検量

線によりバリデーションを実施

• バリデーションが1試験で済むため、低コスト

• 同じ分析法で動物のPK/TK試料が分析

可能

• PK試料の濃度域を重視して分析法を開発すると、TK試料の測定では多くの希釈操作が必要となる。 ⇒ブランク血漿の必要量が多くなる。

希釈に伴うヒューマンエラーや定量値の誤差のリスクが高まる

低濃度、高濃度用の2本の検量線によ

りバリデーションを実施

• PK/TK測定にある程度適した濃度範囲

の設定が可能 • バリデーションが1試験で済むため、低コスト

• 前処理操作が煩雑になる可能性

PKとTKは切り離し、

別試験でバリデーションを実施

• PK/TKそれぞれに最適な濃度範囲の設

定が可能 • TK測定において希釈操作が減る • 希釈QC外れによる再測定リスクが低下

• バリデーションが2試験になり、高コスト

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検量線：定量範囲変更と希釈操作 Change of calibration range and sample dilution

Q5: 非臨床/臨床試験問わず、実試料分析において希釈が必要な実試料が「多い」ことが

想定された場合、どのように対応していますか。あるいはどのように対応すべきと考えますか。

14

6

47

22

0 20 40 60

D

C

B

A

Number of voters

Handling of many samples that need dilution

A： Change the calibration range (partial validation)

B： Dilute samples

C： Validate high and low calibration range to avoid dilution

D： Others

「その他」の回答者コメント非臨床、初期臨床は種々の投与量での曝露量を同一試験内で測定することが多いため、希釈操

作で対応。後期臨床等で投与量が一定となり、測定する濃度範囲がある程度確定した段階で、希釈操作をできるだけ減らすような定量範囲を設定する。

希釈操作がなるべく少なくなるよう、検量線の定量範囲を広めに設定してバリデーションを行う。科学的にも、前処理の軽減(ミスの可能性の軽減)の面からも定量範囲を変更し、パーシャルバリ

デーションを実施すべき｡分析を委託している場合、パーシャルバリデーションの追加費用軽減の面から希釈で対応すること

もある。

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3 3

13

13

16

0 5 10 15 20

D

C

B

A

Number of voters

Criteria for changing calibration range

Q6: 定量範囲の変更は、どのような基準に基づいて判断しますか。（複数回答可）

A： Number of analytical samples that need dilution

B： Dilution ratio

C： Dilution steps

D： Others

「その他」の回答者コメント希釈倍率や希釈回数に関わらず、希釈の妥当性の基準を満たしており、希釈が必要な検体数

が多くなければまったく問題ない。

Q7: 実試料測定について、海外では希釈操作を実施した定量値の信頼性を懸念し、適切な定量

範囲を設定する（定量範囲を変更する）ことを推奨していますが、希釈操作に対する考えをご記入下さい。

回答者コメントサンプリング・前処理・注入のどこかで希釈操作による誤差が発生することも考えに入れるべきな

ので、一概にサンプルの希釈が不可だとは思えない。操作自体のやり方も含めバラツキがでにくい方法を採用したり、エラーのマネジメントができるか、

またそもそもの測定方法の頑健性なども考慮して、希釈で対応するかを判断する必要がある。臨床の実試料測定では、マトリックスの影響を考えると、なるべく希釈操作はすべきではない。

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希釈操作過多により定量値の誤差やヒューマンエラーが起こる可能性が高まることから、希釈操作が最小限となるよう適切な検量線範囲に設定することを推奨する。ただし、希釈再現性及び希釈QC試料の評価により、希釈の妥当性は保証されるため希釈操作を否定することではない。

希釈前の高濃度サンプルの安定性については、高濃度の希釈QCサンプルを調製してサンプルとともに保管すること、あるいはISRに希釈試料を含めることで評価することができる。

Case Pros Cons

希釈が必要な実試料が多い場合、定量範囲を変更するのではなく、希釈操作で対応する

•同じ分析法で幅広い濃度の検体を分析可能

•希釈の妥当性をバリデーションで評価していれば、追加のバリデーションは不要であり、低コスト

•操作が煩雑となり、ヒューマンエラーのリスクが増加

•希釈の妥当性をバリデーションで評価していても、実検体では異なる挙動を示すことがある（希釈マトリックスの影響？）

•希釈QC外れによる再測定リスクが増加

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検量線：重み付け条件の優先順位 Priority of the weighting factor

Q8: 以下の重み付け条件のうち使用経験があるものをご回答下さい（直線の回帰式

はLinear、𝒚 = 𝒂𝒂 + 𝒃とし、信頼性基準試験、GLP試験、臨床測定を前提として下さ

い）。また、複数用いた経験がある場合はその優先順位とともにお答え下さい。

1/𝑥2の重み付けが一番優先順位が高く、次いで1/𝑥が用いられている。 1/𝑦、1/𝑦2、は1/𝑥2 、1/𝑥の後の優先順位であった。重みなし、 1/𝑦、 1/𝑦2は、約半数で用いられていない。 1/𝑠2は、ほとんど用いられていない。(98%)

Weighting Priority Number of Voters

1 2 3 4 5 6 Not Used

No Weighting 7.3% 9.1% 23.6% 3.6% 5.5% 1.8% 49.1% 55

1/𝑥 20.3% 47.8% 7.2% 2.9% 0.0% 1.4% 20.3% 69

1/𝑥2 70.3% 14.9% 5.4% 0.0% 1.4% 1.4% 6.8% 74

1/𝑦 8.6% 3.4% 15.5% 13.8% 1.7% 1.7% 55.2% 58

1/𝑦2 5.2% 13.8% 22.4% 8.6% 1.7% 1.7% 46.6% 58

1/𝑠2 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 2.0% 98.0% 49

Priority of the weighting factor

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検量線：重み付け条件の選択理由 Reason for the selection of the weighting factor

Q9: 重み付け条件について、個別の選択理由がありましたら下記の該当する箇所に

ご記入下さい。

【1/𝑥,1/𝑥2の選択理由】重みなし, 1/𝑥,1/𝑥2で比較して真度(または相関係数)の良好なものを選ぶ。(12件)

単純なモデルを使用する。(2件) 定量範囲が狭い為1/𝑥を選択する。 1/𝑥2と比較して同等ならば1/𝑥を選択する。

デフォルトで選んでいる。良く使われている等。(4件) 低濃度側の真度が良好なので選択する。(4件) 濃度理論値を用いるのでロバストで、相対誤差モデルと整合性がある。(2件)

【1/𝑦,1/𝑦2の選択理由】

試験委託者の希望による。(6件) 理論的に1/𝑥より1/𝑦が正しい。(2件)

【参考文献】

Anal. Chem., 2014, 86, 8959-8966 J. Chromatogr. B, 2002, 774, 215-222

【回答者コメント：抜粋】

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検量線：重み付け条件の選定方法 How to select the weighting factor

0 20 40 60

Number of Voters

Q10: 重み付け条件を決定する際の選定方法をお答え下さい。（複数回答可）

【その他の意見】特に規定はないが過去からの通例で

選択する。基本的に委託者指定。低濃度から高濃度まで、各CS/QC濃度

の分散が同程度となるような重み付けも含めたパラメータの選択をするべきと考えている。

SOP記載はないが，1/𝑥2を優先すると

いう共通認識がある。一番検量線が良好となる重み付け条件

を採用する。

77回答中52回答が、予備試験などの結果から重み付け条件を選択していた。一方で、担当者の好みで選択していたり、過去からの慣例で特に検討をせずに選択している回答もある。

Selection basis of the weighting factor

SOP preference of a person based on preliminary data others

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検量線：重み付け条件決定の手順 Procedure for the selection of the weighting factor

【手順A】各重み付け条件を順番に当てはめてパラメータが最も良い重みを選択する(55件) 検量線各ポイントの真度の絶対値の総和がより小さい方の重み付けを選択する等、全濃

度範囲の真度で判断する。(27件) 定量下限や低濃度QC試料の真度、精度で判断する。(17件) 相関係数で判断する。低濃度から高濃度まで、各CS/QC濃度の分散が同程度となるような重み付けも含めたパ

ラメータの選択をする。【手順B】計算式などに基づき科学的に評価する（6件) 5濃度n=5を測定し各濃度での標準偏差を計算．近似式𝑦 = 𝑎𝑥𝑐を算出する。

C=0の場合SD一定なので重みなし、C=1の場合相対誤差が一定のため1/𝑦2、

C=0.5の場合重み1/𝑦を選択する。

適切な統計解析を行い、妥当性がある重み付けを実施する。（Hartleyの等分散性の検定）

【A,B以外】その他の手順（6件) 分析法ごとに重みづけ判定評価は行わない。 1/𝑥2を用いることとしている。ここから外れる場合にモデルを変更するという対応はしてい

ない。あらかじめSOPで規定している。

Q11: 重み付け条件を決定する際の手順を、以下の該当する箇所に記載して下さい。

【回答者コメント：抜粋】

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DGからの推奨 Recommendation from DG

予備試験(またはバリデーション試験結果等)で、数回(3～5)の検量線試料測定結果から、各重み付け 1/𝑥 、1/𝑥2、 1/𝑦 、 1/𝑦2条件で得られる各濃度の真度の絶対値の総和を計算する。

LLOQ, Low QC濃度等の低濃度試料の真度を比較し、真度の絶対値の総和が小さく、低濃度試料の真度の良い重み付けを選択する。

重み付けたときの残差プロットを作成し、真度からのズレの分布を確認することが望ましい。

Note 【重み付けについて】回帰分析では各濃度の𝑦の分散の逆数1/𝜎2で重みを付ける。

一系列の検量線の直線回帰の場合濃度 𝑥または𝑦に、𝑦 の標準偏差が比例するとき：1/𝑥2または1/𝑦2 濃度 𝑥 または𝑦に、𝑦 の分散が比例するとき：1/𝑥または1/y

【参考文献】 Anal. Chem., 2014, 86, 8959-8966 J. Chromatogr. B, 2002, 774, 215-222 現場技術者のためのデータ解析の基礎知識 http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf

σ

concentration

varia

nce

concentration

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Others, 2.7%(2)

Use all outlier points, 2.7%(2)

Exclude the outlier point, 94.6%(69)

Others, 2.8%(2)

Exclude the points one by one, 62.9%(44)

Exclude all outlier points, 34.3%(24)

Others, 7.7%(5)

Exclude all outlier points, 27.7%(18)

Exclude the points one by one, 64.6%(42)

検量線：基準外のポイントの取り扱い The outlier points of calibration curve

Q12: 真度が基準を満たさなかった検量線用標準試料のポイント（LLOQおよびULOQを

除く）の取り扱いと理由をお答えください。また、「基準を満たさなかった濃度を除外して再回帰した検量線を用いる」を選択された方は、その手順をお答え下さい

Validation

( ):The number of voters

Analysis of study samples

Exclude the outlier point, 84.1%(63)

Use all outlier points, 5.3%(4)

Reject the batch, 5.3%(4)

Others, 5.3%(4)

Handling the outlier points

Exclude way of the outlier points

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基準を満たさなかったポイントの取り扱いに関するコメント

分析法バリデーション (総回答数：58)

Exclude the outlier points (回答数：47)

• 基準を満たさない濃度を含めることで、再回帰値や傾きが変化するため (15) • 実試料測定時と同条件で実施すべきであると考えるため (7) • ガイドライン、SOP、計画書などに規定しているため (12) • 基準を満たさなかった濃度において真度が外れた原因がその濃度である場合は、

除外しても問題ないと考えるため (8) • 分析単位が不採用となることを避けるため (2) • 恣意的な事象が入るのを最小限にするため、機械的に決定している • 一般的に実施されている手法であると考えられるため • 特に理由はなし

Use all outlier points (回答数：5)

• 試験法の評価であるため、基準を満たさない濃度も評価すべきと考えるため (2) • 基準を満たさなかった原因が当該ポイントではなく、他のポイントにある場合 • SOPで規定しているため • 基準を満たさなかった経験がない

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基準を満たさなかったポイントの取り扱いに関するコメント実試料測定 (総回答数：53)

Reject the batch (回答数：4)

• バリデーション時に当該濃度を許容して、実測定時に問題が生じた経験があり、バリデーションでは完全に基準を満たす必要があると考えているため

• バリデーションで複数ポイントが外れる場合は、分析条件が適切でないと判断して、分析法の開発に戻るため

• 定量性を確認している試験であり、分析バッチの信頼性が懸念されるため • 基準を満たさなかった原因が当該ポイントではなく、他のポイントにある場合

Others (回答数：2)

• 実試料測定におけるトラブル発生が懸念されるため、バリデーションにおいては全ポイント基準を満たすことが望ましいと考える

• 状況に応じて判断する

Exclude all outlier points (回答数：50)

• 外れた値を含めることで、再回帰値や傾きが変化するため (15) (検量線に悪影響がある、除外することでより真の値に近づく) • 突発的なエラー(手技的なミスなど)である可能性があるため (10) • ガイドライン、SOPや計画書に規定しているため (10) • バリデーション時と同じ基準にしている (6) • 検量線のポイント数が基準を満たせば問題ないと考えるため (4)

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基準を満たさなかったポイントを除外して再回帰した検量線を用いる際の手順に関する「その他」のコメント

• 分析単位が不採用となることを避けるため (2) • 一般的に実施されている手法であると考えられるため • 恣意的な事象が入るのを最小限にするため、機械的に決定している • 特に理由はなし

Use all outlier points (回答数：2)

• SOP上でそのように規定しているため • 基準を満たさない経験がない

Others (回答数：1)

• 真度の基準を満たさなかった原因が当該ポイントか他のポイントであるかを考察し、状況に応じて判断する

• 真度が±20%を超える場合は除外するが、それ以外の場合は除外しない • 状況に応じて判断する

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3



検量線において真度の基準を満たさなかった検量線用標準試料のポイントは、バリデーション及び実試料測定ともに、除外して再回帰した検量線を用いることが望ましい。ただし、除外する場合は以下の内容に留意する必要がある。

• バリデーションにおいて、検量線の基準は満たすが、一部の濃度の真度が85～115％の範囲外となる頻度が高い場合は、分析法が適切でない可能性が考えられるため、再度分析法の検討をした方が良い(例：希釈して直線性の改善を検討)

• 実試料測定時においても、バリデーション時の検量線と傾き、レスポンス等を比較し、基準を満たさなかった原因について考察すべきである

• 基準を満たさなかった濃度を除外した検量線によって得られる値が妥当であるか、十分に考察すべきである

• 除外するポイントの数は最少限にすべきである

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


検量線：定量下限又は上限を除外した場合の評価基準 Criterion of the modified calibration curve

Q13: ガイドラインに従って定量下限、または

定量上限を変更した経験がありますか？

Yes, 17% (12)

No, 83％ (59)

Q14: 定量下限を新たに設定した場合、その

評価基準は、どうあるべきだと考えますか？また、その理由もお答えください。

(A) Within±15%, 28% (19)

(B)Within±20％, 65% (44)

(C) Others, 7% (5)

( )： Number of voters

回答者コメント

A (15件)

本質的に満たしているはずの基準である±15%を適用すべき。

LLOQの不採用となる理由にもよるが、バリデートされている分析法のポテンシャルを重視すべきである。

新たに定量下限になったからといって基準を緩くする理由を感じない。

もともとの定量下限が±20%を外れて、更にその上の濃度も±15%を外れる場合は信頼性があるのか疑問に思うため。

B （35件）

ガイドラインの記載から±20%と読み取れる。

以前の定量下限が定量下限としての機能を果たさなかったわけなので、新たな定量下限は、正しい定量下限として扱うべき。

定量下限は数値のバラつきが大きいから。

低濃度QCを±15%で評価し、判定基準を満たすのであれば、新たな定量下限は±20%で問題ない。

C （5件）

どちらが妥当であるかはQCのポイント数、実試料の濃度域にて判断する。

Experience to modify the LLOQ or ULOQ

Criterion of the modified LLOQ

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


検量線：検量線の濃度範囲変更 Change the concentration range of the calibration curve

定量下限の変更（10 ng/mL ⇒ 20 ng/mL） STD.1：10 ng/mL STD.2：20 ng/mL 低濃度QC：20 ng/mL

定量上限の変更（1000 ng/mL ⇒ 800 ng/mL） STD.7：800 ng/mL STD.8：1000 ng/mL 高濃度QC：800 ng/mL

Q15: 以下の通り「検量線用標準試料」と「QC試料」が同じ濃度である場合、

濃度範囲の変更は可能と考えますか？

Number of voters Number of voters 0 20 40 60

variable

invariable 18

53

0 20 40 60

53

17

variable

invariable

（ガイドラインより抜粋）実試料分析において、検量線用標準試料の定量下限又は検量線の最高濃度が基準を満たさなかった場合には、これらの次の濃度の検量線用標準試料を定量下限又は検量線の最高濃度としてもよい。その場合、変更された検量線の濃度範囲は、少なくとも3 濃度（低濃度、中濃度及び高濃度）のQC試料を含まなければならない。

Change of the LLOQ Change of the ULOQ

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3



【検量線濃度範囲の変更】「検量線用標準試料」と「QC試料」が同じ濃度である場合、QC試料の設定濃度では

なく、測定で得られたQC試料の定量値が、変更後の検量線範囲内であった場合のみ、変更可能と考える。

検量線範囲外の定量値は外挿値となり、信頼性を保証することができない。このため，「検量線用標準試料」と「QC試料」が同じ濃度である場合は、QC試料の定量値から対応を判断することが望ましい。

【定量下限の評価基準】新たに設定した定量下限の評価基準は、±15%であるべきと考える。設計された定量下限の判定基準が、他のポイントと比べて緩くなっている理由は、S/N比など

の要因により、定量値への影響を受けやすいからである。新たに設定された定量下限は、バリデートされている本来の判定基準の±15%を満たすべき試料であるため、その評価基準を変更しない方が望ましい。

判定基準については、SOP及び試験計画書に記載した方が良い。

Note!! 定量下限を変更した場合は、同一バッチ内の Pre-doseやプラセボも再測定すること。本来バリデートされている定量範囲で評価出来ていないため、検量線変更後の定量下限未満試料（Pre-doseやプラセボを含む）に関しては、全て再測定を実施すべきである。

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


a. Modified calibration range was adopted for calibration curve. （20 - 800 ng/mL）

b. Original calibration range was adopted for calibration curve . （10-1000 ng/mL）

c. Others

0 20 40 60 80

c

b

a

検量線:定量下限及び上限を除外した場合の採用基準 Criterion of the modified calibration curve

Q16: 以下のように検量線の濃度範囲を変更した際のデータ採用基準につい

てお答え下さい。 10 - 1000 ng/mLの定量範囲を、20 - 800 ng/mL（定量下限と定量上限の両方を除外）に変更する。

62

2

5

【回答者コメント】

a (46件)

検量線の定量範囲外は外挿値となるため、数値への信頼性が得られないため。

濃度範囲外のデータは信頼性に欠けると考えるため、参考値扱いとするべき。

定量下限、上限が外れた原因がサンプル処理なのか機器の状態なのか分からないのであくまで検量線で直線が認められている範囲内で評価すべき。

定量範囲として不適切であったものを採用するわけにはいかない。

b （2件）

検量線の範囲は変えるべきではないと思います。

C （4件）

2点外れるのはかなり異常であり、Run全体の数値に懸念があります。

この場合は受け入れられない。再分析を行う。

Acceptable calibration range

Number of voters

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


0 10 20 30 40 50

Not consider

Consider

検量線:検量線の濃度範囲変更 Change of calibration range

Q17: 今後、検量線濃度ポイントを設定する際、「検量線の濃度範囲変更」を考慮して濃度ポイントを設定しますか？

【回答者コメント】

Consider (14件)

測定バッチを無駄にしたくない。再分析を減らすため。（4件）

場合によっては定量下限が厳しいケースがある。分析法開発段階で、そのような可能性がある場合のみ考慮する。（6件）

ガイドラインで基本的なコンセンサスとして認知されているから。（1件）

Not consider （17件）

バリデーション試験までに十分に検討し、バリデーション試験を実施するため、そのようなことは起こらないと想定。（6件）

バッチによりLLOQが異なるデータの取り扱いが複雑になるため。複雑な考察をするよりは、再測定したほうが単純で分かりやすい。（3件）

検量線試料濃度を対数比例で設定する場合に検量線の濃度範囲の変更を考慮すると比例関係から外れる濃度を設定する必要があるため。（3件）

Number of voters

28 43

Setting for modifying calibration range

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


Case Pros Cons

検量線の濃度範囲変更

• 再分析の本数を軽減 • 該当する検体の凍結融解及び使用量の削減

•公比で設定した以外の濃度ポイントにより、検量線の重み付けに影響を与える

•特定の測定単位で濃度範囲が変わるため、データの取り扱いが煩雑になり、品質面でリスクを生じる

検量線:検量線の濃度範囲変更・DGからの推奨 Change of calibration range, Recommendation from DG

★定量下限及び上限を除外した場合の採用基準に関するDGからの推奨検量線範囲外の定量値は外挿値であり、信頼性を保証することができない。そのため、

基準を満たさなかった濃度を除外し、再回帰した検量線の濃度範囲内（20 - 800 ng/mL）の定量値のみ採用すべきである。

ただし、Validateされた分析法にも関わらず検量線の上下2点外れるのは異常ケースの可能性があるため、定量値の正しさを十分に考慮しなければならない。

本件を採用する旨を規定した上で再分析を実施する場合には、データの恣意的な採否を疑われないようにSOP及び試験計画書に記載する必要がある。

★検量線の濃度範囲変更に関するDGからのコメント検量線の濃度範囲変更を否定しないが、変更する場合は、変更後の検量線の濃度範囲

内にQC試料の濃度が収まるように設定することが望ましい。 Ex． STD1：1 ng/mL、STD2：2 ng/mL、LQC：3 ng/mL HQC：750 ng/mL、STD7：800 ng/mL、STD8：1000 ng/mL


ISRに関する疑問

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISRサンプル選択での困難 Difficulty at ISR sample selection

濃度範囲(10) 全て/ほとんどのサンプルがLLOQ付近。初回がLLOQ付近でISRがLLOQ未満になった。（7件）消失過程から選択できない（予想より早すぎる消失→吸収過程からの選択で対応）。（2件）高濃度サンプルが多すぎて広い濃度範囲から選択できなかった。

複数物質測定 (10)

代謝物同時定量でそれぞれ選択、希釈倍率を確認するのが大変。多成分を同時分析する場合に、対象によって定量値に差があると複数回分析する必要があり、凍結融解の回数が増える/サンプルの残量が十分でないことがあった。カクテル投与：すべての化合物のプロファイルを万遍なく網羅できるような試料を選択した。合剤で各化合物毎にCmax付近と消失相が異なり選択と確認が大変。代謝物に薬理活性がある場合のサンプル選択。

希釈 (1) ISRの際に初回測定と異なる希釈倍率で測定。検量線もISR判定値も基準を満たしたが、そのサンプルは基準外れとカウントして対応した。

サンプル数(1) 総実試料数の約10%のサンプルを選択する際、Cmax及び消失相付近で被験者を万遍なく選択しようとするとき、10%よりも少し多めになってしまう。

サンプル量(2) サンプル量が少なく、ISRではバックアップサンプルを使用せざるを得なかった。

選択法の明記 (2)

試験計画書での選出基準の書き方/ISRの選択方法が複雑でCROに指示するのが毎回大変。

Q1: ISRサンプルの選択での困った経験（ご意見数）

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISRサンプルの選択 Selection for ISR samples

Q2: ISRサンプルとして適切と考えられるポイントをお答え下さい。

（複数選択可）

Number of voters

Sampling point suitable for ISR

12 2

26 18 19

6 60

0 10 20 30 40 50 60 70

GFEDCBA A: Near the Cmax and elimination phase

B: Include the highest and lowest concentrations C: Include near the highest and lowest concentrations D: Representative samples of the PK profile E: Initial and after repeat dosing F: Only consideration about total number of ISR samples G: Others (free answers)

【その他の回答者コメント】なるべく多くの被験者から選択する。 Cmax付近と消失相付近で、被験者において同じポイントを選択本来は全ての採血ポイントから均等に選択すべき定量範囲上限および下限付近ではISR試験結果が範囲外となる可能性もあるた

め、Cmax等が希釈が必要な場合にはHQC、LQC付近を選ぶ

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Q3: ISRサンプルとして実際に測定経験のあるポイントをお答え下さい。


Number of voters

21

16

22

4

62

0 20 40 60 80

E

D

C

B

A A: Near the Cmax and elimination phase

B: Include the highest and lowest concentrations

C: Include near the highest and lowest concentrations

D: Representative samples of the PK profile

E: Initial and after repeat dosing

Sampling point experience in ISR

Q4: ISRサンプルの濃度範囲として、他に考慮すべき点がありましたらご記入

下さい。

【回答者コメント】低濃度はLLOQの120％以上とする定量値を希釈して得たサンプルを選択する場合は、希釈後の濃度がLQC以上か

つHQC以下となるサンプルを選択する測定対象化合物が2つ以上ある場合は、すべての化合物が測定可能なサンプル

を優先する

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Q5: ISRサンプルとして適切と考えら

れる個体の選択をお答え下さい。（複数選択可）

Number of voters

3 19

16 11

16 31

12 54

50

0 10 20 30 40 50 60

IHGFEDCBA

A: 多くの異なる個体を含め選択 B: 群からそれぞれ満遍なく選択

C: 初回と反復後で同一個体から選択 D: 同じ個体からCmax、消失相付近を選択

E: 異なる人種を含め選択 F: 異なる年齢層を含め選択

G: 異なる性別を含め選択 H: 特別な集団（例：腎機能障害）

I: その他（自由回答）

Individual suitable for ISR

Q6: ISRサンプルとして実際に測定

経験のある個体の選択についてお答え下さい。（複数選択可）

Number of voters

2 7 7

5 7

36 11

52 51

0 10 20 30 40 50 60

IHGFEDCBA

Individual experience in ISR

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Q7: ISRサンプルの濃度範囲は以下のどちらを優先し測定を実施しましたか。

Low concentration High concentration

Number of voters: 66 Number of voters: 67

With dilution


【その他の回答者コメント】

定量下限の120%以上のサンプル

希釈後の濃度がLLOQの3倍以上

またはHQC以下

Over three

times of LLOQ or

LQC, 87%

Over LLOQ, 13% Under

ULOQ, 44%

Not near ULOQ or

under HQC, 56%

Not consider

about dilution,

52%

Include the

sample needing dilution,

48%

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Q8: ISRサンプルとして適切と考えられるサンプルの状態をお答え下さい。


Number of voters

1

71

63

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Others (free answers)

Validated storage period andfreeze/thaw cycles

Enough sample volume

Sample condition suitable for ISR

Q9: 初回の定量値がほとんどLLOQ未満あるいはLLOQ付近の場合にISRを実

施した経験はありますか。


Low concentration samples experience in ISR

Yes, 28%

No, 72%

【DGからのコメント】

例：実測値が1.1ng/mL、LLOQが1ng/mLの場合

①乖離度が±20%以内となるISRの定量値は0.90～1.34ng/mL

⇒LLOQ未満の値を含むため評価不可

⇒実測値が1.22ng/mL以上の濃度が必要

②測定誤差が±20%程度と考える

⇒1.22ng/mLでは誤差範囲（0.976～1.46ng/mL）に

LLOQ未満の濃度を含むので評価不可

⇒①②を満たすためには実測値が1.25ng/mL以上必要

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：多成分同時分析時のサンプル選択 Sample selection for simultaneous multi-analyte assay

Q10: 多成分同時分析法のISRサンプルの選択において考慮する点

同じ試料での測定が困難（別の測定対象が検出不可となるなど、3件）。サンプル数の増加（各成分でISRサンプルを選択すると、測定試料の10%を

大きく超えるなど、5件）。考慮する項目が多くて大変（希釈倍率、凍結融解回数、残量など）何を優先するかで社内のコンセンサスを得るのが大変。代謝物の濃度に再現性がない。

Q11: 多成分同時分析法のISRサンプルの選択において困った経験

A: Include Cmax and elimination phase for a drug and the metabolites

B: Give priority to the profile of important analyte

C: Drug and metabolites can be measured at the same dilution

D: Others (free answers) • なるべく多くの成分で高い濃度になるポイントを

選択。 3

16

32

47

0 20 40 60

D

C

B

A

Number of voters

Points to consider for sample selection in multi-analyte assay

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISR実施時期、血漿以外での経験 ISR experience except for plasma, Timing of ISR

Q12: 血漿以外のマトリックスでのISR実施経験（自由回答）

【その他の意見】上記A またはB （3件）。次の分析単位に含める（2件）。再測定も含め測定値が確定した時点。 BE試験の予試験終了時、本試験終了時。全サンプルの初回測定終了後。試験に依存（安定性/報告時期/機器の予定など）。

尿 26件

その他骨髄、透析液、肺胞洗浄液、マクロファージ、血清、全血、CSF、皮膚ホモジネート、角質、眼房水、唾液

Q13: ISRの実施時期について優先するもの Q13-1:初回分析から大きく離れない時期とは？

10

0

4

12

9

0 5 10 15

Others

6 months

3 months

1 month

1 week

Number of voters

What's close timing?

回答数：35

【その他の意見】安定性期間内（5件）。次の分析単位（2件）。初回分析終了後、他の試料分析前に直ちに実施。測定値固定後、1－2週間。目安はない。

9

29

30

0 10 20 30 40

C. Others

B. to be small number of ISR

run

A. Close to initial analysis

Number of voters

Priority of ISR timing

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


DGからの推奨 –ISRサンプルの選択 – Recommendation from DG –Selection for ISR samples–

ISRサンプルの選択基準

Cmax及び消失相付近を含めるが、濃度範囲はLQCからHQCのサンプルを選択する（GBCでは、LLOQの3倍～ULOQの80%を推奨している１））

LQC以上のサンプルをISRの対象とすることを推奨する

なるべく多くの被験者からサンプルを選択する

反復投与の場合は、未知代謝物による測定系への影響があり得るため、初回投与及び反復投与後のサンプルを同一被験者から選択する

LQC以下の低濃度サンプルで構成される群（バッチ）のISRについて

PKがPivotalな試験でなければ、ISRの実施不要を推奨する

ISRは実試料の測定値の再現性を確認するのが目的だが、測定値がほとんど得られていないにも関わらず、再現性を確認する必要はないと考える

Note!! 定量下限及び定量上限付近のサンプルを選択した場合、ISR定量値が検量線範囲外となる可能性がある。検量線範囲外の定量値は算出できないため、ISRを正しく評価しているとは言えない。

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

【複数化合物同時測定】

できるだけ少ないサンプル数、且つ凍結融解回数が少なくなるポイントを選択する。

化合物のプロファイルに全て合わせて別々のポイントで分析する意義はそれほど高くない。

その試験で主要な分析対象物質のプロファイルに着目して選択してはどうか。GBCでも同様の考え方が推奨されている1)。

【希釈倍率】

分析対象が一成分の場合、初回測定と同じ希釈倍率で実施する。

複数化合物同時測定の場合、希釈妥当性が確認できた範囲で実施する2)。

【サンプル数】

総実試料数の10%のサンプルを選択すればよい。

Cmax及び消失相付近で被験者を万遍なく選択して10%よりも多めにすることは科学的な必要性がない限りオーバークウォリティの範疇になると考える。

【サンプル量】

バックアップサンプルをISRに利用することは特に問題ないと考えるが、別の用途に利用する予定であったなら検体採取時にISRに十分な量を確保すべき。

【選択方法の明確化】

SOPや計画書等にできるだけ具体的に選択方法を記載する。

参考文献

1)Fluhler E, et al. Repeat analysis and incurred sample reanalysis, AAPSJ 16: 1167-1174, 2014 2) Sangster T, et al. Recommendations on ISR in multi analyte assays, Bioanalysis 4: 1723-1730, 2012

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


0 5 10 15 20 25 30

Investigation was conducted forthe failed analytical batch.

No more investigationwas conducted.

ISR：特定の分析単位でISRが外れた場合の対応 ISR failure for specific analytical batches

【回答者コメント】再測定をする（9人）該当する分析単位の妥当性を再測定により確認する．他の分析単位と異なる点がないか精査し，原因が特定できれば再測定する．再測定はしない（17人）．他の分析単位と異なる点がないか精査し，原因が特定できればそれ以上の対応はしない（今後の分析で改善する）．他の分析単位と異なる点がないか精査し，原因が特定できなければそれ以上の対応はしない．何回目のISRか，今後実施するのか，該当バッチのデータ取扱いなどの要因を考慮する．原因の考察はするが報告書には載せない．

Q14: 以下の現象が認めら

れた場合、どのような対応をすべきと考えますか。あるいは対応した経験がありますか。【事例】長期投与試験のため、ISRを初回測定の分析単位毎に複数回実施したところ、ある特定のISR分析単位においてのみ半数以上のサンプルが乖離度±20％を超えていたが、全体では基準を満たしていた。

Number of voters

7

26

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISR時のコンタミネーションへの対応 ISR failure by the contamination

【その他の回答者コメント】「明らかなコンタミネーション」の度合いにもよる

が，2倍を超えるような値が出た場合には確認をすべきである（実際に追加実験等のアクションを起こすかどうかは別判断）

その数値の影響度によって判断を変えるかもこれが何回目のISRで今後どの程度実施されるの

か，コンタミネーションと結論づけられるのか等の複数要素によって対応を決定

明らかなコンタミであれば何も対応をしない．しかしながら，明らかなコンタミと証明するための対応にも労力が必要であろうと思われる．

Q15: 以下の現象が認められ

た場合、どのような対応をすべきと考えますか。あるいは対応した経験がありますか。【事例】特定のISRサンプルにおいて明らかにコンタミネーションと思われる結果が得られた。

0 5 10 15 20 25 30

Other

Investigation was conducted for thecontamination.

No more investigation was conducted.

Number of voters

5

23

5

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISRがわずかに外れた場合の対応 Slight ISR failure for criteria

【回答者コメント】原因を精査し，原因が特定できればその原因を取

り除いて，全てのサンプルを再測定する（15人）．原因を精査し，原因が特定できなければISRのサン

プル数を増やして再評価する（一時的な対処）．計画書で定めた実施内容で基準不適合なので，

ISRのサンプル数を増やすべきではない．特定の分析単位に偏っていれば，その分析単位に

ついて再測定する． ISRを再度実施する． PKデータは参考値扱いとする．

Q16: ISRにおいて、ガイドライ

ンの基準をわずかに外れた場合、どのような対応をすべきと考えますか。あるいは対応した経験がありますか。

Number of voters 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Investigation was conducted to find outthe cause.

More ISR samples was measured tosatisfy the criteria. 18

46

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：代謝物のISRが外れた場合の対応 ISR failure of metabolite analysis

【回答者コメント】原因を精査し，原因が特定できればその原因を取り除いて，

全てのサンプルを再測定する（15人）．原因を精査し，原因が特定できなければISRのサンプル数

を増やして再評価する（一時的な対処）．計画書で定めた実施内容で基準不適合なので，ISRのサ

ンプル数を増やすべきではない．特定の分析単位に偏っていれば，その分析単位について

再測定する． ISRを再度実施する．安全性評価（MIST対象）や有効性評価に必要な代謝物の

場合はTiered approachで対応．安全性評価や有効性評価に必要でない代謝物の場合は

何も措置しない．代謝物のデータは参考値扱いとする．

Q17: 代謝物単独測定もしく

は代謝物同時測定で、代謝物がガイドライン上のISRの基準を外れた場合、どのような対応をすべきと考えますか。あるいは対応した経験がありますか。

Number of voters 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Investigation was conducted to find outthe cause.

More ISR samples was measured tosatisfy the criteria. 15

48

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISRの評価結果確認と精査項目 Confirmation for ISR data and check points

Q18: ISRにおいて2/3以上のサ

ンプルが乖離度±20％以内であり、ガイドラインの基準を満たしている場合であっても、個別値や分析単位などにおける問題の有無などについて詳細に確認しますか。

( ) Number of voters

No, 53％ (37)

Yes, 47％ (33)

Confirmation for the ISR data of all batches

分類精査項目

サンプル取扱い

保管状況（温度，期間）コンタミネーションサンプル取り違え

前処理ピペット精度サンプル調製記録前処理中安定性希釈倍率

測定機器トラブル（感度低下）マトリックス効果（性別・年齢・疾患・併用薬など）同時測定対象物質の濃度（未変化体⇔代謝物）

データ検量線の回帰式 QC精度 IS面積

人的試験実施者（複数で実施の場合）


7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


DGからの推奨 –ISRが外れた場合の対応– Recommendation from DG – ISR failure –

特定の分析単位でISRが外れた場合の対応

ISRが外れた特定の分析単位で他の分析単位と異なる点がないか精査し，原因を特定する

ISRがわずかに外れた場合の対応

原因を究明し，明らかとなった原因を取り除いて場合によっては全て再測定を行う

ISRサンプル数を増やして基準内に入れてはいけない

代謝物のISRが外れた場合の対応

重要な代謝物（MIST対象，活性代謝物）は原因を究明し，明らかとなった原因を取り除いて場合によっては再測定を行う（Tiered approachでの対応も可）

重要な代謝物でない場合は，参考値扱いとすることも考慮する

ISRサンプル数を増やして基準内に入れてはいけない

ISRの評価結果確認

2/3以上のサンプルが乖離度±20％以内とガイドラインの基準を満たしている場合であっても，個別値や分析単位などにおける問題の有無などについて確認する

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


ISR：ISRの失敗事例 Cases of failures in ISR

Q19: ISRを失敗したことがありますか？

Q20: どのような場合にISRを失敗したのか。

No, 82%

Yes, 18％

〔原因A〕実試料と添加試料の違いによる失敗

安定化剤を使用したが、添加試料と実試料で性状が異なった。代謝物のISRが、夾雑物ピークとの分離不十分で基準を満たさなかった。溶血の影響を受けていた。

Have you failed ISR ?

〔原因B〕測定法に関する問題

前処理法に問題があった。バリデーション試験内で前処理法の変更をしていた。夾雑物ピークとの分離が不十分（実試料の夾雑物のピークが大きすぎた）

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

〔原因C〕人為的ミス

同日に実施した2バッチの結果が入れ替わった。サンプルの撹拌作業が手順に記載されておらず、撹拌しなかった。サンプルの撹拌不足サンプルの粘性が高く、ピペットで上手く吸えないために測定値の再現性が悪

かった。

〔原因D〕非標識体のISにしたことによる問題

マトリックス効果を受けた。未変化体とまったく異なる化合物をISに選定した系において、マトリックス効果を

受けた。

〔原因E〕その他

量の多い他の代謝物が微量に分解し、数値に影響があったと推察しています。室温での安定性（室温で4時間までの安定しか取れていないのに、累積でそれを

超える時間放置した）長期保存と凍結融解の繰り返しと室温放置の累積による濃度低下が起こってい

た。それぞれ単独条件では安定性のクライテリアを満たしていた。

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ISR：ISRの失敗の報告書への記載 What do you report on addressing failure in ISR ?

Q21: ISRを失敗した際に対応した内容について報告書へはどのように記載しますか。あるいはどのように記載すべきと考えますか。

回答件数

当該試験の報告書に検討した内容を全て記載する

32

当該試験の報告書に原因が究明できた検討のみを記載する

20

別の報告書に記載する 6

その他 3 0 5 10 15 20 25 30 35

Others

Specific Report

Investigation only elicidated

All Report

Number of Voters

To Report Failures in ISR

その他（回答者のコメント）当該試験の報告書に検証して判明したことは記述し、試験評価への影響を考察

するが、原因究明と対策が当該試験の終了までに間に合わなかった場合は別途報告書を作成する（原因究明と対策を当該試験の終了要件にはしない）。

当該試験の報告書に、失敗の原因の考察とそれを導く実験結果を記載する。また、可能な限り、原因を取り除くことでISRが成立し、質の高い測定値が得られたことを記載して終わりたい。

報告書には簡潔に結果を報告し、別紙にて原因について記載する。

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ISR：ISRを成功させるために考慮している点 Tips to success ISR

Q22: ISRを成功させるために考慮している点

回答者コメント

分析法の堅牢性（10件）

分析法の予備検討段階でISRも予備検討しておく。分かっている代謝物情報を入手し、影響の有無を考察しておく

精度・頑健性の高い測定法を確立すること

測定対象および代謝物の安定性確認。再現性の高い試験方法の選択

Validationの基準を実質的には厳しく管理する

測定法開発をしっかり行い、なるべくISをD体にする

測定法開発に時間をかける

分析条件が安定したものになるように、予備検討・バリデーションから注意しておく必要があると考える

化合物ごとの安定同位体標識体をISに使用する。分析法開発時に実試料を用いて事前確認する。

測定法開発の際に測定間の再現性を重視する。

質の高いCROの選択初回測定から期間を置かずに実施する。安定同位体のIS の使用、ばらつきの少ない測定法の開発

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時間への考慮（8件）

早めに測定する。再現性のありそうなサンプルを選択する。

各サンプルごとに累積で室温に晒されている時間を管理し、これが室温安定性で担保されている時間を超えないように注意している。

試験の初期に、速やかに行う。あとはケースバイケース

ISR測定時期をなるべく初回測定から離さず測定条件などを変えないようにする

初回測定終了後、速やかにISRを実施することで共通の標準溶液を用いるなど、測定値に影響が出やすい要因を排除するようにしている。

分析法へ影響を与える要素を一つずつ排除するやり方で対処（7件）

丁寧に操作をする

サンプル処理段階での撹拌操作など、初回分析とISRとで違わないように注意する。

複雑な分析方法はなるべくバリデーションの時点から避ける

検量線の日差の違いが生じない方法の工夫。標準溶液の添加方法（容量等）の均一化

病院から送られてくる検体を２分割して、実試料用とISR用に分けている（凍結融解の回数への考慮）

可能であれば初回測定回と同じ試験担当者、測定機器でISRを実施する

測定対象でない代謝物からの測定対象に対する影響（グルクロナイドなど）を考慮する

マトリックの特性に応じて対応

サンプリング直前、血漿は問題ないが、尿は同じ条件で遠心したとしても基準から外れやすいことが多い。検体容器中で濃度勾配が起きているとか？沈殿しているとか？だから尿は採取直前で撹拌している。

その他（3件） ISRが失敗する時点で実験系として問題がある。再度、測定方法の検討からやり直すべき

検体の取り間違えに気を付ける

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ISR：ISRに関しての疑問、問題 Questions and problems for ISR

疑問コメント

ISRの失敗事例はどれくらいの比率であるのか? 失敗例がほとんどなく、原因の傾向が分かっていて対策ができるのなら、そういう情報をシェアして事前に問題を潰し、現状のようなISRは止めた方がよいのではないか? 試験の評価への影響が大きすぎる。

分析サンプル数が少ない場合（50本／試験等）、10%の5本をISRするのか、もう少し数を多くするのか。本数と成功確率に傾向はあるか。

2/3以上であれば判定基準クリアのクライテリアがわからない。

かなり基準は緩めだと思うので、これで入らない場合は、定量法よりサンプルの安定性を疑うと思います。

代謝物のISRはどこまで必要なのか、判断基準が良くわからないです。

疑問・質問回答

プラセボ群の血漿試料をISRの必要数を計算する際に分母に含めるか？

含めない。実薬投与群で濃度測定の対象となったサンプルに対してISRを実施する。

未変化体・代謝物を一斉分析する場合のISRのクライテリアは、未変化体のみの測定と本当に同じでよいのか？（複数成分一斉分析のほうが、測定値のズレ幅はどうしても大きくなる印象があるため）

基本的に同じで良い。その様な条件でValidationを実施しているので、評価は同じであることが基本。

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疑問・質問回答

ガイドライン上，ISRは代表的な試験でのみ求められているのに対し、委託したCROからは全試験でISRを実施することがSOP上決まっていると言われることが多い。CROにとっては売上アップに繋がるが、スポンサーとしてはコスト増大となる。みなさんがISRを全ての試験で実施しているのか、代表的な試験でのみ実施しているか気になる。

スポンサーが必要ないと考えるのであれば、その考えを通しても良い。懸念点がなければ*、代表的な試験のみで問題は無い。 *例）病態マトリックスなど通常と異なるマト

リックスを用いていないなど

ISRが外れた場合の影響が大きい個人的には試験を分析法開発からやり直すのではなく、「ISRはこの程度外れる分析法で実施した試験」という内容で、科学的にデータの信頼性に及ぼす影響が考慮できていればそれでよいと思う

ISRの本来の目的から言えば、信頼性のないデータで申請するのは推奨できない。やり直しをすべきと考えます。もしくは、参考データ程度の扱いとするのであれば問題は無い。

failした場合に、原因は考察するが、サンプル測定でそのぐらいのずれがあるという結論にして、そのまま実測定のデータを採用することはよいのか

検証の結果、本当に結論に影響しないのであれば、参考値程度の扱いで使用はしてもよいが、申請データには推奨できない。

US治験における評価検体数は7%で評価するべきか、JP/EUと同じ基準で10％で測定するべきか。

各国での申請を考えているのであれば、最大公約数の評価を実施すべきである。


その他の疑問

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質問者の意見夾雑ピークの影響は溶液およびブランクマトリックスを用いて検討し、影響がないことを確認してバリデーション試験を実施している。しかし、バリデーション試験後、実測試料を測定した時に夾雑ピークの影響が無視できない場合、条件検討及びパーシャルバリデーションが必要となる可能性がある。

Note バリデーション開始までに、代謝物の影響を見ることを推奨する。例えば、バリデーション用の分析法の検討段階で代謝物を含む試料（予備的なPK・TK試験で採取）を分析することで、上記a)～e)を評価できる。未変化体と分子量やフラグメントイオンが同じ代謝物がある場合、SRM測定においてもピークを分離しておく。可能であればUVピークなども確認し、影響の出そうなピークは分離しておく。

その他：分析法の設定 Interfering peak (exploratory stage)

Q1: 探索段階の分析、測定法確立において、実測試料での夾雑ピークの可能性をど

こまで検討するかまたは予測するか。

夾雑ピークの原因 a) 被験物質中の不純物・分解物 b) マトリクス中の生体成分 c) 前処理中に生成する物質 d) 代謝物 e) 投与媒体

Step 検討方法

Step 1. 溶液のみを分析し、a) の影響を検討。

Step 2. ブランク試料及びブランクに標準溶液を添加した試料でb) 及びc) の影響を検討。

Step 3. PK/TK試料（代謝物を含む試料）が入手できれば、それらを使用してd) 及びe) の影響を検討。

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その他：誘導体化による分析法の検討 Study of analytical methods using derivatization

Q2: 誘導体化や加水分解などを行って測定する場合の確認事項

ガイドラインに規定はないため、どこまで見ればよいのか困っている

【質問者のコメント】反応生成物質の特定、反応率の確認が必要だと考えています。

【確認事項】選択性の確認

誘導体化試薬のみ(analyte, ISなし)で選択性を確認する。反応生成物の確認する

UV、蛍光検出の場合、反応生成物質の特定は必要。反応条件の確認

反応試薬の安定性、反応試薬の量、反応温度、反応時間等。できれば、代謝物存在下での反応性を確認する。

反応率の確認 ① 誘導体化前や加水分解前の安定同位体ISが使用できるのであれば反応

率の確認は不必要ではないか。 ② 反応率は反応後標準物質があれば求める。なければ、検量線と実試料、

QC試料は、全く同じ操作で前処理をすれば反応率は同じになると考える。

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その他：ラセミ体又は光学活性化合物開発における定量法 Analytical method of racemic and optical activity compounds

Q3: ラセミ体（キラル混合物、DG-X）で開発する場合、曝露評価をどのように行います

か？S-R分離してそれぞれ評価するのでしょうか？

Q4: キラル化合物（混合物ではない）を開発する場合も、S体（DG-X-S）、R体（DG-X-

R）それぞれの曝露評価が必要でしょうか？（異性化しないだろうと考えられても、無いことの確認は必要？）

化学的に異性化しないことが明確な場合は、変換の有無を確認する必要ない

【DG-Xで開発する場合】被験物質がDG-X（キラル混合物）のため、分離せずに曝露評価することで問題ないと考える。

【 DG-X-Sで開発する場合】 • 生体内（in vivo）、マトリックス内（in vitro）及び標準溶液中の異性変換の有無、被験物質の光学純度を確認する。基本的には、DG-X-SとDG-X-Rを分離して分析することを推奨する。

• DG-X-R の曝露量が投与薬物に関連する総ての物質の曝露量の 10%以上の場合、ICH M3(R2)に定義されている代謝物評価と同様に、DG-X-S及びDG-X-Rの双方を評価すべきである。


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Q6: ISのみラセミ体を用いてS体、R体それぞれを測定することは可能でしょう

か？

Q5: S-R体分離定量の際、標準物質として光学活性体の混合物を用いること

は可能ですか？標準物質の品質試験としてS-R存在比を測定します。例）Stock solution：DG-X 1mg/mL溶液を調製。CoAに規定されるS-R比= 3 : 7の場合、stock solution中濃度を下記のよう規定 S体：DG-X-S：0.3 mg/mL、 R体：DG-X-R：0.7mg/mL


in vitroでS-Rが相互変換しないのであれば、問題ないと考える。ただし、相互変換の有無を証明するためには単品のDG-X-SとDG-X-Rが必要である。


サンプル中やプロセスサンプル中における異性化がなければ安定同位体のISでラセミ化合物を使用することに問題はないと考える。ISのレスポンスが一定値であることが重要な要素である。

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その他：複数化合物の同時測定 Analysis of multiple compounds

Q7: 未変化体とともに感度の異なる複数代謝物を同時測定する。

未変化体と代謝物の同時測定法を効率よく確立するためのストラテジーが知りたい。

Comment from DG Point 1 同時分析時に問題となることが多い、感度差への対処法・（測定）プロダクトイオンを変更する。・（測定）プレカーサーイオンを同位体イオンに変更する。・（測定） CEを変更する。

point2 未変化体及び代謝物の分離は確保した上で、保持時間をなるべく近づける。・高流速，移動相，保持機構の異なるカラムを試す．

Point3 前処理最後に、希釈あり・なし試料を調製する。

Point4 検討の結果、同時測定が困難な場合には、不安要素が残る同時分析法を無理に進めるよりも、それぞれで、定量性の高いハイスループットな分析法を作成する方が望ましい。

STEP1 溶液（及び実サンプル）を用いて測定条件を確認する・感度差・溶出位置・クロストークの有無・選択性 STEP2 極性が大きく異なる場合、除タンパク法を中心に検討 STEP3 STEP2までの結果から、同時測定が困難な場合はサンプリングから分けて、別測定とする。

Strategy

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質問者の考え検量線の精度については特に判定基準はないが、報告書では精度も求めて記載しておいてもよいのではないか。

その他：フルバリデーション：検量線の精度 Precision of Calibration curve in Full Validation

Q8: バリデーションのガイドラインで、FDAでは検量線の真度だけでなく、精度も求めて

いますが、国内では特に要求されていない。国内だけでなく、FDAにも申請するような場合、検量線の精度はやはり求めておいた方がよいのか？

【DGからの回答】基本的に質問者の考えで問題はないと考える。DGで調査したところ、海外（US, EU）のバリデーション試験では、ほとんどが検量線の精度を算出している。検量線の精度を算出することで、検量線の濃度ポイントごとの頑健性等が評価できる。これらの情報が各種トラブルの原因究明に役立つ場合もある。また、海外ガイドラインの動向を注視しておくことは重要。JBFのWebサイトに3極のBMVガイドラインを比較した資料がありますので参考にしてください。 http://bioanalysisforum.jp/images/Comparion_Japanese_Guideline_vs_EMA_FDA2013_Guidance_v2.pdf#zoom=100

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質問者の考え QCサンプルは6本中4本がRE判定基準を満たし，かつ判定基準外となったQCサンプルが同一濃度でなければ，判定基準外のQCサンプルを再測定せずに，測定結果は採用となるため，クロマトグラムが異常でも同様の判定で問題ないと考える。

その他：クロマトグラムの異常による再測定 Reanalysis: Defective Chromatogram

Q9: 実試料分析において，QCサンプル1本のクロマトグラムが異常であり，かつRE判定基準

を満たしていなかったが，他サンプルにクロマト異常はなく，QCサンプル残り5本はRE判定基準を満たしている。クロマトグラムが異常のQCサンプルを再測定せずに，測定結果を採用としている。この判断が妥当であるかどうか知りたい。

【DGからの回答】クロマトグラムの異常は本来、無条件で再測定を実施することが必須かと思う。しかし、今回の場合、QCサンプルで、かつ判定基準を満たしているため、再測定を実施しても結果は同じである。このため、再測定を実施しないという判断でも問題にならないかと思う。クロマトグラムの異常は正常に分析できていないため、再測定は無条件で行われるべきである。しかし、恣意的なデータ再取得と受け取られないよう、どのような場合がクロマトグラム異常かをあらかじめ試験計画書・SOP等で規定しておくことが重要と考える。

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その他：機器トラブルによる分析中断時のデータ採用 Data adoption of machine trouble

【DGからのコメント】 QC1～3にそれぞれ3濃度のQCサンプルを測定することで保証されていれば、挟み込みができている測定結果のみを採用とし、再測定の際も3濃度のQCサンプルで挟み込みされている質問者の対応は妥当である。

質問者の意見検量線、QC1、実試料1(50本)、QC2までは測定が正常に終了しているため採用とする。実試料2については途中で分析がストップしており、QCサンプルによる挟み込みができていないため、測定結果を棄却する。検量線、QC2、実試料2（50本）、QC3の再測定を行う。この流れが妥当であるかを知りたい。

Q10: 実試料分析おいて検量線、QC1、実試料1（50本）、QC2、実試料2（50本）、QC3の

順に測定する予定であったが、機器トラブルにより実試料2の途中で測定が停止していた。調製後試料中の安定性はバリデートされた期間内である。データの採否について他社での対応を知りたい。

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その他：ガイドライン基準を満たしていない報告書 Handling of old validation report

Q11: 導入品の開発にあたり海外CROの古いバリデーション報告書を読んでいると、

「一部の試料でクライテリアを満たしていないが問題ないと判断した」と結論づけているものがあった。ガイドラインが発出される前とはいえ、そのような報告書が承認申請資料として許容されるのか？

【DGからの意見】基準を満たさなかったバリデーション項目が「実試料の定量値」及び「試験全体」に及ぼす影響を総合的に評価し、「評価資料」とするのか「参考資料」とするのか判断する。例：長期安定性試験で1Mが基準外となっても、3M, 6Mが基準内なら問題なし。

報告書について求める品質

何故問題ないと判断したのか、科学的、客観的な根拠も記載すべき。導出元での品質チェックを厳しくして欲しい。CROは責任を持って試験実施すべき。

【質問者の考え】分析法バリデーションはPK特性を明らかにするために実施すべきものである。クライテリアを外した結果の影響を最大限に評価し、PKの結論に影響がなければそのままでも差し支えない（ただし、どのようにして「最大限に」評価するのか、という問題は残るが）。ただし、日本のBMVガイドライン発出以降（2013年以降）ではそのような言い分は許容されず、バリデーションに関連したPK試験を「評価資料」から「参考資料」へ格下げすべきである。

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Summary

We collected “Questions for bioanalysis” from DG supporters.

We classified the questions (Calibration curve, Stability, Data assay and ISR, and Others).

We discussed the calibration curve, data assay and ISR, and others.

We summarized the solutions and recommendations for the questions.

We would be appreciated if you can find “the loadstar” in our solutions and recommendations.


会場内の皆様に質問

本アンケートは，DGサポータ等より寄せられた「困ったこと」のなかで，「他社の実施状況を知りたい」と要望があったものです。この様な質問に対してのフィードバックを行うためのアンケートになっております。皆様アンケートの回答に，ご協力のほどよろしくお願いいたします。なお，アンケート結果については，後日公表いたします。

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Survey 1：フルバリデーションにおいて検量線を何回評価（することを計画）しますか？ AからDはシールを、Eはポストイットに記入したものを貼って下さい。

あなたが実施する場合

このような回数を目にしたことがある（委託試験、海外試験など）

0件 2件 0件 0件 19件

A：3回 B：4回 C：5回 D：6回 E：その他

0件 2件 5件

• 入るまで何回も • 入らないとやり直し（ミ

ス）のため結果的に入るまで

2件

A：3回 B：4回 C：5回 D：6回 E：その他

検量線に関するアンケート

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A：分析対象物質ごとにサンプルをカウントする（例：3化合物同時測定、測定試料100本の場合、ISRの測定結果として各化合物につき10個必要。ISRサンプル数は10本～30本）

Survey 2：複数化合物同時測定の場合、ISRのサンプル数をどのようにカウン

トしますか？シールを貼付しご回答ください。

B：サンプル数のみでカウントする（例：3化合物同時測定、測定試料100本の場合、ISRサンプル数は10本必要）

ISRに関するアンケート

14件 2件

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投与後試料を準備している投与後試料を準備していない＊

＊投与後試料に代わる対策案

Survey 3：添加試料ではなく投与後試料に特有の問題があるとするならば、分析法

検討時点で投与後試料を準備しておく必要があると思います。実際にそのようにされていますでしょうか、されていない場合には、それに代わる何か対策を持たれていますでしょうか。皆様のお考えをポストイットに記入し、貼って下さい。

0件 15件

• 初回の分析時によくクロマトグラムを観察する。 • ISRである程度確認できると考えている。 • 代謝物の標準品を用いて未変化体の定量に影響を及ぼさないか調べる。

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6.3. クロマトグラムの波形処理クロマトグラムの波形処理及び再波形処理の手順は，あらかじめ計画書又は手順書等に設定しておく必要がある．再波形処理を実施した場合には，再波形処理を実施した理由及び再波形処理を行う前後のクロマトグラムを保存しておく必要がある．

｢医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに関するガイドライン｣について（平成25年7月11日薬食審査発0711第1号厚生労働省医薬食品局審査管理課長通知）

Note

再波形処理をするタイミングパターンA：バリデーションと異なる解析パラメータで実施した場合パターンB：Auto Integrationでうまくいかない場合のManual IntegrationなどパターンC：定量値まで計算した後に、何らかの理由でピークを再び解析する場合

データ評価に関するアンケートクロマトグラムの波形処理 Chromatogram integration

BMVガイドラインの【クロマトグラムの波形処理】の項に「再波形処理を実施した場合には、再波形処理を実施した理由及び再波形処理を行う前後のクロマトグラムを保存しておく必要がある」との記載がありますが、皆さんは、どのように対応していますか？

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Auto Integration（オリジナルクロマトグラム）

データ固定（定量値）

Auto Integration パラメータ変更＊＊バリデーション必要

再解析クロマトグラム

再波形処理

Auto Integration パラメータ変更

Manual Integration ・Base Line調整・垂直分割

再波形処理


問題なし

波形解析はAuto Integrationが原則バリデーションは、解析メソッドを含めて検証しているものとして、実測定でも変更しない（変更にはバリデーション必要）

波形解析はAuto Integrationが原則だがManual Integrationを否定しない正しく波形解析できるようにAuto，

Manual含めて再波形処理してデータを固定する

問題あり

①

②

② ①

波形処理の流れ（パターン１）


Auto Integration パラメータ変更・Bunching Factor ・Smoothing ・保持時間 etc

パターンA

パターンB

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オリジナルクロマトグラム


再波形処理

Auto Integration

問題なし

波形解析はAuto Integration、Manual Integration含めて行う Auto Integration、Manual Integration関係なく、正しく波形解析を行ってデータを固定。ここまでは、再波形処理とは定義しない

③

③

波形処理の流れ（パターン２）

問題あり


データ固定（定量値）パターンC



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波形処理の指標

保持時間が異なる。（移動相、カラムのロット等の影響）パラメータ設定により近傍の異なるピークを認識している。ピークのトップが割れているため、分割して認識されてしまう。ベースラインが寝ているところまでピークを認識していない。ピークの裾に別のピークがあるが区別できていない。

③の解析についての考え方科学的に考えて上記のようなピークをそのまま認識させて、データを固定することは良くないと考え、ここまでは、再波形処理には含めない。

右のような場合は、ピークの割れなのか、ピークが重なってしまっているのかがわからず判断に迷う。他の検体のピークと比較してピークの重なり等で無いと判断出来た時は、Bunching Factorの変更で対応する。

最後に。BMVガイドライン解説書には、以下の記述がある。再波形処理の定義は、生データの定義、電子データの取り扱い、サーバー・Laboratory Information Management System（LIMS）の有無などによってさまざまな考え方があるため、SOP などであらかじめ定めておく必要がある。特に、生データを打ち出し記録（紙）としている場合には注意が必要である。

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①どこからが再波形処理ですか

②波形処理の指標は何ですか

③指標はSOPに定めていますか

④クロマトグラムの残し方

Survey 4 ： BMVガイドラインの【クロマトグラムの波形処理】の項に「再波形処理を実施

した場合には、再波形処理を実施した理由及び再波形処理を行う前後のクロマトグラムを保存しておく必要がある」との記載がありますが、皆さんは、どのように対応していますか？シールを貼付しご回答ください。 ①どこからが再波形処理か ②波形処理の指標は何か ③波形処理の指標をSOPに定めていますか ④再波形処理の前後のクロマトグラムはどの様に残していますか

パターンB：4件パターンC：3件

• クロマトグラムでピークがきちんと積分されているかどうか。

• 見た目

計画書に「SDが判断する」としか書いていない（客観的な指標は無い）

オリジナルと再波形処理の両方（今は紙）：2件

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血中濃度の算術平均値およびSDを算出する際、定量下限未満の値をN.D.とするか、0を代入するか各社で対応が異なると思われる。日本のガイドラインでは定量下限未満の値の取り扱いについて規定されていないので、各社で取り扱いを統一した方がよいのではないか。

ｔ1/2の算出時にNDを除けるようにしている。

12件

【DGからのコメント】定量下限未満の値の取り扱いについては、DG内でも対応が異なった。定量下限未満の取り扱いは試験結果にも大きく影響するので、国内のガイドライン等で規定され、各社統一の取り扱いとすることが望ましいと考える。

0件

C：その他（ポストイットを貼付してください）

B：0を代入して平均値およびSDを算出。

A：N.D.を除外して平均値およびSDを算出。

Survey 5：定量下限未満の値をどのように取り扱っていますか？シールを貼付しご回答ください。

N=4 N=4

N=4

N=4

N=4で、ND=0代入最後の点が下がってしまうので

N=4 N=4

N=4 N=3

NDを除外するようにする

X

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【DGからのコメント】 BMVガイドラインの考え方からすると、手順書があるとしても安易に再分析するのが適切か疑問であり、可能な限り再分析しない方がよいと考える。他の個体等と比較して濃度推移が異なる（終末相の推移、tmaxのずれなど）は再測定理由にならない。安易にデータを入れ替えることによって、データの改ざんが疑われることも十分に考えられる。一方で、投与前の時点に薬剤が検出されたり、実薬投与群で全てNDであった場合などは、確認のための再分析は必要と考える。 ISレスポンスの揺らぎ（2倍程度の低下）によりNDとなった場合は再分析により定量値が得られることもある。原因不明のまま初回データあるいは再分析データを採用することは問題であり、「薬物動態学的理由」についてよく考察すること。

質問者の意見 BMVガイドラインでは可能な限り行わないのが望ましいとされているが、その考え方についてコンセンサスが得られていない。試験責任者の考え方により、手順書の範囲内（再測定手順とデータ採用手順を規定）においては簡単に再測定されている（手順書にしたがって採用データを決めるため生物学的同等性試験以外においては値の入れ替えはありうる）実態がある。

実試料分析における、「薬物動態学的理由による再分析」（Pharmacokinetic outlier）の対応について（手順書整備）。

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ポストイットに記入し、貼って下さい。

Survey 6-1：実施したことがあるとお答えの方への質問です。

どのような理由により再分析を実施しましたか？またデータの採用方法は？

ないある

Survey 6：「薬物動態学的理由による再分析」を実施したことがありますか？

あるor ないにシールを貼って下さい。

9件 4件

・一度定量下限未満になった後に検出されたため（実際はLLOQ付近で推移していたと推測される）ガイドライン発出前だったため実施した。今は実施しないだろう。・投与前サンプルに測定値が出た。・サンプル取り違いと思われるようなPK profileになった。・ Phase 1試験で前の用量のPKデータから、あらかじめ次の用量では希釈を行う

ことしたが、実際には希釈が行われず希釈倍率のみが適応されたため、予想より極端な高値となった。確認のため再測定を実施した。・投与前サンプルに測定値が出た。3回測定して近い（±15％以内）2回の平均をデータとして採用した。

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実試料分析において、I.S.の測定結果にばらつきがある場合、どの程度の違いがあった時に再測定や再分析の対象となるか。

【DGからのコメント】 I.S.の測定結果が、基準の約2倍以上の結果を得た場合に再測定や再分析とする。また、 I.S.が基準より小さい場合（例1/2など）についても考慮する必要がある。ただし、機器の不具合やヒューマンエラー等原因を十分に考察し、原因を明らかにして実施すべきである。

2件

Survey 7-1： I.S.のばらつきにより再測定または再分析を実施する場合のI.S.のばらつ

きの実施基準についてどのように規定していますか？シールを貼付しご回答ください。

3件

A：SOPや計画書等に規定している B：その他（ポストイットを貼付してください）

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

• 特に考慮していない • SST • LC/MS/MSで測定するとピーク面積の変動

が化合物により大きく異なるので何ともいえない

Survey 7-2： I.S.の測定結果がどの程度ばらついた場合に再測定または再分析を実施

しますか？シールを貼付しご回答ください。

7件

A：2倍以上

4件

B：1/2未満 C：その他（ポストイットを貼付してください）

Survey 7-3： I.S.の測定結果のばらつきを考察する場合どの試料を基準としますか？シールを貼付しご回答ください。

2件 0件 7件 0件

A：ゼロサンプル B：検量線 C：QC試料 D：その他（ポストイットを貼付してください）

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

0件 0件 0件 20件

【DGからの推奨】各代謝物の安定同位体を内標準物質として用いることが望ましい。代謝物の数が多い場合等は、物性の類似した代謝物ごとに内標準物質（アナログを含める）を選択するのがよいと考える。

未変化体及び代謝物（3種類）の同時分析法の予備検討を実施している。内標準物質が未変化体の安定同位体であるため、代謝物の分析では、分析法バリデーションの評価基準（ex: 真度及び精度、前処理後試料中安定性）を満たさないことがある。同時分析法の場合、他社ではどのように対応しているか？

C：内標準物質を用いず、他の検出器（UVや蛍光）を使用する。

B：内標準物質を用いず、絶対検量線で評価する。

A：代謝物の内標準物質（アナログを含める）を検討する。

Survey 8：各代謝物において、安定同位体の内標準物質が入手出来ない場合，第一選択として，どのような対応を取りますか？シールを貼付しご回答ください。

D:その他（ポストイットを貼付してください）

その他の疑問に関するアンケート

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Survey 9：探索段階でヒト特異的代謝物の測定法をどのように確立し、生成量を把握し

ていますか？前臨床段階より前のステージで分析用標品がない場合を想定してお答えください。

A：UVを用いて、代謝物と未変化体のピーク面積値を比較する

B：MSを用いて、ISとに対する代謝物と未変化体のピーク面積比を比較する

C:その他（具体的に）

【DGからのコメント】代謝物の量が多ければ、UVで検出して生成比まで算出することが可能。代謝物の生成量が少なく、MSで検出する場合、未変化体・代謝物のイオン化効率の差が大きいと代謝物の量比まで正確に評価することはできない。

AとBはシールを、Cはポストイットに記入したものを貼って下さい。

6件 3件 1件

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

Survey 10： MIST対策のために分析法バリデーション試験を実施する必要があるが、

数が多いため、すべての代謝物で実施するのは困難。ヒトの結果を得る前に、前臨床段階ではどこまで試験を進めておくべきか？

【質問者の意見】段階的バリデーションが有効であると考えるが、自社で実施経験がないため、他社ではどのように対応しているのかを知りたい。

【DGからのコメント】代謝物同時測定の労力を考慮すると、前臨床段階では必要最小限で良いと思われるが、

MIST対象となる可能性が高い代謝物はバリデーション対象に入れた方が良い。ヒト試験で新規にMIST対象になった代謝物については、以下の方法が考えられる。

•当該代謝物のバリデーションを取得し、代謝物を投与する毒性試験の実施 •ヒトと同等以上の代謝物の暴露量が得られるよう、親化合物を投与する毒性試験を実施

上記質問に対し、どのような対応を取られますか？ポストイットに記入し、貼って下さい。

回答なし

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

未変化体にはないが、代謝されることにより不斉炭素ができる。この、不斉炭素を有する代謝物は、主代謝物である。不斉炭素を有する代謝物が主代謝物（総曝露の10％を超える）の場合、キラル分割をした分析法バリデーション試験を実施する必要があるか？

6件

A：必要 • 代謝物の活性が臨床の有効性/安全性に

及ぼす影響が無いことを説明できるのであれば必須では無いと考えられます。

• 生物学的同等性で求められていることは、あくまで未変化体のBA差であるということを考えると分割することを考えたほうがよいのでは

B：不要

Survey 11：キラル分割をした分析法バリデーション試験の実施は必要と考えますか？該当箇所にシールを貼って下さい。

質問者の意見不斉炭素を有する代謝物が、活性代謝物である場合は、キラル分割する必要があると考えるが、それ以外の場合は必要ないと考える。

【DGからのコメント】分割して総暴露の10％を超える場合は、活性の有無等関係なくキラル分割をした分析法バリデーションが必要と考える。

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

① 調製後、１本の容器に保存する。各評価時期にその１本を融解、そこからn回分取後、前処理、測定する（例：長期安定性試験で1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年の場合、凍結融解回数は４回となる。凍結融解安定性は確認済みであることが前提）。

Survey 12：マトリックス中の安定性試験を実施する際に、サンプルをどのように保存し、測定していますか？該当箇所にシールを貼って下さい。（複数回答可）

② 調製後、各評価時期用（例：1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年）に1本ずつ分注して（例の場合は4本分注）保存する。それぞれの時期に1本融解し、そこからn回分取後、前処理、測定する。

③ 調製後、各評価時期（例：1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年）の測定に必要なn数に分注して保存する（n=3で測定の場合、例の場合は12本分注）。それぞれの時期にn本融解し、分取後、前処理、測定する。

④ その他（ポストイットに記入し、貼って下さい。）

8件 0件

8件 0件

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


会場での質問と回答－検量線－

質問回答関連ポスター二次曲線を使用するのはMSに限定しているのか MSだけではなく，UV測定でもあり得ると考えている．検量線 Q1，2，3

一次式以外使用不可のコメントが少数意見ではあるが、(科学的に妥当でないという意見を指して)かなり過激だと思う

DGサポータへのアンケートで寄せられた意見の一例です検量線 Q3

検量線のポスターにある重み付けについて，1/xか1/yかどちらが結局良いのか．

数学的には，1次直線で評価するのであれば，両者ほとんど変わらない．

検量線 Q8，9，10，11

検量線の重み付け表の1/S2のSって何ですか？ S2は分散を示している。次のポスターでは記号の説明などを入れるようにする

検量線 Q8

検量線の重み付けの考え方はステージで違う．探索ステージでは濃度範囲を広くとって，必要な濃度範囲を採用し，一律1/y2を用いている．重み付けについて勉強になった．

探索ステージでは一律でやっているのは同じ．検量線 Q8，9，10，11

検量線の直線について，重み付けは，バリデーション試験内で評価すべきかどうか．ジェネリックでは，検討時に重み付けを決めて，バリデーション試験内では，重み付けの評価をしていないとPMDAの照会事項に記載される傾向にあり，バリデーション試験内で評価している．

ガイドライン解説には，分析法開発段階で検討し，バリデーション試験開始前には，それらの選択が終了している場合には，試験計画書及び報告書に選択の根拠を記載する必要は無いとなっている．

検量線 Q10，11

QAUの立場から、バリデーション試験で、検量線評価とその他の評価を兼ねたバッチで、検量線がクライテリアを外れた。SDの判断で、バッチを不採用とし、検量線評価にもその他の評価にも使用しなかった。検量線は評価に含めるべきであったと思うが。

検量線がクライテリアを外れるリスクの評価も含めて「検量線の評価」と考え、外れた検量線も評価に含めるということも一理あるような気もしますが、外れた検量線のデータを残し、可能なら外れた理由を明らかにしたうえで検量線の評価から外した方がよい。SD判断に任せるのではなく、SOPで規定してもよいのでは。

検量線 Q12

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

質問回答関連ポスター実試料の検量線では，外れたポイントが出れば，ポイントを外して検量線を再構築しますが，バリデーションの直線性において，外れた検量線で評価しますか．また，基準を満たさなかったポイントを除外して採用として問題ないか

これが評価の基準になるため，直線性の評価にはポイントを外れた検量線は使用しません．直線性を評価する試験で基準を満たさなかったポイントを除外して採用とすることは望ましくない．状況によっては，前処理等の再検討をすべきであると考える．ただし，SOPやPCに除外のクライテリアが設定されている場合も多く，完全に否定することは難しい。

検量線 Q12

検量線が2ポイント以上外れた場合で，下記の条件の場合，どのような対応を取るべきか？ ① 外れたポイントが，LLOQもしくはULOQを含む ② 検量線範囲はPCに記載がないため変更出来ない． ③ 外れたポイントを一括で外す対応はしておらず，1ポ

イントずつ外す運用をしている．例1：LLOQ：25％，STD.6：35％など → LLOQ及びULOQ以外のポイントの外れ方が原因で，

LLOQ及びULOQが外れ，中間ポイントを除外することでLLOQ及びULOQはクライテリアを満たす．

例2：LLOQ：30％，STD.6：25% → 重みの影響でLLOQの方が外れているが，STD.6を除

外することで，LLOQはクライテリアを満たす．

事実として，複数ポイント外れていた場合，検量線から1ポイントずつ外す対応されているケースが多いのだと思われます．ただ，DGとしては，このケースは，2ポイント外れていた場合は，明確な理由が無い限りは（明らかな調製ミスなど），1ポイントずつ外さずに2ポイントを一気に外すことを推奨いたします．また，このような場合，ケースバイケースが多く，1ポイントずつ外す判断基準や操作を計画書やSOPに記載することは難しいと思われます．そのため，恣意的な形になることが考えられます． 1ポイントずつ除外する場合は，その除外方法が恣意的でないことを証明することが重要．例1の場合は，より大きく外れているポイントから除外したと説明出来るが，例2は許容されないと考える．加えて，2ポイント除外する場合は，測定回全体に異常がある可能性もあるため，検量線の傾き等，除外後の検量線がこれまでの結果と同等か確認することが望ましい．

検量線 Q12

検量線のLLOQが基準外（±20%）、LLOQの1つ上の濃度は基準内（±15%）という状況があり、『1つ上の濃度』を除外したらLLOQも基準内に入るが、方法として妥当か？

妥当ではない。基準内に入っている点を外すのは、恣意的と言わざるを得ない。正当性を関係各所に説明できないと思われる。そうして再作成した検量線が正しい可能性も高くないと思われる。

検量線 Q13，14，15，16

検量線のLLOQ，ULOQが外れても良いのか？ガイドライン上は問題ない．外して作成しなおした検量線の範囲内にQCが収まっていること．

検量線 Q13，14，15，16

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


会場での質問と回答ーISRとデータ評価ー

質問回答関連ポスター ISRにコントロールを含むか？含めない。実薬投与群で濃度測定の対象となったサンプル

に対してISRを実施する。 ISRに関しての疑問，問題

Ph-3では多くの異なる病態のサンプルを扱うが，これらは全てISRを実施すべきか？

必要に応じてである。 Ph-1より同一の分析法で，Ph-2の病態モデルサンプルなどでもISRを実施している場合は必要ないのでは。 Ph-3で初めて分析法を設定したのであれば，必要に応じて病態サンプルのISRを実施した方がよい。もちろん，通常のISRは必須。

ISRに関しての疑問，問題

実試料測定で、あるサンプルが定量上限を超えたため、希釈して（希釈妥当性はバリデーションで評価済み）再測定を実施した。このサンプルでISRを実施する場合、希釈なし・あり両方を測定するべきか。

ISRは希釈したもののみで良い。希釈なしの測定はULOQを超えるため，測定値が得られない。そのため，ISRの評価ができないため，希釈なしのISRは不必要である。

ISR Q2，3，4，5，6

「化合物のプロファイルに全て合わせて別々のポイントで分析する意義はそれほど高くない。」ことを推奨に記載されているが，Survey 2では「A：分析対象物質ごとにサンプルをカウントする」を選択している人が多いのは，やはりそれぞれの化合物でCmaxや消失相をきちんと評価できているかを問われることを懸念してか？

その通りだと思うが，できるだけ評価本数を少なくするように検討することは可能．

ISR Q5，6

Plasma以外，ISRはどこまで求められるか？海外CROにおいて，糞中濃度分析のISRを不均一試料（バラつく）という理由で断られた．

データの重要性からISRが必要な際は主張すべきである．バリデーションの基準を緩めているのであればISRの基準も緩める．報告書に事象を記載すべきである．そもそも，不均一試料だから再測定ができないという理由は成り立たない。もし，この理由が成り立ってしまうのであれば，初回測定が正確にできないと言いているのと同じである。

ISR Q12

代謝酵素の概日リズムなどにより、特殊な動態プロファイルを示す薬物について、ISRの評価時点はCmaxと消失相のみでよいのか。

特殊な動態を示す薬物の場合は、評価時点を追加すべき。代謝物の動態なども考慮するとよい。

ISR Q10

7th J

BF

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posi

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G20

15-1

3

質問回答関連ポスター ISR失敗例として、CROでISRの分析単位にQCが含まれていなかった。ISRサンプル自体はクライテリアを満たしていたものの、QCがないことにより分析バッチの妥当性が判断できず、結局そのバッチはすべて棄却し、ISRをやり直した。

検量線とQCが入っていて分析1バッチと考える。QCが無いと分析バッチの保証ができないため，測定として成り立たない。やり直しの判断は妥当である。

該当なし

ISRサンプル測定時に検量線などが外れた場合、再分析すべきか？

検量線のクライテリアを満たしていないのであれば，得られたISRの測定値に信頼性がないため、再分析は必須。検量線の真度の外れたポイントはあるが，クライテリアを満たしているのであれば，外れたポイントを除外して検量線を作成しなおし，ISRの評価は可能。ただし，作成しなおした検量線が妥当であることの確認はすべき。

該当なし

食事の影響によるISRの失敗事例はなかったのか？今回のアンケートではそのような事例はなかった．該当なし

代謝物が不安定だとわかっていたら初回測定時にもう１本サンプリングして同時にISRをやることはできるか？

ISRは異なる日に別分析で行う事がBMVガイドラインに明記されているため，同時に実施する事は不可。濃度がわからない段階でサンプル選定をするリスクと同一バッチでの測定に問題がある．通常の方法でISRを実施して問題が起こりそうと想定される不安定な代謝物は測定すること自体よく考える必要あり．

ISR Q13

ポスターにある「ISRを成功させるために考慮している点」の分析法開発時に実試料を用いて事前確認するとあるが，これは動物のことでしょうか．ヒトでは，これは無理だと思われますが．代謝物としてグルクロニドが生成するのはわかっているケースがあって，動物ではグルクロニドが出ることが確実であるが，ヒトではどうなるか不明の場合，代謝物を合成してどこまで確認するか悩んでいる．ISRを実施した場合，グルクロニドからのBack Conversionがあるとクライテリアを満たさない可能性が出てくるのではと考えるが，ヒトの場合，動物の様な事前の確認が出来ない．

このアンケートの回答は，前臨床の動物試験を意図しています．結局，どれぐらいリスクを考えるかになるかと思われます．Back conversionの検討であれば，動物からとってきたグルクロニドをヒトのマトリックスに添加しての安定性を見るなどの方法もあります。もちろん，合成標品があればなお良い。

ISR Q22

ISRを失敗した時の精査項目を減らすことはできるのか？（例えば，ピンポイントに安定性を疑うとか）

測定法を検討している時や，他の動物種での評価結果，代謝パターン等から，まず疑わしい項目が何かは想定できるはず．やみくもにいろいろ検討するのは時間もリソースも無駄になる．ポスターで提案している精査項目に優先順位をつけて実施する。

ISR Q14，15，16，17，18

ISRが失敗した場合はどうなるのか？原因を精査し、失敗の程度に応じてパーシャルバリ、フルバリなど実施した後に再度全てのサンプル分析が必要になると考える。ISRの基準自体が緩いのでそこから外れる場合は実試料に適していない測定法の可能性があるなど、何らかの問題が潜んでいると考える。

ISR Q16，17，19，20

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

質問回答関連ポスター ISR失敗の際の精査項目として「IS面積」が挙げられているが、IS面積の基準を設定しているのか？

一例として，既知濃度の試料（検量線、QC）のIS面積の最大値よりも2倍大きいもの、Analyteの面積がLLOQより小さく、IS面積が既知濃度の試料の最小値の半分の場合にはIS面積異常としている。ただし，この条件は推奨には至っていない。

ISR Q18

「代謝物の ISRが外れた場合の対応で，重要な代謝物（MIST対象，活性代謝物）は原因を究明し，明らかとなった原因を取り除いて場合によっては再測定を行う（Tiered approachでの対応も可）」上記の，Tiered approachでの対応について教えてほしい．

MIST対象となる代謝物は再分析を推奨していますので，「ISRが外れた→原因がわかった→Method改良」という流れになります。保存中の安定性を考慮するとMethod改良にあまり時間をかけられないケースでは， Tiered approachで時間をかけずに再分析して，正しいデータを取得する。その後，バリデーションを実施し，「別の試験で再度ISRを実施」というのが現実的。

ISR Q17

ISRの失敗の原因を追及する際に、追及しても分からない場合はあるか？追求したことは報告書に記載すべきか、照会事項を待つべきか？

追求中にサンプルが無くなり断念する場合はあると思うし、追及しても分からない場合もあると思う。分からなくても、追及中に実施したことは報告書に記載すべきであると思う。わざわざ照会事項が来るまで放置する必要は無い。

ISR Q21

全体としてISRがクライテリアを満たしたが，特定のバッチでみると外れていた場合，原因追求をやると思うが，レポートに記載する必要はあるか？

レポートへの記載については今回詳細な検討・協議をしていない．全体で入っていたら，バッチ単位の外れについて報告書で詳細に記載する必要はない．ただし，当局からの照会を受けた時に対応できるように，原因究明の検討についての報告書を作成しておいた方が良い。

ISR Q21

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3


会場での質問と回答ーその他ー

質問回答関連ポスター代謝物のISには何故安定同位体が良いのか？複数同時測定の際，ISも複数用意した場合は混液にするのか？

類縁体をISに使用した場合，測定対象とISでマトリックス効果の影響が異なる可能性がある．マトリックス効果の影響により，測定値のバラつきの要因につながるため，安定同位体が好ましいと考える．溶解性，安定性に懸念がないのであれば，簡便さから混液が好ましいと考える．

該当なし

ISが見つからない場合、どうすればよいか？物性、構造が類似している化合物をISに利用する方法ある。探索段階の試験であれば、絶対検量線も選択肢の一つとして考えて良いと思う。サンプル量が十分ある場合、正確性を重視するなら、標準添加法（例えばサンプルxに既知濃度a及びbを添加し、その直線から濃度xを導く方法）をお勧めする。

該当なし

低濃度のみ吸着を起こす化合物もある．その場合はどのように分析すれば良いか？

吸着の原因を特定し，原因因子を取り除く．物性から考慮し，溶解度の高い溶媒，試薬を使用することで対処する．場合によってはLCの配管をEDTA等の試薬でコーティングした後に分析することも考慮する．

該当なし

キラル代謝物の分析で，分けて測定する必要性は無いのでは？

キラル代謝物はR体とS体は異なる代謝物すなわち代謝物2種類と考えるべきである。なので，分けて測定することが一般的と考える。

その他 Q3，4，5，6

誘導体化で安定性の悪い代謝物を測定したいが，何を確認すればよい？安定性が悪いため，誘導体化前は測定ができない。

気になる点としては，反応率ですが，誘導体化後の代謝物標品を使っても求める事を推奨。最大限できる事もしくは，必要に応じて実施する（濃度を振って誘導化し，その直線性を確認するなど）。

その他 Q2

x x+a x+b

7th J

BF

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posi

um D

G20

15-1

3

質問回答関連ポスター誘導化の検討をした際，レポートに何を記載すればよい？バリデーションレポートには検討したことを記載する必要は

ないと考える。バリデーションは測定法の検証であり，様々な条件検討ができた後に行う試験なので，例えばMRMの条件を決めるような検討結果をレポートに記載しないのと同じである。会社の考え方にもよるが，検討結果はナレッジとして蓄えておけば良いのでは（簡易のレポートなど）。

その他 Q2

point2「未変化体及び代謝物の分離は確保した上で、保持時間をなるべく近づける。」この記載は，ISがD体の時も当てはまるのか？ point3「前処理最後に、希釈あり・なし試料を調製する。」これは同時測定法ではないのでは？

ISがアナログの際を想定している．それぞれ安定同位体を用意できる場合は，無理に保持時間を近づける必要はない．前処理は同時処理であるが，測定自体は同時測定ではない．前処理の最後に希釈あり・なしに分けて調製するため，血漿等の試料量や凍結融解回数を軽減できることが利点である．

その他 Q7

ヒト代謝物（in vitro）として，グルクロン酸抱合体が検出されているとき，血漿中濃度分析法をどのようにケアすれば良いか．

一般的にアシルグルクロナイドであれば，pH3以下で安定，N-グルクロナイドであれば，中性で安定であるため，分析条件と照らし合わせてほしい．可能であれば，in vitro代謝反応後の試料をLCで分離後に分取して，血漿にスパイクし検討することを推奨する．安定性に加え，インソースフラグメンテーションの有無を確認すること．インソースフラグメンテーションについては保持時間が離れていれば問題ない．

その他 Q7

固相抽出での回収率が、60%、70%、60%であった（回収率サンプルのエリア比（analyte/IS）は一定であったが、最終報告書にはエリア比は載せていなかった）。書面調査で、「回収率の値がぶれている」と指摘されたが、固相抽出で、上記の値は普通の範囲内と考えられるのですが。

60%、70%、60%は普通の範囲内だと思う。最終報告書に参考データとしてエリア比を載せておくと書面調査の際回答しやすかったのでは。

該当なし

SDラットで分析法バリデーションを実施済み。F344系のTK(GLP)でトラフ値のみ測定しているが、動態はエンドポイントではない。この状況で、 F344系の分析法バリデーションは必要か？ F344系の実試料分析において、ISRは必要か？

トラフしか測定しないTKの曝露確認では、バリデーションは不要。個人的には、TKパラメーターを求める試験でも、SD系でバリデーションを実施済みであれば、改めてF344系で実施する必要はないと思う。系統差ではISRは不要。ただし、2年間のがん原性試験など、コストの高い大きな試験を実施する場合には，事前の試験でISRを実施した方が良いのでは。

該当なし

7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

質問回答関連ポスターヒトバリデーションで、注入（インジェクション）量10 μLで全評価項目のクライテリアを満たしていた。しかし、実試料測定の際、注入量10 μLではおかしい結果になったため、注入量を1 μLに変更した。この場合の対応は？

後付けでバリデーションをするしかないと思う。パーシャルバリデーションだが、ほぼすべての項目になると思う。なぜ，10μL はおかしい結果になり，1μLが妥当なのかを検証し，原因を追究すべきである。その後，1μLが妥当であればバリデーションを実施する。

該当なし

BE試験において，検量線の上限を超えることが予想されるポイントについて，初回試験時に希釈して試験を実施することはよいか．

BE試験での実施の場合，照会等で問われる可能性があるが，バリデーションで希釈の妥当性を確認しており，SOPや計画書に規定しておけば初回試験時に希釈しても良い．また，無駄な測定時間やサンプル融解が無くなるため良い方法である。しかし，場合によっては希釈して定量した試料のなかで，本来希釈が必要なかった試料が多く含まれてしまう可能性があるので注意が必要である。

該当なし

実試料測定時にLLOQを変更した後で再分析する際に、初回測定時にピークが全く出なかった投与前サンプルも分析しなくてはならないか？

LLOQ未満の測定値の信頼性がないため原則再分析を勧める。LLOQの変更はピークのレスポンスが変わっている（調製ミスによりレスポンスを設定できずピークの有無の判断ができない事も含む）ために行う行為である。そのため，ピークが無いからと言って，最初からLLOQ以下であると判断する事は出来ない。なので，ピークが全く出なかったものは再測定を実施すべきであると考える。

該当なし

クロマトの解析時のパラメータについて，1サンプルごとに解析パラメータを変えても良いか？

基本的には不可である。少なくとも1バッチ単位で解析パラメータは統一したものを用いた方が良い。バッチ内で一部に変更が加えられるのは，恣意的でなければ問題にはならないと考えられる。

アンケート Survey 4

波形処理パラメータは，測定当日のシステム適合性試験において測定した標準試料を解析して毎回設定する．（この方法だと，パラメータの変更は再波形処理には該当せず，コメントも不要となる）

バリデーションで決定した波形処理パラメータもメソッドの一部であり，変更を加えた場合には記録を残すことを基本としているが，DGの中でも対応に差があることから今回のアンケートに至った．“毎日変える”というのは良い方法の1つかもしれない．


波形処理の変更については，これまでパターンCでやってきたが，社内でも甘いのでパターンBなどを考えないといけないという話が出ている（タイムリーな問題）．他社がどうやっているのか興味があり，今後，推奨があればそれを参考にしたい．

DG内でも対応が異なるため会場アンケートを実施した．最終的に7人の回答しか得られなかったので，傾向を掴むには更なる調査が必要と考えられる．


実試料測定に入ったら波形処理パラメータは絶対変えない．波形処理に問題があったら全てマニュアルで対応する．

恣意的にならないと言い切れるか逆質問したが，波形処理パラメータを変えることに恣意性を感じるとの回答であった．ちなみに，QCが外れて，マニュアルで処理して入れることをどう思うかとお聞きしたら言葉に困っていた．波形処理パラメータを統一して一律に評価する方が恣意性は低い．


7th J

BF

Sym

posi

um D

G20

15-1

3

質問回答関連ポスターサンプル管理はマニュアルでやる会社が多いのか？大手のCROは試料入手からバーコード管理されていると

聞いている．しかし，ヒューマンエラーはゼロにはならない．精査項目の多くは突き詰めるとヒトが要因である．（昨年のDGでも教育の重要性が見えてました）

該当なし

＜コメント＞皮膚など、血漿以外のマトリクスについて、分析法バリデーション試験を実施するにあたって現在のガイドラインにどこまで従うべきなのか、他社へのアンケート調査を期待する。

今後のDGでこの様なトピックで対応するグループがあれば，ぜひ調査を依頼する。

該当なし

13 questions and challenges in bioanalytical study -...

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