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(19)대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(51) 。Int. Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
(45) 공고일자
(11) 등록번호
(24) 등록일자
2006년10월12일
10-0632696
2006년09월29일
(21) 출원번호 10-2005-0031423 (65) 공개번호
(22) 출원일자 2005년04월15일 (43) 공개일자
(73) 특허권자 한림제약(주)
경기 용인시 유방동 1007
에이치 엘 지노믹스(주)
경기도 용인시 유방동 210-1
(72) 발명자 황근배
경기 수원시 영통구 매탄2동 111-165 장미연립 104동 207호
안종웅
부산 영도구 동삼동 1번지 한국해양대학교
정영훈
경기 용인시 구성읍 보정리 포스홈타운아파트 212-804
지옥표
서울 관악구 봉천동 푸르지오아파트 122-1901
김재신
서울특별시 송파구 잠실7동 아시아 선수촌아파트 10동 102호
류종현
경기 과천시 별양동 7 주공아파트 407동 607호
하문천
경기 용인시 포곡면 인정멜로디아파트 105-1604
노영식
경기 수원시 장안구 연무동 256-16 새그린빌라 나동 401호
(74) 대리인 오국진
(56) 선행기술조사문헌
논 문
1020050031423 - 673729
1020050031423 - 673728
* 심사관에 의하여 인용된 문헌
심사관 : 이충호
등록특허 10-0632696
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(54) 아피쿨라렌 Ａ의 제조 방법
요약
본 발명은 아피쿨라렌 A(apicularen A)를 생산하는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184
(기탁번호 KFCC 11348P), 및 a) 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)를 배양하는 단계로서, 배양
중 배양물의 일부를 제거하고 새로운 배지를 공급하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 b) 상기 단계에서 제조되는 배양액을
정제하여 아피쿨라렌 A를 회수하는 단계를 포함하는 아피쿨라렌 A의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 및
방법을 이용하면 아피쿨라렌 A를 고수율로 생산할 수 있다.
대표도
도 1
색인어
아피쿨라렌 A(apicularen A), 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184
명세서
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A의 바람직한 생산 방법의 일 예를 단계별로 나타낸 것이다.
도 2는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 액체 배지 상에서 배양시킨 결과를 나타낸 현
미경 사진이다(200배 확대).
도 3은 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 VY/2 아가 배지 상에서 배양시킨 결과를 나
타낸 현미경 사진이다(200배 확대).
도 4는 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 있어서 배양시간에 따른 용존 산소 농도 및 pH 변화를 나타내는 그래프
이다.
도 5는 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 의해 생산된 아피쿨라렌 A의 HPLC 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 의해 생산된 아피쿨라렌 A의 1H-NMR 분석 결과이다.
발명의 상세한 설명
발명의 목적
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
본 발명은 아피쿨라렌 Ａ를 생산하는 신규한 미생물 및 이를 이용한 아피쿨라렌 Ａ(apicularen A)의 제조 방법에 관한 것
이다.
아피쿨라렌 A(apicularen A)는 하기 화학식 1과 같이 10-원의(membered) 락톤 환(lactone ring)으로 구성되는 마크로
리드계(macrolides)의 화합물로서, 골다공증 치료, 종양세포의 성장억제, 증식성 세포의 성장억제 및 암 치료에 유용한 것
으로 알려져 있다(WO 02/12223 A1). 또한, 아피쿨라렌 A(apicularen A)는 0.1~3 ng/ml 농도 수준에서 각종 인간 및 동
물의 종양세포에 대해 세포 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(WO 99/47523 A1).
등록특허 10-0632696
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<화학식 1>
상기와 같은 다양하고 우수한 아피쿨라렌 A의 활성이 알려지면서 아피쿨라렌 A를 대량 생산하기 위한 연구가 활발히 이
루어지고 있다. 현재 아피쿨라렌 A의 생산 방법으로서 화학적 합성 방법과 생물학적 배양 방법이 알려져 있다.
아피쿨라렌 A의 화학적 합성 방법은 문헌 [Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Oct 4; 41] 및 WO 02/12223 A1에 개시되
어 있다. 상기 종래 방법 모두 18 단계 이상의 반응 단계를 수행하여야 하며 반응 조건들 또한 -78℃ 이하에서 수행되어야
하는 단계들이 대부분이라는 문제점이 있다. 또한, 고가의 반응시약들을 사용하면서도, 전체 반응수율은 5% 미만을 보인
다. 합성 방법의 경우 다음 단계 반응에 지장을 주지 않기 위해서는 각 반응 후에 필히 정제 과정을 진행하여야 하며 이에
많은 시간과 장비들이 투입되어야 하기에 산업적인 면에서나 경제적인 면에서 효과적이지 못하다.
미생물 배양을 이용하는 아피쿨라렌 A의 생물학적 생산 방법은 문헌 [Brigitte Kunze et al., The Journal of Antibiotics,
51(12):1075-80, 1998] 및 WO 99/47523 A1에 개시되어 있다. 생물학적 생산 방법은 합성 방법에 비해 시간이 적게 소
요되고 정제 과정이 상대적으로 용이하다는 장점을 갖는다. 또한, 균주의 종류, 기질의 종류와 사용량, 미량원소 조절, 공
기주입량의 조절 및 배양 조건 등에 따라 상당한 수율 차이를 보일 수 있기 때문에 적당한 배양 조건만 확립한다면 수율을
향상시킬 수 있다는 장점을 갖는다.
상기 Brigitte Kunze et al의 문헌은 콘드로마이세스 속 미생물, 예컨대 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces
apiculatus), 콘드로마이세스 로버스투스(Chondromyces robustus), 콘드로마이세스 페디쿨라투스(Chondromyces
pediculatus), 콘드로마이세스 라누지노수스(Chondromyces lanuginosus)로부터 아피쿨라렌 A를 생산할 수 있음을 개시
하고 있다. 또한, 상기 문헌은 콘드로마이세스 로버스투스(Chondromyces robustus) 균주 Cm r8의 배양을 이용하는 아
피쿨라렌 A의 생산 방법을 개시하고 있다. 상기 방법에 의한 아피쿨라렌 A의 생산 능력은 미생물의 영양원 공급체의 종류
에 따라 다소 차이가 있지만, 0.5~2.4 mg/L으로 낮은 수준이었다. 또한, WO 99/47523 A1은 콘드로마이세스 로버스투스
(Chondromyces robustus) 균주 Cm r8 DSM 12054의 배양을 이용하는 아피쿨라렌 A의 생산 방법을 개시하고 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 종래의 회분식 배양 방법을 이용한 아피쿨라렌 A의 생산 방법은 생산 능력에 한계를 갖는 문제
점이 있다. 또한, 콘드로마이세스속 미생물은 분리가 어렵고, 원핵생물 가운데 가장 복잡한 라이프 사이클을 갖고 생육 조
건이 까다롭기 때문에 인공배양이 어려운 실정이다.
이에 본 발명자들은 아피쿨라렌 A를 생산하는 효과적인 방법을 개발하기 위하여 연구를 계속하던 중, 아피쿨라렌 A를 생
산하는 능력이 우수한 신규한 미생물 균주를 분리 및 동정하고, 주입 및 배출(Fill and Draw) 배양법을 이용하여 아피쿨라
렌 A를 고수율로 생산할 수 있는 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
본 발명의 목적은 아피쿨라렌 A를 생산하는 신규한 미생물 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 미생물 균주를 이용한 아피쿨라렌 Ａ의 효과적인 제조 방법을 제공하는 것이다.
발명의 구성 및 작용
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아피쿨라렌 A를 생산하는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces
apiculatus) JW184(기탁번호 KFCC 11348P)를 제공한다.
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본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)를 배양
하는 단계로서, 배양 중 배양물의 일부를 제거하고 새로운 배지를 공급하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 b) 상기 단계에서
제조되는 배양액을 정제하여 아피쿨라렌 A를 회수하는 단계를 포함하는 아피쿨라렌 A의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배양물의 일부 제거 및 새로운 배지 공급은 5~15회 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 a) 배양 단계는 a-1) 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184
(기탁번호 KFCC 11348P)를 배지 중에서 공기 주입 속도 0.1~2 vvm 하에서 배양하는 단계; 및 a-2) 배양물의 일부를 제
거하고 새로운 배지를 공급하는 단계로서, 상기 배양물의 제거 및 새로운 배지의 공급은 배양액 중의 용존 산소가 감소하
였다가 다시 증가하다가 더 이상 변화가 없는 시점에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배지는 대두분말(soybean flour), 탈지대두, 클로렐라 및 소이펩톤(soypeptone)으로 구성
되는 군에서 선택되는 하나 이상의 질소원을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 질소원은 0.45~5 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배지는 CuSO4, Na2MoO4·2H2O, LiCl, SnCl2·2H2O, H3BO3, KBr, KI, CoCl2, ZnCl2,
MnCl2·4H2O, EDTA 및 시아노코발라민(cyanocobalamine)을 함유하는 미량 원소 용액을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 미량 원소 용액은 CuSO4 0.3~2.5 중량부, Na2MoO4·2H2O 0.3~2.5 중량부, LiCl
0.2~1.5 중량부, SnCl2·2H2O 0.2~1.5 중량부, H3BO3 0.3~2.5 중량부, KBr 0.7~5.0 중량부, KI 0.7~5.0 중량부,
CoCl2 3.0~5.0 중량부, ZnCl2 3.0~5.0 중량부, MnCl2·4H2O 17~23 중량부, EDTA 1500~1700 중량부 및 시아노코발
라민(cyanocobalamine) 80~120 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배지의 pH는 6.9~7.6인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 제거되는 배양물 및 공급되는 새로운 배지는 각각 배양물에 대하여 30~70 중량%인 것이
바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 b) 정제 단계는 b-1) 상기 회수된 배양액 및 잔여 배양액 혼합물을 원심분리하여 균체 및
상등액으로 분리하는 단계; b-2) 상기 균체를 유기 용매로 추출하는 단계; b-3) 상기 상등액을 흡착하고 유기 용매로 추출
하는 단계; b-4) 상기 b-2) 단계 및 b-3) 단계의 추출 혼합물을 농축하는 단계; 및 b-5) 크로마토그래피를 이용하여 정제
하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 방법으로, 상기 b) 정제 단계는 b-1) 상기 회수된 배양액 및 잔여 배양액 혼합물을 동결 건조하는 단계; b-2) 상기 건
조물을 유기 용매로 추출하는 단계; b-3) 감압 여과 및 농축시키는 단계; 및 b-4) 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단
계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일면은 아피쿨라렌 A를 생산하는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184에 관한 것
이다.
본 발명자들은 아피쿨라렌 A를 고수율로 생산할 수 있는 새로운 균주를 찾기 위해서, 토양으로부터 다수의 시료를 채취하
고 그로부터 미생물을 분리하여 각 미생물의 아피쿨라렌 A 생산 능력을 확인하였다. 그 결과 JW184 균주의 아피쿨라렌 A
생산 능력이 가장 우수하였다. 상기 균주를 동정한 결과 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)의 신
균주로 확인되었다.
상기 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 한국미생물보존센터에 2005년 3월 12일에 기
탁 신청하여, 기탁번호 KFCC 11348P로서 기탁하였다.
등록특허 10-0632696
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본 발명의 다른 일면은 상기 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 이용하여 아피쿨라렌 A
를 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A의 바람직한 생산 방법의 일 예를 단계별로 나타낸 것이다. 이하, 도 1을 참조하여 본
발명에 따른 아피쿨라렌 A의 생산 방법을 설명한다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A의 제조 방법은 크게 배양 단계와 정제 단계로 나눌 수 있다. 즉, 본 발명의
방법은 a) 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)를 배양하는 단계로서, 배양 중 배양물의 일부를 제
거하고 새로운 배지를 공급하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 b) 상기 단계에서 제조되는 배양액을 정제하여 아피쿨라렌 A
를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)는 JW184(기탁번호 KFCC
11348P)인 것이 바람직하다.
선택적으로, 상기 a) 배양 단계 이전에 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 종 배양하는
단계 및 안정화 시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 종 배양 단계는 바람직하게 2~4일 동안 수행되고, 보다
바람직하게 3일 동안 수행된다. 또한, 상기 안정화 단계는 바람직하게 12~48시간 동안 수행되고, 보다 바람직하게 24시간
동안 수행된다.
본 발명에 있어서, 배양온도는 25~30℃가 바람직하고, 27~28℃가 보다 바람직하다. 또한, 배양시 교반 속도는 군집으로
생장하는 상기 균주의 특성을 파괴하지 않을 정도이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게 50~200 rpm일 수 있고, 보다
바람직하게 100~160 rpm일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배지는 탄소원, 질소원 및 미량원소 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 배지의 예는 표 1 및
표 2와 같다. 질소원으로서 대두 분말, 탈지대두, 클로렐라 또는 소이펩톤을 사용하는 것이 바람직하고, 대두 분말을 사용
하는 것이 보다 바람직하다(표 4 참조). 상기 질소원의 함량은 배지를 기준으로 0.45~5 중량%인 것이 바람직하고, 2 중
량%인 것이 보다 바람직하다(표 5 참조). 탄소원으로서 배지를 기준으로 0.3~3 중량%의 전분을 포함하는 것이 바람직하
고, 1.2 중량%의 전분을 포함하는 것이 보다 바람직하다(표 5). 본 발명에 사용되는 배지는 CuSO4, Na2MoO4·2H2O,
LiCl, SnCl2·2H2O, H3BO3, KBr, KI, CoCl2, ZnCl2, MnCl2·4H2O, EDTA 및 시아노코발라민(cyanocobalamine)을 포함
하는 미량 원소 용액을 0.05~0.15 부피%, 보다 바람직하게 0.1 부피% 포함한다. 상기 미량 원소 용액은 미량 원소들을
CuSO4 0.3~2.5 중량부, Na2MoO4·2H2O 0.3~2.5 중량부, LiCl 0.2~1.5 중량부, SnCl2·2H2O 0.2~1.5 중량부, H3BO3
0.3~2.5 중량부, KBr 0.7~5.0 중량부, KI 0.7~5.0 중량부, CoCl2 3.0~5.0 중량부, ZnCl2 3.0~5.0 중량부, MnCl2·4H2O
17~23 중량부, EDTA 1500~1700 중량부 및 시아노코발라민(cyanocobalamine) 80~120 중량부의 비율로 함유하는 것
이 바람직하다(표 6 참조). 본 발명에 사용되는 배지의 pH는 6.9~7.6인 것이 바람직하고, 7.2인 것이 보다 바람직하다.
다시 도 1을 참조하면, 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184의 종 배양 및 안정화 시킨 후에,
상기 종 배양액에 새로운 배지를 주입하고 배양을 수행한다. 배양은 배양액에 0.1~2 vvm의 속도로 공기를 주입하면서 수
행되는 것이 바람직하다. 상기 종 배양액에 주입되는 배지의 양은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 종 배양액 100 중량부
를 기준으로 50~500 중량부일 수 있다.
본 발명의 방법에서는 일정한 시점이 되면, 상기 배양물의 일부를 제거하고 새로운 배지를 공급해 준다. 상기 배양물의 제
거 및 새로운 배지의 공급은 배양액 중의 용존 산소가 감소하였다가 다시 증가하다가 더 이상 변화가 없는 시점에서 이루
어지는 것이 바람직하다. 상기 배양물의 제거 및 새로운 배지의 공급은 16~24시간의 주기로 수행되는 것이 바람직하고,
상기 주기는 배양이 진행됨에 따라 감소할 수 있다.
상기 제거되는 배양물의 양 및 공급되는 새로운 배지의 양은 특별히 제한되지는 않지만 동일한 것이 바람직하고, 각각 상
기 배양물을 기준으로 30~70 중량%일 수 있다. 30 중량% 이하일 경우 회수하는 배양액이 적어지므로 아피쿨라렌 A의 수
득량이 적어지는 문제점이 있고, 70 중량% 이상일 경우 배양 중 과도한 거품이 발생하거나 수율이 낮아지는 문제점이 있
다.
도 4는 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 있어서 배양시간에 따른 용존 산소 농도 및 pH 변화를 나타내는 그래프
이다.
등록특허 10-0632696
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도 4를 참조하면, 배양이 진행됨에 따라 미생물의 증식이 활발하게 일어나 배양액 내의 용존 산소 농도는 점점 감소한다.
배지에 의해 공급된 영양원이 고갈됨에 따라 미생물 증식은 정지되므로, 일정한 시점이 되면 용존 산소 농도는 다시 증가
하게 된다. 증가하던 용존 산소 농도는 일정한 시점이 되면 더 이상 증가하지 않고, 일정한 수준을 유지하기 시작한다. 이
때, 상기 배양물의 일부를 제거하고 새로운 배지를 공급해 준다. 영양원이 공급됨에 따라 미생물의 증식이 다시 활발하게
일어나 배양액 내의 용존 산소 농도는 감소한다. 이와 같은 과정을 계속하여 수행할 수 있다.
상기 배양 과정에 있어서, 배양액의 용존 산소 농도에 따라 공기 공급 속도를 조절해 주는 것이 바람직하다. 본 발명의 실
시예에서는 배양 개시시 0.5 vvm의 속도로 공기를 주입하기 시작해서 시간이 지남에 따라 공기 공급 속도를 조금씩 높혀
주었다. 용존 산소 농도가 최저점인 시점에서의 공기 공급 속도는 2 vvm이었다. 용존 산소 농도가 최저점을 지나 상승하
여 일정해지기 시작할 때까지 상기 2 vvm의 속도를 유지하였다. 이후 배양물의 일부 제거 및 새로운 배지의 공급 시점에
서 다시 0.5 vvm으로 조절하였다.
배양 중 pH는 최초 7.2에서 시작하여 배양의 진행시 서서히 감소되어 6.8 정도까지 떨어지다 다시 서서히 7.2~7.3으로
회복한다. 새로운 배지의 공급시 마다 약간의 변화는 관찰되나 5시간 이내에 다시 7.2~7.8의 상태를 회복한다. 배양의 가
장 적절한 pH의 상태는 용존 산소 농도가 회복되었을 때 7.2~7.8의 상태를 유지하는 배양 조건이며, 배양시 pH가 6.8 미
만으로 떨어지면, 배양의 실패확률은 급격히 증가한다. 배양액의 pH를 조절하기 위해 산 또는 염기를 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 새로운 배지를 공급하는 횟수가 많아짐에 따라 용존 산소가 감소했다가 다시 회복하는 시간이
점점 짧아지는 경향을 갖는다. 즉, 도 4를 다시 참고하면, 최초 1회 공급 후 용존 산소 농도의 변화 후 회복까지 평균
72~84시간 정도가 소요되나, 2회 공급시는 완만한 감소현상을 보인 뒤 24시간 전후에 회복이 되며, 3회 공급 이상의 횟수
에서는 주입 후 1시간 이내에 급격한 감소를 보이며 이는 2~3시간 동안 바닥상태를 유지 후, 16시간 이후에는 완전한 회
복을 하는 경향이 관찰 되었다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 동안에 배양액의 부피는 배양조 부피의 2/5~4/5 수준을 유지하는 것이 바람직하고, 3/5
수준을 유지하는 것이 보다 바람직하다. 상기 수준을 벗어나면, 수율이 낮음을 확인하였다(결과 미도시). 또한, 배양조 내
의 공기 배출구는 다공성의 막을 갖는 구조가 바람직하다. 배지와의 접촉면을 넓혀 줌으로써 더 큰 용해성을 갖도록 도움
을 주기 때문이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배양물의 일부 제거 및 새로운 배지 공급은 5~15회 수행되는 것이 바람직하다.
다시 도 1을 참조하면, 본 발명의 아피쿨라렌 A의 제조 방법은 정제 단계를 포함한다. 정제 단계는 b-1) 상기 회수된 배양
액 및 잔여 배양액 혼합물을 원심분리하여 균체 및 상등액으로 분리하는 단계; b-2) 상기 균체를 유기 용매로 추출하는 단
계; b-3) 상기 상등액을 흡착하고 유기 용매로 추출하는 단계; b-4) 상기 b-2) 단계 및 b-3) 단계의 추출 혼합물을 농축하
는 단계; 및 b-5) 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 방법으로, 정제 단계는 b-1) 상기 회수된 배양액 및 잔여 배양액 혼합물을 동결 건조하는 단계; b-2) 상기 건조물을
유기 용매로 추출하는 단계; b-3) 감압 여과 및 농축시키는 단계; 및 b-4) 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포
함할 수 있다.
상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸 아세테이트, 에
틸 아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸 에테르 및 디클로로메탄으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상
기 추출 단계는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있다.
상기 크로마토그래피를 이용한 정제 단계는 2회 이상 수행될 수 있으며, 2회 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예
에서, 1차 정제의 이동상으로 N-헥산/에틸아세테이트를 사용하고, 2차 정제의 이동상으로 메틸렌클로라이드/메탄올을 사
용하였다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 방법(실시예 2 참조)과 종래의 통상적인 회분식 배양법(비교예 1 참조)의 아피쿨
라렌 A 수득율을 비교하였다. 그 결과 아피쿨라렌 A의 수득량은 본 발명에 따른 방법의 경우 83.52 mg, 회분식 배양법의
경우 4.29 mg이었다. 또한, 배양액 1L 당 아피쿨라렌 A의 수득량은 본 발명에 따른 방법의 경우 4.64 mg, 회분식 배양법
의 경우 1.43 mg이었다(표 3 참조). 상기 결과로부터 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A의 생산 방법은 아피쿨라렌 A의 수득율
면에서 종래의 회분식 배양법에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.
등록특허 10-0632696
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이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것
으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
아피쿨라렌 Ａ의 생산 능력이 우수한 미생물의 탐색
경기도 용인군 소재의 토양을 다수 채취하고, 상기 각 시료로부터 로도코쿠스 루브라(Rhodococcus rubra)의 생균체를 먹
이균으로 이용한 베이팅 방법(bating method)에 의해 콘드로마이세스 속(Chondromyces sp.) 미생물들을 분리하였다.
베이팅 방법이란 먹이균을 증균한 후 집균 후 분리용 아가 배지에 도말하고 토양시료등을 소량의 증류수에 현탁하여 평판
에 떨어뜨려 배양 후 먹이균을 용해(lysis)시켜 성장하는 균이 발견되면 그 균주를 선택하는 방법을 말한다. 상기에서 분리
된 미생물 각각을 배지(조성: 대두 분말 2 중량%, 전분 1.2 중량%, HEPES 1.19 중량%, CaCl2·2H2O 0.05 중량%,
MgSO4·7H2O 0.2 중량%, 미량 원소; pH 7.2) 400 mL를 함유하는 2000 mL 플라스크에 접종하고, 진탕배양기에서 28℃,
160rpm으로 교반하면서 3일간 종 배양하였다. 다음으로, 상기 종 배양액을 배지 3L에 접종하고, 온도 28℃, 교반속도
100rpm, 공기 주입량은 0.5vvm 으로 시작하여 2vvm까지 조절하면서 10일동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 아피
쿨라렌 Ａ를 정제하였다. 상기 미생물 중 JW184 균주가 아피쿨라렌 A를 가장 많이 생산하였다. 상기 미생물을 동정한 결
과 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus)의 신균주로 확인되었다.
상기 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 한국미생물보존센터에 2005년 3월 12일에 기
탁 신청하여, 기탁번호 KFCC 11348P로서 기탁하였다.
도 2는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 액체 배지 상에서 배양시킨 결과를 나타낸 현
미경 사진이고(200배 확대), 도 3은 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 VY/2 아가 배지
상에서 배양시킨 결과를 나타낸 현미경 사진이다(200배 확대).
실시예 2
본 발명의 방법에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 생산
2000 mL 플라스크에 표 1과 같은 성분 및 조성비(표 1의 미량 원소 용액은 표 2의 성분 및 조성비를 가짐)를 갖는 배지
(pH 7.2) 400 mL를 첨가하고, 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 접종한 다음 진탕배
양기에서 28℃, 160rpm으로 교반하면서 3일간 종 배양하였다.
다음으로 상기 종 배양액을 멸균된 배양조로 옮긴 후 24시간 동안 안정화 시켰다. 세균의 막단백질은 그 세균 내부와 환경
사이의 통로 역할을 하는데 상기 세균과 배지환경의 변화는 막단백질에 쇼크 내지 스트레스로서 미생물대사에 변화를 주
므로 일정환경에 적응하도록 하는 안정화단계가 필요하다. 상기 안정화 단계 후 멸균된 배지 1.6 L를 배양조에 첨가하고,
온도 28℃, 교반속도 100rpm, 공기 주입 속도는 0.5vvm으로 하여 배양을 시작하였다.
배양 시간에 따른 배양액의 용존 산소 농도 및 pH 변화를 도 4에 나타내었다. 배양 개시 시점에서의 용존산소 농도는 85%
였고, pH는 7.2였다. 배양을 계속 진행하면 배양액 내의 용존산소 농도 및 pH는 감소하였다. 배양을 계속 진행함에 따라
공기 주입 속도를 조금씩 증가시켰다. 배양 시작한지 3일이 되면 pH 는 6.8, 용존산소 농도는 10% 정도가 되었다. 이때 조
금씩 증가된 공기 주입 속도는 2vvm이었으며 이를 유지시켰다. 배양 3일 이후에는 pH 및 용존산소 농도가 다시 회복하여
약 12시간 이후에 pH 7.2, 용존산소 농도 80%가 되었으며, 용존 산소 농도는 더 이상 증가하지 않았다. 이 때, 배양액 800
mL를 제거하고, 다시 멸균된 새로운 배지 800 mL를 공급하였고, 공기 공급 속도를 다시 0.5 vvm으로 재설정하였다. 배양
액의 용존 산소 농도가 감소하였다가 다시 증가하다가 더 이상 변화가 없는 시점에서 상기 배양물의 일부 제거, 새로운 배
지의 공급 및 공기 공급 속도의 재설정을 하면서, 상기 단계를 계속 반복시켰다. 상기 작업을 최종 배양액이 18 L가 될 때
까지 수행하였다. 상기 단계들에 있어서, 배양액의 pH가 7.6을 초과하지 않도록 0.1N-염산을 첨가하여 조절하였다.
<표 1>
배지의 성분 함량
대두 분말 20 g
등록특허 10-0632696
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전분 12 g
CaCl2·2H2O 0.5 g
MgSO4·7H2O 2 g
HEPES 11.9 g
미량 원소 용액 1 mL
물 나머지
총량 1 L
<표 2>
미량 원소 용액의 성분 함량
CuSO4 1 mg
Na2MoO4·2H2O 1 mg
LiCl 0.5 mg
SnCl2·2H2O 0.5 mg
H3BO3 1 mg
KBr 2 mg
KI 2 mg
CoCl2 4 mg
ZnCl2 4 mg
MnCl2·4H2O 20 mg
EDTA 1.6 g
시아노코발라민(cyanocobalamine) 100 mg
물 나머지
총량 200 mL
상기에서 얻은 배양액을 7,000 rpm으로 원심분리하여 균체와 상등액으로 분리하였다. 상기에서 분리된 균체를 메탄올/아
세톤(3:1) 혼합용매로 2회 추출하였다. 한편, 상기에서 분리된 상등액을 XAD-16(시그마사 제품) 180g으로 흡착하고, 메
탄올/아세톤(3:1) 혼합용매로 2회 추출하였다. 상기에서 추출한 혼합용매를 감압 농축하여 120g의 미정제 생성물을 얻었
다. 미정제 생성물에다 3%의 물이 함유된 메탄올 1L을 가한 후 여과하여 불순물을 제거한 다음 감압 농축하여 41.04g의
미정제 생성물을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 즉, 상기 미정제 생성물을 실리카 칼
럼에 로딩 시킨 후, n-헥산/에틸아세테이트(2:1), n-헥산/에틸아세테이트(1:1), 에틸아세테이트의 이동상을 이용하여 1차
정제 하였다. 상기 1차 정제물을 감압농축하여 순도 90%의 아피쿨라렌-A 133.08mg을 얻었다. 상기 90% 정제된 아피쿨
라렌 A를 실리카칼럼에 로딩한 후 메틸렌클로라이드/메탄올(9:1)의 이동상을 이용하여 2차 정제 하였다. 이를 감압 농축
하여 순도 97%의 아피쿨라렌 A 83.52 mg을 얻었다(배양물 1 L 당 수득량은 4.64 mg/L, 일일 수득량은 4.18 mg/일). 상
기 결과를 표 3에 나타내었다.
상기에서 얻은 물질이 아피쿨라렌 A인지 여부는 HPLC(Column: LiChrosorb RP-18(5μm, 250 X 4mm), Eluent:
Methanol & Water(50:50), Flow rate: 1.0 mL/min, Detection: 280nm, Retention Time: 10 min) 및 1H-NMR에 의해
확인하였다. 도 5는 본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 의해 생산된 아피쿨라렌 A의 HPLC 분석 결과이고, 도 6은
본 발명에 따른 아피쿨라렌 A 생산 방법에 의해 생산된 아피쿨라렌 A의 1H-NMR 분석 결과이다. 상기 결과로부터 상기에
서 얻은 물질이 아피쿨라렌 A임을 확인할 수 있었다.
실시예 3
본 발명의 방법에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 생산
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 배양하여 최종 배
양액 18 L를 얻었다. 본 실시예에서는 상기 배양액으로부터 동결 건조 방법을 이용하여 아피쿨라렌 A를 정제하였다.
등록특허 10-0632696
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즉, 상기 배양액을 동결 건조하여 분쇄한 후, n-부탄올로 추출하여 여과하였다. 추출한 여과액을 30~60℃에서 감압 농축
하여 81.5g의 미정제 생성물을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 즉, 상기 미정제 생성물
을 실리카 칼럼에 로딩 시킨 후, n-헥산/에틸아세테이트(2:1), n-헥산/에틸아세테이트(1:1), 에틸아세테이트의 이동상을
이용하여 1차 정제 하였다. 상기 1차 정제물을 감압농축하여 순도 90%의 아피쿨라렌 A 191.2 mg을 얻었다. 상기 90% 정
제된 아피쿨라렌 A를 실리카칼럼에 로딩한 후 메틸렌클로라이드/메탄올(9:1)의 이동상을 이용하여 2차 정제 하였다. 이를
감압 농축하여 순도 97%의 아피쿨라렌 A 125.4 mg을 얻었다.
비교예 1
회분식 배양법에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 생산
2000 mL 플라스크에 표 1과 같은 성분 및 조성비(표 1의 미량 원소 용액은 표 2의 성분 및 조성비를 가짐)를 갖는 배지
(pH 7.2) 400 mL를 첨가하고, 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 접종한 다음 진탕배
양기에서 28℃, 160rpm으로 교반하면서 3일간 종 배양하였다.
다음으로 상기 종 배양액을 멸균된 배양조로 옮긴 후 24시간 동안 안정화 시킨 뒤, 멸균된 배지 3 L를 배양조에 첨가하고,
온도 28℃, 교반속도 100rpm, 공기 주입 속도는 0.5 vvm으로부터 시작하여 2 vvm으로 조절하면서 10일 동안 배양하였
다. 상기 배양 개시 시점에서는 pH 7.2, 용존 산소 농도 85%이었지만, 배양 3일 후에는 pH 6.0으로 떨어지고, 용존 산소
농도는 거의 0%로 떨어졌다가 서서히 회복하여 배양이 끝날 시점에서는 pH 7.4, 용존 산소 농도 60%였다.
정제 단계는 상기 실시예 2의 정제 방법과 동일하게 수행하였다. 즉, 상기에서 얻은 배양액을 7,000 rpm으로 원심분리하
여 균체와 상등액으로 분리하였다. 상기에서 분리된 균체를 메탄올/아세톤(3:1) 혼합용매로 2회 추출하였다. 한편, 상기에
서 분리된 상등액을 XAD-16(시그마사 제품) 30g으로 흡착하고, 메탄올/아세톤(3:1) 혼합용매로 2회 추출하였다. 상기에
서 추출한 혼합용매를 감압 농축하여 7.89g의 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물에다 3%의 물이 함유된 메탄올 1L
을 가한 후 여과하여 불순물을 제거한 다음 감압 농축하여 3.48g의 미정제 생성물을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 크로마
토그래피에 의해 정제하였다. 즉, 상기 미정제 생성물을 실리카 칼럼에 로딩 시킨 후, n-헥산/에틸아세테이트(2:1), n-헥
산/에틸아세테이트(1:1), 에틸아세테이트의 이동상을 이용하여 1차 정제 하였다. 상기 1차 정제물을 감압농축하여 순도
90%의 아피쿨라렌 A 6.18mg을 얻었다. 상기 90% 정제된 아피쿨라렌 A를 실리카칼럼에 로딩한 후 메틸렌클로라이드/메
탄올(9:1)의 이동상을 이용하여 2차 정제 하였다. 이를 감압 농축하여 순도 97%의 아피쿨라렌 A 4.29 mg을 얻었다(배양
물 1 L 당 수득량은 1.43 mg/L, 일일 수득량은 0.43 mg/일). 상기 결과를 표 3에 나타내었다.
<표 3>
배양 방법 아피쿨라렌 A 수득량(mg) 배양액 L 당 수득량(mg/L) 일일 수득량(mg/일)
본 발명에 따른 방법 83.52 4.64 4.18
회분식 배양법 4.29 1.43 0.43
실시예 4
배지 성분에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 수득량 비교
상기 실시예 1에서 사용된 배지 성분 중 질소원의 종류에 따른 아피쿨라렌 A의 수득량을 비교하였다. 실시예 1에서 사용
된 대두 분말 대신에, 각각 탈지대두, 클로렐라 및 소이펩톤을 사용하여 실시예 1과 동일하게 아피쿨라투스
(Chondromyces apiculatus) JW184를 배양하고 정제하여 아피쿨라렌 A를 수득하였다. 각 경우의 수득량을 표 4에 나타
내었다. 상기 결과로부터 배지의 질소원으로서 탈지대두, 클로렐라 또는 소이펩톤을 사용하여 배양하여도 바람직하나, 대
두 분말을 사용하여 배양하는 것이 특히 바람직함을 알 수 있었다.
<표 4>
질소원 성분 아피쿨라렌 A 수득량(mg) 배양액 L 당 수득량(mg/L)
대두 분말(실시예 1) 83.52 4.64
탈지대두 74.34 4.13
클로렐라 64.26 3.57
등록특허 10-0632696
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소이펩톤 55.08 3.06
실시예 5
배지 성분의 함량에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 수득량 비교
상기 실시예 1에서 사용된 배지 성분 중 질소원 및 탄소원(전분)의 함량에 따른 아피쿨라렌 A의 수득량을 비교하였다. 질
소원으로서 각각 대두 분말, 탈지대두, 클로렐라 및 소이펩톤을 사용하였고, 상기 질소원 및 전분의 함량을 하기 표 5와 같
이 달리하여 실시예 1과 동일하게 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 배양하고 정제하여 아피쿨라렌 A
를 수득하였다. 각 경우의 수득량을 표 5에 나타내었다. 상기 결과로부터 배지의 질소원의 함량은 0.45~5 중량%가 바람
직하고, 2 중량%가 가장 바람직함을 알 수 있다. 또한, 배지의 전분 함량은 0.3~3 중량%가 바람직하고, 1.2 중량%가 가장
바람직함을 알 수 있다.
<표 5>
실시예 6
배지의 미량 원소 함량에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 수득량 비교
상기 실시예 1에서 사용된 배지 성분 중 미량 원소 용액의 미량 원소 함량에 따른 아피쿨라렌 A의 수득량을 비교하였다.
실시예 1에서 사용된 미량 원소 용액 대신에, 미량 원소의 함량이 상이한 각각 하기 표 6에 기재된 용액 2 및 용액 3을 사
용하여 실시예 1과 동일하게 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184를 배양하고 정제하여 아피쿨라렌 A를 수
득하였다. 각 경우의 수득량을 표 6에 나타내었다. 상기 결과로부터 배지에 함유되는 미량 원소로서 표 6의 용액 1 내지 용
액 3 모두가 바람직하지만, 특히 용액 1이 바람직함을 알 수 있었다.
<표 6>
용액 1 (실시예 1) 용액 2 용액 3
CuSO4 1 mg 2 mg 0.5 mg
Na2MoO4·2H2O 1 mg 2 mg 0.5 mg
LiCl 0.5 mg 1 mg 0.25 mg
SnCl2·2H2O 0.5 mg 1 mg 0.25 mg
등록특허 10-0632696
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H3BO3 1 mg 2 mg 0.5 mg
KBr 2 mg 4 mg 1 mg
KI 2 mg 4 mg 1 mg
CoCl2 4 mg 4 mg 4 mg
ZnCl2 4 mg 4 mg 4 mg
MnCl2·4H2O 20 mg 20 mg 20 mg
EDTA 1.6 g 1.6 g 1.6 g
시아노코발라민 100 mg 100 mg 100 mg
물 나머지 나머지 나머지
총계 200 mL 200 mL 200 mL
아피쿨라렌 A 수득량(mg) 83.52 76.14 76.86
배양액 L 당 수득량(mg/L) 4.64 4.23 4.27
실시예 7
배지 성분 및 미량 원소 함량에 따른 아피쿨라렌 Ａ의 수득량 비교
상기 실시예 4 및 실시예 6을 조합하여, 실시예 1에서 사용된 배지 성분 중 질소원의 종류 및 미량 원소 용액의 미량 원소
함량에 따른 아피쿨라렌 A의 수득량을 비교하였다. 질소원의 함량은 20g으로 동일하게 하였다. 표 7에 기재되어 있는 것
과 같은 질소원 및 미량 원소 용액의 조합을 포함하는 배지를 사용하여 실시예 1과 동일하게 아피쿨라투스
(Chondromyces apiculatus) JW184를 배양하고 정제하여 아피쿨라렌 A를 수득하였다. 각 경우의 수득량을 표 7에 나타
내었다. 상기 결과로부터 배지에 함유되는 질소원으로서 대두 분말 및 미량 원소 용액으로서 표 6의 1번 용액을 사용하는
경우 아피쿨라렌 A의 수득량이 많음을 알 수 있었다.
<표 7>
발명의 효과
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 및 방법을 이용하면 골다공증 치료, 종양세포의 성장억제, 증식성 세포
의 성장억제 및 암 치료에 유용한 아피쿨라렌 A를 고수율로 생산할 수 있다.
(57) 청구의 범위
청구항 1.삭제
등록특허 10-0632696
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청구항 2.
a-1) 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) JW184(기탁번호 KFCC 11348P)를 배지 중에서 공기 주
입 속도 0.1~2 vvm 하에서 배양하는 단계;
a-2) 배양액 중의 용존 산소가 감소하였다가 다시 증가하다가 더 이상 변화가 없는 시점에서 배양물의 일부를 제거하고 새
로운 배지를 공급하는 단계; 및
b) 상기 단계에서 제조되는 배양액을 정제하여 아피쿨라렌 A를 회수하는 단계
를 포함하는 아피쿨라렌 A의 생산 방법.
청구항 3.
제 2항에 있어서,
상기 배양물의 일부 제거 및 새로운 배지 공급은 5~15회 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4.삭제
청구항 5.
제 2항에 있어서,
상기 배지는 대두분말(soybean flour), 탈지대두, 클로렐라 및 소이펩톤(soypeptone)으로 구성되는 군에서 선택되는 하
나 이상의 질소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6.
제 5항에 있어서,
상기 질소원은 0.45~5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 7.
제 2항에 있어서,
상기 배지는 CuSO4, Na2MoO4·2H2O, LiCl, SnCl2·2H2O, H3BO3, KBr, KI, CoCl2, ZnCl2, MnCl2·4H2O, EDTA 및 시아
노코발라민(cyanocobalamine)을 함유하는 미량 원소 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8.삭제
청구항 9.
등록특허 10-0632696
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제 2항에 있어서,
상기 배지의 pH는 6.9~7.6인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10.
제 2항에 있어서,
상기 제거되는 배양물 및 공급되는 새로운 배지는 각각 배양물에 대하여 30~70 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
도면
도면1
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도면2
도면3
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도면4
도면5
등록특허 10-0632696
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도면6
등록특허 10-0632696
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