GENOMICAGENOMICAGENOMICA

Conoscenza di fenomeni biologiciConoscenzaConoscenza didi fenomenifenomeni biologicibiologici

Prevenzione e cura di malattie(screening del DNA per malattie genetiche, produzione test genetici per diagnosi, etc)

PrevenzionePrevenzione e e curacura didi malattiemalattie(screening del DNA per (screening del DNA per malattiemalattie genetichegenetiche, , produzioneproduzione test test geneticigenetici per per diagnosidiagnosi, etc), etc)

Creazione banche dati del DNACreazioneCreazione banchebanche datidati del DNAdel DNA

= = conoscenzaconoscenza del DNAdel DNA

GENOMICAGENOMICAGENOMICA

AnalisiAnalisi delladella sequenzasequenza didi interiinteri genomigenomi

Genomica comparativa(somiglianze genetiche tra specie)

GenomicaGenomica comparativacomparativa((somiglianzesomiglianze genetichegenetiche tratra specie)specie)

Genomica funzionale(funzione dei geni)

GenomicaGenomica funzionalefunzionale((funzionefunzione deidei genigeni))

Progetto Genoma UmanoProgettoProgetto GenomaGenoma UmanoUmano

LibrerieLibrerie (o (o banchebanche) ) genomichegenomicheLibrerieLibrerie (o (o banchebanche) ) cromosomichecromosomiche

RIDURRE LA COMPLESSITARIDURRE LA COMPLESSITA’’ !!

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

INGEGNERIA GENETICAINGEGNERIA GENETICA

Insieme di tecnologie e strumenti molecolari per lo studio e la manipolazione del DNA finalizzate:

1) a risolvere la sua complessità

2) al suo clonaggio

3) alla sua collezione in “biblioteche” molecolari

STRUMENTI DELLSTRUMENTI DELL’’INGEGNERIA GENETICAINGEGNERIA GENETICA

�� ENZIMI ENZIMI DIDI RESTRIZIONE RESTRIZIONE : consentono di : consentono di tagliare il DNA in punti specificitagliare il DNA in punti specifici, in , in modo da separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettmodo da separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettore prescelto, o ore prescelto, o modificarlo in vitro, in modo conveniente alle proprie necessitmodificarlo in vitro, in modo conveniente alle proprie necessitàà..

�� VETTORIVETTORI: consentono : consentono ll’’ingresso del gene scelto nella cellula ospiteingresso del gene scelto nella cellula ospite, , provvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua espreprovvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua espressione.ssione.

�� ORGANISMI OSPITIORGANISMI OSPITI: batteri, cellule animali e vegetali, lieviti. Sono dotati di : batteri, cellule animali e vegetali, lieviti. Sono dotati di caratteristiche genetiche o biochimiche altamente specifiche checaratteristiche genetiche o biochimiche altamente specifiche che li rendono pili rendono piùù o o meno adatti a determinate applicazioni pratiche o ad ospitare vemeno adatti a determinate applicazioni pratiche o ad ospitare vettori. ttori. Consentono di Consentono di amplificare la sequenza di DNAamplificare la sequenza di DNA clonata nel vettore.clonata nel vettore.

Studiare il GenomaStudiare il Genoma

� Tagliare il DNA in punti specifici (enzimi di restrizioneenzimi di restrizione)

� Localizzare specifiche sequenze di DNA (SouthernSouthern blottingblotting e FISHe FISH)

� Amplificare una sequenza di DNA generando quantità manipolabili (PCR e applicazioniPCR e applicazioni)

� Mutare e/o unire frammenti di DNA per produrre sequenze desiderate (mutagenesi e clonaggio genicomutagenesi e clonaggio genico)

� Trasferire nuove sequenze di DNA in cellule riceventi e selezione di cloni positivi

� Costruzione di “biblioteche” molecolari (genoteche o librarieslibraries)

TAGLIARE IL DNATAGLIARE IL DNATAGLIARE IL DNA

11

22

33

Digestione vettore con lo

stesso enzima di restrizione Ligazione

5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

5’-G 5’-GATCC-3’

3’-CCTAG-5’ G-5’

Sau3ASau3A

OSSERVARE I FRAMMENTI DI DNAOSSERVARE I FRAMMENTI OSSERVARE I FRAMMENTI DIDI DNADNA

L’elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

3- Il DNA si può “osservare” grazie alla presenza nel gel di bromuro di etidio, un intercalante in grado di emettere fluorescenza quando eccitato da raggi UV (emessi da un trans-illuminatore)

1-Il DNA, insieme ad un colorante che permette di seguirne la “corsa”, si carica sul gel di agarosio

2- L’apparato di elettroforesi si collega ad un alimentatore e si applica una corrente elettrica che permette la migrazione del DNA verso il polo positivo (elettrodo rosso in figura)

LL’’elettroforesi su gel consente di elettroforesi su gel consente di separare molecole di DNA di separare molecole di DNA di dimensioni diversedimensioni diverse

AatII

AatII

Pst1

XhoI(2840bp)

0

Frammenti attesi dalla digestione con i

seguenti enzimi di restrizione:

Pst1 2840bp

AatII 900bp e 1940bp

XhoI 2840bp

E da doppie digestioni?

Pst1+XhoI 700bp e 2140bp

AatII+XhoI 500bp, 400bp e 1940bp

Costruzione di una mappa di restrizione in un frammento di DNACostruzione di una mappa di restrizione in un frammento di DNA

ctr E B E/B

0,5

2

2,53

4,55

M

0,5

2

Digestione di molecole di DNA relativamente piccole

Digestione di DNA genomico

Come identificare la banda di interesse?Come identificare la banda di interesse?

LOCALIZZARE I FRAMMENTI DI DNALOCALIZZARE I FRAMMENTI LOCALIZZARE I FRAMMENTI DIDI DNADNA

IbridazioneIbridazione

+

DenaturazioneDenaturazione

Una sondasonda è una sequenza di DNA o RNA (a singolo o doppio filamento), complementare ad un DNA DNA o RNAo RNA di interessedi interesse.L’ibridazione tra la sequenza target e la sonda può essere rivelata attraverso la radioattivitradioattivitàà (sonda marcata con isotopi radioattivi) o la fluorescenzafluorescenza (sonda marcata con un fluoroforo).

Denaturazione (A) e rinaturazione (B) del DNA

La denaturazione a 95-100°C, seguita dal raffreddamento, permette la rinaturazione delle molecole del DNA omologhe

La rinaturazione tra molecole di DNA con totale omologia avviene a temperature più alte (alta specificità) rispetto a quelle con omologia parziale (bassa specificità)

(A) (B)

Una sonda di DNA (omologa o eterologa) può essere:Una sonda di DNA (omologa o eterologa) può essere:

1- un cDNA parziale o full-length

2- un oligonucleotide

3- un amplificato da PCR

4- il DNA del gene

Una sonda di RNAUna sonda di RNA

Identificazione di una sequenza per Identificazione di una sequenza per ibridazione con una sondaibridazione con una sonda

riconoscimento della sequenza d’interesse

SOUTHERN BLOTTINGSOUTHERN BLOTTING:

come identificare un ago (gene)

in un pagliaio (genoma)

SouthernSouthern blottingblotting

Procedura– Isolamento del DNA genomico– Digestione con enzimi di restrizione specifici– Separazione mediante elettroforesi su gel d’agarosio dei frammenti di DNA– Denaturazione del DNA per separare i filamenti complementari– Trasferimento del DNA su membrana per capillarità– Ibridazione con una sonda marcata–Autoradiografia

ProceduraProcedura– Isolamento del DNA genomico– Digestione con enzimi di restrizione specifici– Separazione mediante elettroforesi su gel d’agarosio dei frammenti di DNA– Denaturazione del DNA per separare i filamenti complementari– Trasferimento del DNA su membrana per capillarità– Ibridazione con una sonda marcata–Autoradiografia

(1970- Dr. Edward Southern)

Gel di agarosio colorato con EtBr

Autoradiografia

Il Il SouthernSouthern blottingblotting permette dipermette di::

--determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genicideterminare la presenza o assenza di specifici frammenti genici

-- studiare la struttura e lstudiare la struttura e l’’organizzazione di un geneorganizzazione di un gene

ApplicazioniApplicazioni

� Diagnosi di malattie genetiche ereditarie (es. anemia falciforme, Corea di Huntington, etc) sia prenatale che preclinica

� Medicina forense (determinazione dell’”impronta” genetica)

� Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni

� Analisi filogenetiche

� Mappatura del genoma

Una mutazione associata alla malattia (non necessariamente causale) può causare la perdita o l’acquisizione di un sito di restrizione e quindi modificare il normale pannello di restrizione.

A1

A1

A2

A2

A1

A2

EE’’ il caso del gene della globina il caso del gene della globina ββ mutata nellmutata nell’’anemia falciformeanemia falciforme

La mutazione (causa della malattia) modifica un sito di restrizione

(normale)

(mutata)

Il Southern Blotting permette di fare una diagnosi molecolare

della malattiasondasonda

Quattro individui che presentano una diversa lunghezza dei frammenti di restrizione nel medesimo locus genico, rivelati per SouthernBlotting mediante la sonda indicata in figura.

Il Il SouthernSouthern blottingblotting nello nello studio della variabilitstudio della variabilitàà geneticageneticaRFLP (RFLP (RRestrictionestriction FFragmentragment LLenghtenght PPolymorphismolymorphism))

NorthNorthernern BlottingBlotting �� analisi di RNAanalisi di RNA

WestWestern ern BlottingBlotting �� analisi di proteineanalisi di proteine

EastEasternern BlottingBlotting �� analisi di PTManalisi di PTM

Varianti del Varianti del SouthernSouthern BlottingBlotting::

NorthernNorthern BlottingBlottinguna variante del una variante del SouthernSouthern BlottingBlotting per identificare un trascritto (RNA)per identificare un trascritto (RNA)

Procedura– Isolamento dell’RNA– Elettroforesi dell’RNA su gel di agarosio– Trasferimento dell’RNA su membrana– Ibridazione con una sonda marcata– Autoradiografia

ProceduraProcedura– Isolamento dell’RNA– Elettroforesi dell’RNA su gel di agarosio– Trasferimento dell’RNA su membrana– Ibridazione con una sonda marcata– Autoradiografia

AApplicazionipplicazioni

� Espressione di un trascritto in diversi tessuti

� Come varia l’espressione di un trascritto

� Caratterizzazione di diversi trascritti (es.isoforme di splicing)

Il Il NorthernNorthern blottingblotting permette dipermette di::

--determinare la dimensione e la quantitdeterminare la dimensione e la quantitàà di specifici RNAdi specifici RNA

-- studiare lstudiare l’’espressione genicaespressione genica

Es. Northern Blotting con mRNA estratti da tessuti diversi.

Si ottengono diverse informazioni:1- livello di espressione nei tessuti esaminati2- tipo di mRNA prodotto

Espressione di un trascritto in diversi tessutiEspressione di un trascritto in diversi tessuti

Es. Northern Blotting in una stessa linea cellulare prima e dopo trattamento con un farmaco

Gene housekeeping

Gene di interesse

Controllo di caricamento

trattamento

Come varia lCome varia l’’espressione di un trascrittoespressione di un trascritto

Caratterizzazione di isoforme di Caratterizzazione di isoforme di splicingsplicing

AMPLIFICARE IL DNAAMPLIFICARE IL DNAAMPLIFICARE IL DNA

CGGCATTTGCGTATTCGGCCTAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACTGCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

CGGCATTTGCGTATTCGGCC

TAGCTACTCGTACCCCTGAT

AGGTGTGCATTTAGGGCACT

GCAGGGCCTCGGCAATCCGC

CCCGGTGTGAATAAATCGTA

Clonaggio in vettori e amplificazione in cellule ospitiClonaggio in vettori e amplificazione in cellule ospiti(anche di sequenze non note)(anche di sequenze non note)

Amplificazione di sequenze note mediante la reazione Amplificazione di sequenze note mediante la reazione a catena della DNA polimerasi o PCRa catena della DNA polimerasi o PCR

PCR (PCR (PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction))La reazione a catena della polimerasi

È una metodica che consente di ottenere un numero enorme di copie di una specifica sequenza di DNA partendo da una piccola quantità di templato

Mullis- Nobel 1993

La La TaqTaq polimerasi (da polimerasi (da ThermusThermus aquaticusaquaticus) ) èè una DNA polimerasi resistente alle alte una DNA polimerasi resistente alle alte temperaturetemperature

Cicli di denaturazione � annealing dei primers � allungamento (polimerizzazione)Cicli di Cicli di denaturazionedenaturazione �� annealingannealing dei dei primersprimers �� allungamentoallungamento (polimerizzazione)(polimerizzazione)

Cicli di denaturazione � annealing dei primers � allungamento (polimerizzazione)Cicli di Cicli di denaturazionedenaturazione �� annealingannealing dei dei primersprimers �� allungamentoallungamento (polimerizzazione)(polimerizzazione)

La La TaqTaq polimerasi (da polimerasi (da ThermusThermus aquaticusaquaticus) ) èè una DNA polimerasi resistente alle alte una DNA polimerasi resistente alle alte temperature e per questo utilizzata nella PCRtemperature e per questo utilizzata nella PCR

http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk

http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI

Il SYBR Green I emette fluorescenza solo dopo il legame al DNA � la quantità di fluorescenza èproporzionale alla quantità totale di DNA a doppio filamento presente. La fluorescenza aumenta man mano che il target viene amplificato

RealReal--time PCR o PCR quantitativatime PCR o PCR quantitativa

Vantaggi della PCR:

� Amplificazione di tracce minime di DNA

� Diagnosi molecolare diretta senza l’uso di sonderadioattive

Vantaggi della PCR:Vantaggi della PCR:

� Amplificazione di tracce minime di DNA

� Diagnosi molecolare diretta senza l’uso di sonderadioattive

Applicazioni della PCR:Applicazioni della PCR:

� Diagnosi di malattie genetiche ereditarie sia prenatale che preclinica

� Amplificazione di DNA per clonaggio e sequenziamento

� Medicina forense (determinazione dell’”impronta” genetica)

� Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni

La PCR sequita da digestione con enzimi di restrizione (DdeI) permette di fare una diagnosi molecolare della malattia

DNA amplificato per PCR

DNA amplificato per PCR

Es. dellEs. dell’’anemia falciformeanemia falciforme

RT= retrotrascrizione

PCRPCR

Uso della PCR per rivelare la presenza di un genoma virale in unUso della PCR per rivelare la presenza di un genoma virale in uncampione di sanguecampione di sangue

CLONARE IL DNACLONARE IL DNACLONARE IL DNA

Fasi di un esperimento di Fasi di un esperimento di clonaggioclonaggio::

1) isolamento di un frammento di DNA (frammento di restrizione o frammento di restrizione o amplificato per PCRamplificato per PCR)

2) unione del filamento ad un vettore di clonaggio (tipi di vettoritipi di vettori)

3) introduzione del DNA ricombinante nelle cellule ospiti (trasformazione trasformazione battericabatterica)

4) identificazione delle cellule contenenti le molecole di DNA ricombinante di interesse (selezione dei batteri trasformatiselezione dei batteri trasformati)

5) isolamento del DNA di interesse ed eventuale sequenziamento

Permettono il trasferimento di DNA nella cellula ospite in Permettono il trasferimento di DNA nella cellula ospite in modo da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie.modo da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie.Alcuni rimangono Alcuni rimangono in forma in forma episomaleepisomale, altri si , altri si integranointegrano nel nel genoma dellgenoma dell’’ospiteospite

Vettori di clonaggioVettori di clonaggio

Tipi di vettoreTipi di vettore

Elementi genetici extracromosomici Elementi genetici extracromosomici ((cosmidicosmidi o plasmidi)o plasmidi)

Vettori virali (Vettori virali (fagifagi o virus animali)o virus animali)

Caratteristiche di un vettore idealeCaratteristiche di un vettore ideale

PlasmidiPlasmidi � di piccole dimensioni, facili da isolare e purificare, con capacità di replicazione autonoma, conferita anche da un’origine di replicazione. Es. pBR322pBR322.

FagiFagi � ospitano frammenti di DNA più lunghi rispetto ai plasmidi.es. fago lambdafago lambda con genoma completamente sequenziato e fornito di appropriate mutazioni, in modo da adattarlo alle necessità del clonaggio (vengono eliminati alcuni geni del fago che sono sostituiti dal DNA esogeno).

Ogni tipo di vettore possiede caratteristiche che lo rendono Ogni tipo di vettore possiede caratteristiche che lo rendono adatto al tipo di applicazione di interesseadatto al tipo di applicazione di interesse

Vettore dimensione dell’inserto (kb) Esempi

PlasmidiPlasmidi 0,10,1--15 15 pUC18, pBR322pUC18, pBR322

FagiFagi 88--22 22 λλ

CosmidiCosmidi 3232--45 45 pJB8pJB8

BACBAC 100100--300300 pBAC108LpBAC108L

YACYAC 10001000--2000* 2000* pYAC4pYAC4

Vettori di clonaggioVettori di clonaggio

*2000kb= 2Mbp*2000kb= 2MbpNB: Il cromosoma piNB: Il cromosoma piùù piccolo, il 21, ha circa 46 Mbppiccolo, il 21, ha circa 46 Mbp

Sito di

taglio

Clonaggio di DNA in un vettore Clonaggio di DNA in un vettore plasmidicoplasmidico

La trasformazione e La trasformazione e ll’’uso di marcatori uso di marcatori selezionabiliselezionabili

Trasformazionebatterica

TrasformazioneTrasformazionebattericabatterica

Amp+

I batteri trasformati sono

piastrati su terreno selettivo (+ampicillina)

I batteri I batteri trasformati sono trasformati sono

piastratipiastrati su su terreno selettivo terreno selettivo ((+ampicillina+ampicillina))

NBNB

Colonie resistenti

all’ampicillina

Colonie Colonie resistenti resistenti

allall’’ampicillinaampicillina

Uso di Uso di lacZlacZ come come marcatore di clonaggiomarcatore di clonaggio

Vettori derivati Vettori derivati da batteriofagida batteriofagi

Es. il fago Es. il fago λλλλλλλλ

Selezione e amplificazione: infezione battericaSelezione e amplificazione: infezione batterica

placche placche fagichefagiche

Ciclo litico

Vettori Vettori cosmidicicosmidici

Caratteristiche: Caratteristiche:

� ospitano fino a circa 45 kb di DNA

� origine replicazione plasmidica

� uno o più siti di restrizione unici

� uno o più marcatori selezionabili

� uno o più siti cos*

*coscos = estremità coesive del batteriofago; permettono l'impacchettamento del DNA nel

virione.

CosmidiCosmidi

Un cosmide è un plasmide, di circa 5 Kpb, contenente un sito cos di λ . Come tutti i vettori plasmidicicontiene: �una oriori�un marcatore di resistenza marcatore di resistenza �un sito unico di restrizionesito unico di restrizione per l’inserimento del DNA

Il cosmide ricombinante, per essere un buon substrato per la reazione di packaging deve avere dimensione tra 37-51 Kb.

Considerando la dimensione media di un vettore cosmidico, la dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide varia tra 32 e 45Kb, che rappresenta più di quanto è possibile clonare nei vettori lambda (8-22Kb)

Ciclo lisogenico

Si clona come un plasmide e sipropaga come un fago λ

Un’estensione logica nella produzione di vettori per il clonaggio di grossi frammenti di DNA è quella di ricostruire un cromosoma a replicazione autonoma nel quale possono essere inseriti frammenti di DNA esogeno.

I cromosomi naturali eucariotici per la loro stabilità e funzionalità hanno le seguenti strutture:

- TelomeriTelomeri (DNA e proteine all’estremità dei cromosomi, che hanno una funzione protettiva)

- CentromeriCentromeri (segmenti di DNA altamente ripetuti che sono essenziali per il controllo e la segregazione cromosomica)

Cromosomi artificialiCromosomi artificiali

Cromosomi artificiali batterici (BAC):Cromosomi artificiali batterici (BAC):

� 100-300 kb di DNA

Cromosomi artificiali di lievito (YAC):Cromosomi artificiali di lievito (YAC):

� ospitano fino a 600-2000 kb di DNA� origine di replicazione di lievito� 2 telomeri (stabilità)� 1 centromero

I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono vettori che derivano dal fattoresessuale F

Cromosomi artificiali batterici: BACCromosomi artificiali batterici: BAC

I vettori BAC contengono:I vettori BAC contengono:

- siti cos cos del fago λ

- marcatori di selezionemarcatori di selezione (CAMR=resistenza al cloramfenicolo)

- oriSoriS e repErepE per la replicazione del fattore F

- polylinkerpolylinker per il clonaggio di inserti

Cromosomi artificiali di Cromosomi artificiali di lievito:YAClievito:YAC

I vettori YAC contengono:I vettori YAC contengono:

- un centromeroun centromero (CEN4)- una sequenza a replicazione sequenza a replicazione autonomaautonoma (ARS1) che permette la replicazione autonoma rispetto alle origini di replicazione cromosomiche- telomeritelomeri (TEL) necessari per la replicazione e il mantenimento dei cromosomi- marcatori di selezionemarcatori di selezione in lievito (ura3 e trp1) - origine di replicazioneorigine di replicazione (oriC) e un marcatore selettivo battericomarcatore selettivo batterico, per la propagazione in E. coli prima del clonaggio.

Trasformazione di cellule di lievito

e selezione in terreno minimo (ura- e trp-)

la trascrizione del

Vettori di espressioneVettori di espressione

Il gene esogeno può essere trascritto e tradotto.

Es. vettore di espressione

Promotore

Con il clonaggio del DNA Con il clonaggio del DNA si possono isolare i genisi possono isolare i geni

Genoteca genomica

A cosa serve clonare il A cosa serve clonare il DNA?DNA?