24종 아미노산 (Amino Acid) & 가바 (GABA)

HPLC로 쉽게 분석할 수 있다!OPA & FMOC 유도체화 시약 사용

Asp Glu

AsnSer

Gln

His

Gly

Thr

Cit

Arg

Ala

Tyr

Cys

Val

Met

NvaTrpPheILeLeu

Lys

Hyp

Sar

Pro

Agilent HPLC를 이용한 자동화 유도체화 방법을 통한

24종 아미노산 동시 분석

분석 개요

아미노산은 염기성인 아미노기(-NH2)와 산성인 카르복시기(-COOH)를 모두 가지고 있는 화합물이며 대표적인 양성 전해질로서

단백질을 구성하는 중요 성분입니다. 아미노산의 경우 Single-bond로 이루어져 UV/VIS 에서 흡광을 갖지 않아 다양한 방법으로

유도체화 하여 분석합니다. 주로 OPA (ο-phthaldialdehyde : 1차 아미노산 유도체화)와 FMOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl

chloride : 2차 아미노산 유도체화)를 이용하여 FLD 또는 UVD를 통해 검출합니다.

다른 유도체화 방법으로는 Dabsyl chloride를 이용하는 방법과 AQC (6-Aminoquinoly-N-hydroxysuccinimidyl)를 이용하는

방법 등이 있으나 이러한 유도체화 방법은 고온에서 반응시키기 때문에 재현성과 시료전처리의 자동화가 어렵습니다.

Agilent HPLC을 이용한 OPA/FMOC 유도체화 방법은 상온에서 Auto-Sampler로 간편히 자동화하여 재현성 있는 결과를 얻을 수

있습니다. 만일 Agilent HPLC를 사용하지 않는다면 상온에서 유도체화 시약을 섞어서 사용하면 같은 결과를 얻을 수 있습니다.

본 실험은 Agilent AAA Column를 사용하여 아미노산을 분석한 결과 입니다.

분석 결과

분석 방법

Chromatogram

HPLC Condition

1차 아미노산

2차 아미노산

Column Agilent ZORBAX Eclipse AAA 4.6×150 mm, 5 μm (P/N 993400-902)

M.PhaseA: 40 mM Sodiumphosphate(Di-basic) 0.1% Phosphoric acidB: Acetonitrile / Methanol / DW = 45/45/10

DetectorDAD 338nm (1차 아미노산) 262nm (2차 아미노산) FLD Ex : 340nm, EM : 450nm (1차 아미노산) Ex : 266nm, EM : 305nm (2차 아미노산)

Flow rate 1.5 ml/min

Temp. 40℃

Time (min) B (%)

0.0 0

1.9 0

18.1 57

18.6 80

22.3 80

23.2 0

26.0 0

Agilent HPLC를 이용한 자동화 유도체화 방법을 통한

GABA 분석

분석 개요

GABA(γ-Aminobutyric acid)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질 아미노산의 일종으로 흥분억제성 신경전달 물질입니다.

중추신경계 전체 신경전달물질 중 약 30%를 차지하며 다른 신경전달물질에 비하여 약 200~1,000배의 고농도로 존재합니다.

GABA는 항스트레스, 항불안, 혈압상승억제, 항경련, 시력증진 등 인체의 많은 생리적인 메카니즘의 조절에 관여하는 것으로

알려져 있고, 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 통증완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 주목 받는

물질입니다. 그렇기 때문에 이러한 GABA의 역할로 인해 최근에는 기능성 식품소재로의 관심이 고조되고 있습니다.

Agilent HPLC을 이용한 OPA/FMOC 유도체화 방법은 상온에서 Auto-Sampler로 간편히 자동화하여 재현성 있는 결과를 얻을 수

있습니다. 만일 Agilent HPLC를 사용하지 않는다면 상온에서 유도체화 시약을 섞어서 사용하면 같은 결과를 얻을 수 있습니다.

본 실험은 Agilent AAA Column를 사용하여 GABA를 분석한 결과 입니다

분석 결과

분석 방법

Chromatogram

Auto-Sampler Program

1. Draw 2.5ul from Vial 1 (Borate buffer) ①

2. Draw 0.5ul from Sample

3. Mix 3ul “in air” max speed, 2x

4. Wait 0.5min

5. Draw 0ul vial2

(Needle wash-uncapped vial)

6. Draw 0.5ul vial3 (OPA) ②

7. Mix 3.5ul “in air” max speed, 6x

8. Draw 0ul vial2

(Needle wash-uncapped vial)

9. Draw 0.5ul vial4 (FMOC) ③

10. Mix 4.0ul “in air” max speed, 6x

11. Draw 32ul vial5 (Water)

12. Mix 18ul “in air” max speed, 2x

13. Injection

14. Wait 0.10min

15. Valve bypass

[Calibration curve : 0.1ug/ml~50ug/ml]

AG”BC”201607

제품상담 : 크로마토그래피팀 (T:02-2140-5460)

③ 2차 아미노산 유도체 시약 FMOC

① 유도체화 시 최적의 조건(pH)를 맞추기 위한 Borate Buffer② 1차 아미노산 유도체 시약 OPA

① Borate Buffer : P/N 5061-3339② OPA Reagent 6/pK : P/N 5061-3335③ FMOC Reagent 10/pK : P/N 5061-3337④ Agilent ZORBAX Eclipse AAA 4.6×150 mm 3.5 μm : P/N 963400-902⑤ Agilent ZORBOX Eclipse AAA 4.6 x 150 mm 5 μ m : P/N 993400-902⑥ AA, STD 1nmol/ μL 10/PK (17종): P/N 5061-3330

What are you looking for?

Peptide, Protein Analysis Column

Nofluorescent, absorbs at 230 nmDoes not absorb at 338nm

FluorescentAbsorbs at 266 nm and Fluoresces at 305 nm

O SR’

NRH

H

O

O

+

O

CI

RR’NHorRNH2

NRR’orNHR

Fluorescence: Ex 230 nm, Em 450 nmDAD: 338, 10 nm; Ref.390, 20 nmAbsorbs at 230 nm and 338 nm

Fluorescence: Ex 266 nm, Em 305 nmDAD: 262, 16 nm; Ref. 324,8 nm

+R’SH

Room Remperature

-HCI

Room Remperature

+RNH2

Amino Acids를 분석하는 또 다른 방법

특화된 아미노산 분석기 Biochrom AAA

● 식품, 임상, 제약, 사료 분야 등 광범위한 분야에서 다양한 목적으로 분석● 48종의 유리 아미노산 분석 가능

● Primary structure analysis - (RP) AdvanceBio RP-mAb / AdvanceBio Peptide Mapping

● Charge variant analysis - (Ion-Exchange) Agilent Bio IeX / Agilent Bio Mab / PL-SCX / PL-SAX

● Aggregation and fragment analysis - (SEC) Bio SEC-3 / Bio SEC-5 /ProSeC 300S

● Glycosylation characterization - (Hydrophilic) AdvanceBio Glycan Mapping

● Titer determination - (Affinity) AdvanceBio Bio-Monolith / Protein A