[1]expoproteomica

7/31/2019 [1]expoPROTEOMICA

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Comparative proteomics of

E.Coli; O157:H7 : twodimensional gel electrophoresis

Vs two dimensional liquid

chromatography [1]

E. Coli O157:H7Es una cepa enterohemorragica de la

bacteria E.Coli y una causa de intoxicacinalimentaria.

[1] Nereus W. Gunther IV, Hoan-Jen Pang, Alberto Nuez, Gaylen A. Uhlich


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Agenda

1. Abstract

2. Introduccin

3. 2-D Gel Electrophoresis

4. 2-D Liquid Chromatography

5. Anlisis de matched protein.

6. Identificacion de proteinas 7. Resultados

Conclusiones


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1. Abstract

Las tcnicas para separacin de protenaspor estos mtodos ( 2-D GE, 2-D LC)difieren de manera significativa,actualmente no es claro hasta que punto

difieren los sets de protenas identificadospor estos mtodos

Se compara el proteoma de E. ColiO157:H7 contra una variante de

ocurrencia natural usando ambosmtodos ( 2-D GE, 2-D LC).

Una mitad de la muestra fue analizada

con 2-D GE y la otra parte con 2-D LC


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Abstract

Protenas diferencialmente reguladasfueron observadas en cada uno de lossistemas e identificados por anlisisMALD/I-TOF/TOF .

Numero diferente de Matched ProteinPairs durante pruebas comparativas entremtodos

Una falta de redundancia significativaentre los conjuntos de protenasidentificados, sugiere que estos mtodosson complementarios y no estrictamente

corroborativos.


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2. Introduccin

Inicialmente es necesario, Separar,visualizar, y medir las cantidades relativasde varias protenas individuales.

2-D GE : Separa protenas individualesbasndose en el punto isoelectrico y lamasa de las protenas

2-D LC : Hace uso del punto isoelectrico yla hidrofobicidad de protenas individualespara hacer la separacin


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Introduccin En este estudio ambas tcnicas fueron

utilizadas para comparar el perfil deprotena de E. Coli O157:H7 cepa 43895contra el perfil de su fase variante de

ocurrencia natural 43895OR. Una comparacin de los perfiles de

protenas proporciona las funcionesindividuales de protenas y las posibles

vas fisiolgicas para ser examinadas enexperimentos posteriores.

Biological Replicates, falta de consistencia

de datos.


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Cepa Variante 8395OR

Se conoce que tiene punto de mutacinen la regin de promotores del gen csgD.

Caracterizada con las siguientes

diferencias fenotpicas : Colony Appereance, rojo,seca y spera

Formacin de biopeliculas fuertes

Aumento de la invasin de clulas HEP-2 Aumento de virulencia en raton modelo.


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3. 2-D Gel Electrophoresys Las cepas bacterianas fueron cultivadas y

mantenidas en placas de levadura con extractosde casamino acidos (YESCA)

La concentracin total de protenas presentesen las preparaciones resultantes fue medida por

medio de BCA Protein Assay. Personal Densitometer (scanea los Coomassie

stained gel resultantes), Imgenes Digitalesusadas para alinear y comparar las intensidades

de puntos de protena entre los geles de la cepa43895 y 43895OR

Z32-D Gel ImageAnalysis, crea un Master GelAlignment para cada cepa a partir de geles

replicados.


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4. 2-D Liquid Chromatography

Cromatografa lquida (LC), es una tcnica deseparacin en la que la fase mvil es un lquido.puede ser llevada a cabo en una columna o unplano.

1D, columna de cromatoenfoque que genera ungradiente de pH 8,5 a 4, permitiendo separacinpor punto isoelectrico. Monitorizado porabsorvencia UV a 280nm

2D, Columna C18 de fase inversa no porosa,utilizando un gradiente de acetonitrilo agua a uncaudal de 0,75 ml / min durante 45 min ymonitoreado por absorbancia UV a 214nm,separacin por hidrofobicidad.


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5. Anlisis de Matched Proteins

Cada Matched Protein, Protein Expression Ratio :

Protein x [43895], Protein x [43895OR] :Concentracin de pxel para un punto de protenade la cepa respectiva.

Se obtiene la media de todos los log[ratios], y se

determina la desviacin estndar. Protenas expresadas diferencialmente , aquellos

Spot Protein que se encuentran fuera de ladesviacin estndar, son extradas del gel y

almacenados a -20 grados centgrados

P.E.R=log (Protein X[43895 ]/Protein X[43895OR ])


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6. Identificacin de las Proteinas

MALDI/I-TOF, (Matrix-assited Laser DesorptionIonization with Automated Time Of Flight ) identificarlos Differentially Expressed Protein Spots.

4700 Proteomics Analyzer massspectrometer (Applied Biosystems, MA)

http://www.speciation.net/Database/Instruments/Applied-Biosystems/4700-Proteomics-Analyzer-;i589


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Principio de MALDI-TOF

Linear Time Of Flight tube

Reflector Time Of Flight tube

detector

reflector

ion source

ion source

detector

time of flight

time of flight

-Macromolculaimplantada en una matriz.

(evita ser destruida yfacilita ionizacin).

-Ioniza molculasmediante lser pulsado

-Separacin segn m/zen el analizador de

masas.

-Finalmente el detectorregistra las seales de

todos los iones.


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Reported protein(s)from databasesearches from

putative peptidesequences were

within a 95%confidence interval.


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7. Resultados


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Preps #1

43895 43895OR

First half,2-D GE

224 Spots, 43895225 spots, 43895OR

98 matching spots126 spots, 43895

127 spots, 43895OR

Log ([ratios])Media , Standard

deviation

Differentially Regulated- 7 P.S. Upregulated(43895->43895OR)-11 P.s. Upregulated(43895OR->43895)

Replica Biolgica,Preps #2.-101 matched protein.-13 P.S Upregulated

(43895->43895OR)-10 P.S Upregulated(43895OR->43895)


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Preps #1

43895 43895OR

Second half,2-D LC

321 Matched ProteinPeaks

-Log (ratios)

-AbsorbanceUnits [UA]-Mean

-Standard DeviationDifferentially Regulated

- 27 P.P. Upregulated(43895->43895OR)-30 P.P. Upregulated(43895OR->43895)

Replica Biolgica,Preps #2.-205 matched peaks.-19 P.P Upregulated

(43895->43895OR)-22 P.S Upregulated(43895OR->43895)


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Resultados

Graphical analysis of protein expressionlevels as determined by 2-D GE. [1]


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Resultados

Graphical analysis of protein expressionlevels as determined by 2-D LC.


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Identities of Differentially RegulatedProteins After Separation by 2-D GE [1]


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Identities of Differentially Regulated


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Identities of Differentially RegulatedProteins After Separation by 2-D LC [1]


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Identificacion con 2D GE

Prep #1.

6 protenas fueron identificadas de 7 quese tomaron como sobrereguladas de la

cepa 43895 comparado con 43895OR.

8 protenas fueron identificadas de 11 que

se tomaron como sobrereguladas de lacepa 43895OR comparado con 43895.

Prep #2.


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p


cepa 4385 comparado con 43895OR. 8 protenas fueron identificadas de 10 que


Dos protenas reguladas diferencialmenteen ambas preparaciones (#1 y #2)

30S ribosomal Protein 56

Clp peptidase, chain A


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Identificacion con 2D LC

Prep #1.


cepa 43895 comparado con 43895OR.

Sin embargo, ninguna protena fue

identificadas de 30 que se tomaron comosobrereguladas de la cepa 43895ORcomparado con 43895.

Prep #2.


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p


cepa 4385 comparado con 43895OR. 2 protenas fueron identificadas de 22 que


Una nica protena reguladasdiferencialmente en ambas preparaciones

(#1 y #2):

Hypothetical Protein Ecs5028


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Identificacin de Protenas

Overview of the differentially regulated proteins identified [1]

l i


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Conclusiones

Las diferencias en las tcnicas de separacin

empleadas por los diferentes mtodos hacenpoco probable que exista un considerableoverlap en las protenas identificadas.

Tanto 2-D LC y 2-D GE carecen de

reproducibilidad en replicas biolgicas 2-D LC es mas sensible que la 2-D GE

commassie blue stained Gel, y presenta mayorfacilidad en el alineamiento de protenas entre

separaciones comparativas, evidenciando unmayor numero de matched protein.


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Fue posible mediante MALDI/I TOFidentificar mayor numero de protenasseparadas usando 2-D GE,principalmente fue el resultado de que lasensibilidad de la deteccin no setranslado a suficiente material para laidentificacin basada en MALDI

2-D GE y 2-D LC son mtodos que sesugieren de uso complementarios y nouno en remplazo del otro.

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