163 malaria

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA

Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003


Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003

MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. lvaro Vidal Rivadeneyra Viceministro Econ. Carlos Rodrguez Cervantes

Subcomit Editor

Presidente Dra. Ada Palacios Ramrez

Secretario tcnico Dr. Csar Cabezas Snchez INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga Subjefe Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez Centro Nacional de Salud Pblica Dra. Susana Zurita Macalup Directora General Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Dr. Napolen Chvez Villanueva Director General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora General Centro Nacional de Productos Biolgicos Q.F. Ricardo Valera Snchez Director General

Miembros Q.F. Zulema Arvalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodrguez Dr. Zuo Burstein Alva Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Csar Nquira Velarde Q.F Rosa Mendoza Yanavilca Dra. Frine Samalvides Cuba Dr. Vctor Surez Moreno

Editor Dr. Leonid Lecca Garca

Asistente Editorial Lic. Daniel Crdenas Rojas

Centro Nacional de Salud Intercultural Dr. Carlos del guila Campos Director General

Secretaria Srta. Roco Sols Agurto

Centro Nacional de Salud Ocupacional y Proteccin del Ambiente Para la Salud Dr. Enrique P. Swayne Daz Director General

Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica Volumen 19 Nmero 4 octubre diciembre 2002 La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica es una publicacin trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la divulgacin de trabajos tericos o aportes prcticos desarrollados por tcnicos y cientficos, promueve el avance y la aplicacin de la investigacin y experiencia cientfica en salud Los artculos firmados no expresan necesariamente la opinin de la revista, siendo los autores responsables de los criterios por ellos emitidos. Todos lo derechos quedan reservados por el Instituto Nacional de Salud. Cualquier publicacin, difusin y/o distribucin de la informacin presentada queda autorizada siempre que se cite la fuente de origen. Copyright octubre diciembre 2002 INS-PER Cartula: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud 1726-4634 Versin impresa Direccin: Instituto Nacional de Salud Cpac Yupanqui 1400. Lima 11, Per. Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162 E-mail: [email protected] Pgina web: www.ins.gob.pe Editor: Dr. Leonid Lecca Garca E-mail: [email protected] Depsito Legal 2000-2856

ARTES & DISEOS LASER S.R.LTDA. Calle Las Turquesas 263-265-269 - Balconcillo - Lima 13 Telfono: 265-8320 Telefax: 266-0075 e-mail: [email protected]

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Instituto Nacional de Salud

Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnstico de Malaria


ELABORACIN: Blga. Sonia C. Gutierrez Gonzles Blga. Nancy Arrspide Velasco Laboratorio de Malaria Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Lima - Per

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I



CONSULTORES: Dr. Wilmer Marquio Quesada Laboratorio de Malaria Instituto Nacional de Salud Dr. Trenton K. Ruebush II Centro de Control de Enfermedades Infecciosas: CDC - Atlanta-USA

AGRADECIMIENTO: Lic. T.M. Maritza N. Puray Chvez Tc. Lab. Luz Mendizbal Alvarez Laboratorio de Malaria Instituto Nacional de Salud DEDICATORIA: A la memoria de nuestra compaera de trabajo T.M. Blanca Pardav Lugo.

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INSGutierrez Gonzles, Sonia C. y Arrspide Velasco, Nancy Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de malaria / Elaborado por Sonia C. Gutierrez Gonzles y Nancy Arrspide Velasco. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2003. 100 p. : 30 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 39)

1. MALARIA /diagnstico 2. MALARIA /inmunologa 3. MALARIA /parasitologa 4. PLASMODIUM FALCIPARUM /aislamiento y purificacin 5. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO I. Gutierrez Gonzles, Sonia C. II. Arrspide Velasco, Nancy III. Instituto Nacional de Salud (Per) IV. Per. Ministerio de Salud

ISBN 9972 857 26 3 (O.C.) ISBN 9972 857 37 9 (N39) ISSN 1607 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501152003-4204 Ministerio de Salud, 2003 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2003 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: [email protected] Pgina Web: www.ins.gob.pe Publicacin aprobada con R.J. No 461-2003-J-OPD/INS Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

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II


INTRODUCCIN

CONTENIDO


VII

Malaria

Ciclo biolgico del Plasmodium Sntomas de la enfermedad Diagnstico de la enfermedad Diagnstico clnico Diagnstico de laboratorio

SECCIN 1: 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6

GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas Condiciones generales para la obtencin y manejo de muestras

SECCIN 2: 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6

BIOSEGURIDAD Medidas de bioseguridad Medidas de proteccin Descontaminacin Limpieza Desinfeccin Esterilizacin

SECCIN 3: 3.1 3.2 3.3

OBTENCIN DE MUESTRA HEMTICA Limpieza y almacenaje de lminas portaobjeto Registro Procedimiento para la obtencin de Ia muestra

SECCIN 4: 4.1 4.2 4.3 4.4

DESCRIPCIN DE GOTA GRUESA Y FROTIS Gota gruesa Frotis Secado de las muestras hemticas Errores comunes en la preparacin de muestras hemticas

SECCIN 5:

COLORACIN DE LA MUESTRA HEMTICA PARA EL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA Uso del colorante giemsa Recomendaciones para una buena coloracin Coloracin de las muestras

5.1 5.2 5.3

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III


15 15 15 16 12 12 12 13 13 9 9 9 9 4 4 4 4 4 4 5 1 1 2 2 3 1 7 7 7 8 8 8 8


8.2.

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IV


SECCIN 11: 11.1 11.2 11.3 11.4

DIAGNSTICO INMUNOLGICO DE MALARIA Generalidades Tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Pruebas rpidas para diagnstico de malaria Kits existentes en el mercado para su aplicabilidad

10.6 10.7 10.8

SECCIN 10: 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5

CULTIVO in vitro DE Plasmodium falciparum Equipos Reactivos Materiales Preparacin de medios y otros Procedimiento para el aislamiento de parsitos en pacientes infectados por Plasmodium falciparum Cambio del medio de cultivo Criopreservacin o congelamiento de los parsitos Determinacin del porcentaje de parasitemia en frotis sanguneo

SECCIN 9: 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7

CONTROL DE CALIDAD EN EL DIAGNSTICO DE MALARIA Actividades del laboratorio de referencia nacional Actividades del laboratorio de referencia regional Actividades del nivel local e intermedio Recomendaciones generales para el envo de lminas e informe de resultados Criterios de evaluacin de la calidad tcnica de la lmina de gota gruesa Supervisin directa a los laboratorios Tipos de supervisin

SECCIN 8: 8.1

RESISTENCIA FARMACOLGICA Evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los medicamentos antimalricos mediante el seguimiento in vivo Evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los medicamentos antimalricos en un sistema in vitro mediante la prueba de la microplaca

SECCIN 7: 7.1 7.2 7.3

DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA Consideraciones generales Mtodos de determinacin de la densidad parasitaria Reporte de la densidad parasitaria en caso de malaria por P. falciparum

SECCIN 6: 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6

OBSERVACIN MICROSCPICA DE MALARIA Recomendaciones Reconocimiento de los plasmodia Aspectos del parsito de malaria en sus diferentes estadios Morfologa de las especies de Plasmodium en el frotis de sangre Apariencia de los parsitos en gota gruesa y frotis Examen de rutina de la gota gruesa y frotis

19 19 19 19 20 21 21 30 30 30 32 33 33 37 42 42 42 43 44 44 46 47 48 48 48 48 49 50 51 51 53 54 54 54 59 62


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V


Limpieza y almacenamiento de lminas portaobjeto Formato: Solicitud de gota gruesa Precoloracin de la gota gruesa Preparacin de colorantes y soluciones Evaluacin de excresin urinaria de cloroquina y sulfamidas Formatos de control de calidad Preparacin de antgenos Titulacin de conjugado

ANEXOS Anexo A Anexo B Anexo C Anexo D Anexo E Anexo F Anexo G Anexo H

74 75 75 76 78 81 83 98 100

BIBLIOGRAFA

71


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VI



INTRODUCCIN

La malaria es una enfermedad parasitaria y transmisible que por siglos ha representado una amenaza para la salud del hombre y la economa de los pases endmicos. La Organizacin Mundial de la Salud estima que anualmente ocurren ms de 300 millones de infecciones de malaria y que, 1,5 a 2,5 millones de personas fallecen como consecuencia de esta enfermedad. Esto supone una amenaza para 200 millones de personas, dado que deteriora la salud y bienestar de la poblacin econmicamente activa, mermando los escasos recursos de muchos pases en vas de desarrollo. En nuestro pas, la poblacin residente en riesgo de enfermar es de aproximadamente 19 millones de habitantes, con un patrn de comportamiento temporal y estacional asociado geogrfica y ecolgicamente a zonas tropicales y desrticas irrigadas de la costa norte, selva montaosa, selva central y suroriental y la Cuenca Amaznica oriental del pas. El comportamiento y tendencia de la enfermedad malrica tiene un patrn en las reas fronterizas y en el nororiente del Per, con diseminacin a valles interandinos. Esta poblacin en riesgo ha sido clasificada en reas definidas de alto, mediano y bajo riesgo de transmisin, presentando el mayor nmero de casos los departamentos de Loreto, Piura, Tumbes, San Martn, Junn y Madre de Dios. El presente manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico y control de calidad de malaria tiene como propsito contribuir a que el personal profesional de los Laboratorios de la Red Nacional en Salud Pblica, cuente con procedimientos estandarizados para el diagnstico de malaria y su respectivo control de calidad. Incluye fundamentos, procedimientos y anlisis de los resultados obtenidos, todos ellos factibles de realizar en los diferentes niveles intermedios de la red. En el futuro estos mtodos pueden ser mejorados o reemplazados por otros de mayor sensibilidad y especificidad.

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VII



MALARIA CICLO BIOLGICO DEL Plasmodium

El agente etiolgico de la malaria es un protozoario del gnero Plasmodium y es transmitido por un vector (mosquito) del gnero Anopheles. Existen cuatro especies de Plasmodium capaces de infectar al hombre: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale; en el Per se han descrito las tres primeras. El ciclo biolgico del Plasmodium comprende tres fases (Figura No1): CICLO SEXUAL O ESPOROGNICO: la transmisin natural de la enfermedad se produce cuando un mosquito hembra del gnero Anopheles pica a un husped infectado de malaria (ser humano), adquiere los gametocitos del Plasmodium (macho y hembra), los que ingresan al tubo digestivo del mosquito y luego de la fecundacin se reproducen en la pared de ste hasta adquirir la forma infectante denominada esporozoito, los cuales miden de 12 a 15 m aproximadamente. Estos esporozoitos son fusiformes, poseen un ncleo alargado y estn desprovistos de pigmento malrico. Los esporozoitos pasan por todas partes del mosquito y algunos llegan a las glndulas salivales, para ser transmitidos a otro husped sano, en el momento de la picadura. La forma infectante del Plasmodium (esporozoito) ingresa a la va sangunea del husped, en donde permanecen aproximadamente media hora antes de penetrar clulas hepticas. Esta fase dura de 14 a 20 das, dependiendo de factores ambientales. CICLO EXOERITROCTICO: Esta fase se inicia en los hepatocitos, donde los esporozoitos se reproducen en grandes cantidades hasta asumir la forma capaz de invadir los glbulos rojos. En un segundo da de esta fase, en el interior de los hepatocitos se encuentran esquizontes tisulares que aumentan de volumen y se dividen para formar millares de minsculos merozoitos. Esta fase tiene una duracin promedio de 12 das. CICLO ERITROCTICO: Ocurre cuando los merozoitos se liberan del hgado, pasan en grandes cantidades a la sangre e invaden los glbulos rojos produciendo su destruccin. Ello ocurre en 48 horas en P. vivax, P. falciparum y P. ovale, y 72 horas en P. malariae. Esto quiere decir que cada 48 72 horas se reinicia un nuevo ciclo eritroctico (trofozoito - esquizonte - trofozoito). SNTOMAS DE LA ENFERMEDAD El perodo de incubacin es el tiempo que transcurre desde la picadura del mosquito infectante hasta la aparicin de los sntomas de la enfermedad. En el caso de la malaria dura de 10 a 28 das segn la especie de Plasmodium. Luego de este perodo, los sntomas se presentan bruscamente con escalofros intensos, fiebre y sudoracin profusa; estos se presentan como accesos intermitentes cada 48 72 horas que corresponden a la ruptura de los esquizontes, aunque tambin se pueden presentar todos los das sin intermitencia. En el caso de P. falciparum los sntomas no son tan caractersticos durante los primeros das, pudiendo confundirse con una infeccin viral con febrcula, escalofros, dolor de huesos y dolor de cabeza.

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Figura No 1. Ciclo biolgico del Plasmodium

DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD El diagnstico de la malaria se realiza considerando las manifestaciones clnicas y la confirmacin laboratorial de la gota gruesa u otra prueba de laboratorio que demuestre la presencia del parsito. Diagnstico clnico Las formas clnicas de la malaria se pueden dividir en: Leve: Frecuente en individuos parcialmente inmunes, quienes ya han tenido ataques de malaria, o en personas con buena respuesta inmediata del sistema inmune. En estos pacientes la fiebre no es muy alta y los sntomas, si los hay, son discretos. La parasitemia es baja, generalmente por debajo de 0,1% de glbulos rojos infectados. Moderada: Es tpica en individuos no inmunes, quienes presentan el caracterstico paroxismo febril con perodos de fro, calor y sudor, la temperatura es alta, con aumentos en la crisis. Los sntomas generales son ms intensos, con fuerte cefalea; adems, presentan anemia moderada y una parasitemia que varia de 0,1% a 0,5%.

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Grave y de urgencia: Casi siempre se observan en las infecciones producidas por P. falciparum. Este tipo de malaria se presenta en individuos no inmunes, mujeres embarazadas y nios. El paciente mantiene una fiebre persistente, la cefalea es fuerte, el vmito es frecuente y puede presentarse delirio. Adems, la anemia es intensa y pueden estar parasitados 2% a ms de los eritrocitos. Diagnstico de laboratorio Diagnstico parasitolgico Consiste en el examen microscpico de la muestra de sangre para demostrar la presencia del parsito para lo cual se usa la tcnica de coloracin de giemsa, con la cual podemos observar la gota gruesa y el frotis. Gota gruesa: Es una tcnica de rutina y consiste en una muestra de una gota de sangre conformada por numerosas capas en su mayora de glbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la coloracin con giemsa. Esta concentracin de glbulos rojos facilita la deteccin de los parsitos que pudieran estar presentes en su interior en densidades bajas. Frotis: Es una capa delgada, nica de clulas sanguneas, fijadas con metanol y coloreadas con giemsa, que facilitan la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos presentes en los glbulos rojos. El examen en ambos casos (gota gruesa y frotis) se realiza con aumento de 1000x con aceite de inmersin. Diagnstico inmunolgico Abarca mtodos inmunoserolgicos que evalan la inmunidad humoral y celular del husped. La metodologa es suficientemente sensible y especfica para detectar las infecciones cuando la parasitemia es baja, adems de ayudar a diferenciar infecciones pasadas de la actual. Entre las tcnicas que se encuentran para el inmunodiagnstico de malaria tenemos: inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, pruebas inmunocromatogrficas (Dipstick), hemaglutinacin, radioinmunoensayo, etc. La prueba de ELISA no es de mucha utilidad en el diagnstico clnico de un paciente, su mayor aplicacin es en estudios epidemiolgicos. El Instituto Nacional de Salud (Lima-Per) tiene estandarizada la tcnica IFI y tcnicas inmunocromatogrficas.

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SECCIN I GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico de malaria. 1.2 CAMPO DE APLICACIN Se aplica en los laboratorios regionales referenciales y de establecimientos de salud del Sistema de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica. 1.3 1.3.1 RESPONSABILIDADES El Centro Nacional de Salud Pblica es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud. Los directores de los establecimientos de salud son responsables de autorizar y proporcionar los recursos necesarios para designar al personal que aplicar las disposiciones contenidas en el presente manual. Los jefes o responsable de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicados. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I). 2a ed. Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas No 15. Instituto Nacional de Salud. Normas de bioseguridad. 2a ed. Lima: INS; 2002. Serie de Normas Tcnicas No 18. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS anopheles: gnero de dpteros culcideo que comprende mosquitos caracterizados por poseer palpos largos y finos, casi tan largos como la trompa. Algunas especies transmiten el Plasmodium, agente de la malaria. anticuerpo: protenas pertenecientes al grupo de las gammaglobulinas o inmunoglobulinas, constituidas por la asociacin de cuatro cadenas polipeptdicas unidas entre s mediante puentes disulfuro, dos cadenas se denominan pesadas y las otras dos ligeras. A su vez, cada una de las cadenas ligeras y pesadas, incluye una regin variable (cuya secuencia de aminocidos es peculiar de cada anticuerpo) y una regin constante (con la misma secuencia en todos los anticuerpos). antgeno: generador de lo contrario. Sustancia que da lugar a reacciones inmunitarias como los anticuerpos.4 Instituto Nacional de Salud

1.3.2

1.3.3 1.3.4 1.4 1.4.1 1.4.2 1.5 1.5.1

1.5.2

1.5.3

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1.5.4

bioseguridad: conjunto de medidas preventivas para proteger la salud, seguridad humana y del medio ambiente frente a los diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnicos. desinfeccin: proceso que busca eliminar la mayora de microorganismos que causan enfermedades como hongos, virus, bacterias, etc. desinfectante: agente qumico utilizado para el proceso de desinfeccin. incubacin: mantenimiento de microorganismos en condiciones favorables para su crecimiento y reproduccin. infeccin: invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped, pudiendo progresar hacia una enfermedad. limpieza: remocin de toda materia extraa con la finalidad de disminuir el nmero de microorganismos, pero sin asegurar la eliminacin de ellos. malaria: paludismo. paludismo: enfermedad infecciosa, febril, producida por protozoarios del gnero Plasmodium, que es transmitida por la picadura de mosquitos infectados del gnero Anopheles. La enfermedad se caracteriza por ataques de escalofros, fiebre y sudoracin. plasmodia: plural de Plasmodium. plasmodium: gnero de protozoarios plsmidos que comprende numerosas especies de parsitos de los glbulos rojos del hombre y de diversos vertebrados. Tienen un alto grado de especializacin parasitaria y su ciclo evolutivo es muy complejo. Son los agentes etiolgicos del paludismo. parsito: todo organismo que vive a expensas de otro, causndole dao. registro: documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos. sincronizacin: procedimiento por el cual es posible obtener un solo estadio de Plasmodium falciparum luego de haberlo cultivado in vitro. CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS Elegir el lugar correcto a partir del cual se obtendr la muestra empleando la tcnica apropiada. Esta debe obtenerse del pulpejo del dedo de la mano, de preferencia los dedos medio o anular por ser los menos usados. Obtener una muestra adecuada para asegurar la calidad tcnica. La muestra debe ser obtenida de preferencia antes de que el paciente haya recibido tratamiento antimalrico.

1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10 1.5.11

1.5.12 1.5.13

1.5.14 1.5.15 1.5.16 1.6 1.6.1

1.6.2 1.6.3

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1.6.4 1.6.5 16.6

Enviar las muestras de gota gruesa al establecimiento de salud ms cercano para obtener el diagnstico. Si fuera una muestra de suero mantenerla a 4oC si se procesar inmediatamente, o a -20oC si el proceso se va a ejecutar despus de un tiempo. En el caso de sangre para cultivo, stas se enviarn inmediatamente dentro de las 24 horas y a temperatura de refrigeracin ( 2oC - 8oC). En caso contrario, se debe criopreservar y guardar a -70oC o nitrgeno lquido. Las muestras deben ser colocadas para su envo en un recipiente apropiado para su transporte al laboratorio con la finalidad de evitar cualquier derrame o rotura .

1.6.7

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SECCIN II BIOSEGURIDAD 2.1 2.1.1 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Trabajar en un laboratorio aumenta el riesgo de enfermar por la exposicin a los agentes biolgicos, sea a travs de accidentes con agujas o materiales cortopunzantes contaminados, aerosoles, manejo de material contaminado o por falta de vacunacin. El personal involucrado en los diferentes procesos para el diagnstico de malaria debe aplicar las medidas de bioseguridad establecidas en las Normas de Bioseguridad (Serie Normas Tcnicas No 18). Se deben controlar las medias necesarias aplicables a: El personal. La vestimenta. Los ambientes. La obtencin de muestras. El envo de muestras al laboratorio. Los casos de accidentes. El laboratorio. MEDIDAS DE PROTECCIN Lavarse las manos cada vez que sea necesario. Los objetos afilados y punzantes deben manejarse con sumo cuidado. Desinfectar, esterilizar o descartar adecuadamente los instrumentos despus de usarlos. Usar guantes cada vez que maneje sangre o productos de sangre as como mascarilla, bata de proteccin, anteojos de proteccin, segn los requerimientos de cada procedimiento. Cubrir cualquier corte o abrasin de las manos con adhesivos. Cuidar de punzarse con cualquier instrumento agudo que haya estado en contacto con sangre. Nunca utilizar lancetas o agujas ms de una vez. Cualquier material contaminado con sangre, deber ser colocado en un envase con cloro o hipoclorito de sodio al 1%, y luego para mayor seguridad disponer su entierro o incineracin.7 Instituto Nacional de Salud

2.1.2 2.1.3 2.1.3.1 2.1.3.2 2.1.3.3 2.1.3.4 2.1.3.5 2.1.3.6 2.1.3.7 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 . 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.9 2.2.10

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2.3

DESCONTAMINACIN La descontaminacin es un pretratamiento necesario para la proteccin cuando se manipular materiales potencialmente infectados. Se pueden emplear soluciones de hipoclorito de sodio al 0,5%, fenol al 5%, perxido de hidrgeno al 6%, glutaraldehdo, formaldehdo, etc.

2.4

LIMPIEZA Consiste en la eliminacin fsica de sangre, fluidos corporales o cualquier material extrao visible, que pueda encontrarse en la piel o en los objetos inanimados.

2.5

DESINFECCIN Desinfeccin de alto nivel. Significa eliminar la mayora de microorganismos que causan enfermedades como hongos, virus, bacterias, etc. Esta puede obtenerse por ebullicin y por agentes qumicos.

2.6

ESTERILIZACIN Permite eliminar completamente de los objetos todo microorganismo (bacterias, virus, hongos, parsitos, etc., incluido endosporas bacterianas). Es el mtodo ms seguro para procesar los instrumentos que entran en contacto con material contaminado. La esterilizacin puede lograrse por medios fsicos o qumicos (Tabla No 1).Tabla No 1. Tipos de esterilizacin

MTODOS FSICOS QUMICOS

MEDIO CALOR HMEDO CALOR SECO LQUIDO GAS

TIPOS AUTOCLAVE HORNO GLUTARALDEHDO AL 2% CIDO PARACTICO XIDO DE ETILENO FORMALDEHIDO PEROXIDO DE HIDRGENO

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SECCIN III OBTENCIN DE MUESTRA HEMTICA 3.1 3.1.1 LIMPIEZA Y ALMACENAJE DE LMINAS PORTAOBJETO Las lminas portaobjeto para uso de toma de muestra hemtica en gota gruesa debern ser procesadas antes de su uso, (lavadas, secadas y almacenadas correctamente). Las lminas nuevas son lavadas con detergente neutro y agua limpia. Despus de estar remojadas en agua con detergente por 30 minutos a 1 hora, enjuagar con agua continua o cambiada varias veces. Cada lmina deber ser pulida individualmente con esponja para luego secarlas con un trozo de tela de algodn. Las lminas ms limpias debern cogerse slo por los bordes para evitar dejar grasa sobre su superficie. Es preferible descartar lminas portaobjeto cuando: - Tengan coloracin iridiscente u opaca. - Presenten rajaduras o superficies irregulares. - No estn limpias. Las lminas portaobjetos limpias podrn ser envueltas en papel delgado (papel copia) en grupos de 10. Los paquetes as seleccionados para uso de toma de muestra sern almacenados en cajas de cartn y en lugares secos (evitando polvo y humedad) para uso posterior, y separando simultneamente las de uso diario. Es necesario tomar medidas de proteccin cuando se manipula sangre para evitar la contaminacin con agentes de transmisin sangunea (hepatitis viral B, C, G, VIH, etc.) cuya manipulacin representa un riesgo potencial. El riesgo es que la sangre de un paciente infectado con una de estas enfermedades, puede contaminar accidentalmente a otro paciente o trabajador. Sin embargo, el riesgo de infeccin de estas enfermedades se reduce tomando en cuenta las medidas de bioseguridad. 3.2 3.2.1 REGISTRO Para asegurar la fcil localizacin de los pacientes es importante Ilenar la informacin requerida en una ficha de toma de muestra diseadas por el Ministerio de Salud (MINSA) (Anexo B). No olvidar que equivocarse en el Ilenado correcto de estos formatos de registro, puede ser lo mismo que equivocarse en la lectura de la gota gruesa. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE LA MUESTRA En malaria, la muestra de sangre perifrica se obtiene para preparar dos clases de pelculas, una gruesa y una delgada (gota gruesa y frotis, respectivamente), para su examen por microscopa directa. La gota gruesa est conformada por numerosas capas de clulas sanguneas, en su mayora glbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la coloracin con giemsa. Esta concentracin de glbulos rojos facilita la deteccin de los parsitos que pudieran estar presentes en el interior de alguno de ellos cuando la densidad es baja (Figura No 2).9 Instituto Nacional de Salud

3.1.2

3.1.3

3.3 3.3.1

3.3.2

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3.3.3

El frotis consiste en una capa delgada, nica de clulas sanguneas. Esto facilita la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos presentes en los glbulos rojos, sobre todo para la identificacin de la especie del parsito, cuando este no ha podido ser identificado por gota gruesa. Adems, el frotis debe ser utilizado siempre para rotular e identificar al paciente.

Figura No 2. Materiales necesarios para diagnstico de gota gruesa.

3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.4.3 3.3.4.4

Despus que los datos del paciente han sido registrados en forma apropiada, las muestras de sangre se procesan de la siguiente manera: Sostener la mano izquierda del paciente, con la palma hacia abajo seleccionar el tercer dedo a partir del pulgar o el dedo ndice (EI dedo gordo del pie puede ser utilizado en nios). Limpiar el dedo con una pieza o torunda de algodn ligeramente humedecido en alcohol, utilizando golpes firmes para retirar suciedad y grasa de la yema del dedo. Secar el dedo con un algodn limpio y seco, utilizando golpes firmes para estimular la circulacin de la sangre. Sostener el dedo del paciente con la mano izquierda, tomndolo por sus lados y manteniendo una suave presin sobre ellos para favorecer la salida de sangre (Figura No 3).

Figura No 3. Presionar el dedo antes de la puncin.

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3.3.4.5

Punzar el borde de la yema del dedo con una lanceta estril y un movimiento rpido, presionar suavemente el dedo para extraer la primera gota de sangre y limpiar con una torunda de algodn seco. Asegrese que ninguna hilacha de algodn, que pueda mezclarse posteriormente con la sangre, permanezca en el dedo (Figuras No 4 y No 5).

Figura No4. Puncin digital.

Figura No 5. Limpiar con algodn la primera gota de sangre.

3.3.4.6 a.

Trabajando rpidamente y manipulando lminas completamente limpias, colectar la sangre de la siguiente forma: Aplique suave presin al dedo para extraer una gota de sangre y colocarla inmediatamente en contacto con el primer tercio externo de la superficie de la lmina. El tamao de esta gota se aproxima al tamao de una cabeza de fsforo. Presionar nuevamente el dedo y colectar una segunda gota de sangre ms pequea que la primera, en el centro de la lmina, para realizar el frotis. Limpiar la sangre restante del dedo con una torunda de algodn humedecido en alcohol e indicar al paciente que presione esta torunda contra el lugar de la puncin por 5 minutos.

b. c.

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SECCIN IV DESCRIPCIN DE GOTA GRUESA Y FROTIS 4.1 GOTA GRUESA Una vez obtenida la muestra, realizar la gota gruesa de la siguiente manera: utilizando uno de los ngulos de una segunda lmina (lmina auxiliar) esparcir rpidamente la gota de sangre y extenderla uniformemente hasta formar una gota gruesa de 1 cm de lado o de dimetro. La sangre no debe ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el homogeneizado de la muestra en una sola direccin, en forma concntrica (de adentro hacia fuera o viceversa). 4.2 4.2.1 FROTIS Utilizando la misma lmina auxiliar, ponerla en contacto con la superficie de la lmina que contiene la gota central y hacerla correr firmemente a lo largo de su borde en un ngulo de 45. Asegrese de que ocurra un contacto parejo con la superficie de la lmina todo el tiempo que la sangre est siendo esparcida, de tal manera que el frotis sea homogneo y fino. Siempre manipular las lminas por los bordes o por una esquina para realizar el frotis, como se muestra en la Figura No 6:

Figura No 6. Ejecucin del frotis en ngulo de 45C.

4.2.2

Luego de haber secado el frotis, rotular con lpiz de carbn suave, escribiendo en la parte ms gruesa el cdigo, nmero y fecha de la muestra. No utilizar bolgrafo para etiquetar la lmina. Dejar secar la lmina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e insectos.

Figura No 7. Rotular las muestras con lpiz.

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4.2.3

Si no existiera centro de diagnstico, envuelva la lmina seca en el formato de registro del paciente y enviar al Laboratorio de Referencia tan pronto como sea posible. La segunda lmina utilizada para esparcir la sangre puede ahora ser utilizado para el siguiente paciente y una segunda lmina limpia del paquete ser usado como lmina extensora. El frotis se usa como herramienta auxiliar para discriminar entre las diferentes especies. SECADO DE LAS MUESTRAS HEMTICAS Las lminas con las muestras de sangre deben permanecer horizontalmente, lo que va a permitir que la gota gruesa est en un mismo nivel y seque uniformemente. Proteger las muestras con la ayuda de pequeos mosquiteros para alejarlas de dpteros y otros insectos, as como del polvo. En climas hmedos y clidos, la autofijacin de las muestras ocurre muy rpidamente, por lo tanto deben ser coloreadas cuanto antes, a ms tardar en un plazo no mayor de tres das luego de su coleccin. Cuando un largo almacenamiento es inevitable, deben ser precoloreadas dentro de las siguientes 24 horas por el mtodo de Walker (Anexo C) para evitar la fijacin y contaminacin por hongos. ERRORES COMUNES EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS HEMTICAS La preparacin incorrecta de la muestra hemtica puede afectar el etiquetado, la coloracin o el examen y, a veces, ms de uno de estos. Las fallas ms comunes que deben evitar cometerse son:

4.2.4

4.2.5 4.3 4.3.1

4.3.2

4.3.3

4.3.4

4.4

4.4.1

Mala posicin de las muestras de sangre Las pelculas de sangre debern estar situadas correctamente en la lmina. Si no es as, puede dificultar el examen de gota gruesa; incluso porciones de la muestra pueden ser lavadas durante el proceso de coloracin.

4.4.2

Mucha sangre Si se obtiene demasiada sangre al colectar la gota gruesa, entonces la coloracin puede quedar muy bsica (azul), significando que se observarn muchas clulas blancas por campo pudiendo estas oscurecer o cubrir algunos parsitos de malaria que pueden estar presentes. Si el extendido es demasiado grueso, los glbulos rojos pueden estar unos encima de otros imposibilitando el examen adecuado despus de la fijacin.

4.4.3

Poca sangre Si se emplea poca sangre en la preparacin de las muestras, no habrn suficientes clulas blancas por campo y no se examinar suficiente cantidad de sangre como lo establece la norma.

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4.4.4

Lmina con grasa En una lmina sin desengrasar, la sangre se esparcir irregularmente, lo que har difcil el examen; por otro lado, parte de la gota gruesa en algunos casos puede desprenderse durante el proceso de coloracin.

4.4.5

Si el borde de la lmina extensora es irregular Cuando el borde de la lmina empleada como extensora est astillada, el frotis es esparcido irregularmente, afectndose la calidad del frotis.

4.4.6

El frotis demasiado grande y la gota gruesa mal ubicada Si el frotis es demasiado grande, la gota gruesa estar fuera de lugar, cerca al borde de la lmina, entonces no podr ser visto fcilmente a travs del microscopio. Durante el proceso de coloracin o secado porciones de la gota gruesa probablemente pueden ser desprendidas.

M

M

M

M

M

B

M= Mala calidad

B= Buena calidad

Figura No 8. Muestras de diferente calidad de gota gruesa

4.4.7 4.4.7.1 4.4.7.2 4.4.7.3 4.4.7.4

Otros errores comunes Dejar las lminas expuestas a moscas, cucarachas, hormigas y otros insectos que se alimentan de sangre seca y daan las muestras de sangre. Realizar gotas y frotices en muestras de sangre en lminas mal seleccionadas o rayadas. Secado irregular de la gota gruesa. Permitir la auto fijacin de la gota gruesa que ocurre con el transcurrir del tiempo o a travs de la exposicin al calor, por lo que la coloracin se hace difcil e insatisfactoria.

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SECCIN V COLORACIN DE LA MUESTRA HEMTICA PARA EL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA

5.1

USO DEL COLORANTE GIEMSA El constituyente bsico del colorante giemsa consiste en cierto tipo de eosinato de azul de metileno, disuelto ya sea en alcohol metlico puro o glicerina pura. La solucin alcohlica constituye una forma conveniente en la preparacin de la solucin acuosa que tie simultneamente en rojo, azul y violeta. Los elementos disueltos permanecen en solucin y al cabo de un tiempo todos los elementos activos de coloracin se precipitan.

5.2 5.2.1 5.2.2

RECOMENDACIONES PARA UNA BUENA COLORACIN Asegrese que la gota gruesa y el frotis estn secos antes de iniciar el proceso de tincin. Puede acelerarse el secado empleando calor suave, por ejemplo, exponindolos al calor generado por una lmpara. Evite utilizar demasiado calor ya que esto puede dificultar la deshemoglobinizacin. Mantenga el envase (vidrio mbar u oscuro) que contiene la solucin madre giemsa, cerrado y en lugar seco, fresco y protegido de luz solar directa. As evitar la volatizacin del solvente y la oxidacin del colorante prolongando la duracin de la solucin. Nunca aada agua a la solucin madre del colorante o deje entrar una pipeta mojada. Esto puede provocar deterioro de la solucin de modo que esta no coloree adecuadamente. No agite la botella de colorante antes de utilizarla. Se suspenderan pequeos cristales de colorante que no han sido disueltos, los cuales pueden visualizarse en las muestras de sangre durante el proceso de coloracin y dificultaran el examen bajo microscopio. Nunca regrese el colorante diluido no utilizado al envase que contiene la solucin madre. El material de vidrio usado para guardar colorante giemsa debe ser lavado en agua limpia inmediatamente despus de ser utilizado para retirar los restos del colorante. El material usado debe remojarse por algn tiempo, preferiblemente toda la noche, en una solucin de detergente y posteriormente, debe ser enjuagado totalmente en agua limpia. Los residuos de detergente en el material de vidrio pueden alterar el pH de su contenido y estropear el colorante. La solucin madre constituye el colorante stock (giemsa concentrado), el cual se diluye con buffer o agua destilada para obtener la solucin de trabajo o de uso diario.

5.2.3

5.2.4

5.2.5

5.2.6 5.2.7

5.2.8

5.2.9

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5.3 5.3.1

COLORACIN DE LAS MUESTRAS Antes de proceder a la coloracin de la gota gruesa, fije el frotis sumergindolo en metanol, por tres segundos y djelo secar (Figura No 9).

Figura No 9. Fijar el frotis en metanol.

5.3.2 5.3.3 5.3.3.1

Asegrese de preparar el volumen de colorante diluido en cantidad suficiente para las lminas que debe colorear (Anexo D). Mtodo rpido o coloracin en varilla Este mtodo se usa generalmente para colorear entre 1 a 10 lminas. Debe tenerse en cuenta que la gota de sangre tiene que estar seca antes de ser coloreada, debindose evitar secar las muestras con demasiado calor. Procedimiento Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente de tal forma que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin y coloque las lminas que debe colorear sobre las varillas, espacindola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad (Figura No 10).

5.3.3.2 a.

Figura No 10. Lminas listas para colorear

b.

Vierta colorante diluido sobre la gota gruesa cubrindola por completo. Haga esto suavemente, a una distancia corta de la lmina y deje actuar el colorante por 10 minutos. La experiencia le puede indicar la necesidad de modificar este tiempo de espera.16 Instituto Nacional de Salud

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Figura No 11. Coloracin de lmina en varilla.

c.

Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lmina con agua corriente, usando una pista, hasta que el agua no desprenda colorante (Figura No 12).

Figura N 12. Lavado de lmina de gota gruesa.

d.

Acomode las lminas en una gradilla de madera, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo. Deje secar las lminas en esta posicin. En caso de no poder dilucidar las especies en la gota gruesa, colorear el frotis de la misma forma anterior (Figura No 13).

Figura No 13. Secado de muestras hemticas de gota gruesa.

5.3.4 5.3.4.1

Mtodo de lmina invertida Este mtodo de coloracin se usa para colorear la gota gruesa y frotis de varias lminas a la vez en una bandeja especial de coloracin hecha de material acrlico, la inversin de las lminas disminuye la probabilidad de precipitado del colorante.17 Instituto Nacional de Salud

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5.3.4.2

Procedimiento Coloque la bandeja de coloracin sobre una superficie plana (mesa de trabajo) cerca del lavatorio o recipiente, de tal forma que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin. Acomode las lminas que desea colorear en forma invertida (con la muestra hacia abajo), espacindolas entre ellas de tal manera que pueda agregarse el colorante lmina por lmina (dejar fluir el colorante por el borde de la lmina (Figura No14).

Figura No 14. Coloracin de lmina invertida.

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SECCIN VI OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS PARSITOS DE MALARIA 6.1 RECOMENDACIONES Se necesita un microscopio compuesto con fuente de luz propia o con sistema de espejos para recibir luz natural o artificial. Si se usa como fuente externa de luz una bombilla incandescente (foco de 100W y pavonado), la luz se debe hacer pasar por un filtro azul (que se puede preparar con la solucin azul cielo) (pg. 76), esto facilita la visualizacin de los parsitos. 6.2 6.2.1 6.2.2 RECONOCIMIENTO DE LOS PLASMODIA Los parsitos de malaria toman con la coloracin de giemsa un aspecto determinado en la gota gruesa y el frotis que permite el reconocimiento del tamao y la forma del parsito. El ncleo del parsito (cromatina) es generalmente redondo y se colorea de un rojo intenso (rojo grosella), el citoplasma toma diferente formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular y se colorea siempre de azul, aunque la tonalidad pueden variar ligeramente. ASPECTOS DEL PARSITO DE MALARIA EN SUS DIFERENTES ESTADIOS Las caractersticas en los diferentes estadios de los plasmodia que se observan en la gota gruesa y frotis se muestran en las Tablas No 1, 2 y 3. Para el reconocimiento de la especie y del estadio de los plasmodios, el frotis permite observar mejor las caractersticas del parsito. 6.3.1 6.3.1.1 Etapa de trofozoito joven Esta etapa es la que se observa con mayor frecuencia en las diferentes especies, a veces puede tomar la forma de coma o anillo como en el caso de Plasmodium falciparum, o formas ameboideas, como en el caso de P. vivax. (Figura No 15)Ncleo

6.3

Citoplasma Trofozoito joven de P. falciparumFigura No 15. Trofozoito joven

Trofozoito joven de P.vivax

6.3.2 6.3.2.1

Etapa de trofozoito mediano y adulto El trofozoito es una etapa del desarrollo del parsito dentro del glbulo rojo, puede variar en tamao desde pequeo a grande. En el trofozoito se visualiza, en la mayora de las veces, el pigmento malrico el cual aparece a medida que el parsito crece. Este pigmento denominado tambien hemozona es un producto del metabolismo celular del parsito y proviene de la descomposicin de la hemoglobina en hem y globina. La hemozona no se colorea, porque adopta un color propio, que puede variar de amarillo plido a castao oscuro o negro.19 Instituto Nacional de Salud

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6.3.2.2

El trofozoito mediano se caracteriza porque morfolgicamente es grande, de citoplasma fragmentado y con presencia de vacuola, pudiendo ser la cromatina o ncleo del parsito de posicin central o excntrica. El trofozoito adulto es de menor tamao, de citoplasma compacto, la cromatina se ubica por lo general excntricamente y es ms pequea que la de los gametocitos (Figura No 16).

Trofozoitos medianos

Trofozoitos adultos

Figura No 16. Trofozoito medianos y adultos.

6.3.3 6.3.3.1

Etapa de esquizonte En la etapa de esquizonte el parsito de malaria comienza a reproducirse. Esta reproduccin es conocida como asexual debido a que se reproducen por simple divisin binaria. El parsito presenta ncleos con cromatina y citoplasma definido. Cuando este estadio est presente el nmero de ncleos observados son de utilidad para determinar la especie (Figura No 17).

P. malariaeFigura N 17. Esquizontes.o

P. vivax

6.3.4 6.3.4.1

Etapa de gametocito El gametocito es el estadio sexual en el cual el parsito llega a ser masculino o femenino, ste proceso de maduracin se completa en el estmago del anofelino hembra. La morfologa de los gametocitos depende de la especie. El gametocito masculino es llamado microgametocito y el gametocito femenino macrogametocito (Figura No 18).

P. falciparum

P. vivaxFigura No 18. Gametocitos.

P. malariae

En malaria por P. falciparum se pueden ver en sangre perifrica gametocitos y anillos a diferencia de vivax en el que se visualiza todos los estadios parasitarios. 6.4 6.4.1 MORFOLOGA DE LAS ESPECIES DE Plasmodium EN EL FROTIS DE SANGRE Una simple manera de distinguir entre las cuatro especies de malaria es observar los cambios morfolgicos que provoca el parsito al infectar los glbulos rojos. Los caracteres distintivos son: el tamao del glbulo rojo (si est o no agrandado) y si se han coloreado o no las granulaciones de Schuffner dentro de la clula.20 Instituto Nacional de Salud

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6.4.2

En las preparaciones sanguneas de pelcula fina o frotis, las plaquetas adheridas a los eritrocitos pueden confundirse con plasmodios, as como otros contaminantes como bacterias, esporas, hongos, microalgas, precipitado de colorante, etc. APARIENCIA DE LOS PARSITOS EN GOTA GRUESA Y FROTIS La morfologa de los glbulos rojos y de los leucocitos cambian en el frotis y en la gota gruesa, lo mismo sucede con la morfologa de los parsitos. Los parsitos de malaria pueden ser vistos semejantes a los glbulos blancos en la gota gruesa, pero aparentan ser ms pequeos que en el frotis. Se necesita observarlos muy cuidadosamente antes de identificarlos, enfocando y usando el micromtrico cada vez que mueva un campo microscpico, esto le permitir examinar la gota gruesa en profundidad. El citoplasma de los anillos finos de los trofozoitos pueden aparecer incompletos o rotos. Esta apariencia es normal en muestras de sangre de gota gruesa. Similarmente, la ausencia de glbulos rojos puede dificultar la visin de las granulaciones de Schffner; por tanto, en partes de la muestra no puede ser posible ver el punteado. Observar el parsito en diferentes etapas de desarrollo le ayudar para hacer el diagnstico. Recordar que las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa.

6.5 6.5.1

Grnulos de Shuffner en frotis

Grnulos de Shuffner gota gruesa

Figura No 19. Grnulos de Shffner de P. vivax.

6.5.2

En el estado de trofozoito, los Plasmodium presentan tres caractersticas indispensables, presentes tanto en la gota gruesa como en el frotis: citoplasma azul violceo o azul cielo, ncleo rojo intenso o rojo grosella, y pigmento amarillo plido o castao oscuro o negro (dependiendo de la especie y de las formas maduras del parsito). En las preparaciones sanguneas las siguientes estructuras pueden confundirse con parsitos de malaria: plaquetas adheridas a los eritrocitos en las extensiones sanguneas, conglomerados de plaquetas, fragmentos de leucocitos en las preparaciones de gota gruesa, colorante precipitado, restos de piel del paciente, polvo, bacterias, levaduras, esporas y otros microorganismos que caen en la preparacin (si no se tienen protegidos) mientras se est secando, y algas u otros organismos que pueden estar contaminando el colorante. EXAMEN DE RUTINA DE LA GOTA GRUESA Y DEL FROTIS El examen de la gota gruesa es recomendable para detectar la presencia de los parsitos de malaria, mientras que el frotis sirve como herramienta auxiliar para determinar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la gota gruesa. El cdigo del paciente es rotulado en la cabeza del frotis.

6.5.3

6.6

6.6.1 6.6.1.1

Examen de la gota gruesa El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscpicos ptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersin.21 Instituto Nacional de Salud

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6.6.1.2

Una lmina puede declararse como negativa, slo despus de observar 100 campos microscpicos sin haber encontrado parsitos. Si se encuentran parsitos, deben examinarse tambin los 100 campos microscpicos; esto asegura detectar la posibilidad de infeccin mixta (ms de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parsitos. Procedimiento Verificar la clave de la lmina que va examinar en la hoja de registro de datos. Colocar la lmina entre los soportes de la platina mecnica y verificar que est sostenida firmemente al momento de mover el carro, de lo contrario se pueden perder de vista objetos sospechosos antes de que puedan ser ubicados. Examinar la gota gruesa completa con el objetivo de 10X, hasta localizar una zona conveniente para la bsqueda de los plasmodia (que se observen leucocitos numerosos y bien coloreados). Colocar aceite de inmersin sobre la zona seleccionada de la gota gruesa y girar el objetivo de 100X hasta ponerlo en posicin sobre ella. Bajar el objetivo hasta ponerlo en contacto con el aceite de inmersin. Verificar que la parte seleccionada de la lmina sea ptima (leucocitos de 10 a 20 por campo microscpico). Examinar 100 campos. Desplazar la lmina que contiene la muestra de sangre siguiendo el patrn mostrado (Figura No 20). Recuerde usar el ajuste fino para enfocar, accionando el tornillo micromtrico hacia delante y atrs, con el fin de observar el mayor nmero posible de capas sanguneas. Anotar el nmero de parsitos observados y la especie a la que pertenecen (si le fue posible identificarla).

6.6.1.3 6.6.1.4 a. b.

c.

d.

e. f.

g.

h.

FROTISFigura No 20. Recorrido de la gota gruesa durante la observacin microscpica.

6.6.2 6.6.2.1

Examen del frotis de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa, debido a que la concentracin de los elementos sanguneos es mucho menor.

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6.6.2.2 a. b. 6.6.2.3 a. b. c. d. 6.6.2.4

Se debe realizar en las siguientes circunstancias: Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razn (Ejemplo: por ser muy pequea). Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de Plasmodium. El aspecto que debe presentar esta preparacin al microscopio debe ser: Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teidos de color rosa plido. El ncleo de los leucocitos, de color morado oscuro y grnulos bien definidos. Los grnulos de Schffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. vivax. La cromatina de los plasmodia se tie de color rojo grosella intenso y el citoplasma de azul violceo o azul cielo. Procedimiento Colocar la lmina sobre la platina mecnica entre los soportes de esta. Enfocar con el objetivo de 10X el extremo menos denso del frotis, donde los glbulos rojos estn dispuestos en una sola capa. Bajar el objetivo de inmersin hasta poner en contacto con el aceite de inmersin. Enfocar y examinar la pelcula de sangre siguiendo el patrn mostrado (Figura No 21). Examinar el mayor nmero de campos microscpicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnstico es dudoso deber examinar de 400 a 500 campos microscpicos (Figura No 22).

Figura No 21. Recorrido del frotis durante la observacin microscpica

Figura No 22. Observacin microcpica de P. falciparum en frotis

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Tabla No 1. Caractersticas diferenciales entre plasmodios vistos en frotis de sangre humana

Caracterstica Glbulo rojo Aspecto general Trofozoito joven (anillos)

P. vivax - Tamao aumentado. - Grnulos de Schuffner presentes. - Pequeo a grande, generalmente un anillo por eritrocito.

P. falciparum - Tamao normal

P. malarie - Tamao normal o menor - Generalmente uno a dos anillos por eritrocito.

- Pequeo y delicado, a menudo dos puntos de cromatina y dos o ms anillos por eritrocito - La infeccin mltiple es rara. - Raro en sangre perifrica. Si existe, es de tamao moderado. - Pigmento en forma de grnulos. - Raro en sangre perifrica.

Trofozoito mediano

- Grande, ameboide. - Pigmento en forma de bastones finos.

- Pequeo y compacto, a menudo en forma de banda. - Pigmento granulado.

Trofozoito maduro o adulto Esquizonte

- Tamao mediano, con citoplasma compacto. - Pigmento fino. - Grande, con numerosos merozoitos (12-24). Promedio: 16. - Pigmento concentrado en 1 2 masas.

- Mediano, con numerosos merozoitos (12 - 32). - Pigmento en una masa nica - Su presencia es rara en sangre perifrica.

- Pequeo, con pocos merozoitos grandes dispuestos en roseta (6 a 12), Promedio: 8. - Pigmento granuloso, ubicado generalmente en la parte central. - Parecido al P. vivax pero ms pequeo y menos numeroso en el frotis.

Gametocito

- Esfricos, compactos y de ncleo nico.

- Forma de banana o salchicha y de ncleo nico central.

- Pigmento difuso y fino.

Nota: Ocasionalmente se puede encontrar dificultades para establecer diferencias entre trofozoitos maduros y gametocitos de Plasmodium vivax y entre trofozoitos maduros de Plasmodium malariae y gametocitos redondeados de Plasmodium falciparum. Tampoco es posible distinguir entre trofozoitos en estadios avanzados y gametocitos de Plasmodium malariae en muestras de gota gruesa, aunque si estn presentes los gametocitos de Plasmodium falciparum es relativamente fcil de realizar el diagnstico.

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Tabla No 2. Algoritmo para el diagnstico parasitolgico de malaria en gota gruesa.

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Tabla No 3. Aspecto de las diferentes especies y estadios de los plasmodia en la gota gruesa.Estadio caracterstica P. vivax P. falciparum P. malarie

TrofozoitoTamao Nmero Citoplasma Cromatina Formas pequeo a grande moderado Fragmentado, de forma irregular nica, a veces dos Jvenes: anillos, comas, sin pigmento mediano: citoplasma ameboideo, fragmentado, con pigmento. maduro o adulto: compacto. Fino, desperdigado pequeo a mediano por lo general abundante uniforme, fino a menudo dos ncleos Frecuentemente anulares y comas. Las formas maduras (compactas) slo presentes en casos graves Pocos grnulos o en masa pequeo a grande escaso a moderado regular, denso nica grande Jvenes: anulares Adultos: redondos, compactos

Pigmento Esquizonte Tamao No en sangre N de rnerozoitos Forma

Abundante, generalmente rodeando el citoplasma pequeo escaso 6 a 12, generalmente 8 merozoitos en conglomerado laxo, de forma madura, algunos aparentemente sin citoplasma concentrado Difciles de distinguir de trofozoitos maduros redondeadas, compactas, algunas veces tambin difcil de distinguir de los Trofozotos maduros bien definida menor tamao Desperdigado, rugoso, Puede estar distribuido en la periferie solo con cromatina y pigmento

grande escaso a moderado 12 a 24, generalmente 16 en conglomerado irregular formas maduras

pequeo, compacto poco frecuente, solo en forma, graves 12 a 30, mas aglomerados y compactos

Pigmento Gametocito Formas inmaduras Formas maduras

dispuesto en masa suelta difciles de distinguir de trofozoitos maduros redondas, grandes

masa nica y oscura inmaduras: puntiagudas en forma de banana o redondeadas

Cromatina Pigmento

grande y nica, bien definida desperdigado fino

bien definida de menor tamao desperdigado, grueso

Formas erosionadas

con citoplasma oscuro o ausente, y solo con cromatina y pigmento

a veces se observa rgano de extrusin de color rosa

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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. vivax EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)

Plasmodium vivax c

TROPHOZOITES

SCHIZONTS

Thin film

GAMETOCYTES

Thick film

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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. falciparum EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)

Plasmodium falciparum

TROPHOZOITES

SCHIZONTS

Thin film

GAMETOCYTES

Thick film

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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. malariae EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)

Plasmodium malarie

TROPHOZOITES

SCHIZONTS

Thin film

GAMETOCYTES

Thick film

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SECCIN VII DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA 7.1 7.1.1 7.1.1.1 7.1.1.2 7.1.1.3 CONSIDERACIONES GENERALES La determinacin de la densidad parasitaria es til para: Evaluar la severidad de la infeccin malrica. Evaluar la eficacia del tratamiento antiparasitario, monitoreando la densidad parasitaria durante el tratamiento. Si el tratamiento es eficaz, la densidad parasitaria disminuir progresivamente. La determinacin de la densidad parasitaria es especialmente importante en la infeccin por P. falciparum, la cual se asocia a enfermedad severa y potencialmente fatal, por lo que es necesario el seguimiento de la evolucin parasitolgica en respuesta al tratamiento instaurado. MTODOS DE DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA Los mtodos ms usados para establecer la densidad parasitaria son dos: 7.2.1 7.2.1.1 Mtodo 1: Sistema de cruces (+) o mtodo simple (semicuantitativo)

7.2

Sistema indirecto, simple, usado rutinariamente que permite determinar el nmero de parsitos presentes por microlitro de sangre mediante la suma del total de parsitos observados en 100 campos. El resultado se deber informar de la siguiente manera: Cualquier numero inferior a 40 parsitos en 100 campos debe escribirse el nmero de parsitos encontrados en la lectura. Si observ ms de 40 parsitos, use la siguiente escala: +/2 De 40 a 60 parsitos en 100 campos + Un parsito por campo en 100 campos ++ De 2 a 20 parsito por campo en 100 campos +++ De 21 a 200 parsitos por campo en 100 campos ++++ Ms de 200 parsitos por campo en 100 campos Con un aumento de 750X, 100 campos microscpicos de inmersin, una muestra de gota gruesa bien preparada corresponde aproximadamente a 0,2 mL de sangre.

7.2.1.2

7.2.2 7.2.2.1

Mtodo 2: Clculo del nmero de parsito por microlitro de sangre Mtodo prctico, razonable y de precisin aceptable. El nmero de parsitos por microlitro de sangre se mide comparando el nmero de parsitos asexuados con el nmero de leucocitos en la gota gruesa en base a un recuento medio estimado en cerca de 6000 leucocitos por microlitro de sangre. Aunque existen variaciones este nmero nos permite comparaciones razonables, particularmente cuando se comparan densidades de muestras obtenidas sucesivamente del mismo paciente. Para poner en prctica este mtodo se necesitan dos contadores: uno para contar los parsitos y otro para los leucocitos.30 Instituto Nacional de Salud

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7.2.2.2 a. b.

Aplicar los siguientes criterios, segn se presente el caso: Si despus de contar 200 leucocitos, 10 ms parsitos han sido identificados y contados, anotar los resultados en los formatos de registro en trminos de nmero de parsitos por 200 leucocitos. Si despus de contar 200 leucocitos, menos de 10 parsitos han sido identificados y contados, continuar el recuento de leucocitos hasta Ilegar a 500 leucocitos, para luego anotar los resultados en los formatos de registro en trminos de nmero de parsitos por 500 leucocitos. En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en funcin del nmero de parsitos, registrando su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en la frmula con la cantidad de leucocitos encontrados. En cada caso, el nmero relativo de parsitos al nmero de leucocitos contados puede ser convertido a parsitos por microlitro de sangre usando la siguiente frmula: N de parsitos x 6000 = Parsitos / L N de leucocitos Donde: N de parsitos = Nmero de parsitos contados. N de leucocitos = Nmero de leucocitos contados. L= microlitro Ejemplos: Si se cuentan 205 leucocitos y 50 parsitos, al aplicar la frmula se tendr: Parsitos/ L = 50 x 6000 = 1463 205

c. 7.2.2.3

Si se cuentan 508 leucocitos y 7 parsitos, al aplicar la frmula se tendr: Parsitos/ L = 7 x 6000 = 83 508

Si se cuentan 501 parsitos y slo 95 leucocitos, al aplicar la formula se tendr: 501 x 6000 = 31 642 95 Como podemos observar las cantidades de 200 y 500 no siempre son exactas en la prctica del conteo. Parsitos/ L =

7.2.2.4

Si al finalizar los clculos, se obtienen cifras decimales redondear a nmeros enteros. Ejemplo: Parsitos / L = 68 x 6000 = 1990,24 esto es: 1990 p / L 205

7.2.2.5

En el caso de P. falciparum, el recuento se realiza de manera independiente para los estadios de trofozoito y gametocito. Para el recuento de P. vivax, todos los estadios ingresan al recuento sin independencia alguna.31 Instituto Nacional de Salud

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7.3 7.3.1

REPORTE DE LA DENSIDAD PARASITARIA EN CASO DE MALARIA POR P. falciparum Si la infeccin malrica es por P. falciparum, adems de la densidad parasitaria, se debe registrar las fases de desarrollo de la siguiente manera: F F y Fg Fg = = = anillos nicamente anillos y gametocitos gametocitos nicamente

7.3.2

Cuando se detecta un caso positivo de malaria por P. falciparum, se debe reportar inmediatamente al jefe inmediato y realizar un seguimiento o control tomando muestras durante los das D3, D7 y D14. En caso de realizar la evaluacin de alguna droga antimalrica, el seguimiento de los pacientes se realizar los das D1, D2, D3, D7, D14, D21 y D28. Para garantizar el diagnstico en el seguimiento de un caso por P. falciparum, se debe observar como mnimo 300 campos microscpicos con la finalidad de detectar la ocurrencia de resistencia a la(s) droga(s) antimalrica(s) o recrudescencia de la infeccin. En caso de seguimiento a P. falciparum, se identificar la muestra con la clave original (primera muestra) en todas las lminas a tomarse, adicionando un nmero correlativo para cada una de ellas. Ejemplo: Clave original (201) 15 Claves de seguimiento (201) 15/1, (201) 15/2, (201) 15/3, etc.

7.3.3

7.3.4

7.3.5

El control de casos de malaria por P.vivax se realiza de la misma forma que para P. falciparum; esto es, determinando la densidad parasitaria los das D3, D7 y D14, a no ser que se est realizando alguna evaluacin de droga antimalrica para P. vivax.

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32



SECCIN VIII RESISTENCIA FARMACOLGICA

8.1

EVALUACIN DE LA RESISTENCIA DE P. falciparum A LOS MEDICAMENTOS ANTIMALRICOS MEDIANTE EL SEGUIMIENTO in vivo Para la evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los antimalricos es necesario hacer un seguimiento del paciente, que consiste en la evaluacin de la densidad parasitaria (nmero de parsitos por microlitro de sangre) mediante el examen de la gota gruesa durante los das sealados denominados como das de control. El incremento o disminucin de la densidad parasitaria como respuesta a un antimalrico es considerado como respuesta parasitolgica. Un parsito es resistente a una droga cuando sobrevive a una concentracin de droga que anteriormente lo eliminaba. La vigilancia sistemtica de los fracasos del tratamiento en lugares donde se puede efectuar el diagnstico microscpico puede actuar como sistema de alerta acerca de los problemas de eficacia del tratamiento. Las pruebas in vivo e in vitro recomendadas por la OMS son dirigidas esencialmente a determinar el efecto de un medicamento sobre los parsitos y sirven para la adopcin de decisiones en el cambio de la poltica nacional de medicamentos antimalricos. Criterios de inclusin Personas enfermas con diagnstico parasitolgico a malaria por P. falciparum. Adems, la densidad parasitaria debe ser de 500 a 100,000 parsitos asexuados determinados por examen microscpico de gota gruesa. Edad > 2 aos. Fiebre, corroborada por temperatura axilar > de 37,5 C o antecedente de fiebre de 48 horas previas a la captacin. Monoinfeccin a P. falciparum. Malaria no complicada. Acceso geogrfico y disponibilidad del paciente para asistir regularmente al seguimiento. Hemoglobina > 5gr/dL o hematocrito > 15,0%. Consentimiento informado y autorizado con firma del paciente. En caso de nios, adems del asentimiento del menor, se deber contar con la autorizacin del padre, madre o tutor, en caso de imposibilidad de firmar, se tomar huella digital.33

8.1.1

8.1.2

8.1.3

8.1.4 8.1.4.1 8.1.4.2

8.1.4.3 8.1.4.4

8.1.4.5 8.1.4.6 8.1.4.7 8.1.4.8 8.1.4.9

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8.1.5 8.1.5.1 8.1.5.2 8.1.5.3 8.1.5.4 8.1.5.5 8.1.5.6 8.1.6 8.1.6.1 8.1.6.2 8.1.6.3 8.1.6.4 8.1.6.5 8.1.7

Criterios de exclusin Mujeres embarazadas. Presencia de otras causas de fiebre o condiciones mdicas agudas o crnicas. Infecciones mixtas o de otras especies distintas de P. falciparum. Presencia de signos de alarma o malaria grave complicada. Antecedentes de hipersensibilidad a alguna de las drogas antimalricas en estudio. Contraindicaciones especficas del medicamento a ser utilizado. Procedimiento La identificacin del parsito, preparacin y examen de lminas y el conteo de parsitos se realizarn de acuerdo a los procedimientos correspondientes desarrollados en los Anexos A, C y D. Una vez enrolado el paciente es necesario que este regrese los das que le son sealados como das de control. El da del enrolamiento del paciente es considerado como da 0 de seguimiento. Todos los pacientes regresarn para sus controles los das 1, 2, 3, 7 y 14, pudiendo extenderse a los das 21 y 28, segn el nmero de das de seguimiento fijado. En cada da de control se realizar una evaluacin clnica del paciente, un examen de gota gruesa (para determinacin de densidad parasitaria) y evaluacin de temperatura axilar. Respuesta parasitolgica Esta se clasifica de la siguiente manera:

8.1.7.1

Resistencia tipo III (RIll): Si la densidad parasitaria del da 2 es del 100% del da 0. Si la densidad parasitaria del da 3 es < del 25% del da 0.

8.1.7.2

Resistencia tipo II (RII): Si la densidad parasitaria del da 3 es < del 25% del da 0, pero reaparece el da 7.

8.1.7.3

Resistencia tipo I (RI) temprana: Si la densidad parasitaria del da 3 es negativa, pero reaparece entre el da 4 y da 28 inclusive, o si la densidad parasitaria del da 3 es < 25% del da 0, el da 7 es negativa, pero reaparece despus del da 7.

8.1.7.4

Resistencia tipo I (RI) tarda: Considerando los criterios anteriores, pero la parasitemia aparece despus del da 14.

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34



8.1.7.5

Sensible Cuando la densidad parasitaria del da 3 es negativa < del 25% del da 0, y negativa entre el da 7 y da 28 inclusive.

Figura No 23. Respuesta parasitolgica al tratamiento antimalrico

8.1.8

Respuesta teraputica La respuesta teraputica se clasifica en tres categoras:

8.1.8.1

Fracaso precoz del tratamiento (FPT) Si el paciente presenta una de las siguientes situaciones durante los 3 primeros das de seguimiento:

a. b. 8.1.8.2

Presencia de signos de peligro o signos de malaria grave con presencia de parasitemia el da 1, 2 3. Si la densidad parasitaria del da 3 es > al 25% del da 0. Fracaso tardo del tratamiento (FTT) Si el paciente presenta una de las siguientes situaciones entre los das 4 y 28 de seguimiento, sin haber tenido anteriormente ninguno de los requisitos que lo calificaran como FPT:

a. b. c. 8.1.8.3

Presencia de signos de peligro o de malaria grave despus del da 3, con parasitemia de la misma especie que el da 0. Regreso no programado del paciente debido a deterioro clnico en presencia de parasitemia. Presencia de parasitemia entre el da 7 y el da 28. Respuesta Clnica Adecuada (RCA). Si el paciente no presenta ninguno de los criterios de FPT ni FTT y se confirma la desaparicin del parsito durante el perodo de seguimiento.

8.1.9 8.1.9.1 a.

Medicamentos estudiados Cloroquina Droga antimalrica de marcada y rpida accin esquizonticida sangunea contra todas las infecciones por P. malariae y P. ovale y contra las infecciones por P. falciparum y P. vivax sensibles a cloroquina.35 Instituto Nacional de Salud

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Ejerce tambin accin gametocitocida contra P. vivax, P. malariae y P. ovale, as como contra los gametocitos inmaduros de P. falciparum. No es activa contra las formas intrahepticas. b. Presenta una composicin qumica de 7-cloro (4-dietilamino-metilbutalamina) quinolena. Sus nombres comerciales son Aralen, Avovlar, Resoqun y Nivaquina. Se presenta en comprimidos de 50 mg 100 mg y 150 mg de base (como difosfato o sulfato), y en jarabe que contiene 50 mg de base (como difosfato o sulfato) por cada 5 mL (Anexo E). Sulfadoxina / pirimetamina Droga antimalrica de accin esquizonticida sangunea. Presenta una composicin qumica de N 5,6 dimetoxi-4-pirimidil sulfanolamida y de 2,4- diaminoclorefenil-6-etilpirimidina. Su nombre comercial es Fansidar. Su presentacin es en frascos de comprimidos. Cada comprimido contiene 500 mg de sulfadoxina con 25 mg de pirimetamina. Los resultados de las pruebas in vivo e in vitro realizadas para esta droga se registran en formularios recomendados por la OMS (Anexo E). Mefloquina Es un 4 quinolino-metanol qumicamente relacionada con la quinina. Es un potente esquizonticida sanguneo de accin prolongada contra P. falciparum. Es tambin sumamente activo contra P. vivax y P. malariae, y probablemente tambin contra P. ovale. No tiene una accin gametociticida ni contra las etapas tisulares de los plasmodia. Debido a su larga vida media de eliminacin y a la consiguiente concentracin subteraputica prolongada en la sangre, cabe preveer la aparicin de resistencia, especialmente en lugares con alta transmisin. La mefloquina se fija en gran medida a las protenas (98% en el plasma) y tiene una larga vida media de eliminacin que oscila entre 10 y 40 das en los adultos pero que tiende a ser ms corto en los nios y mujeres embarazadas (II y III trimestre). El metabolito principal, la carboximefloquina, aparece de dos a cuatro horas despus de la ingestin del medicamento de origen (quinolina metanol). La mefloquina puede usarse con fines teraputicos como quimioprofilctico. El principal problema de la mefloquina es la posibilidad de reacciones adversas neuropsiquitricas, adems de otros efectos colaterales como mareos, vmitos, diarreas, dolor abdominal as como la probabilidad de un mayor riesgo de estos eventos durante el embarazo y en personas que toman medicamentos cardioactivos. Artesunato El principio activo del artesunato es la artemisinina (compuesto de origen), aislado de la Artemisia annua. Es una lactona de sesquiterpeno con un puente de perxido; la fijacin de este perxido parece ser responsable de su accin antimalrica.

8.1.9.2 a. b.

c.

8.1.9.3 a. b.

c.

d. e.

8.1.9.4 a.

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36



b. c.

Esta droga antimalrica es un esquizonticida sanguneo de accin rpida. Puede ser administrado en terapia combinada , ya sea con sulfadoxina/pirimetamina o con mefloquina. De acuerdo a estudios clnicos realizados, la razn por la cual se administra mefloquina el segundo da de iniciado el tratamiento con artesunato es por que hay menos riesgos de vmitos, debido a que la afeccin clnica ha mejorado. Quinina La quinina es eficaz contra infecciones por P. falciparum resistentes a sulfadoxina/pirimetamina o a la combinacin de sulfadoxina /pirimetamina + artesunato o sulfadoxina /pirimetamina + mefloquina. En algunos lugares de Asia suroriental, donde la quinina se ha usado mucho para el tratamiento de la malaria, se ha detectado una disminucin de la sensibilidad a esta droga, especialmente en casos en que se administr tratamiento en un entorno no supervisado y en pacientes ambulatorios en un rgimen de ms de tres das. Aunque pesar de esto la quinina sigue siendo el medicamento de eleccin para tratar la malaria por P. falciparum grave y complicada. Las sales de quinina vienen en muchas formas diferentes, tanto en comprimidos como inyectables. Las ms comunes son clorhidrato de quinina y sulfato de quinina que contienen 82% y 82,6% de base de quinina, respectivamente. La presentacin en forma de bisulfato de quinina (con 59,2%) es la menos comn. EVALUACIN DE LA RESISTENCIA in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS ANTIMALARIAS Los estudios in vitro comparan las reacciones de los parsitos a los antimalricos bajo condiciones libres de interferencia de factores derivados del sistema inmunolgico humano. Al mismo tiempo son estudios complementarios de los estudios in vivo. Criterios de inclusin Personas enfermas con diagnstico parasitolgico positivo a P. falciparum nicamente. Densidad parasitaria > 1000 y < 80 000 parsitos asexuados / L. Malaria no complicada. Criterios de Exclusin Pacientes que hayan recibido tratamiento antimalrico con 4-aminoquinoleinas los ltimos 14 das o sulfadoxina/ pirimetamina en los ltimos 28 das. Pacientes muy enfermos o con vmitos, con antecedentes recientes de convulsiones, conciencia afectada, no poder sentarse o estar de pie. Pacientes positivos a la prueba de Dill-Glazko (evaluacin de excrecin de metabolitos antimalricos) Infecciones mixtas o de otras especies distintas de P. falciparum.

8.1.9.5 a.

b.

8.2 8.2.1

8.2.2 8.2.2.1 8.2.2.2 8.2.2.3 8.2.3 8.2.3.1 8.2.3.2 8.2.3.3 8.2.3.4

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37



8.2.4 8.2.4.1

Procedimiento Se emplear el estuche de microprueba in vitro (MARK II) que consiste en placas de ELISA para varias determinaciones con pozos que contienen drogas antimalricas en diferente concentracin. Estas placas son utilizadas para la evaluacin de la respuesta del P. falciparum a la cloroquina, sulfadoxina/ pirimetamina y otras drogas recomendadas por la OMS (1987)(Figura No 24). Pipetear 0,9 mL de medio RPMI completo en varios tubos Falcon de tapa de presin de 5 mL. Rotular adecuadamente los tubos y colocarlos en posicin vertical en la gradilla.

8.2.4.2 8.2.4.3

RPMI

Tubos con medio RPMI

Placas con droga impregnada Figura N 24. Materiales utilizados para la evaluacin de resistencia in vitro

8.2.4.4

Realizar puncin capilar o venosa y tomar 100L de sangre para transferirla rpidamente al tubo Falcon de 5 mL que contiene 0,9 mL de medio. De este modo estaremos preparando una solucin de 1/10 de la muestra obtenida (Figura No 25). El volumen final de la solucin 1/10 depender del nmero de drogas a evaluar. Presionar la tapa firmemente y agitar suavemente eI tubo para mezclar la sangre.

8.2.4.5 8.2.4.6

Figura N 25. Extraccin de 0,1 mL de sangre parasitada para diluir en 0,9 mL de medio.

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38



8.2.4.7

La mezcla sangre/medio (1/10) se mantendr estable varias horas y los tubos podrn transportarse con cuidado en el bolsillo del pecho o del pantaln, para mantener el contenido a una temperatura aproximada a la corporal. Si el tiempo de transporte es mayor a 4 horas, se mantendr conservado en hielo hmedo. Realizar las extensiones y preparaciones en gota gruesa previas al cultivo. Retira las tiras del precintado que cubren los pocillos de la placa (viene en el estuche de la microprueba)(Figura No 26).

8.2.4.8 8.2.4.9

Figura No 26. Retiro del precintado de la muestra.

8.2.4.10

Todos los pocillos de la fila apropiada (una fila por cada paciente analizado) se dosifican con 50 L de la mezcla sangre/medio (1:9) usando la pipeta eppendorf de 50 L y una punta estril desechable suministrada con el estuche. La dosificacin se efectuar empezando por el pocillo testigo (A) y se seguir por orden creciente de concentracin hasta el pocillo H (Figura No 27).

8.2.4.11

Figura No 27. Siembra de las muestras.

8.2.4.12

Agitar de vez en cuando la mezcla sangre/medio en el tubo de 5 mL para asegurar que la sangre se mantenga en suspensin y se distribuya por igual a todos los pocillos. Luego, quitar y descartar la punta desechable estril. Adaptar una nueva punta desechable estril a una pipeta eppendorf e instalar la prxima fila exactamente del mismo modo y as sucesivamente hasta que todas las muestras queden repartidas en partes alcuotas sobre la placa. Colocar la cubierta sobre la microplaca y con un lpiz graso escribir todos los detalles de cada paciente analizado sobre la fila correspondiente de la placa.39 Instituto Nacional de Salud

8.2.4.13

8.2.4.14

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8.2.4.15

Agitar la placa suavemente para tener la seguridad de que el frmaco depositado en los pocillos ha quedado completamente disuelto (Figura No 28).

Figura No 28. Agitar la placa luego de sembrar las muestras

8.2.4.16

Tomar el tarro de velas de la incubadora regulada para asegurar una temperatura interna de 37C en el tarro; es sumamente necesario precalentar el tarro durante una horas como mnimo y cargar con las placas que van a incubarse. Cuando la segunda vela est a punto de apagarse cerrar el grifo de evacuacin. Incubar el contenido a 37 C durante 24-30 horas (segn la fase de desarrollo de los trofozoitos en el frotis previo al cultivo)(Figura No 29).

8.2.4.17 8.2.4.18

Figura No 29. Incubacin de las muestras en estufa de C02.

8.2.4.19

Tras la incubacin, cosechar el contenido de los pocillos, quitando el lquido sobrenadante con tubos capilares de 50 L y traspasar los glbulos rojos depositados en el fondo plano de los pocillos a una lmina portaobjetos limpio, para formar una serie de gotas gruesas dispuestas en serie (Figura No 30).

Figura No 30. Cosecha de muestras luego de incubacin.

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40



8.2.4.20

Antes de teirlas, secar cuidadosamente las preparaciones en gota gruesa resultantes, pues de otro modo se desprendern espontneamente del portaobjetos. Normalmente se necesita 24 horas para secarlas al aire, pero este plazo puede acortarse secndolas en una estufa a 37C (30 minutos). Las preparaciones en gota gruesa se tien durante 30 minutos con giemsa diluido al 1% (v/v) en agua de pH 7,2 (Figura No 31).

8.2.4.21

Figura No 31. Coloracin de las gotas gruesas con giemsa.

8.2.4.22

Realizar la lectura de la gota gruesa para el recuento de esquizontes. Para que la prueba sea aceptable se tendr en cuenta que la poblacin de esquizontes maduros debe ser del 10% ms (es decir, 20 esquizontes con tres o ms ncleos por 200 parsitos asexuados). Para el caso de las preparaciones en gota gruesa con sulfadoxina/piremetamina (SP), se tendr en cuenta: presencia de trofozoitos, presencia de esquizontes con 3 a 7 ncleos, esquizontes anormales y esquizontes normales con 8 ncleos o ms. Asimismo, se tendr en cuenta el porcentaje de esquizontes maduros y el porcentaje de esquizontes inhibidos. Los resultados de las pruebas inmediatamente despus de conocerse se anotarn en las fichas adecuadas. Interpretacin de los resultadosTabla No 4. Interpretacin de los resultados de evaluacin formolgica

8.2.4.23

8.2.4.24 8.2.4.5

DROGA

RESPUESTA SATISFACTORIA (inhibicin completa de esquizontes)

RESISTENCIA (crecimiento de esquizontes)

Cloroquina Mefloquina Quinina Amodiaquina Fansidar

4 pmol (*)

8 pmol 64 pmol 256 pmol 4 pmol > CI 90%

128 pmol

2 pmol

= CI 50%

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= CI 50%


SECCIN IX CONTROL DE CALIDAD EN EL DIAGNSTICO DE MALARIA 9.1 9.1.1 ACTIVIDADES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Recepcin de lminas Recepciona el 100% de lminas positivas y 10% de lminas negativas de la produccin de muestras hemticas de los laboratorios de referencia regional y realiza la evaluacin de control de calidad en cuanto a reproductibilidad diagnstica y calidad tcnica de las lminas enviadas por el nivel regional. 9.1.2 Revisin Para la revisin de lminas se debe tener en cuenta los siguientes criterios: 9.1.2.1 Criterios de seleccin Revisa 10% de lminas negativas y selecciona las lminas positivas de acuerdo a los siguientes porcentajes: 10% de laminas positivas (+) 10% de lminas positivas (++) 10% de laminas positivas (+++) 100% de lminas positivas menores de +/2. 9.1.2.2 Criterios de evaluacin Realiza el control de calidad para evaluar: 9.1.3 Calidad de reproducibilidad diagnstica: 10 % de lminas negativas y todas las lminas positivas segn criterio de seleccin. Calidad tcnica de la muestra en gota y frotis: Revisa 10 % de lminas recibidas y registra los resultados en el formato CCM-2 .

Consolidado Consolida los resultados de reproducibilidad diagnstica y calidad tcnica de la muestra en el formato CCM-5.

9.1.4

Emisin de resultados Emite los resultados de control de calidad en el formato CCM-5, en un perodo no mayor de 3 semanas despus de recibir las lminas. Califica, de acuerdo a escalas, la reproducibilidad diagnstica y calidad tcnica de la muestra.

9.2 9.2.1

ACTIVIDADES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL, Y LABORATORIOS INTERMEDIOS Recepcin de lminas Recepciona la produccin de muestras hemticas de sus respectivos laboratorios intermedios y locales al 100 % de lminas positivas y negativas.

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9.2.2 9.2.2.1 a.

Revisin Criterios de seleccin Revisa 10% de lminas negativas y 10% de lminas positivas de cada una de las siguientes densidades parasitarias: +, ++, +++ y 100% de lminas positivas cuyas densidades son menores de +/2. Para la revisin de lminas utiliza el formato CCM-2 El personal recin capacitado y aquellos que tengan discordancias mayores al 2%, debern realizar la revisin de lminas, de acuerdo al siguiente porcentaje: 1ER. 2DO. 3ER. 4TO. Trimestre Trimestre Trimestre Trimestre 100 % de positivas y 100 % negativas 100 % de positivas y 50 % negativas 100 % de positivas y 25 % negativas 100 % de positivas y 10 % negativas

b.

Este esquema debe ser considerado, hasta que el personal evaluado logre superar los porcentajes de discordancias. 9.2.2.2 Criterios de evaluacin El nivel regional realiza el control de calidad tcnica para evaluar la calidad de muestra y la calidad de coloracin al 10 % de lminas recibidas, registrando los resultados en el formato CCM - 2, lo cual le permite tener un sistema de vigilancia permanente en la calidad diagnstica de la muestra pudiendo tomar decisiones de realizar supervisiones al nivel local e intermedio, si fuera el caso. 9.2.3 Consolidado Registra y consolida los resultados de produccin y control de calidad de las lminas de cada laboratorio evaluado en la fichas CCM-3. 9.2.4 Emisin de resultados Remite en forma trimestral al Laboratorio de Referencia Nacional de Malaria el informe de produccin y reproducibilidad diagnstica, en el formato CCM-3. Asimismo, remitir de manera inmediata los resultados de la calidad tcnica de gota gruesa y frotis, as como los de reproducibilidad diagnstica, a los niveles locales e intermedios de su jurisdiccin. Envia en el formato CCM-4 al nivel de referencia nacional la relacin del total de lminas. Cuando existan laboratorios intermedios, estos recibirn, revisarn y consolidarn la informacin con los mismos criterios del regional. El envo de informacin a su nivel superior lo har mensualmente. 9.3 9.3.1 ACTIVIDADES DEL NIVEL LOCAL Envo de lminas Todos los laboratorios locales que realicen diagnstico de malaria enviarn 100 % de positivas y

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100% de negativas, separando por grupos de lminas positivas y negativas, acompaado de su informe semanal, en el formato CCM-1. 9.4 RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL ENVIO DE LMINAS E INFORME DE RESULTADOS Del envo de lminas Las lminas al momento del envo deben estar limpias. Para ello, eliminar todo residuo de aceite de inmersin. El embalaje se har con cartn corrugado y asegurado con pabilo, a fin de evitar su deterioro o rotura. Es aceptable el envo de lminas hacia el nivel inmediato superior con un retraso de hasta una semana para el nivel local e intermedio y de un mes para el nivel de referencia regional . De la emisin de resultados El nivel de referencia regional emitir su resultado de control de calidad a los niveles intermedios de su jurisdiccin en un tiempo no mayor de quince das despus de recibir las lminas. El nivel intermedio emitir sus resultados en un tiempo de una semana. El nivel de referencia nacional emitir su resultado de control de calidad al nivel de referencia regional en un tiempo no mayor de 3 semanas despus de recibir las lminas. CRITERIOS DE EVALUACIN DE LA CALIDAD TCNICA DE LA LMINA DE GOTA GRUESA Calidad ptima de la toma de muestra De la gota gruesa - Ubicacin - Tamao - Calidad 9.5.1.2 Del frotis Tamao Ubicacin Extendido Identificacin : : : : 3 cm Del centro al borde externo de la lmina Fino, con cabeza cuerpo y cola Legible (fecha y nmero). : : : 1 a 1,5 cm. del tercio exter

163 malaria

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