2011_12 marcadores moleculares

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Marcadores Moleculares Esteban Hopp Marcadores Moleculares Agrobiotecnología Curso 2010 Esteban Hopp Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

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Page 1: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores Moleculares

Esteban HoppMarcadores Moleculares

Agrobiotecnología Curso 2010

Esteban Hopp

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Page 2: 2011_12 Marcadores Moleculares

¿Qué son los marcadores genéticos?

Marcadores bioquímicos

Marcadores moleculares RFLP

Sumario

Marcadores moleculares RAPD

Agrobiotecnología

Marcadoresmoleculares

Referencias

Marcadores moleculares AFLP

Microsatélites o SSR

Marcadores moleculares SNP

Page 3: 2011_12 Marcadores Moleculares

¿Qué son los marcadores genéticos?¿Qué son los marcadores genéticos?

Agrobiotecnología

Marcadoresmoleculares

Page 4: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores morfológicos

Fenotipos que resultan de mutaciones en el ADN

Tomado de “The Cartoon Guide to Genetics”, Larry Gonick, Marck Wheelis

Agrobiotecnología

Marcadoresmoleculares

Page 5: 2011_12 Marcadores Moleculares

¿Qué son los marcadores genéticos?

• El concepto de marcador surge con los trabajos de Mendel:

Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres morfológicos) como marcadores que le permitieron

estudiar los patrones de la herencia

Gregor Mendel (Moravian Museum, Brno)

Jardín del monasterio donde Mendel realizaba sus experimentos con las arvejas

Tomado de: Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, 2000.

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Marcadoresmoleculares

Page 6: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Permiten establecer diferencias ( polimorfismos ) entre dos individuos diferentes ( genotipos ) pertenecientes a la misma especie (o a especies emparentadas).

• Su herencia suele responder a las leyes de Mendel.

• Los primeros marcadores utilizados fueron los de ti po morfológico ( fenotípicos ), por ejemplo, color de la flor.

• Permiten la confección de mapas genéticos o de ligamiento.

• Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas.

¿Qué son los marcadores genéticos?

Agrobiotecnología

Marcadoresmoleculares

Page 7: 2011_12 Marcadores Moleculares

Mapa genético de tomate basado en marcadores morfológicos

Tomado de: Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, 2000.

Page 8: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Fenotípicos : los polimorfismos de los genes se detectan a través de sus productos

- Morfológicos: por ejemplo, color de flor- Bioquímicos: básicamente perfiles electroforéticos de

isoenzimas y de proteínas de reserva- Base molecular: mutaciones de distinto tipo

(puntuales, deleciones, etc.)

• Genotípicos o moleculares : Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel de l ADN

Tipos de marcadoresgenéticos

detectan a nivel de l ADN- Restricción con endonucleasas + hibridación

molecular (ejemplo, RFLP)

- Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites)

- Restricción con endonucleasas + PCR: (ejemplo, AFLP)

- Conformación del ADN (ejemplo, SSCP)- Secuenciación directa- Base molecular: mutaciones puntuales o

estructurales (inserciones, deleciones, variaciones en el número de motivos repetidos en tándem)

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Page 9: 2011_12 Marcadores Moleculares

Comparación entre marcadores morfológicos y moleculares

Marcadores

morfológicos

Influencia del ambiente

Bajo número

Baja cobertura del genoma

Sin influencia ambiental y neutros

Cantidad ilimitada

Amplia cobertura del genoma

Marcadores

moleculares

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Marcadoresmoleculares

Bajo nivel de polimorfismo

Menos informativos (dominantes o recesivos)

Caracteres de madurez

Entrenamiento y subjetividad

Alto nivel de polimorfismo

Más informativos(en general codominantes)

Análisis en fases tempranas

Sencillos, rápidos y objetivos

Page 10: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores bioquímicos: isoenzimas Marcadores bioquímicos: isoenzimas y proteínas de reserva

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Page 11: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Isoenzimas

Grupo de múltiples formas moleculares de una misma enzima presente en una misma especie, como resultad o de la presencia de uno o más genes que codifican c ada una de estas formas.

Marcadores bioquímicos:isoenzimas

Las que son relevantes como marcadores genéticos so n las aloenzimas (o alozimas) que son variantes alélicas del mismo gen (o locus) y que presentan una migración electroforética diferencial .

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Page 12: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ejemplo: detección de isoenzimas de maíz

F isomerasa

Malato deshidrogenasa (MDH)

Identificación de variantes isoenzimáticas. Se obser van genotipos homocigotas y heterocigotas para diferentes alelos en una población de maíz analizada para dos loci isoenzimáticos (MDH y F isomerasa), lo que

revela la existencia de polimorfismos dentro de la misma.

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Marcadoresmoleculares

Gentileza de Instituto Nacional de Semillas, Argentina.

Page 13: 2011_12 Marcadores Moleculares

• La interpretación de los geles puede ser difícil porque los patrones de bandas suelen ser complejos

Detección de isoenzimas:Interpretación de resultados

La enzima puede ser multimérica: sus subunidades pueden tener un control genético complejo. Puede comprender alelos del mismo locus

(alozimas) o de loci diferentes(isozimas). La expresión es codominante.

Adaptado de: Ferreira and Grattapaglia. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética, 1995.Agrobiotecnología

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Page 14: 2011_12 Marcadores Moleculares

Detecciónde proteínas de reserva

• Se extraen mediante procedimientos sencillos a partir de las semillas.

• Se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes).

• No se requiere detectar actividad enzimática.

• Se visualizan por tinción con Azul de Coomassie.

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Page 15: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ejemplo:detecciónde proteínas de reserva de avena

Perfiles electroforéticos de proteínas de reserva de distintas variedades argentinas de avena.

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Marcadoresmoleculares

Gentileza de Instituto Nacional de Semillas, Argentina.

Page 16: 2011_12 Marcadores Moleculares

Extracción de ADN: generación de marcadores de ADN

1. Recolección muestra material vegetal y almacenamiento

temporario en hielo

2. Almacenamiento en ultrafreezer (– 80 °C).

3. Macerado del tejido vegetal empleando nitrógeno líquido.

5. Extracción del ADN utilizando solventes orgánicos.

4. Pasaje de la muestra a tubos eppendorf y pesado de la misma. 6. Muestras con

buffer de extracción en baño

termostático.

7. Centrifugado para separación de la fase líquida de la sólida.

8. Purificación final del ADN extraído (lavados con alcohol y resuspensión final del mismo en

agua estéril.

Page 17: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores genotípicos o moleculares basados en la restricción enzimáticadel ADN Marcadores moleculares RFLP

Restriction Fragment Length PolymorphismRestriction Fragment Length Polymorphism(polimorfismo de longitud de fragmentos

de restricción)

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Page 18: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ensayo de transferencia de ADN (análisis de Southern)

Page 19: 2011_12 Marcadores Moleculares

Procedimiento para obtener los RFLP

Page 20: 2011_12 Marcadores Moleculares

Perfiles de RFLPs de Solanum commersoniiempleando bulk segregant analysis (BSA)

Análisis utilizando RFLPs de los bulks resistente (R) y susceptble (S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas de restricción Hinf I, DdeI, Hind III, DraI, EcoRI, XbaI y Sty I (1 al 7). Autoradiografía de los perfiles de RFLP obtenidos e mpleanado

la sonda s1+A/as1+T(584) marcada con radioactividad .

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Page 21: 2011_12 Marcadores Moleculares

Origen del polimorfismo de los RFLPs

Mutaciones puntuales:Ocurren en sitios de restricción.

Mutaciones estructurales:Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.

Adaptado de: Ferreira and Grattapaglia. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética, 1995.

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Page 22: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Comprenden un número potencialmente ilimitado de loci (alta cobertura genómica).

• Son codominantes, por lo tanto más informativos.

• Permiten una mayor cobertura del genoma que las isoenzimas.

• Son altamente reproducibles intra- e inter-laboratorios.

• Permiten homologar mapas de ligamiento

Ventajas de los RFLPs

• Permiten homologar mapas de ligamiento diferentes.

• Se pueden usar las mismas sondas en especies relacionadas (sondas heterólogas).

• Al igual que todos los marcadores moleculares, tienen mayor grado de polimorfismo que las isoenzimas, no son influidos por el ambiente y son selectivamente neutros.

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Page 23: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Algunas especies presentan bajo nivel de polimorfismo (en comparación con otros marcadores moleculares).

• Se requiere disponer de sondas específicas para la especie en estudio.

Desventajasde los RFLPs

• La utilización de radiactividad introduce altos costos y problemas de bioseguridad.

• Requieren alta cantidad de DNA. El procedimiento es laborioso y lento.Agrobiotecnología

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Page 24: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores moleculares basados en la amplificación arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

Random Amplified Polymorphic DNAs

Marcadores moleculares RAPD

Random Amplified Polymorphic DNAs(polimorfismo de ADN amplificado al azar)

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Page 25: 2011_12 Marcadores Moleculares

Características del análisisde RAPDs

- Consiste en la amplificación mediante PCRde ADN anónimo, utilizando para ello un único iniciador de secuencia arbitraria. Los oligonucleótidos iniciadores (primers) se diseñan sin tener en cuenta información de la secuencia genómica de la especie a analizar.

- Normalmente se usa un sólo iniciador, - Normalmente se usa un sólo iniciador, de 10 nucleótidos de longitud (más corto que el de una PCR común) y con un alto contenido en G+C.

- Ejemplo: OP-A01Agrobiotecnología

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CAGGCCTC

Page 26: 2011_12 Marcadores Moleculares

Correspondencia entre los fragmentosamplificados y las bandas de un gel

RAPDs

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Page 27: 2011_12 Marcadores Moleculares

No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante

Los RAPDs son marcadores genéticos dominantes

Page 28: 2011_12 Marcadores Moleculares

Puede deberse a: inserciones (2), deleciones (3), mutaciones de punto que impiden la unión del iniciador (4), o que crean un nuevo sitio de unión del iniciador (5).

Origen del polimorfismo de los RAPDs

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Page 29: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ejemplo: RAPDs en sorgo

Segregación de un marcador RAPD en una población segregante de sorgo para el carácterde resistencia a brotado precosecha. DNAs de IS, B2 (parenta les), F1 y F2 amplificados conel primer OP H02. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5 %, T BE 1x) teñidocon bromuro de etidio.

Gentileza Dr. D.C. Lijavetzky

Page 30: 2011_12 Marcadores Moleculares

Problemas en la Interpretación de bandasde RAPDs

• Problemas de subjetividad del operador:

- ¿Qué bandas se incluyen en el análisisy cuáles no?

• Problemas de la co-migración:

- Una banda no contiene necesariamente- Una banda no contiene necesariamenteun único fragmento de ADN.

- Una banda del mismo tamaño en dos individuos no representa necesariamenteel mismo fragmento de ADN.Agrobiotecnología

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Page 31: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ventajas delos RAPDs • No requieren conocimiento previo del

genoma (anónimos).

• El ensayo es rápido, simple y económico.

• Se dispone de un número ilimitado de marcadores.

• El polimorfismo es elevado.

• Proveen una amplia cobertura del genoma.

• Son más polimórficos que los RFLPs.

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Page 32: 2011_12 Marcadores Moleculares

• La herencia es dominante (menor información genotípica).

• Poseen problemas de reproducibilidad.

• La interpretación de bandas presenta dificultades.

• Son difíciles de transferir a otros laboratorios.

Desventajas de los RAPDs

• A medida que la distancia filogenética aumenta, también aumenta la probabilidad de que dos fragmentos de ADN diferentes co-migren y se cometan errores de cómputo (no son confiables para comparación entre especies distintas).

• Sólo se puede computar presencia compartida de bandas y no la ausencia.

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Page 33: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Estudios de diversidad genética

• Estudios taxonómicos (relaciones fenéticas)

• Determinación de pureza híbrida

• Establecimiento de genealogías (paternidad)• Elaboración de mapas genéticos saturados

Aplicaciones de los RAPDs en especies vegetales

• Mapeo de genes

• Identificación de material vegetal

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Page 34: 2011_12 Marcadores Moleculares

Otras técnicas basadas en la amplificación de fragmentos de DNA anónimo

Los RAPDs son los más populares, pero se se desarrollaron varias técnicas similares en forma relativamente simultánea y que han recibido otros nombres menos conocidos:

• AP-PCR: Arbitrary Primed PCR

• DAF: DNA Amplification Fingerprinting

• MAAP: Multiple Arbitrary Amplicon ProfilingAgrobiotecnología

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Page 35: 2011_12 Marcadores Moleculares

Amplified Fragment Length Polymorphism(polimorfismo de longitud de fragmentos

Marcadores moleculares AFLP

Marcadores moleculares basados en la amplificación arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

(polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados)

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Page 36: 2011_12 Marcadores Moleculares

Etapas para la obtención de marcadores AFLP

tomate 4.000.000 2.800 200.000tomate 4.000.000 2.800 200.000

digestión con Mse I (4pb) y Eco RI (6pb)Mse I Mse I Eco RI Eco RI Mse I Eco RI

Eco RI Mse I

ligación de adaptadores

detección

ligación de adaptadores

“pre”amplificación con oligos complementarios

amplificación con oligos selectivos

ACTAGC

amplificación con oligos selectivos

ACTAGC

Page 37: 2011_12 Marcadores Moleculares

Procedimiento para la obtención de AFLPs

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Page 38: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ejemplo: AFLPs en Eucaliptus spp.

pb500450425400375

350325

300

275

AFLPs. Gel de poliacrilamida teñido con nitrato de plata

Gentileza Dra. S.N. Marcucci Poltri

250

225

200

175

150

125

Page 39: 2011_12 Marcadores Moleculares

AFLP fluorescentes

Detección de AFLPs usando durante la última etapa de amplificación iniciadores fluorescentes, resolviendo los fragmentos en un secuenciador ABI3130XL

Page 40: 2011_12 Marcadores Moleculares

Origen del polimorfismo de los AFLPs

• Resulta de mutaciones de punto, inversiones, deleciones e inserciones que llevan a:

- Pérdida o ganancia de un sitio de restricción.

- Alteración de la secuencia reconocidapor los iniciadores.por los iniciadores.

• Son marcadores dominantes: no es posibledistinguir fácilmente si una banda en un gel es el resultado de la amplificación de 1 ó 2 alelos.

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Page 41: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Anónimos: no requieren• conocimiento previo del genoma.

• Número ilimitado de marcadores.

• Polimorfismo elevado.

• Analizan todo el genoma.

Ventajas de los AFLP

• Analizan todo el genoma.

• Altamente reproducibles.

• Versátiles: distintas enzimas e iniciadores selectivos.Agrobiotecnología

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Page 42: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Herencia dominante.- Se puede hace lectura cuantitativa por densitometría.

• Bajo contenido de informacióngenética por locus.

Desventajas de los AFLP

genética por locus.

• Procedimiento medianamente laborioso.

• Costo medio.Agrobiotecnología

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Page 43: 2011_12 Marcadores Moleculares

Minisatélites

Minisatélites

Minisatélites

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Page 44: 2011_12 Marcadores Moleculares

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Page 47: 2011_12 Marcadores Moleculares

VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) o Minisatélites

• Secuencias idénticas adyacentes que se repiten . en número variable.

• Estas secuencias repetitivas poseen de 15 a 100 . pb y pueden repetirse hasta 50 veces por locus.. pb y pueden repetirse hasta 50 veces por locus.

• Están dispersos por todo el genoma.

• Detección similar que para RFLP (sondas . Constituidas de secuencias con los motivos de . repetición (“core sequence”)

Page 48: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores moleculares basados en la amplificación sitio-específica del ADN Simple Sequence Repeats

(repeticiones de secuencias simples)

Microsatélites o SSR

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Marcadores SCARSequence Characterized Amplified Region

(Región amplificada caracterizada por secuencia)

Page 49: 2011_12 Marcadores Moleculares

Microsatélites

Repeticiones en tándem de secuencias cortas deDNA de 1 a 10 pb de longitud

Ejemplos :

(GA)14

...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA...

(GAT)10

...GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT...

(CATC)8

...CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC..

Sinónimos : SSLP, SSRP, SSR o STMS

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Page 50: 2011_12 Marcadores Moleculares

Microsatélites

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’

3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

16 repeticiones

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’

3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

CTGCGATCAGCCCATCATCG5’

iniciador

PCR con iniciadores específicos

3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3’

3’ CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCG5’

105 pb

iniciador5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAG

Producto de amplificación obtenido

Electroforesis en gel de poliacrilamidadesnaturalizante

Page 51: 2011_12 Marcadores Moleculares

Origen del polimorfismo de los microsatélites

Page 52: 2011_12 Marcadores Moleculares

Los microsatélites son marcadores co-dominantes

Page 53: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ejemplo: variedades de soja (Glycine max) analizadas mediante SSR

Patrones obtenidos para 43 variedades de soja. Gel de poliacrilamida teñido con plata.

Gentileza Dra. S. Giancola.

Page 54: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcación de marcadores moleculares con fluoróforos

Page 55: 2011_12 Marcadores Moleculares

Con el secuenciador automático

Page 56: 2011_12 Marcadores Moleculares

Electroferograma en el secuenciador ABI 3130

Page 57: 2011_12 Marcadores Moleculares

Síndrome del X - frágil

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Gen de retardo mental X-Frágil

Page 58: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Polimorfismo muy elevado (multialélicos)

• Enorme número de loci

• Herencia mendeliana codominante

• Interpretación sencilla de los resultados

Ventajas de los microsatélites

• Interpretación sencilla de los resultados

• Reproducibilidad muy alta

• Resultados transferibles entre laboratorios

• Posible automatizaciónAgrobiotecnología

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Page 59: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Requerimiento de conocimientos previos sobre el genoma de la especie en cuestión:

- Inicialmente lentos

- Inicialmente costosos

• Alto costo para desarrollar los iniciadores

Desventajas de los microsatélites

• Unilocus (aunque pueden hacerse multiplex)

• Alta tasa de mutación que puede afectar la reproducibilidad en estudios genealógicos.Agrobiotecnología

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Page 60: 2011_12 Marcadores Moleculares

SCARs• Los marcadores SCAR consisten en la

amplificación por PCR de un marcador específico.

• Los marcadores RAPD se pueden convertir en marcadores estables y confiables clonando las bandas amplificadas, secuenciando los extremos y usando luego estas secuencias para diseñar iniciadores estas secuencias para diseñar iniciadores específicos.

• El diseño específico de los iniciadores permite trabajar en condiciones de mayor rigurosidad de anillamiento.

• Los marcadores SCAR son muy útiles en los programas de selección asistida.

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Page 61: 2011_12 Marcadores Moleculares

Obtención de marcadores SCAR

Un fragmento polimórfico de interés, puede ser esci ndido de un gel, clonado (o no) y secuenciado para diseñar i niciadores específicos para ese fragmento en particular, permi tiendo su

amplificación en condiciones de PCR más rigurosas.

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Page 62: 2011_12 Marcadores Moleculares

Propiedades de los marcadores basados en la amplificación de fragmentos de ADN conocidos

• Son muy utilizados en mapeo físico de genomas.

• Su análisis es sencillo (muy útiles en selección asistida).

• El ensayo es altamente reproducible.

• Son fácilmente transferibles a otros laboratorios.• Son fácilmente transferibles a otros laboratorios.

• Según las características de su diseño, pueden ser co-dominantes.

• Pueden separarse en geles multiplex cuando se analizan varios loci simultáneamente.

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Page 63: 2011_12 Marcadores Moleculares

• ISSRInter Simple Sequence Repeat (secuencias entre repeticiones de secuencias simples, comúnmente denominados microsatélites anclados)

- Se emplean iniciadores que poseen secuencias

Marcadores moleculares originados por la combinación de técnicas básicas

repetitivas de microsatélites con un par de bases extra, lo que permite amplificar las regiones entre dos SSR cercanos y en orientaciones opuestas.

• SAMPLE

- Se emplean iniciadores microsatélites en conjunción con AFLP.

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Page 64: 2011_12 Marcadores Moleculares

Marcadores moleculares de última generación

Marcadores moleculares SNP

Single Nucleotide PolymorphismSingle Nucleotide Polymorphism(polimorfismo de un solo nucleótido)

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Page 65: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Consisten en sustituciones de una sola base, resultando en un polimorfismo dialélico de secuencia. En el genoma humano su frecuencia es de 1/1.000 nt.

• Son variaciones puntuales a nivel de secuencia. Disponibles por la gran cantidad de secuencias genomicas ya secuenciadas.

• Son más frecuentes que SSR.

• Se ubican cercanos o en el locus de interés. Por lo

Marcadores moleculares SNPs

• Se ubican cercanos o en el locus de interés. Por lo tanto, pueden asociarse precisamente a caracteres como enfermedades.

• Son muy útiles como marcadores para la construcción de mapas de ligamiento más densos que los actuales.

• Son dialélicos. Son mutacionalmente más estables, en comparación con variantes en el largo de la secuencia.

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Page 66: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Secuenciación comparativa de ADN amplificado

• Métodos conformacionales:- Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)- Análisis por internal heteroduplex generator (IHG)

• Métodos para análisis de un gran númerode muestras (high throughput analysis):

- Microplate-array diagonal-gel electrophoresis (MADGE)

Detección de SNPs

- Microplate-array diagonal-gel electrophoresis (MADGE)

- *TaqMan® y variantes de PCR en tiempo real y FRET- ELISA- Sequence-specific oligonucleotide hibridization (SSO)

- *Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC)

- *Single Nucleotide Polymorphism (SNP) array- Solid-phase minisequencing, pyrominisequencing,

minisequencing with FRET, etc.

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Page 67: 2011_12 Marcadores Moleculares

• Fundamento:

- Diferencias en las secuencias específicas de segmentos conocidos (locus/loci)

• Procedimiento:

- Extracción y purificación de ADN

Detección de SNPs: secuenciación comparativa de segmentos amplificados

- Extracción y purificación de ADN - PCR con iniciadores caracterizados- Secuenciación del producto de amplificación

- Aplicación de alguna de las técnicas de detecciónAgrobiotecnología

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Page 68: 2011_12 Marcadores Moleculares

Identificación de polimorfismos

Page 69: 2011_12 Marcadores Moleculares

PCR en tiempo real: sistema TaqManDetección de SNPs: métodosde análisis para gran número de muestras

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Page 70: 2011_12 Marcadores Moleculares

Detecciónde SNP empleando sondasTaqMan®para cada alelo

Química de la discriminación alélica

La sonda sólo hibrida con la secuencia blanco si existe complementariedad perfecta de bases. Así, la sonda marcada con FAM sólo reconoce al alelo 2 (AT)

y la sonda marcada con VIC sólo reconoce al alelo 1 (GC). Ambas sondas se colocan en la misma reacción de PCR y, de acuerdo con el alelo presente, se obtienen señales fluorescentes para uno u otro fluorocromo. En un individuo

heterocigota se puede detectar la señal correspondiente a ambos alelos.

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Page 71: 2011_12 Marcadores Moleculares

Microordenamientos de oligonucleótidos de alta densidad (microarrays o chips de ADN)

Detección de SNPs: métodosde análisis para gran número de muestras

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Marcadoresmoleculares

Page 72: 2011_12 Marcadores Moleculares

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Marcadoresmoleculares

Page 73: 2011_12 Marcadores Moleculares

Esquema de genotipeado GoldenGate

Por cada polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), se

diseñan dos oligonucléotidos alelo específicos (ASOs) y un

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Marcadoresmoleculares

alelo específicos (ASOs) y un oligonucléotido específico de

locus. Las tres secuencias oligonucleotídicas contienen

regiones de complementariedad genómica

y sitios de iniciación universales para PCR; el LSO

contiene además una única secuencia de dirección

complementaria a un tipo particular de cuenta. La

secuencia de dirección hibrida a las sondas para el tipo de

cuenta universal en el último paso de hibridación.

Page 74: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ensayo con el sistema GoldenGate

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Page 75: 2011_12 Marcadores Moleculares

Ventajas y desventajas de los marcadores SNP

• Ventajas:- Baja tasa de mutación (mayor estabilidad que los SSR)

- Muy abundantes

- Fáciles de analizar por métodos bioinformáticos

- Desarrollo continuo de nuevas metodologías analíticas para su detección

- Simplificación de los estudios comparativos cruzados.

• Desventajas:- Costosos de aislar y caracterizar (secuenciación)

- Bajo contenido de información para un único SNP

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Referencias82.

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