19 rekombinant dna teknoloj

REKOMBNANT DNA TEKNOLOJS

Giri

q Kethleen Danna ve Daniel Nathans tarafndan 1971de yaynlanan bir makale, rekombinant DNA ann balangcna iaret etmitir.

q Makale, bir bakteri suundan bir enzimin ayrtrlmasn ve enzimin viral DNAy zgl nkleotit dizilerinden kesmek iin kullanln tanmlamaktayd.

q Makale, restriksiyon enzimleri olarak adlandrlan bu proteinlerle kesilmi DNAnn ilk fotorafn da iermektedir.

Prof. Dr. Bekta TEPE (Kaynak: Genetik Kavramlar,

Klug, Cummings & Reece)

2

Giri

q Rekombinant DNA teknolojisi, bir genomdaki binlerce ya da onbinlerce gen arasndan tek bir genin; q Ayrtrlmasn, q Tanmlanmasn ve q Bu genin klonlanm DNA molekl olarak byk miktarlarda

retilmesini mmkn klmaktadr.

q Ayrca klonlanm gen, ifreledii rn sentezleyecek hcrelere de aktarlabilir.



3

Giri

q Bu rn daha sonraki aratrmalarda, tpta ya da endstride kullanlmak zere ayrtrlarak saflatrlr.

q Klonlar, tek bir atadan kk alan, birbirine zde organizmalar, hcreler ya da molekllerdir.

q Bir genin klonlanmas; q Bir genin yapsnn ve organizasyonunun aratrlmas ya da

sz konusu genin ifreledii proteinin ticari retimi gibi saysz amalar iin kullanlmak zere, o genin birok zde kopyasnn retilmesidir.



4

Rekombinant DNA teknolojisi eitli deneysel teknikleri kapsar

q Rekombinant DNA terimi, doal olarak bir arada bulunmas mmkn olmayan DNA molekllerinin kombinasyonunu ifade eder.

q Krossing over gibi genetik srelerde de rekombinant DNA moleklleri oluturulabilir.

q Ancak rekombinant DNA terimi daha ok, farkl biyolojik kaynaklardan elde edilen DNAlarn birletirilmesiyle elde edilen molekller iin kullanlr.

q Rekombinant DNA teknolojisi, bakteri ve virslerle yaplan almalarda gelitirilen genetik teknikleri ve nkleik asit biyokimyas metotlarn birlikte kullanr.



5

Rekombinant DNA teknolojisinin temel basamaklar

q Bu teknoloji, bir genin potansiyel olarak snrsz miktarda retilmesi iin gl bir aratr.

q in iinde birok yntem olsa da, temel ilem aadaki basamaklar ierir.

q 1. Klonlanacak DNA doku ya da hcrelerden izole edilir.

q 2. zgl DNA paralarnn oluturulmas iin restriksiyon enzimleri denilen proteinler kullanlr. q Bu enzimler DNA molekllerini zgl nkleotit dizilerinden tanr ve

keser.



6


3. Restriksiyon enzimleri ile oluturulan DNA paralar, vektr ya da tayc molekl ad verilen dier DNA moleklleri ile birletirilir. Bir DNA parasyla birlemi olan vektr, bir rekombinant

DNA molekldr.

4. Rekombinant DNA molekl, bir konak hcreye aktarlr. Konak ierisinde rekombinant molekl kendini eler ve

rekombinant molekln birbirine zde dzinelerce kopyas ya da klonlar oluur.



7


5. Konak hcre kendisini elerken, rekombinant DNA moleklleri de tm yavru hcrelere geer. Her biri klonlanm DNA dizisinin kopyalarn tayan konak

hcre topluluu oluur.

6. Klonlanm DNA konak hcrelerden izole edilebilir ve incelenebilir.



8


7. Klonlanm DNA daha sonra transkripsiyona uratlabilir. mRNAs translasyona sokulabilir. Kodlanan gen rn izole edilerek aratrma iin ya da ticari

amalarla satlmak iin kullanlabilir.



9

Rekombinant DNA teknolojisi genom analizinin temelidir

q Rekombinant DNA ve gen-klonlama teknolojisi, bilim adamlarna; q Byk ve karmak genomlardan zgl genleri; q Ya da dier DNA dizilerini eitli yntemlerle byk

miktarlarda elde etme olana tanr.

q rnein insan genomu, milyarn zerinde nkleotit ve 25.000 ila 30.000 civarnda gen ierir.



10

Restriksiyon enzimleri ne yapar?

q Restriksiyon enzimleri genomu; q zole edilebilen, q Kopyalanabilen, q Ayr ayr allabilen, q zerinde oynanabilen kk paralara bler.



11

Restriksiyon enzimlerinin avantajlar

Bu durum, aratrmaclara; Gen organizasyonunu, Fonksiyonunu, Gen ifadesini dzenleyen faktrleri, Genler tarafndan ifrelenen proteinlerin ilevlerini ve doasn aratrmalarna olanak salar.



12

Restriksiyon enzimleri aslnda bakterilerin savunma mekanizmasdr !

q Restriksiyon enzimleri bakteriler tarafndan virs istilasna kar bir eit savunma mekanizmas olarak retilirler.

q 200den fazla restriksiyon enzimi tanmlanmtr.

q Bunlardan yaklak 100 kadar aratrmaclar tarafndan yaygn olarak kullanlmaktadr.

q Enzim DNAya, tanma dizisi denilen zgl nkleotit dizisini tanyarak balanr.



13

Restriksiyon enzimleri DNAy zgl tanma dizilerinden keserler



14

Restriksiyon enzimleri fragmentler oluturur !

q Enzim, bu tanma dizisi iinden, DNAnn iki zincirini zgl bir kesim kalb oluturacak ekilde keser.

q Restriksiyon enzimlerinin klonlama ilemindeki faydas, genomik DNAy her zaman doru bir ekilde keserek restriksiyon paralar denilen fragmentler oluturma zelliinden gelmektedir.

q Restriksiyon paralarnn bykl, sz konusu restriksiyon enzimlerinin DNAy ne kadar sklkla kestiine gre hesaplanr.



15

Restriksiyon enzimleri fragmentler oluturur !

q Drt baz tanma dizisi olan Alu I (AGCT) gibi enzimler ortalama her 256 baz iftinde bir kesecektir.

q Eer drt nkleotid eit oranlarda bulunuyorsa birok kk para oluacaktr.

q Not I gibi sekiz nkleotitlik tanma dizisine (GCGGCCGC) sahip olan enzimler DNAy ortalama her 65.500 baz iftinde bir keserek irili ufakl fragmentler oluturur.



16

Palindromik (ters tekrar) tanma dizileri

q Belirli bir restriksiyon enziminin DNAy kesmesi ile oluturduu paralarn gerek byklkleri deikenlik gsterir.

q nk, DNAdaki tanma dizilerinin says ve yerleimi her zaman gelii gzel deildir.

q Tanma dizilerinin ounda yle bir simetri vardr ki, nkleotid dizisi DNAnn iki zincirinde de 5 den 3 ynne doru benzer ekilde okunur (bir palindrom).



17

Kt u-Yapkan u

Her restriksiyon enzimi DNAy kendisine zg kesim modeline gre keser.

Birok restriksiyon enzimi DNAy asimetrik olarak keserek tek zincirli kuyruklar olan paralar (yapkan ular) oluturur ya da,

Palindromik tanma dizisinden iki zinciri simetrik bir ekilde keserek kt ulu paralar oluturur.



18



19

Eco RI

Tanmlanan ilk restriksiyon enzimlerinden biri E. colinin R suundan izole edilmi olan Eco RIdir.



20

Yapkan ularn birlemesi kolaydr !

q Eco R kesimi ile ortaya kan DNA paralarnn knt yapan tek zincirli ular (yapkan ular), herhangi bir kaynaktan gelen DNA paralarnn komplementer tek zincirli kuyruklaryla hidrojen balar oluturulabilir.

q Eer farkl iki kaynaktan gelen bu paralar uygun koullarda kartrlrsa, yapkan ular arasndaki hidrojen balardan tr rekombinant (yenibileen) molekller ortaya kar.

q Paralar DNA ligaz enzimi ile kovalent olarak balanarak rekombinant DNA moleklleri oluturulur.



21



22

Vektrler klonlanacak DNA paralarn tarlar

q Kopyalanacak olan DNA restriksiyon paralar konak hcresine dorudan giremezler.

q Ancak bir restriksiyon paras, vektr ad verilen baka bir DNA molekl ile birleirse,

q Klonlanm bir ok kopyasnn oluabilecei konak hcreye girebilir.

q Vektrler, kendilerine taklan DNA parasn nakleden ve replike eden tayc DNA moleklleridir.



23

Birok farkl klonlama vektr vardr

Konak zgll,

Tayabildikleri parann bykl,

Olutuklar kopya saylar,

Klonlama iin sahip olduklar tanma dizilerinin saylar ve

Marker genlerinin tipi ve saylar

gibi bir takm zellikleri asndan deiiklik gsteren birok farkl klonlama vektr vardr.



24

Vektrler tanma dizileri iermelidir

q Bir DNA moleklnn vektr olarak kullanlabilmesi iin, kendini ve tad herhangi bir DNA parasn bamsz olarak replike edebilmesi gerekir.

q Vektr ayrca, klonlanacak DNA parasnn insersiyonuna olanak tanyan birok tanma dizisi de iermelidir.



25

Vektre gen insersiyonu !

q Bir DNA parasn vektre takmak iin; q Vektr, restriksiyon enzimi ile kesilir ve ayn enzimle kesilerek

oluturulmu DNA paralar ile kartrlr.

q Araya eklenen fragmenti tayan vektrler rekombinant vektr olarak adlandrlr.

q Bu yap, her biri farkl iki kaynaktan gelen DNAlarn birlemesi ile olumu rekombinant DNA moleklne bir rnektir.



26

Rekombinantlarn seimi

q Vektrleri tayan konak hcrelerini, vektr tamayanlardan ayrmak iin,

q Vektrde, seicilik salayan bir marker gen (genellikle antibiyotik diren genleri ya da konakta bulunmayan enzimlere ait genler) bulunmaldr.



27

Plazmit vektrler

q lk gelitirilen vektrler, genetik olarak deiiklie uratlm plazmitlerdir.

q Hala klonlama iin yaygn olarak kullanlmaktadr.

q Bu plazmit vektrler, q Bakteri hcreleri iinde doal olarak bulunan, q Bamsz olarak replike olabilen, q Bakteri kromozomunun dnda, ift zincirli DNA moleklleridir.



28

Plazmit vektrler



29

Plazmitler oalr

q Plazmitler, klonlama vektr olarak kullanlabilmeleri iin genetik mhendislii ile ok fazla deiiklie uratlmtr.

q Genellikle tek bir plazmit bakteri konak hcresine girmesine ramen, bir kere girince, baz plazmitler kopya saylarn binlerce kopya olacak ekilde artrrlar.

q Vektr olarak bu plazmitler, klonlanm DNAnn birok kopyasnn olumasna da olanak verir.



30

pUC18

q Vektrler, ok sayda restriksiyon enziminin tanma dizilerini ve marker genleri ierecek ekilde dizayn edilebilirler.

q Bu tr plazmitlerden biri, vektr olarak birok yararl zellii bulunan pUC18dir.



31

Plazmit vektrler



32

pUC18

Bu plazmit kktr (2686b) ve bu nedenle, daha byk DNA paralarn tayabilir.

Replikasyon orijini vardr ve araya sokulan DNAnn hcre bana 500 kadar kopyasn oluturabilir.

pUC18 zerindeki oklu-balayc (poli-linker) olarak adlandrlan bir blge, ok sayda restriksiyon enziminin tanma dizisini kapsayacak ekilde dzenlenmitir.



33

pUC18, lac Z geni tar

pUC18, bakteriyel lacZ gen parasn tamaktadr ve oklu-balayc blge bu parann iine sokulmutur.

lacZnin ifade olmas, pUC18i tayan bakteri konak hcrelerinin Xgal ad verilen maddeyi ieren ortamda retildiinde mavi koloniler oluturmasna neden olur.



34

Lac Znin insersiyonal inaktivasyonu

Eer DNA paras, oklu-balayc blgeye taklrsa, lac Z geni etkisiz hale gelir.

Yabanc DNA parasn tayan pUC18 plazmitini ieren konak hcreler, tannmas kolay olan beyaz koloniler oluturur.



35

Plazmit vektrler



36

Lambda () faj vektrleri

q Plazmit vektrler genellikle 10 kba kadar yabanc DNA tayabilir.

q Ancak birok deneyde daha byk DNA paralar gereklidir.

q Bu nedenle fajnn genetik olarak deitirilmi sular vektr olarak kullanlr.



37




38


q Vektr olarak kullanlmas iin, lambda kromozomunun ortasnda yer alan genomun te birlik ksm, fajn hcreleri enfekte etmesini ve plak oluturmasn engellemeden, yabanc bir DNA ile deitirilebilir.



39



40

Lambda () faj ile gen aktarm

Bu vektr kullanarak DNA klonlamas yapmak iin nce faj DNAs ayrtrlr.

Daha sonra EcoR gibi bir restriksiyon enzimi ile kesilerek, sol kol, sa kol ve vazgeilebilir orta blm olmak zere kromozomal para oluturulur.

Sol ve sa kollar izole edilir.

EcoR ile kesilmi ve yabanc DNA ile kartrlr.



41


Paralarn DNA ligaz ile birletirilmesiyle rekombinant vektrler oluur.

Rekombinant vektrleri fajn protein kafas iine paketlenir.

Konak bakteri hcresine sokulur.

Bakterinin iinde vektrler oalr ve her biri yabanc DNA tayan ok sayda faj kopyas oluur.



42


Fajlar olutuka konak bakteri hcresini paralar.

Petri kabnda plak olarak bilinen berrak lekeler eklinde yaplar oluur.

Bu plaklardan klon DNAlar ayrtrlr.

Faj vektrler yaklak 20kb byklndeki DNA paralarn tayabilir.

Bu byklk, plazmitlerin tad DNA parasnn iki katndan daha fazladr.



43


Bu zellik, byk genlerin klonlanmasnda nemli bir avantajdr.

Ayrca baz faj vektrleri birka dzne ya da birka yz nkleotit uzunluunda olan DNA paralarn kabul ederler.



44

Kozmit (hibrit) vektrler

Kozmitler, lambda kromozomunun bir ksm ile plazmitin bir ksmnn birletirilmesi ile oluturulmu melez (hibrit) vektrlerdir.

Kozmitler, lambda fajnn faj protein klfna paketlenmesi iin gerekli olan cos dizileri ile plazmitin replikasyon iin gerekli dizileri ierir.

Ayrca, rekombinant kozmitleri tayan konak hcrelerin tespitine yarayan plazmit kkenli antibiyotik diren geni de ierirler.



45

Kozmit vektrler



46

Kozmit (hibrit) vektrler

Kozmit, bir bakteri konak hcresinin iine girdikten sonra plazmit gibi replike olur.

Lambda genomunun ok kk bir ksmn ierdii iin kozmitler, lambda vektrlerinin tadndan daha byk DNA paralarn tayabilirler.

Kozmitler yaklak 50kb byklnde DNA paralar tayabilirken, faj vektrleri yaklak 10-15 kb byklnde DNA paralar tayabilirler.



47

Mekik vektrler

Deiik kaynaklardan tretilen ve kendi replikasyon orijinlerini ieren dier hibrit vektrler birden fazla konak hcrede replike olabilirler ve mekik vektrler olarak adlandrlrlar.

rnein, SV40 gibi hayvan virsleri.

Bu vektrler genellikle iki tip konak hcre iinde ayrt edilebilen genetik marker ierirler.



48

Mekik vektrler

Tadklar DNAy E. coli ile maya gibi dier konak hcre arasnda tamak iin kullanlr.

Bu vektrler genellikle gen ifadesi almalarnda kullanlrlar.



49

Bakteri yapay kromozomlar (BAC): F faktrleri !

Karmak yapl karyotik genomlarn analizi ve haritalamas iin gerekli olan vektrler, ok byk DNA paralarn tayabilmelidirler.

Baz insan genlerinin uzunluu 2000 kbdan daha uzundur.

Bu genleri tamak iin klonlama kapasitesi daha byk vektrlere gereksinim vardr.



50


Byk klonlama kapasitesine sahip vektrlerden biri, bakteriden reme plazmiti (F faktr) ile oluturulmasna dayanr.

F faktrleri, 1 Mb uzunluuna kadar olan bakteri kromozomlarn tayabildiklerinden, karyotik DNA paralar iin vektr olarak dzenlenmilerdir.

Yaklak 300 kb uzunluundaki bir paray tayabilirler.



51




52


BAC vektrler, Replikasyon ve kopya says iin gerekli olan F faktr genlerini, En az bir tane antibiyotik diren marker genini ve Klonlanacak yabanc DNAnn sokulabilecei restriksiyon

tanma dizilerinin kmelendii polil-inker blgesini ierir.



53

fade vektrleri

q fade vektrleri, seilen bir proteinin birok kopyasn konak hcrede retmek iin dzenlenmi olan vektrlerdir.

q fade vektrleri hem prokaryotik hem karyotik konak hcrelerinde kullanlabilir.

q pET E. coli konak hcresinde kullanlan bir ifade vektrdr.



54

fade vektrleri



55

fade vektrleri

Bu vektr kullanmak iin;

fade edilecek olan gen, vektrn poli-linker blgesindeki tanma dizisi iine klonlanr.

Bir T7 viral promotorunun ve bakteri lac operatrnn yanna yerletirilir.



56

T7 polimeraz

Konak hcre genomu T7 viral polimeraz, lac promotoru ve lac operatr tayacak ekilde deitirilmitir.

Rekombinant plazmit konak hcreye sokulduktan sonra, laktoz yerine geen (analog) IPTGnin ortama ilave edilmesiyle genlerin ifadesi indklenir.

IPTG, basklayc proteini lac operatrnden uzaklatrarak, bakteri kromozomundaki T7 polimeraz geninin ve oklu-balayc (polil-inker) blgesindeki genin aktivasyonunu salar.



57

T7 polimeraz

T7 polimeraz, T7 promotoruna balanr.

Poli-linker blgeye sokulmu olan geni transkribe ederek sz konusu proteinin byk miktarlarda sentezini salar.



58

DNA ilk defa prokaryotik konak hcrelerinde klonlanmtr

oalma, rekombinant molekln konak hcreye aktarlmasndan sonra gerekleir.

Bu, gelitirilen ilk klonlama yntemi olup, hcre-tabanl klonlama olarak bilinir.

Klonlanm DNA yaratmak iin ok yaygn olarak kullanlmaktadr.



59


En yaygn kullanlan prokaryotik konak, K12 olarak bilinen E. colinin bir labaratuvar suudur.

K12 gibi sularn genetik zellikleri ok iyi bilinmektedir ve ok eitli vektrler iin konak olarak kullanlmaktadr.



60

E. coli: Klonlamann basamaklar

Rekombinant DNA molekl yaratmak ve bu molekllere klonlanacaklar E. coli konak hcresine aktarmak iin aadaki basamaklar gereklidir.

1. Klonlanacak DNA izole edilir ve zgl baz dizilerine sahip ular yaratmak iin restriksiyon enzimleriyle muamele edilir.

2. DNA paralar, rekombinant vektr molekl oluturmak zere, ayn enzimle muamele edilmi plazmit moleklleri ile birletirilir.



61


3. Rekombinant vektr, E. coli konak hcresine aktarlr ve rekombinant plazmit dzinelerce kopyasn oluturmak zere orada kendini eler.

4. Besiyerine konulan bakteriler koloni oluturur ve rekombinant plazmitleri ierenleri semek zere koloniler taranr.



62




63


Her bir kolonideki hcreler ayn atasal hcreden olutuu iin, kolonideki tm hcreler ve ierdikleri plazmitler genetik olarak zde klonlardr.



64

Maya hcreleri klonlamada karyotik konak hcreleri olarak kullanlr

Saccharomyces cerevisiae mayas be nedenden tr karyotik genlerin ifadesi ve klonlanmas iin uygun bir konak hcredir.

1. Maya karyotik bir organizma olmasna ramen bakteri hcreleri gibi maniple edilebilir (ynlendirilebilir) ve retilebilir.

2. Maya genetii ayrntl olarak allmtr ve gelitirilmi bir genetik haritas ve saptanm mutasyonlarn gsteren geni bir katalou vardr.



65


3. Ayrca, mayann tm genomunun dizi analizi yaplm ve organizmadaki genlerin ou belirlenmitir.

4. Baz karyotik proteinlerin ilevlerini almak iin, translasyon sonras deiiklikleri yapabilen ve bylece proteinin ilevsel bir ekilde katlanmasn salayan bir konak hcreye gereksinim vardr.

Bakteri konak hcreleri bu tr deiiklikleri yapamaz ve yanl katlanan proteinleri hzla paralar.



66


5. Maya, ekmek yapmnda ve mayal iki endstrisinde yzyllar boyunca kullanlmaktadr ve alar ve tedavi edici ajanlar iin proteinlerin retilmesinde gvenli bir organizma olarak kabul edilmitir.



67

Maya yapay kromozomu

ok eitli maya klonlama vektrleri gelitirilmi olup, bunlardan biri maya yapay kromozomudur ( Yeast artificial chromosome ; YAC ).



68



69


Bir YAC molkl; doal kromozomlarda olduu gibi her iki uta telomer yaps, bir replikasyon orijini (DNA sentezini balatr) ve bir sentromer ierir.

Kromozom, iki seici marker gene (TRP1 ve URA3) ve yabanc DNAn girebilmesini salayan, restriksiyon enzimi tanma dizilerinin kme halinde bulunduu blgeye baldr.



70


Maya kromozomlarnn bykl 230-1900 kb arasnda deiebilir.

Bylece, 100-1000 kb arasndaki byklkte olan DNA paralarnn YAC iine klonlanmas mmkn olur.



71

Genler karyotik hcrelere aktarlabilir Transformasyon-Transfeksiyon

Mayann yan sra, hem bitki hem de hayvan hcreleri, evrelerinden DNA molekllerini ilerine alabilirler.

Dahas YAC gibi ok farkl tipteki vektrler, karyotik hcrelere DNA aktarmnda kullanlabilir.

Eer vektr bir plazmit ise, DNA aktarm transformasyon olarak adlandrlr.

Eer vektr bir virs ise transfeksiyon terimi bir konaa DNA aktarmn tanmlar.



72

Ti plazmidi

Yksek yapl bitkilere gen aktarmak iin bakteriyel plazmitler vektr olarak kullanlr.

Toprak bakterisi Agrobacterium tumifaciens, bitki hcrelerine enfekte eder.

Birok farkl bitki trlerinde gal ad verilen tmrler oluturur.

Tmr oluumu, bakterinin tad tmr-indkleyici (Ti) plazmit sayesinde olur.



73

Konak bitki hcreleri



74

Ti plazmidi

Ti plazmiti tayan bakteriler bitki hcrelerini enfekte ettiinde, Ti plazmitinin T-DNA olarak bilinen ksm, konak bitki hcresinin genomuna aktarlr.

T-DNAsndaki genler tmr oluumunu ve enfekte eden bakterinin bymesi iin gerekli olan bileenlerin sentezini kontrol eder.



75

Ti plazmidi-Kallus oluumu

Yabanc genler, T-DNA parasnn iine sokulabilir.

A. tumifaciens enfeksiyonu ile rekombinant plazmit bitki hcrelerine aktarlabilir.

Hcreye girilince, T-DNA konak hcre kromozomuna katldnda, yabanc DNA da bitki genomuna girmi olur.

Rekombinant Ti plazmiti tayan bitki hcreler, kltr ortamnda kallus (callus) olarak bilinen hcre kitlesi oluturarak byyebilir.



76

Ti plazmidi-Kallus oluumu

Kltr ortamn deitirerek, kalluslarn kk ve srgn oluturmas ve giderek yabanc geni tayan olgun bitkinin oluumu salanabilir.

Yabanc DNA tayan canllar transgenik organizmalar olarak adlandrlr.



77

Konak memeli hcreleri

DNA, memeli hcrelerine eitli yollarla aktarlabilir.

rnein, endositoz ile ya da yapay zar yaplar (lipozomlar) iine hapsedilen DNAnn hcre zarndan fzyonu ile memeli konak hcresi iine aktarm gerekletirilebilir.

Ayrca, YAClar ya da retrovirsler ile oluturulan vektrler kullanlarak da DNA aktarm yaplabilir.



78

YAC neden avantajldr ?

YAClar eitli nedenlerden tr vektr olarak kullanlr.

Bu nedenlerden birisi, farelerin eey hcrelerine gen aktarmnn verimliliini artrmaktr.

Transgenik fare oluturmak iin ilk adm, dllenmi yumurta ya da embriyonik kk hcre gibi uygun bir fare hcresi ekirdeine rekombinant YACn aktarlmasdr.



79

YAC aktarm

Bunu daha sonra DNAnn kromozoma katlmas takip eder.

YAClar farelere eitli yollarla aktarlr.

Birincisi, saf YAC DNAsnn fare yumurta hcresine mikroenjeksiyon yoluyla sokulmasdr.



80

Mikroejneksiyon



81

YAC aktarm

Transgenik zigot daha sonra, gelimesi iin vey anneye implante edilir.

kincisi, YAClar ayn zamanda fare embriyonik kk hcresine (embryonic stem ; ES) aktarlr.

Bu trangenik ES hcreleri daha sonra, erken dnem fare embriyo hcrelerine aktarlr.

Orada eey hcreleri de dahil yetikin dokularn oluumuna katlmas salanr.



82

Retrovirsler ile memelilere aktarm

Memeli hcreleri iin kullanlan dier vektrler, genetik mhendislii ile oluturulmu olan ku ve fare retrovirsleridir.

Bu retrovirslerin tamam tek zincirli RNAdan oluur.



83


Konak hcreyi enfekte ettikten sonra RNA, revers transkriptaz enzimi ile ift zincirli DNA (zDNA,dsDNA) moleklne evrilir.

Bu zDNA, konak genomuna katlr.

Hcre blnmesi srasnda yavru hcrelere aktarlr.



84


Retroviral genomu, ok sayda virs geninin karlmasyla, yabanc DNAy tayacak vektrler haline getirilir.

Bu vektrler, genetik hastalklarn tedavisinde (gen terapisi) kullanlr.

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Cummings & Reece)

Prof. Dr. Bekta TEPE

85

Polimeraz zincir reaksiyonu konak hcre olmadan DNA kopyalar yapar

1986 ylnda, polimeraz zincir reaksiyonu (polymerace chain reaction ; PCR) ad verilen dier bir teknik gelitirilmitir.

PCR, DNA klonlamas iin hzl bir tekniktir.

Bu nedenle rekombinant DNA aratrmalarnn gc artm ve DNA klonlamak iin konak hcre gereksinimini ortadan kaldrmtr.



86


Hcreye dayal klonlama hala kullanlmasna ramen, PCR; molekler biyoloji, insan genetii, evrim, gelime biyolojisi, koruma ve adli tp gibi birok alanda kullanlan bir yntemdir.

PCR, bir seri in vitro reaksiyon boyunca zgl bir DNA dizisinin bir ok kopyasn yapar.

Farkl DNA moleklleri karmnda, yok denecek kadar az miktarda bulunan hedef DNA dizisini oaltabilir.



87


PCR iin n koul, klonlanacak DNAnn nkleotid dizisi hakknda baz bilgilerin gerekliliidir.

Dizi bilgisi, iki oligonkleotit primerin sentezi iin kullanlr:

Klonlanacak DNA dizisinde, biri 5 ucu iin, dieri de 3 ucu iin olmak zere iki primer gereklidir.

Tek zincirli duruma getirilmi bir DNA rneine primerler ilave edilir.



88


Primerler klonlanacak dizideki elenik nkleotitlere balanr (hibridizasyon).

Hibridizasyondan sonra ortama sya dayankl DNA polimeraz ilave edilir.

DNAnn ikinci zinciri sentezlenir.

Bu admlarn tekraryla DNAnn bir ok kopyas oluturulur.



89

PCRnin basamaklar

Pratikte, PCRda adm vardr.

1. Klonlanacak DNA denatre edilerek tek zincirli hale getirilir.



90

PCRnin basamaklar

Bu DNA; Genomik DNA, Mumya kalntlar, Fosiller, Kurumu kan, Semen gibi adli rnekler, Tek bir sa teli, ya da Tbbi kaytlara ait kurumu rnekler gibi deiik kaynaklardan elde edilebilir.



91

PCRnin basamaklar

ift zincirli DNAnn 90-95 Cde stlmas onu tek zincirli hale getirerek denatre eder (genellikle yaklak 5 dakika sre ile).

2. Scaklk 50 C ila 70 C arasnda bir deere drlr. Bu birleme (annealing) scaklnda primerler tek zincirli

DNAya balanr.

Primerler yapay oligonkleotidlerdir (15-30 nkleotit uzunluunda).

oaltlacak hedef DNAnn ularndaki dizilere eleniktir (komplementer).



92

PCRnin basamaklar

Primerler, kalp DNAnn sentezi iin, balang noktas olarak grev yaparlar.

3. DNA polimerazn sya dayankl bir formu (Taq polimeraz) reaksiyon karmna ilave edilir.

DNA sentezi 70 C ila 75 C arasnda gerekleir. Taq polimeraz, nkleotitleri 5 den 3 ne doru ekleyerek

primerlerin uzamasn salar.

Hedef DNAnn iki zincirli kopyasn yapar.



93

PCRnin basamaklar

basamakl her reaksiyon seti; ift zincirli DNAnn tek zincirli hale getirilmesi

(denatrasyon,denaturation),

Primerlerin balanmas ( anniling,annealing) ve Polimeraz enzimi ile zincirin uzamas (ekstensiyon, extencion) basamaklarndan oluur.



94

PCRnin basamaklar

PCR bir zincir reaksiyonudur.

nk, yeni DNA zincirlerinin says her dngde iki katna kar.

Eski zincirlerle beraber yeni zincirler de bir sonraki dngde kalp grevi grr.

Yaklak be dakika sren bir dng birok kez tekrar edilir.

saatten daha az bir zamanda (25-30 dng sonunda), DNA miktar milyon kattan daha fazla artar.



95



96


Bu ilem, thermocycler (s dngcs) denilen makinelerde, nceden dng says ve scaklklar otomatik olarak programlanarak gerekletirilir.

Bu sayede; Klonlama, Dizi analizi, Klinik tan ve Genetik taramalar gibi birok ama iin kullanlan zgl DNA dizileri bol miktarda elde edilir.



97


PCR ile yaplan klonlama ilemi hcre-temelli klonlamadan daha avantajldr.

PCR hzldr ve konak hcre ile yaplan klonlama ilemleri gnler srerken, PCR ile yaplan klonlama birka saat iinde tamamlanr.

lave olarak, PCR primerleri, bilgisayar program destekli aletlerde yaplr.



98

PCRnin kullanld alanlar

Ticari olarak sentezlenmesi de ucuz ve ekonomiktir.

PCR ok hassastr; rnein, tek bir hcrenin iindeki ok kk miktarlardaki zgl DNA dizisini oaltabilir.

PCRn bu zellii onun, genetik testler, adli vakalar ve molekler paleontoloji gibi birok alandaki deerini paha biilmez yapar.



99


Ksmen paralanm, baka maddelerle bulam ya da herhangi gibi bir ortamda gml olan ve dolaysyla klasik metodlarla klonlanmas zor hatta imkansz olan DNA rnekleri de kullanlabilir.



100

PCRnin snrlar

PCR ok deerli bir teknik olmasna ramen, onun da baz snrlar vardr.

Hedef DNAnn nkleotid dizisi hakknda baz bilgiler bilinmelidir.

Dier DNA kaynaklarndan ok kk bir miktarda bir bulama bile sorunlara neden olabilir.



101

PCRnin snrlar

rnein, aratrmacdan dklebilecek deri paralar bir fosilden ya da su mahallinden alnan DNA rneine bulaabilir ve doru sonu alnmas engelleyebilir.



102

PCRnin dier uygulamalar

PCR ile DNA klonlamas molekler biyoloji ve genetikte en ok kullanlan tekniklerden birisidir.

PCR yntemi ile gen haritalamas almalarnda genetik belirte (marker) olarak kullanlan ardk tekrarlanan DNA dizi varyasyonlar ve restriksiyon enzimi tanma dizisi deiiklikleri kolayca saptanabilir.

Gene-zgl primerler, genomik DNAdaki mutasyonlarn taranmas ve buna bal olarak da mutasyonun doasnn kolaylkla saptanmasn salar.



103

PCRnin dier uygulamalar

Rastgele primerler (random primers) DNAy ayrm yapmadan oaltr.

zellikle bilinen bir blgeye komu olan karakterize edilmemi bir DNA blgesine aratrmak iin uygundur.

PCR belirli balina trlerine ait rnlerin dnya apnda satlmas yasan uygulamak iin ve saf kan kpeklerin soyaac gemileri ile ilgili tartmalar zmek iin de kullanlmaktadr.

Ksaca PCR, modern genetiin birok alannda en fazla kullanlan bir tekniktir.



104

Ktphaneler klonlanm dizilerin bir koleksiyonudur

Bir organizmann genomunun kk bir ksmn elde edebilmek iin bile byk klon koleksiyonlarna ihtiya vardr.

Tek bir bireyden treyen klon DNA takm bir klon ktphanesidir.

Bu ktphaneler tm genomu, tek bir kromozomu ya da tek bir hcrede ifade olan genler takmn temsil eder.



105

Genomik ktphaneler

Bir genomik ktphane, bir organizmann genomundaki tm diziler bulunur.

Genomik ktphaneler, konak hcre klonlama yntemleri kullanlarak hazrlanr.

nk, PCR ile klonlanm DNA paralar greceli olarak olduka kktr.

Genomik ktphane yaparken, DNA, hcrelerden ya da dokulardan ayrtrlr.



106

Genomik ktphaneler

Restriksiyon enzimleri ile kesilir ve paralar vektrlere taklr.

Baz vektrler (plazmitler gibi) sadece bir ka bin bp byklnde yabanc DNA tad iin, genomik ktphanenin hazrlanmasnda tm genomu en az sayda klonlarla oluturabilecek uygun vektr seimi nemlidir.



107

nsan genom ktphanesi hazrlamak

nsan genomundaki tm dizileri %99 orannda ierecek kadar byk bir insan genomu ktphanesi hazrlamak istediinizi varsayn.

nsan genomu ok byk olduundan byle bir ktphanenin hazrlanmasnda ncelikle vektr seimi dikkate alnmaldr.



108


Eer ortalama tama bykl 5 kb olan plazmit vektrleri kullanarak bir ktphane oluturursak, genomdaki herhangi bir diziyi %99 olaslkla alabilmemiz iin 2.4 milyondan fazla klona ihtiya vardr.

Byklnden tr bu ktphanede ilgili gen iin etkin bir tarama yapmak olduka gtr.

Tama bykl ortalama 17 kb olan faj vektrleri kullanlacak olursa, bu durumda herhangi bir insan dizisini %99 olaslkla bulmak iin 800.000 klon gereklidir.



109


Bu miktar plazmit ktphanesinden ok daha az olmasna ramen bu byklkteki faj ktphanesinin taranmas ilemi hala ar youn i gc gereken skc bir itir.

Ancak ktphane, ortalama yabanc DNA tama kapasitesi 1Mb olan YAC vektrle hazrlanrsa, ktphane taranma ilemi grece daha kolay olan sadece 14.000 YACtan oluur.

YAC gibi byk klonlama kapasitesine sahip vektrler nsan Genom Projesinin temel parasn oluturur.



110

Kromozom-zgl ktphaneler

Genomun byk parasndan, rnein tek bir kromozomdan oluan bir ktphane, zgl genlerin klonlanmasnda ve kromozom organizasyonu almalarnda byk nem tayabilir.

Drosophilada X kromozomunun yaklak 50 politen bandna karlk gelen kk bir paras mikro ayrtrm ile izole edilmitir.



111


Bu kromozomal paradaki DNA ayrtrlm, bir restriksiyon endonkleaz ile kesilmi ve lambda vektrne klonlanmtr.

Bu X kromozomu blgesi; white, zeste ve Notch genlerinin yan sra;

Bir kromozom parasn, genoma dalm 100den fazla blgeye tayabilen ve yer deitirebilen bir elementin (elemann) (transposable element) girme (insersiyon) blgesini ierir.



112


Teknik adan zor olmasna ramen, bu ilem sonucu, sadece ilgili genleri ve onlara komu olan genleri ieren bir ktphane hazrlanmtr.

Her bir insan kromozomundan hazrlanan klonlanm ktphaneler, ak sitometri (flow cytometry) denen bir teknikle oluturulur.



113

Flow cytometri ile kromozomlarn ayrtrlmas

Her bir kromozomu elde etmek iin mitotik hcreler toplanr.

Metafaz kromozomlar, floresan boyalar ile boyanr.

Boyanan kromozomlar, lazer n demetinin nnden geirilerek malar salanr.

Bir fotometre onlar baladklar boya ve yaydklar nlara gre ayrarak gruplandrr.



114



115


Kromozomlar izole edildikten sonra DNA ayrtrlr.

Restriksiyon enzimi ile kesilir ve DNA paralar bir vektre klonlanr.

nsan kromozomlarnn her biri iin klon ktphaneleri hazrlanm ve ktphaneler nsan Genom Projesinde nemli rol oynamtr.



116

Pulsed-field elektroforezi

Dier yntemler kullanlarak da ktphane hazrlamak iin her bir kromozom saflatrlabilir.

Pulsed-field (atml-alan) jel elektroforezi olarak bilinen bir elektroforez eidi, kromozoma zgl ktphanelerin hazrlanabilmesi iin maya kromozomlarnn izolasyonunda kullanlmtr.



117

Pulsed-field elektroforezi



118

Pulsed-field elektroforezi: Maya Genom Projesi

Mayann III. kromozomunun (315kb) klon ktphanesinin oluturulmas Maya Genom Projesinin balang noktas olmutur.

Bu kromozomu ve maya genomunun geriye kalan dizilerinin analizi bir laboratuvarlar konsorsiyumu tarafndan gerekletirilmitir.

Kromozom IIIn dizi analizinin beklenmeyen sonularndan biri, bu kromozomdaki genlerin yaklak yarsnn daha nceden bilinmediinin ortaya karlmasdr.



119

Tek kromozom ktphaneleri

Mutagenez ve genetik analizler gibi klasik metotlarn baarsz olduu ve mRNA problarnn ya da gen rnlerinin olmad ya da bilinmedii durumlarda, bir genetik blgenin incelenmesinde tek-kromozom ktphaneleri ok deerlidir.

Ayrca, kromozom-zgl ktphaneler, genomdaki belirli bir blgedeki molekler organizasyonunda, hatta nkleotid dizisi almalarnda da byk yarar salamaktadr.



120

cDNA ktphaneleri: Aktif mRNAlarn tespiti

Geliim, hcre lm, kanser ve dier biyolojik srelerdeki zgl olaylar almak iin belirli bir zamanda belirli bir hcre tipinde ifade olan genomun belirli ksmlarna ait bir ktphane ok deerli bir ara olabilir.

Genomik ktphaneler ve kromozom ktphaneleri bir genomdaki ya da bir kromozomdaki tm genleri ierir.

Fakat bu koleksiyonlar bir hcredeki transkripsiyonel olarak aktif olan genleri bulmak iin dorudan kullanlmaz.



121


Bir cDNA ktphanesi, belirli bir zamanda, hcre topluluunda bulunan ve ktphanenin hazrland zaman hcrede transkripsiyonel olarak aktif olan genlere ait mRNA molekllerinden yaplan DNA kopyalarn ierir.

Burada elde edilen DNA, mRNAnn nkleotit dizisine eleniktir (komplementer).



122


cDNA ktphanesindeki klonlar genomik ktphanedeki klonlarla ayn deildir.

karyotik mRNA ncl mRNAnn ilenmesiyle ortaya kar.

lenme srasnda intron dizileri ortadan kaldrlmaktadr.

Ayrca, genlerin yaknnda yerleim gsteren ve genin aktivitesini dzenleyen dizileri de iermez.



123

cDNA ktphanelerinin oluturulmas

cDNA ktphanesinin oluturulmas bir hcre topluluundan mRNA izolasyonu ile balar.

Hemen hemen tm karyotik mRNA moleklleri 3 ularnda poli-A kuyruu tadklar iin mRNA izolasyonu mmkndr.

Poli-A kuyruu olan mRNAlar ayrtrlr ve komplementer DNA moleklnn (cDNA) sentezi iin kalp olarak kullanlr.



124


cDNA moleklleri daha sonra vektrlere klonlanarak belirli bir zamanda transkripsiyonel olarak aktif olan genleri gsteren cDNA ktphaneleri oluturulur.

cDNA ktphanesi yapmak iin ilk adm, poli-A kuyruklar olan mRNAlar, poli-A kuyruklar ile birleerek ksmi ift zincirler oluturan oligo-dT primerleri ile kartrmaktr.



125



126


Revers transkriptaz (geri transkriptaz) ad verilen enzim, primerleri uzatr.

mRNA dizisinin komplementeri olan DNA kopyasn sentezler.

Bu reaksiyonun rn mRNA-DNA ift zinciri olan melez bir molekldr.



127


RNAz H enziminin ilevi ile RNA zincirinde kesikler oluturularak RNAnn ksmi paralanmas salanr.

Geriye kalan RNA paralar DNA polimeraz I ikinci DNA zincirini sentezler.

RNA primerlerini uzaklatrarak ift zincirli cDNA oluturur.



128


cDNA moleklnn ucuna balayc (linker) dizileri taklrsa, cDNA, bir plazmit ya da faj vektre klonlanabilir.

Linker dizileri bir restriksiyon enziminin (r. EcoRI) tanma dizisini ieren, ksa ift zincirli oligonkleotitlerdir.

Balayc dizi cDNAya takldktan sonra EcoRI ile kesilir.

Ayn enzimle ilem grm vektrle birletirilir.



129


Geliimin zgl aamalarndaki doku ve hcrelerden ya da beyin, kas, bbrek gibi farkl organlardan hazrlanm birok cDNA ktphaneleri vardr.

Bu ktphaneler, belirli bir zamanda, bir hcrede aktif olan tm genlere ait hazr bir katalogdur.



130

RT-PCR ile ktphane oluturulmas

Bir cDNA ktphanesi, PCRnin bir eidi olan revers transkriptaz PCR (RT-PCR) yntemi kullanarak da hazrlanabilir.

Bu ilemde, revers transkriptaz, mRNA molekllerinin tek zincirli cDNA kopyalarn oluturur.

Bu reaksiyonu, PCR ile tek zincirli DNAnn ift zincirli molekle evrilmesi ve birok kopyasnn oluturulmas ilemi takip eder.

Tek zincirli cDNAya Tag polimeraz ve rastgele primerler (random primers) (belirli bir gene zgl olmayan) ilave edilir.



131


Primerlerin balanmasndan sonra Tag polimeraz primerleri uzatarak ift zincirli cDNA yapar.

PCRn ilave dngleri ile cDNAnn birok kopyas oluturulur.

oaltlan cDNA , plazmit vektrlere klonlanarak cDNA ktphanesi elde edilir.



132


RT-PCR, klasik cDNA hazrlanmasndan daha duyarldr.

Hcrede sadece bir ya da iki kopya bulunan mRNAlar belirlemek iin gl bir aratr.



133

zgl klonlar bir ktphaneden elde edilebilir

Bir genomik ktphane genellikle yzbinlerce klondan oluur.

zgl bir geni bulmak iin, sadece bu geni ieren klon ya da klonlar belirlememiz ve ayrtrmamz gerekir.

Ayrca, klonun alacamz genin tamamn m yoksa bir ksmn m ierdiini de saptamamz gerekir.



134

Problar zgl klonlar saptar

Problar, zgl bir gene ait klonlar elde etmek amacyla bir ktphaneyi taramak iin kullanlr.

Prob, ktphanedeki klonlanm bir dizinin bir ksmna elenik (komplementer) olan ve bir ekilde iaretlenmi DNA ya da RNA dizileridir.

Hibridizasyon reaksiyonunda kullanlan prob, bir ya da daha fazla klonda bulunan komplementer DNA dizlerine balanr.



135


Bir ktphanedeki zgl klonun yerini saptamak iin problar radyoaktif izotoplarla ya da kimyasal veya renk reaksiyonuna giren bileiklerle iaretlenebilir.

Problar ok eitli kaynaklardan hazrlanabilir.

Hatta, eer DNA dizisi trler arasnda byk oranda korunmu ise, ilgili gen dier trlerden ayrtrlp, elde edilerek, prob olarak kullanlabilir.



136


rnein, Afrika trnakl kurbaas Xenopus laevise ait ribozomal RNA genleri santrifj ile ayrtrlr ve plazmit vektrlere klonlanr.

Eer bir genomik ktphaneden, belirli bir tip hcrede ifade olan bir gen elde edilecekse, cDNA problar kullanlabilir.

Bu teknik, bir gen rnnn mRNAsnn elde edilmesinde zellikle ok yararldr.



137


rnein, krmz kan hcrelerinin belirli geliim aamalarnda, -globin mRNA konsantrasyonu ok fazladr.

Bu hcrelerden elde edilen mRNA, prob olarak kullanmak iin revers transkriptaz ile cDNA moleklne evrilebilir.



138

Bir ktphanenin taranmas

Bir plazmit ktphanesinin taranmas iin, klonlar tayan bakteriler nutrient agar plaklarda retilir.

Yzlerce hatta binlerce koloni oluur.



139


Kolonilerin kopyalarnn alnmas iin plak yzeyine naylon bir filtre yavaa bastrlr.

Bu ilem, bakteri kolonilerinin plaktan filtreye aktarlmasn salar.

Filtre, bakteri hcrelerini paralamak, paralanan hcrelerden salnan ift zincirli DNAy denatre ederek tek zincirli hale getirmek ve bu zincirleri filtreye balamak iin ilemlerden geirilir.



140


Filtredeki DNA, iaretli bir nkleik asit probu ile inkbe edilerek taranr.

Filtre zerindeki klonlanm DNAlardan herhangi biri zerindeki nkleotit dizisi probun tamamlaycs (komplementeri) ise, ift zincirli hibrit bir molekl oluacaktr.



141


Prob ile filtrenin inkbasyonundan sonra filtre ykanarak, balanmam ve/veya fazla prob moleklleri filtreden uzaklatrlr.

Filtrede hibrit molekllerinin olup olmadn saptamak zere filtre incelenir.

Eer radyoaktif bir prob kullanlm ise, filtrenin zerine bir rntgen filmi yerletirilir.



142


Filtre zerindeki DNAya bal probdaki radyoaktif ma, banyo edildiinde koyu lekeler oluturacak ekilde rntgen filmine yansr.

Bu lekeler, klonlanm ilgili geni ieren plaktaki kolonileri gstermektedir.

Film zerindeki lekelerin konumlarn rehber alarak, ilgili geni ieren bakteri kolonisi orijinal nutrient plakta belirlenir ve plaktan alnr.



143



144

Plak hibridizasyonu

Faj ktphanesini taramak iin kullanlan farkl bir yntemdir.

DNA parasn tayan faj zeltisi, plakta reyen bakterilerin zerine yaylr.

Fajlar, plaktaki bakteri hcrelerini enfekte ederler ve kendilerini elerken plak olutururlar.



145

Plak hibridizasyonu

Her plak, parlak ve belirgin noktalar halinde grnr.

Tek bir fajdan meydana gelmi nesilleri temsil eder ve dolaysyla bir klondur.

Bu plaklar naylon membranlara aktarlr.



146

Plak hibridizasyonu

Fajlar paralanr ve filtre zerindeki DNA tek zincirli hale getirilip iaretli prob ile hibridize edilerek taranr.

Faj plaklar plazmit kolonilerinden ok daha kktrler.

Tek bir filtre ile ok daha fazla plak taranabildiinden, byk genomik ktphaneler iin bu metot daha uygundur.



147

Klonlanm diziler eitli yollarla tanmlanabilir

Klonlama ya da PCR ile genlerin ve dier zgl DNA blgelerinin elde edilebilmesi ve tanmlanabilmesi, genomik yap ve fonksiyon almalar iin nemli bir ara olmutur.

nsan Genom Projesi bu tip tekniklere dayanmaktadr.



148

Restriksiyon haritalamas

Bir klon DNAnn tanmlanmasndaki ilk adm, bir restriksiyon haritasnn karlmasdr.

Restriksiyon haritas; Klonlanm bir DNA paras zerindeki restriksiyon enzimi

kesim blgesinin saysn,

Sralann ve Aralarndaki uzaklklar ortaya karr.



149


Klonlanm farkl DNAlara ait restriksiyon haritalar, genellikle, sz konusu klon iin bir kimlik grevi grecek kadar farkldr.

Harita birimleri; baz ifti (b) (base pairs,bp) olarak ya da daha uzun mesafeler iin kilobaz (kb) ifti (kilobase, kb) olarak ifade edilir.

Restriksiyon haritalar, klonlanan DNA parasnn uzunluu ve restriksiyon enzim kesim blgelerinin yerleri hakknda da bilgi salar.



150


q Bu bilgi, bir gen parasnn tekrar klonlanmasn ya da klonlanm parann i organizasyonunu klonlanm dier dizilerinki ile karlatrlmasn salar.

q DNAnn restriksiyon enzimleri ile kesimi sonucu oluturulan paralar jel elektroforezi ile ayrlabilirler.



151


q Bu metot, DNA paralarn byklklerine gre ayrr.

q Kk paralar daha hzl hareket ederler.

q Jelde ayrlan DNA paralar etidyum bromr ile boyanp, ultraviyole altnda incelendiinde, bir seri bantlar halinde grnrler.



152




153



154


q ekil 19-23, klonlanm bir DNA parasnn restriksiyon haritasnn oluturulmasn gstermektedir.

q Bu harita iin elimizde 7.0 kb byklnde klonlanm bir DNA paras olduunu varsayalm.

q Bu DNA parasnn ayr tpte, restriksiyon enzim kesimi gerekletirilir.



155


q DNA birinci tpte Hind III, ikincide Sal ve ncde hem Hind III hem de Sal I ile kesilir.

q Kesim sonucunda oluan paralar jel elektroforezi ile ayrlr ve etidyum bromr ile boyanr.

q Jel zerinde oluan bantlarn resmi ekilir ya da analiz iin bu bantlar taranr.



156


q Paralarn bykl, ayn jelde yan hatta yrtlen molekler arlk standartlar ile karlatrlarak hesaplanr.

q Restriksiyon haritas, paralarn say ve byklk bakmndan analiz edilmesiyle ortaya karlr.

q DNA Hind III ile kesildiinde, klon DNAnn byklnn 7.0 kb olduunu gsteren iki para (0.8 ve 6.2 kb byklnde) elde edilir.



157


q Bu bize, Hind III enziminin sadece bir kesim blgesi (DNAnn bir ucundan 0.8 kb uzaklkta) olduunu gsterir.

q DNA Sal I ile kesildiinde, iki para (1.2 kb ve 5.8 kb byklnde) elde edilir.

q Bu da, klonlanm DNA parasnn bu enzim iin bir utan 1.2 kb uzaklkta sadece bir kesim noktas olduunu gsterir.

q Bu sonular, DNAnn her iki enzim iin birer kesim noktas ierdiini gsterir.



158



159


q Restriksiyon haritalar klonlanm DNAnn karakterizasyonu iin ok nemlidir.

q Restriksiyon haritalamalar; q Bir genin snrlarnn belirlenmesi, q Gen ii ve onun etrafndaki ara blgelerin organizasyonu ve q Gen iindeki mutasyon tayan blgelerinin yerlerinin

belirlenmesi

amacyla kullanlabilir.



160


q Restriksiyon haritalar zgl kromozomlardaki insan genlerinin haritalanmas ve her bir kromozomdaki yerlerinin belirlenmesinde ok nemli rol oynamtr.



161


Dier yandan, eer restriksiyon tanma dizisi mutant allel ile yakn balantl ise, bu diziler; Tan testlerinde, ekinik kaltsal bozukluklarn tayclarnn belirlenmesinde Fetal genotipin prenatal (doum ncesi) tansnda marker olarak kullanlabilir.



162

Nkleik asit blotlamas

Buradaki tekniklerin ou birbirinin tamamlaycs (komplementeri) olan nkleik asit (DNA ya da RNA) moleklleri arasndaki hibridizasyona dayanr.



163

Sourthern blot

Sourthern Blot yntemi bir ktphanedeki klonlardan hangisinin belirli bir geni (ribozomal DNA, globin geni vb. gibi) ierdiini saptamak iin kullanlr.

q Bu tekniin iki bileeni vardr: q DNA paralarnn jel elektroforezi ile ayrlmas q Paralarn iaretli problarla hibridizasyonu



164

Sourthern blot

q Jel elektroforezi, DNAnn restriksiyon enzimleri ile kesimi sonucunda oluan paralarn saysn ve molekler arlklarn gsteririr.

q Hibridizasyon, DNA paralarndaki proba elenik olan dizileri gsterir.

q Sourthern blot hibridizasyonu ile belirlenen DNA, genomik DNA ya da bir ktphaneden seilmi klonlar gibi eitli kaynaklara ait olabilir.



165

Sourthern blot

q Sourthern blot yapmak iin, DNA bir ya da daha fazla restriksiyon enzim ile kesilir.

q Oluan paralar jel elektroforezi ile bir seri bantlar halinde ayrlr.



166



167

Sourthern blot

q Jeldeki DNA boyanr ve fotoraf ekilir ya da restriksiyon paralarnn saysn ve molekler arln saptamak iin taranr.

q Hibridizasyon iin, jeldeki DNA paralar alkali muamelesi ile denatre edilerek tek zincirli hale getirilir.

q Daha sonra jelin stne, DNA balayan bir filtre (membran) (genellikle nitroselloz ya da naylon) kat yerletirilir.



168

Sourthern blot

q Membran ve jel, tampon zelti iine oturtulmu bir sngerin zerine yerletirilerek jeldeki DNA paralar membrana aktarlr.

q Filtre kadnn zerine kat havlular ya da kurutma katlar konur.

q Onlarn zerine de bir arlk yerletirilir.



169

Sourthern blot

q Kapiler hareket tampon zeltisini jelin iinden yukar doru ekerken DNA paralarn da filtre kadna aktarr.

q Filtre kad, hibridizasyon iin tek zincirli ve iaretli prob ieren, az ksm syla kapatlan bir plastik torba iine konur.

q Filtre kadna aktarlan DNA paralarndan probun nkleotit dizisine komplementer olanlar probla birleerek ift zincirli hibritler oluturur.



170

Sourthern blot

q Fazla prob ykanarak uzaklatrlr.

q Hibridize olmu paralar bir film zerinde grntlenir.

q Bylelikle bu teknik ile, birok DNA paras iinden, ilgilenilen geni tayan tek bir parann belirlenmesi mmkn olabilir.



171

Sourthern blot



172

Sourthern blot

q Bu teknikle ayrca, normal hcrelere ait bant kalplar ile genetik bozukluu olan ya da kanserli hastalara ait kalplar karlatrarak, q nsan genetik bozuklular ve kanserle ilikili genlerdeki genetik

deiiklikleri,

q Duplikasyonlar ve q Delesyonlar ortaya karmak iinde kullanlr.



173

Northern blot

q Klonlanan bir genin, belirli bir doku ya da hcre tipinde transkripsiyon asndan aktif olup olmadnn tayini iin,

q Klonlanan genin elenii olan mRNAnn varlnn aratrld bir blotlama teknii uygulanr.

q Bunun iin, zgn bir hcre veya dokudan mRNA elde edilir.

q Bu RNA jel elektroforezi ile ayrtrlr.



174

Northern blot

q Jeldeki RNA bantlar, Sourthern blot tekniinde olduu gibi bir membrana aktarlr.

q Daha sonra membran, klonlanm genin kopyasndan tretilen tek zincirli ve iaretli DNA probu ile hibridize edilir.

q Eer DNA probuna komplementer mRNA varsa probla hibridize olacandan, film zerinde bant eklinde belirecektir.



175

Northern blot

q Orijinal blotlama (DNAnn filtreye baland) ilemine Sourhern blot dendii iin, bu blotlama (RNAnn filtreye baland) ilemine northern blot ad verilmitir.

q Bunu takiben, proteinlerin bir membrana baland bir baka teknie de biraz ters bir mantkla western blot ad verilmitir.

q Northern blot, zgl genlerin ifadeleri hakknda bilgi verir.



176

Northern blot

q Embriyonik, kanser ve genetik bozukluk olan dokulardaki genlerinin ifadesinin aratrlmasnda kullanlr.

q Northern blot ayrca, seenekli splays (splice) sonucu oluan mRNAlar saptar.

q Transkripsiyona uram mRNA rnleri ile ilgili dier bilgilerin elde edilmesinde kullanlr.



177

Northern blot

q Eer uzunluu bilinen marker RNAlar kontrol olarak incelenen RNA ile ayn elektroforeze konursa, incelenen genin bykl hakknda bilgi edinilebilir.

q Northern blot, farkl hcrelerde, dokularda ya da organizmalardaki genlerin transkripsiyon aktivitesini belirler ve ler.



178

DNA dizi analizi bir klonun tanmlanmasnda en kesin yoldur

q DNA, ancak nkleotid dizisi bilindii zaman tam anlamyla karakterize edilebilmektedir.

q En ok kullanlan DNA dizi analizi yntemi, James Sanger ve arkadalar tarafndan gelitirilendir.



179


Bu ilemde, dizisi belirlenecek DNA molekl bir seri elenik zincirlerinin sentezlenebilmesi iin nce tek zincirli hale dntrlr.

Bu elenik zincirlerden her biri; farkl, zgl nkleotidlerde geliigzel sonlanmtr.



180



181


q Bu ilem sonucunda; elektroforezle birbirinden ayrlan bir seri DNA paralar ortaya kar.

q DNA dizisinin saptanmas iin incelenir.

q Bu reaksiyonda ilk adm, DNAnn syla denatre edilerek tek zincirli duruma getirilmesidir.



182


q Tek zincirli DNA, 3 ucuyla birleecek olan primerler ile kartrlr.

q Primer bal tek zincirli DNA rnekleri drt ayr tpe pay edilir.

q Bir sonraki admda, tplere DNA polimeraz ve drt tip deoksiribonkleotit trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ilave edilir.



183


q Ayrca her tpe, dideoksinkleotit (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) denilen yaps deitirilmi deoksiribonkleotitlerden bir tanesi az miktarda ilave edilir.

q Dideoksinkleotitler 3- OH gubu yerine 3- H ierirler.

q Deoksiribonkleotitlerden biri ya da primer daha sonra dizi analizini yapabilmek iin radyoaktivite ile iaretlenir.



184


q Her tpe DNA polimeraz konarak primer, kalp zincirin komplementerini oluturacak ekilde 5- 3 ynnde uzatlr.

q DNA sentezi gerekleirken polimeraz, uzayan zincire deoksiribonkleotit yerine ara sra dideoksinkleotit katar.

q Dideoksinkleotit yapsnda 3- OH bulunmad iin dier nkleotit ile 3 ba yapamaz ve DNA sentezi durur.

q rnein, ddATPnin olduu tpte, polimeraz enzimi dATP yerine ddATPyi zincire katnca zincirin uzamas sonlanr.



185



186


q Reaksiyon ilerledike, ddATP tpnde Ann bulunduu her konumda sonlanm olan DNA moleklleri elde edilecektir.

q Dier tplerde, reaksiyonlar srasyla, G, C ve T de sonlanacaktr.

q Her bir reaksiyon tpndeki DNA paralar jel elektroforezinde yan yana yklenerek ayrtrlr.

q Sonuta, jelin stne konan filmin banyo edilmesiyle bantlarn merdivene benzer bir grnts ortaya kar.



187



188


q DNA dizi analizi byk aptaki genom dizisi projelerinde otomatik hale gelmitir.

q Bu sistemde gnde yz binlerce nkleotit dizisini belirleyebilen makineler kullanlmaktadr.

q Bu ilemde, drt dideoksinkleotit analoglarndan her biri farkl floresan boya ile iaretlenmitir.



189


q Bylece, rnein, adenozin ile sonlanan zincirler bir renkte iken, sitozin ile sonlanan zincirler baka bir renktedir.

q Bu ekilde 4 ayr renk bulunur.



190



191


q Tm iaretli dideoksinkleotitler tek bir tpe ilave edilir.

q Primerler DNA polimerazla uzadktan sonra reaksiyon rnleri jelin tek kuyucuuna yklenir.

q Jel, lazer k kayna ile taranarak her bantn farkl renkte ma vermesi salanr.



192


q Dizi makinesine bal bir detektr her bandn rengini okur.

q A, T, C ve Gden hangisinin olduunu saptar.

q Aletin yazcsndan, her biri bir nkleotide karlk gelen renkli pikler elde edilir.



193



194

DNA dizi analizi ve genom projeleri

q DNA dizi analizi genom projelerinin kalbidir.

q Rekombinant DNA teknolojileri ve nkleotit dizi analizi birlikte kullanlarak 100den fazla prokaryot trne ait analizi gerekletirilmitir.

q DNA dizi analizi teknii kullanlarak birok karyota ait genom projeleri de tamamlanmtr ve dzinelerce halen analiz edilmektedir.



195

TEEKKR

Bu sunumun hazrlanmasndaki katklarndan dolay aada isimleri verilen rencilerime teekkr ederim.

FATMA GNDOAN

DENZ BABACAN



196

19 rekombinant dna teknoloj

Documents