25 lampiran 1. skema kerja penelitian pengambilan sampel tanah

12
25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah dari lahan tambang timah di Belitung Isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur Pemurnian isolat bakteri Karakteriasi isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur Pengamatan makro morfologi Pewarnaan Gram Pengamatan mikro morfologi Seleksi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium Yang Mengandung Fe dan S Identifikasi Isolat Bakteri Terpilih Secara Molekuler Sekuensing Analisis urutan sekuen gen 16S rRNA

Upload: ngodien

Post on 13-Feb-2017

290 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

25

Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian

Pengambilan sampel tanah dari lahantambang timah di Belitung

Isolasi bakteri pengoksidasibesi dan sulfur

Pemurnian isolat bakteri

Karakteriasi isolat bakteripengoksidasi besi dan sulfur

Pengamatanmakro

morfologi

PewarnaanGram

Pengamatanmikro

morfologi

Seleksi Bakteri Pengoksidasi Besi dan SulfurBerdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium

Yang Mengandung Fe dan S

Identifikasi Isolat Bakteri TerpilihSecara Molekuler

Sekuensing

Analisis urutan sekuen gen 16S rRNA

Page 2: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

26

Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan

No. Nama Alat Merk/Type Kegunaan Tempat1. Autoklaf HL36AE (Hirayama

Manufacturing Corp.)Sterilisasi alat dan bahan Lab. Mikrobiologi

2. pH meter Thermo ElectronCorporation (RL060P)

Mengukur pH medium Lab. Mikrobiologi

3. Shaker Inkucator Lab Companion SI-600 Menginkubasi biakan bakteri Lab. Mikrobiologi4. Alat elektroforesis CBS Scientific EPS – 300X Memisahkan DNA

berdasarkan berat molekulLab. Genetika danMolekuler

5. Nanophotometer Implen Mengukur kemurnian DNA Lab. Riset6. Alat PCR Thermal Cycler Techne

(TC-5000)Perbanyakan DNA tempat Lab. Riset

7. Gel Doc UVP MultiDoc-It Visualisasi DNA Lab. Genetika danMolekuler

8. Mikroskop Olympus CO11 Mengamati sel bakteri Lab. Mikrobiologi9. UV-Vis

SpektrophotometerShimadzu UV mini 1240 Mengukur nilai OD Lab. Lingkungan

10. Sentrifuge Eppendorf Centrifuge5415R

Memisahkan supernatan Lab. Genetika danMolekuler

No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan1. Alkohol 70% Sterilisasi permukaan2. SDS 10% Lisis sel bakteri3. Tenderizer 30% Lisis sel bakteri4. Alkohol absolut 99% Pencuci DNA5. TE 1x Larutan Buffer6. TAE 1x Larutan Buffer7. Primer 27F dan 1540R 100 pm Templat replikasi DNA genom8. Agarose 1,5% Running DNA saat elektroforesis9. HCl 10 M Menurunkan pH medium

Page 3: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

27

Lampiran 3. Gambar Hasil Isolasi dan Pemurnian Isolat Bakteri Pengoksidasi Besi danSulfur

Hasil isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur

Hasil pemurnian isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur

Page 4: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

28

Lampiran 4. Gambar Hasil Pewarnaan Gram

Page 5: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

29

Lampiran 5. Komposisi dan Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri

a. Medium Cair dari Dunger and Fielder (1989) dengan garam ferro

Komposisi :

K2HPO4 0,05 gram

(NH4)2SO4 0,15 gram

Ca(NO3)2 0,01 gram

MgSO4. 7H2O 0,50 gram

KCl 0,05 gram

FeSO4. 7H2O 1,00 gram

Akuades 1000 ml

pH 3,5

Cara Pembuatan Medium :

Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali

FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C dan didinginkan. FeSO4. 7H2O,

dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya, sebesar

3,5 dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut

kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam tabung yang

telah steril.

Page 6: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

30

b. Medium Padat 9K (Silverman and Lundgreen, 1959)

Komposisi :

K2HPO4 0,05 gram

(NH4)2SO4 0,15 gram

Ca(NO3)2 0,01 gram

MgSO4. 7H2O 0,50 gram

KCl 0,05 gram

FeSO4. 7H2O 1,00 gram

Agar 15 gram

H2SO4 1 N 10 ml

Akuades 1000 ml

pH 3,5

Cara Pembuatan Medium :

Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali

FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C kemudian didinginkan. FeSO4.

7H2O dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya

sebesar 3,5 dengan H2SO4 1 N, dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan.

Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi

ke dalam cawan petri yang telah steril.

Page 7: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

31

Lampiran 6. Kromatogram Urutan Basa Gen 16S rRNA

a. Isolat L2K5

b. Isolat L2K3

Page 8: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

32

c. Isolat L1K1

Page 9: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

33

Lampiran 7. Hasil Alignment Sekuen Forward dan Reverse Urutan Basa Gen 16S rRNAdengan Program BioEdit

a. Isolat L2K5

AATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGA

b. Isolat L2K3

GTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT

Page 10: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

34

GTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGAT

c. Isolat L1K1

GAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGAGCGTCCACCGCATGGTGGGTGTTGGAAAGATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGTCCGGGGCTTAACCCCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTTCTCGATCGCCGTAGAGATACGGTTTCCCCTTTGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACGTCGTGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTTAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCAGCGATT

Page 11: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

35

Lampiran 8. Hasil Analisis Sekuen 16S rRNA dengan Program BLASTN NCBI

a. Isolat L2K5

d. Isolat L2K3

Page 12: 25 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah

36

e. Isolat L1K1