β2-adrenozeptor-stereoisomere: neue pharmakologische und ... · copd (β 2ar-agonisten) ... lp h a...
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Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011
β2-Adrenozeptor-Stereoisomere: Neue pharmakologische und klinische
Erkenntnisse zu alten Arzneistoffen
Fortbildung für Apotheker
13.07.2011
Regensburg
Roland Seifert
Institut für Pharmakologie13. 07.2011
Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011
Themen
• β2AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion
• Interaktion des β2AR mit Stereoisomeren
• Klinische Implikationen
Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011
β2-Adrenorezeptor
• G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR)
• Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen (7TMR)
• Katecholamine als endogene Liganden
• Potenz: Adrenalin (Hormon) > Noradrenalin (Neurotransmitter) > Dopamin (Neurotransmitter)
• Neben Rhodopsin bestuntersuchter GPCR
• Kopplung an Gs-Proteine (kanonisch)
• Kopplung an Gi-Proteine, Gq-Proteine und β-Arrestin (nicht-kanonisch)
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Kanonische und nicht-kanonische Signaltransduktion über den β2AR
A2
G16 Gi Gs β-Arrestin
AC ERKPLC
A1 A3
β2AR
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Expression, Funktion und pharmakologische Bedeutung des β2AR
Expression Funktion Pharmakologische Bedeutung
Glatte Gefäßmuskulatur Vasodilatation Schutz vor exzessiver Kontraktion (α1AR) bei LA mit Adrenalin
Glatte Muskulatur, Uterus
Relaxation Tokolyse bei vorzeitigen Wehen (β2AR-Agonisten)
Leber Glykogenolyse Verhinderung von Hypoglykämie (endogenes Adrenalin)
Glatte Muskulatur, Bronchien
Bronchodilatation Asthma bronchiale, COPD (β2AR-Agonisten)
Mastzellen, eosinophile und neutrophile Granulozyten
Hemmung der Mediatorfreisetzung
Asthma bronchiale, COPD (β2AR-Agonisten)
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AC
cAMPATP
4
1
66
Gsα
GDP
Pi
5
2
Gsαγ β β2AR
2
Agonist
β2ARAgonist
Gsα
GDP
γ β
1
GDP
G-Proteinzyklus
Gsα
GTP
Gsα
GTPγ β
γ β
3GTP
β2AR
Agonist
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Methoden zur Analyse derGPCR/G-Protein-Kopplung
• GTP(γS)-sensitive hochaffine Agonistbindung Proximal
• Steady-state-Hydrolyse von [γ-32P]GTP
• [35S]GTPγS-Bindung
• Effektorsystemaktivierung
• Kinaseaktivierung
• Genexpression Distal
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GPCR-Gα-Fusionsproteine
• Definierte 1 : 1-Stöchiometrie der Signalpartner
• Enge Nachbarschaft der Signalpartner (Transduzisom)
• Vergleich der Kopplung von GPCR-Isoformen an ein Gα
• Vergleich der Kopplung eines GPCRs an verschiedene Gα
• Exakte Potenzen (EC50) und Maximaleffekte (Emax) von Liganden
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R R* G E
inverserAgonist
neutralerAntagonist Agonist
Zweizustandsmodell der GPCR-Aktivierung (Two-state model)
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
50
100 voller Agonist
partieller Agonist
neutraler Antagonist
partieller inverser Agonist
voller inverser Agonist
G-P
rote
in- u
nd E
ffekt
orsy
stem
-
Aktiv
ität (
rela
tive
Einh
eite
n)
Ligand (log M)
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Aktivierung des β2-Adrenozeptors durch Rotation von TM5 und TM6
Rasmussen et al., Nature 2011;469:175Rosenbaum et al., Nature 2011;469:236
+ reversibler inverser Agonist (R)
+ reversibler Agonist + Nanobody(G-Protein-Substitut)
+ irreversibler Agonist (R*)
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Ligand-spezifische G-Protein-Aktivierung
Wenzel-Seifert & Seifert, Mol Pharmacol 2000;58:954
Ligand β2AR-GsαS β2AR-Giα2 β2AR-G16α
(R)-ISO 1.00 1.00 1.00
rac-SAL 0.81 0.64 0.64
rac-DOB 0.68 0.40 0.35
rac-EPH 0.33 0.35 0.26
rac-DCI 0.19 0.29 0.08
Emax-Werte
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Mutiple aktive Zustände (Multiple-state model)
R*1
Agonist 1
R*2 R*3
Agonist 2 Agonist 3 Agonist n
R*n
G1 G2 G3 Gn
E1 E2 E3 En
Ligand-spezifische Rezeptorkonformationen
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ligand-directed trafficking of receptor signalling
functional selectivity
biased agonism
ligand-biased efficacy
collateral efficacy
pluridimensional efficacydifferential engagement
conformational selectivity
Ligand-specific receptor conformation
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Herausforderung Funktionale Selektivität
• Neue pharmakologische Möglichkeiten– Reduktion von unerwünschten Wirkungen
– Zelltyp/Organ-spezifische Wirkungen
• Neue Strategien für High-Throughput-Lösungen in der Arzneistoffentwicklung nötig
– kein universeller HTS-Assay
– Berücksichtigung multipler Signalwege/Effektoren
– rekombinante und native Systeme
– dennoch ökonomisch
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Themen
• β2AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion
• Interaktion des β2AR mit Stereoisomeren
• Klinische Implikationen
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Isoproterenol-Stereoisomere
• keine Selektivität für β2AR im Vergleich zum β1AR
• aber bis vor kurzem einziges erhältliches Stereoisomerenpaar
• für die meisten Liganden nur Razemate verfügbar
• Manchmal reines (R)-, aber kein (S)-Stereoisomer verfügbar
* *
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β2ARLAKHEKLCF
272
269
267266
A
K
RS
Konstitutiv aktivierte Mutante des β2AR (β2ARCAM)
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R R* G
β2ARinverserAgonist Agonist
R R* G
inverserAgonist Agonist
β2ARCAM
β2AR versus β2ARCAM
• Erhöhte basale G-Proteinaktivierung
• Erhöhte Potenz/Affinität von Agonisten
• Erhöhte Effektivität von inversen Agonisten und partiellen Agonisten
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-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
50
100
(-)-R(+)-S
β2AR-Gsα
A
GTP
ase
activ
ity (%
of m
axim
um)
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
β2ARCAM-Gsα
B
Isoproterenol stereoisomer (log M)
Unterschiedlich potente GTPase-Aktivierungdurch ISO-Stereoisomere an β2AR und β2ARCAM
Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218
Isoproterenol-Stereoisomere an β2AR und β2ARCAMParameter (-)-(R)-Isoproterenol (+)-(S)-Isoproterenol
Chemische Bezeichnung
Eutomer Distomer
Affinität (Bindung) Hoch Niedrig
Potenz (funktioneller Assay)
Hoch Niedrig
Maximale Wirkstärke (Emax)
~1,0 (voller Agonismus) ~1,0 (voller Agonismus)
Aktiver Zustand R* R*
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0
25
50
75
100
controlGTPγS
β2AR-Gsα
A B
β2AR-Gsα
-11 -9 -7 -5 -3
0
25
50
75
100
β2ARCAM-Gsα
C
(-)-R-ISO (log M)-10 -8 -6 -4 -2
β2ARCAM-Gsα
D
(+)-S-ISO
[3 H]D
HA
boun
d (%
of b
asal
)
Differentielle ternäre Komplex-Bildungmit ISO-Stereoisomeren an β2AR und β2ARCAM
Seifert et al., J Pharmacol Exp Ther 2001;297:1218
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Funktionell inaktive ternäre Komplexe mit R-ISO an β2ARCAM
Parameter (-)-R-ISO (+)-S-ISOKh (nM) 0.2 3.8Kl (nM) 3.8 75Rh (%) 35 56KhGTPγS (nM) 2.0 -KlGTPγS (nM) 13 135RhGTPγS (%) 66 0
Seifert et al., J Pharmacol
Exp Ther 2001; 297:1218
(-)-R-ISO
R*CAM-(-)-R-ISO
Gsα
(-)-S-ISO
R*CAM-(-)-S-ISO
Gsα
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OH
NH
OH
OH
OH
**
OH
NH*
OH
OH
OH
NHNH
O
**
OH
O
OH
NH*
OH
OH
O
OH
NHNH
O
*
OH
OO
β2AR-Agonist-Stereoisomere: Endlich verfügbar!
SABA = Short Acting Beta2 Agonist– Fenoterol (RR, RS, SR, SS)
Salbutamol (R, S)
LABA = Long Acting Beta2 Agonist– Formoterol (RR, RS, SR, SS)
– Salmeterol (R, S)
– Olodaterol (R, S)
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Die vier Fenoterol-Stereoisomere
DiastereomereEnantiomere Enantiomere
Jozwiak et al., J Med Chem 2007;50:2903
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Fenoterol-Stereoisomer-spezifische Signaltransduktion in Kardiomyozyten
Woo et al., Mol Pharmacol 2009;75:158Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13
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Distinkte Interaktion von Fenoterol-Stereoisomeren mit dem β2AR: Größere Flexibilität von (S,R)-Fenoterol
(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol
Seifert & Dove, Mol Pharmacol 2009;75:13
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Differentielle Stabilisierung des ternären Komplexes durch Fenoterol-Stereoisomere an β2AR-Gsα
(R,R)-Fenoterol (R,S)-Fenoterol
(S,R)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol
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Differentielle GTPase- und AC-Aktivierung durch Fenoterol-Stereoisomere an β2AR-Gsα
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
log (cfenoterol / (mol/L))
GTP
ase
activ
atio
n /
% o
f (R
)–IS
O
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
log (cfenoterol / (mol/L))
AC
activ
atio
n /
% o
f (R
)–IS
O(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol
(R,S)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol
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Humane neutrophile Granulozyten als β2AR-Modell
PLC
NOX
IP3DAG
PTX
ROS
PKC
FPR
Ca2+
Ca2+
ER
β2AR
Giα β γ
Gsαβ γ
cAMP
AC 9
ERK
P
β2AR
Giα β γ
PIP2
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HL-60-Promyelozyten als Modell für den β2AR
PLC
IP3DAG
PTX
PKCCa2+
Ca2+
ER
β2AR
Gsα β γ
cAMP
AC 9
ERK
Pβ2AR
βγ
G16α
β2AR
Giα β γ
PIP2
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S49 Lymphomzellen als Modell für den β2AR
PTXSSTR
β2AR
Giα β γ
Gsαβ γ
cAMP
AC 5/6
ERK
P
β2AR
Giα β γ
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S49 cyc- Zellen als Modell für den β2AR
PTXSSTR
β2AR
Giα β γ
Gsαβ γ
cAMP
AC 5/6
ERK
P
β2AR
Giα β γ
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Multiplexanalyse von β2AR-Stereoisomeren
Binding
[Ca2
+ ] i
O 2.-
ACGTPase
cAMP
ERK
PTXInter
nalisie
rung
Giα + + + + +
Gsα + + + + +
G16α +
β-Arrestin + + +
Sf9 + + +
HL-60 + + + + + +
HEKβ2AR (+) + + + +
S49 + + +
Neutrophile + + + + +
Kop
pelu
ngsp
artn
erZe
llsys
tem
e
Membran Intakte Zellen
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Differentielle cAMP-Akkumulation durch Fenoterol-Stereoisomere in humanen neurophilen Granulozyten und HL-60-Promyelozyten
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
human neutrophils
log (cfenoterol / (mol/L))
c cA
MP
/ % o
f (R
)-ISO
-12 -10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
HL-60 promyelocytes
log (cfenoterol /(mol/L))
c cA
MP
/ %
of (
R)-I
SO(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol
(R,S)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol
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Differentielle Stimulation der cAMP-Akkumulation und Hemmung der O2
- Produktion durch Fenoterol-Stereoisomere in neutrophilen Granulozyten
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
log (cfenoterol / (mol/L))
c cA
MP
/ % o
f (R
)-ISO
-12 -10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
log(cfenoterol /(mol/L))
Inhi
bitio
n of
RO
S pr
oduc
tion
/ % o
f (R
)-ISO
1 μM fMet-Leu-Phe
(R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol
(R,S)-Fenoterol (S,S)-Fenoterol
Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome ProfilerTM Human Phospho-MAPK Array Kit
Kontrolle ATP (R,R)-Fenoterol (S,R)-Fenoterol
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p38alp
ha
CREB
ERK1
ERK2
Akt2GSK-3b
etaGSK3a
lpha/beta
RSK1
JNKpan
MKK3
MKK6
MSK2
0
50
100
KontrolleATP 10 µMRR-FEN 1 µMSR-FEN 1 µM
Nor
mal
isie
rte
auf h
öchs
tes
Sign
al
Analyse von ERK-Signalwegen an HL-60-Promyelozyten mit dem Proteome ProfilerTM Human Phospho-MAPK Array Kit
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Web of Potencies and Efficacies von Fenoterol-Stereoisomeren am β2AR: Evidenz für Ligand-spezifische
Rezeptorkonformationen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9pKi,low
pEC50,AC
pEC50,GTPasepEC50,cAMP
IC50,ROS
RR RS SR SS
0
20
40
60
80
100
120Ratio high affinity agonist binding
Emax AC
Emax GTPaseEmax cAMP
Emax ROS
RR RS SR SS
Web of Potencies Web of Efficacies
Weitere Hinweise für Stereoisomer-spezifische Rezeptorkonformationen
Rezeptor Ligand-Stereoisomere
Effekt
β2AR Noradrenalin Schnelle Konformationsveränderung (kein G-Protein)
α1AR Adrenalin Kontraktion von Blutgefäßen (Gq)
α2AAR Medetomidin [Ca2+]i-Anstieg (Gi)
H1R Chiraprodifene GTPase-Aktivierung (Gq)
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Strukturelle Evidenz für Ligand-spezifische β1AR-Konformationen
Warne et al., Nature 2011;469:241
partielle Agonisten volle Agonisten
Bisher nur R-Stereoisomere analysiert
Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011
Zukünftige Untersuchungen
• Komplettierung der Multiplexanalyse mit allen β2AR-Stereoisomerpaaren
• β2AR-Giα2-Kopplung
• β2AR-β-Arrestin-Kopplung• Molecular Modelling mit 7TMR-active-state-Modellen
• Zielgerichtete Mutagenese zur Identifikation von „Stereoisomer-Switches“
• Vergleich β2AR und H2R (Rezeptor-spezifische G-Protein-und Effektoraktivierung)
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Themen
• β2AR: Funktion, Aktivierung, Signaltransduktion
• Interaktion des β2AR mit Stereoisomeren
• Klinische Implikationen
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Vergleich (R)-Salbutamol versus (S)-Salbutamol beim Asthma bronchiale
Parameter (R)-Salbutamol (S)-Salbutamol
Klassifikation Eutomer Distomer
β2AR-Affinität hoch niedrig
Paradoxe proinflammatorische Effekte in vitro
nein Ja
Paradoxe proinflammatorische Effekte in vivo
nein ?
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Paradoxe Wirkungen von β2AR-Stereoisomeren
Ligand System Effekt
(R)-Salbutamol Glatte Muskelzellen der Atemwege
Dilatation
(S)-Salbutamol Glatte Muskelzellen der Atemwege
Kontraktion
(S)-Salbutamol Mastzellen, T-Zellen, Granulozyten
Histamin, IL-13, ROS↑
(R,R)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung↓
(S,S)-Formoterol Mastzellen Mediatorfreisetzung↑
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(R,S)- versus (R)-Salbutamol beim Asthma bronchiale
Parameter (R,S)-Salbutamol (R)-Salbutamol
Internationaler Freiname
Salbutamol, Albuterol Levosalbutamol, Levalbuterol
Handelname Salbubronch, Salbulair, SalbuHEXAL, ….
Xopenex® (USA)
Klinische Wirksamkeit
vorhanden vorhanden, Überlegenheit bislang nicht nachgewiesen
Relative Kosten 100 500
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β2AR-Rezeptorpolymorphismen16
27164
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Wichtigste Eigenschaften von β2AR-Polymorphismen
Parameter Arg16Gly Gln27Glu Thr164Ile
Agonistbindung unverändert unverändert erniedrigte Affinität
G-Protein- und Effektorkopplung unverändert unverändert vermindert
Desensitisierung verstärkt vermindert vermindert
Assoziation mit Erkrankungen
Asthma bronchiale
Asthma bronchiale, vorzeitige Wehen, kardiovaskuläre Erkrankungen
Kardiovaskuläre Erkrankungen
β2AR-Polymorphismen funktionell nur unvollständig charakterisiert
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Einfluss von β2AR-Polymorphismen auf die klinische Wirksamkeit von β2AR-Agonisten
Israel et al., Am J Respir Crit Care Med 2000;162:5
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Rolle von neutrophilen Granulozyten beim Asthma bronchiale
Bakterien
Formylpeptide
Neutrophile Granulozyten
Hypersekretion Remodelling
Atemwegskonstriktion
Infektion
β2AR
β2ARMakrophagen Neutrophile
Epithelialzellen Eosinophile
Lymphozyten
Zellen in BAL-Flüssigkeit von Asthmatikern
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Hemmung der O2- Produktion in humanen neutrophilen
Granulozyten über den β2AR: Keine paradoxen Effekte von „Distomeren“
-12 -10 -8 -6 -40.0
0.1
0.2
0.3IsoproterenolRR-FenoterolSS-FenoterolR-SalbutamolS-Salbutamol
Ligand (log M)
Δ A
550
nm
8 ml venöses Vollblut, 96 Proben, Mutiplate-reader
1 μM fMet-Leu-Phe
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Interindividuelle Variabilität der IC50-Werte für Fenoterol-Stereoisomere an neutrophilen Granulozyten
(O2- Produktion) gesunder Spender
RR-FENRS-FENSR-FENSS-FEN
R-ISO
-10
-8
-6
-4lo
g(IC
50/M
)
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Zukünftige Untersuchungen
• Korrelation zwischen β2AR-Pharmakologie in neutrophilen Granuloyten und β2AR-Genotyp in gesunden Spendern
• Korrelation zwischen β2AR-Pharmakologie und β2AR-Genotyp in neutrophilen Granulozyten von Asthmatikern
• Analyse der Wirkungen von LABAs an gesunden Spendern und Asthmatikern
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Implikationen für zukünftige klinische Studien mit β2AR-Agonisten bei Asthma
bronchiale und COPD
• β2AR-Genotypisierung der Probanden• Funktionelle β2AR-Charakterisierung in Immunzellen • Vergleich Razemat, „Eutomere“ und „Distomere“• Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener SABAs• Mögliche Nicht-Äquivalenz verschiedener LABAs
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Take-Home Messages
• Funktionelle Selektivität in rekombinanten Systemen und nativen Zellen
• GPCR-Stereoisomere als Werkzeuge zur Exploration funktioneller Selektivität
• Analyse der Wirkungen von β2AR-Stereoisomeren beim Asthma bronchiale als Strategie zur Therapieoptimierung
Institut für PharmakologieProf. Dr. med. Roland Seifert13.07.2011
Kooperationspartner• Brian Kobilka, Ulrik Gether (Stanford University)• Katharina Wenzel-Seifert (Stanford University; University of Kansas)• Michael Kabesch (Pädiatrie, MHH)• Irena Brunskole, Armin Buschauer, Stefan Dove (Medizinische Chemie,
Universität Regensburg)• Peter Gmeiner (Medizinische Chemie, Erlangen)• Irving Wainer (NIH, Bethesda)
Institut für Pharmakologie, MHH• Michael Reinartz • Solveig Kälble• Heike Burhenne, Volkhard Kaever
DFG, AHA, NIH, US Army Research Office