2 dimensionale -NMR Spektroskopie

F.D. SönnichsenMittwoch, Oct 22 2008

• Kopplung über Bindungen• COSY (DQF-COSY)• TOCSY

• Kopplung durch den Raum• NOESY• ROESY

• Kopplung über Bindungen• HETCOR• (Long-range HETCOR or

COLOC)• INADEQUATE• INDIRECT-DETECTION

(HSCQ, HMQC, HMBC)

Homonuklear Heteronuklear

NMR – die Suppenterrine voller Abkürzungen

Problem

Bei komplexeren, größeren Verbindungen erschwert die Zahl der Resonanzen und deren eventuelle Überlappung die eindeutige Zuordnung

Beispiel: ein Protein (120 Aminosäuren)

ppm01234567891011

1D 1H-NMR Spektrum:Ein sehr kompliziertes Spektrum mit dramatischer Überlappung der Resonanzlinien. Man kann nur wenig Informationen extrahieren, und es ist bis auf ein paar Außnahmen unmöglich einzelne Resonanzen zuzuordnen.

Zwei dimensionales NMR (2D)

Die zwei grundlegenden/einfachen 1D-NMR Experimente

Der Prototyp eines 2D- Experimentes

Das einfachste 2D- Experiment

Mischung

N-fach wiederholen, Jedes Mal mit dem Δt1 –Delay um ein Inkrement verlängert. Die einzelnen FIDs werden getrennt gespeichert.

Direkte Dimension

Indirekte Dimension

Perioden im2D Experiment:

EquilibrierungVorbereitung

Frequenz-Bestimmung

Akquisition/Detektion

Die Wirkung von Pulsen auf die Magnetisierung

Vektor-Diagramm Analyse des 2D-Experimente –die Frequenzbestimung in der indirekten Dimension

FID 1:

FID 2:

FID 3:

FID 4:

90xT1=0

T1=τ

T1=2τ

T1=3τ

90x

Acq

Acq

Acq

Acq

t1

90x 90x

t2

n

Eine Komponente der Magnetisierung wird durch den zweiten Puls in Z-Richtung weitergedreht, während die zweite Komponente in der transversalen Ebene bleibt. Die Amplitude ist jedoch verringert, sie ist Sinus-moduliert. Was passiert wenn wir das Experiment wiederholen, jedesmal mit einer systematisch verlängerten Delay-Zeit?

x

Fourier transform with respect to t1

Zur Vereinfachung werden 2D-Spektren im allgemeinen nicht im Seitenblick gezeigt (links, „stacked plot“), sondern in der Aufsicht (rechts). In dieser liegen beide Frequenzachsen in der Papierebene, und die Intensität des Peaks ist vertikal angezeigt in der Form von Höhenlinien / Konturen.

Zwei Spins, I und S

F2

F1

Diagonalpeak von S

Diagonal

Cross peakωS, wS

ωI

ωI,ωI

Die Diagonale dieses Spektrums ist das 1D-Spektrum.

ωI,ωS

Das 2D COSY Experiment

H

• Dieses Zwei-Puls experiment ist auch tatsächlich ein sehr nützliches Experiment. Es wird benutzt, um koppelnde Protonen zu identifizieren, also Protonen die über J-Kopplungen miteinander verbunden sind. Das Experiment nennt sich COSY, als Abkürzung für homonuclear COrrelation SpectroscopY .

• Gleichzeitig ist anzumerken, dass alle 2D Experimente diese Grundstruktur haben, und sich nur in der Mitte durch das Einfügen weiterer/anderer Pulse und Delays unterscheiden.

• Für gekoppelte Spins (I,S) mischt sich die Magnetisierung während t1 (Ix -> IxSz).

• Der zweite Puls wirkt auf diesen gemischten Term, und konvertiert ihn (IxSz ->IzSx) .

• In t2- ensteht dann/ wird detektiert Magnetisierung beim Kern S (IzSx-> Sz), die vom Kern I stammt, und deren Frequenz während der t1–Frequenzbestimmung die Larmorfrequenz von Kern I war.

• Ergebnis: ein Peak, der in t1 mit der Frequenz I moduliert ist, und in t2 mit der Frequenz S moduliert ist

• Off-diagonal peak=ein Peak der nicht auf der Diagonalen des Spektrums liegt.

• Dieser Peak verbindet die miteinander koppelnden Protonen/Spin I und S, und wird zur Identifizierung der Kopplung/ der Nachbarschaft der Kerne benutzt.

F2

F1

(ähnliche peaks für S)

Diagonale

Cross peakωS

ωI

ωI,ωI

The correlation appears at the frequency of the two coupled spins, with the frequency of one proton in the direct dimension,and the frequncy of the other in the indirect dimension

ωI,ωS

CHI

HS

COSY Spektrum von Ethylacetat / Essigsäureester

1D Spektren an den Seiten sind zu Anfang hilfreich .

These couple No coupling

crosspeaks

3J = 12 Hz

Ein weiteres Beispiel

1D-NMR spectra of Ipsenol

Which peaks are neighbors and are coupled ? beyond matching coupling constants

Homonuclear spectra are symmetric as the coupling from one proton to the other is the same as the reverse! Therefore , one often symmetrizes these during processing and plotting.

DQF-Cosy

Das DQF-COSY ist eine Variante des COSY experimentes. Es ist sehr ähnlich, und zeigt praktisch identische Information-Peaks. Es ist jeder etwas weniger empfindlich, hat aber schärfere Diagonalen und Singulett-Unterdrückung, sieht von daher besser aus.

Um CROSS peaks im COSY zu sehen , brauchen wir Kopplunskonstanten von mehreren Hz. Daher sehen wir Kopplungen in diesem Experiment nur für die rot-umrandeten Kopplungen, primär alle geminal und vicinal protons , rarely for protons which are separated by 4 or more bonds

COSY Zusammenfassung• Ein 2D-Experiment, mit zwei Frequenzachsen• Ein Proton – Proton Experiment, d.h. homonuklear• Die Diagonale ist das 1D-Spektrum• Das Spektrum ist symmetrisch• Basiert auf 2,3J Kopplungen, die die Magnetisierung von

Spins mischen und dadurch correlieren-verbinden• Koppelnde Protonen sind verbunden durch Kreuzpeaks-

Cross peaks oder off-diagonal peaks (Correlations)

Cross Peaks enstehen nur durch große Kopplungen, also normalerweise:

Geminale Protonen • Vicinale Protonen, Dieder-Winkel abhängig. • Selten weiter Kopplungen , aber öglich ccasionaly longer

range coupling if J>2 Hz (Homoallyl coupling)

Korrelation von unterschiedlichen KernenDas HETCOR Experiment(traditionelle,ursprüngliche Weg, Protonen mit HeteroAtomen zu koppeln)Jetzt selten benutztNOTE: Detektion des Kohlenstoffes

Das HMQC Experiment(Heteronuclear multiple quantum coherences)Benutzt die direkte 1J-Kopplung der gebundenen Atome. Detektiert mit Proton. Sehr empfindlich . Der benutzte Wert für J ist typischerweise145 Hz.

Note: der Entkoppler –Decoupler während der Detektionszeit führt zur Aufnahme von Singuletts,ungespaltete Signale

Note: the spectra are flipped, as the detected dimensions are opposite in the experiments, and it is convention to present the direct dimension F2 at the bottom

These spectra also show nicely that largely down/upfield shifts of proton and carbon resonances are largely correlated.

Note: no diagonal! Since hetero!

J. B. Lambert & E. P. Mazzola, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Pearson Prentice Hall, 2004

HSQC –Analoges Experiment zum HMQC

•Das HSQC ist wesentlich komplizierter auf der spektroskopischen Seite (Zahl der Pulse, delays etc.)•Gleiche Peaks wie das HMQC - Korrleation von H mit direkt gebundenen X-Kern (13C oder 15N)•selektive Nutzung der 1J-Kopplung

Das HMBC experiment• Wir haben Protonen direkt verbunden (COSY) • Wir haben 13C mit direkt gebunden Protonen verbunden mit der 1J

coupling (HMQC)• Können wir auch Fernkopplungen nutzen?

1. Das HMBC selektiv detektiert Protonen und 13C die über kleine 2,3J Kopplungen verbunden sind (Größenordnung 10 Hz).

2. Hilfreich zum detektieren von quartären Kohlenstoffen3. Und zum Verbinden von Spinsystemen öber quartäre C hinweg

MB steht für Multiple bonds

1

1

2

2

3

3

1

1

2

2

3

3

2JH1-C2

3JH3-C1

IpsenolNote : the arrows indicate artifacts, i.e. direct couplings which are not completely removed. These are 1J couplings, ad can be identified by their large splitting. Since we don‘t decouple during t2, the 1J couplings constant splits the signal into a doublett, with the ~145 J separation

More on 2D:

• Also, the principle can be extended to 3D, 4D and even higher experiments, i.e. even more frequencies can be simultaneously detected What is the caveat ?

•• A 1D spectrum takes minutes, a 2D hours,

a 3D days, a 4D ……

More on 2D:

• Many more 2D experiments can be created , that correlate the same or further nuclei with desired specificity

• Most of these experiments correlate nuclei using coupling constants, i.e. the correlate through bonds.

• Some also offer the possibility to correlate nuclei through space

References

J. B. Lambert & E. P. Mazzola, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Pearson Prentice Hall, 2004

RM Silverstein, FX Webster & DJ Kiemle, Spectrometric Identification of Organic compounds Wiley 2005.