31. cocobacili gram-negativi. genul haemophilus gabriela...

40
31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) 31. 1. Definiţie. Încadrare Microorganismele din acest gen sunt cocobacili polimorfi (pot exista chiar şi forme filamentoase), imobili, nesporulaţi, Gram-negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenţioşi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezenţa factorilor de creştere prezenţi în sânge (de unde şi numele genului). Există mai multe specii. Genul Haemophilus a fost inclus în Familia Pasteurellaceae, împreună cu genurile Actinobacillus, Pasteurella şi alte 4 grupuri ce cuprind peste 80 de specii bacteriene. Taxonomic, genul este într-o permanentă schimbare; unele specii sunt eliminate ori candidate la excludere, altele sunt nou identificate. În prezent genul Haemophilus cuprinde peste 15 specii. Dintre speciile care colonizează/infectează omul, amintim: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H. parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphrophilus şi H. segnis; în cadrul acestui capitolul vom prezenta două specii, H. influenzae şi H. ducreyi. 31. 2. Haemophilus influenzae A fost considerat agentul etiologic al gripei în pandemia de gripă din anii 1890-1892 (Pfeiffer). A fost izolat în 1892. Numele a fost stabilit în 1917, în „amintirea erorii” din 1892. 31. 2. 1. Caractere generale 31. 2. 1. 1. Habitat Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi mucoasa conjunctivală, precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase. Într-un studiu recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi / sau faringian dar nici un student nu a fost purtător de H. influenzae. Am identificat un caz de portaj pentru H. parainfluenzae. 31. 2. 1. 2. Caractere morfologice În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3μm), uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot apărea forme filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu Streptococcus

Upload: lycong

Post on 08-Feb-2018

228 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

Page 1: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus. (Gabriela

Loredana Popa, MI Popa)

31. 1. Definiţie. Încadrare

Microorganismele din acest gen sunt cocobacili polimorfi (pot exista chiar şi forme

filamentoase), imobili, nesporulaţi, Gram-negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni

pretenţioşi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezenţa factorilor de creştere prezenţi în sânge

(de unde şi numele genului). Există mai multe specii. Genul Haemophilus a fost inclus în

Familia Pasteurellaceae, împreună cu genurile Actinobacillus, Pasteurella şi alte 4 grupuri ce

cuprind peste 80 de specii bacteriene. Taxonomic, genul este într-o permanentă schimbare;

unele specii sunt eliminate ori candidate la excludere, altele sunt nou identificate. În prezent

genul Haemophilus cuprinde peste 15 specii. Dintre speciile care colonizează/infectează

omul, amintim: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H.

parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphrophilus şi H.

segnis; în cadrul acestui capitolul vom prezenta două specii, H. influenzae şi H. ducreyi.

31. 2. Haemophilus influenzae

A fost considerat agentul etiologic al gripei în pandemia de gripă din anii 1890-1892

(Pfeiffer). A fost izolat în 1892. Numele a fost stabilit în 1917, în „amintirea erorii” din 1892.

31. 2. 1. Caractere generale

31. 2. 1. 1. Habitat

Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi mucoasa

conjunctivală, precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase. Într-un studiu

recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate

(date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus,

nazal şi / sau faringian dar nici un student nu a fost purtător de H. influenzae. Am identificat

un caz de portaj pentru H. parainfluenzae.

31. 2. 1. 2. Caractere morfologice

În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-negativi, mici

(1-1,5 / 0,3µm), uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot apărea forme

filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20

secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu Streptococcus

Page 2: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

pneumoniae, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci

numai cu fucsină bazică 0,1% sau cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 5 minute.

În culturi apar în funcţie de vârsta culturii şi de mediul de cultură:

- în medii bogate, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă.

- în culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (probleme de

diagnostic diferenţial microbiologic). Polimorfismul apare odată cu „îmbătrânirea” culturii şi

este caracteristic tulpinilor în curs de trecere la forma „R”.

31. 2. 1. 3. Caractere de cultură

Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2, atmosferă umedă,

la 35-37ºC, pH=7,6 incubat pentru o perioadă de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt

necesari factori de creştere precum (factorii X şi V). Factorul X, termostabil (rezistă 45

minute la 120°C), este protoporfirina IX sau o protohemă cu fier, prezentă în sânge sau în

derivatele sale cu hemină şi asigurată în mediile de cultură prin adaos de 5% sânge

chocolatat, de suplimente XV, Fildes sau Levinthal, care conţin aproximativ 500 µg/ml factor

X şi 150 µg/ml factor V, sau prin suplimentare cu hemină. Haemophilus influenzae necesită

pentru dezvoltare 0,1-10 µg/ml factor X, iar H. ducreyi 200 µg/ml hemină. Factorul V,

termolabil (rezistă numai 15 minute la 90°C), este nicotin-amid-adenin dinucleotidul (NAD)

sau NADPH (fosfat), prezent în hematii, dar eliberat, este distrus de pirofosfatază şi NAD-

ază, prezente în sângele de om, ovine, caprine, ori bovine (enzime inactivate prin

chocolatizare). Surse de factor V sunt suplimentele XV, extractul de drojdie, de cartof sau

tomate, diferite bacterii: stafilococ, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa mucos,

Sarcina lutea, Escherichia coli, levuri şi preparatele de NAD sau NADPH. Necesităţile de

factor V pentru H. influenzae sunt de 0,2-1 µg/ml, pentru H. parainfluenzae de 1-5 µg/ml sau,

pentru unele tulpini, de 25 µg/ml. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară

eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică).

Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de

Haemophilus influenzae sunt mai numeroase în jurul unor colonii de stafilococ (fenomenul de

satelitism); util în identificare.

Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S,

care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Pe geloză-

chocolate, coloniile ating 1-3 mm abia după 36-48 ore, având aspectul unor picături de rouă.

31. 2. 1. 4. Caractere biochimice şi de metabolism

Page 3: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesită pentru dezvoltare factorii X şi V.

Fermentează inconstant carbohidraţii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol-pozitive

(transformă triptofanul în indol). Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi împărţită în 8

biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacienţi se încadrează în biotipurile I-IV;

majoritatea tulpinilor cu capsulă de tip b fac parte din biotipul I.

31. 2. 1. 5. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici

Rezistenţa în mediu este scăzută. Prin uscare sunt distruşi rapid. În spută pot rezista până

la 48 de ore. Sunt distruşi de dezinfectanţii obişnuiţi sau de menţinerea timp de 30 minute la

56ºC. Datorită viabilităţii reduse, cultura trebuie repicată pe mediu proaspăt la un interval de

5-6 zile. Totuşi, în tuburi închise (cu geloză-chocolate), cultivate din abundenţă, culturile de

H. influenzae ar putea rezista până la 4-5 săptămâni, la temperatura camerei. Cele mai bune

metode de conservare sunt reprezentate de a. liofilizare şi de b. menţinerea la -70ºC (după

cultivare în mediu lichid, îmbogăţit, cu 20% glicerol).

31. 2. 1. 6. Structură antigenică

Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică ce are o compoziţie diferită, în

funcţie de tipul serologic. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi

de imunofluorescenţă folosind seruri specifice. Cel mai răspândit şi mai patogen este tipul b,

la care antigenul este poliribozil-ribitol-fosfat (PRP) şi prezintă înrudiri antigenice cu

Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes, Stafiloccocus epidermidis, Enteroccocus

feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora normală a tractului

respirator nu prezintă capsulă). Totuşi, răspunsul imun faţă de structura capsulară de tip b

este slab, ineficient, în primii ani de viaţă (0-2 ani), exact în perioada în care infecţiile cu H.

influenzae au potenţialul cel mai grav.

Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puţin două proteine: substanţa M, un antigen

de suprafaţă labil şi substanţa P, care constituie o parte însemnată a corpului bacterian.

Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate în mediu lichid,

dar natura ei antigenică nu este foarte clară.

Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezintă

activitate faţă de tulpini capsulate de alte tipuri, faţă de tulpinile necapsulate, faţă de alte

specii de Haemophilus şi faţă de unele enterobacterii.

31. 2. 1. 7. Răspuns imun

La nou-născuţi şi la sugarii sub 3 luni există o stare de imunitate, anticorpii provenind de

la mamă. După această vârstă, concentraţia de anticorpi scade. În SUA, Haemophilus

influenzae este cea mai frecventă cauză de meningită la copii între 5 luni şi 5 ani. Diferite

Page 4: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

studii demonstrează că la vârsta de 3-5 ani un număr important de copii au anticorpi anti-PRP

care contribuie la realizarea lizei dependentă de complement şi stimulează fagocitoza.

Există o corelaţie (insuficient de bine precizată practic) între anticorpii bactericizi şi

rezistenţa la infecţii grave cu Haemophilus influenzae.

31. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate

Haemophilus influenzae este un microorganism condiţionat patogen. Prezintă adezine de

suprafaţă (filamentoase). Endoxina are un rol redus în patogenitate. Rolul antigenelor

somatice urmează să fie clarificat.

Rolul esenţial îl are capsula, iar din cele şase tipuri, tipul b apare în circa 90% din cazurile

severe de infecţie cu Haemophilus influenzae.

H. influenzae mai produce IgA protează şi 2 proteine pentru achiziţia de fier.

Tulpinile necapsulate se pare că îşi exercită virulenţa datorită structurii peptidoglicanului

(cu acţiune pro-inflamatorie), LOZ, Cu şi Zn-super oxid dismutaza.

31. 2. 2. Patogenie şi principalele boli produse

Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazie.

Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută,

probabil în asociere cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată

de epiglotită, laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de pneumonie, dar şi de meningită

acută purulentă la copiii mici preşcolari.

Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie locală (se poate nota faptul că

Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se numără printre agenţii etiologici comuni ai

otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor acute).

Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin, pe această cale poate infecta

meningele.

Ocazional infecţia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă fulminantă

care necesită traheotomie sau intubare promptă a copilului respectiv.

31. 2. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse deHaemophilus influenzae

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este

bacteriologic, direct.

În vederea discutării examenului de laborator vom avea în vedere meningita. În

meningita produsă de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi /

Page 5: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

sau deces), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator.

Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului”, chiar dacă pentru concentrarea

germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR

este utilă în stabilirea etiologiei.

Tulpinile capsulate (prezintă Ag de tip K) se pot identifica în produsul patologic (LCR

sau urină, după centrifugare) prin contraimunoelectroforeză, latex aglutinare, coaglutinare sau

ELISA. Pot apărea reacţii fals-pozitive datorită unor „înrudiri antigenice”, pentru că

antigenele capsulare tip a, b, c şi f, conţin acizi teichoici. O altă problemă tehnică este

reprezentată de faptul că există şi tulpini „autoaglutinabile”.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie

de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât

mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de

asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta

secreţii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreţii din sfera ORL, lichide

recoltate prin puncţie, sânge, LCR etc. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este

reprezentat de LCR (vezi şi anexa nr. 6). Aşa cum am mai menţionat, recoltarea LCR prin

puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de

ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar

pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi

de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). În cazul în care p.p.

urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o

temperatură apropiată de 37°C, refrigerarea este contraindicată). H. influenzae ar putea fi

izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de

vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu

albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent frotiurile se pot

executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se

examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor inflamatorii (ex.

leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, fini, capsulaţi, dispuşi separat sau în

grămezi „aranjate în aceeaşi direcţie”, uneori dispuşi în lanţuri scurte, situaţi intra sau

extraleucocitar. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în

Page 6: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

coloraţia Gram, ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă sau,

recolorarea prelungită cu fucsină (vezi şi 31.2.1.2.).

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi anexa nr. 2).

Haemophilus influenzae este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe

medii de cultură obişnuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea

creşterii 5-10% CO2. Este necesară pentru incubare o atmosferă umedă, la 35-37°C, şi o

durată de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de creştere precum

hemina (factor X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime.

Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea conţinutului acestora în

mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de

stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai

numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o

tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe de altă parte,

atunci când produsele însămânţate sunt potenţial contaminate, este necesară folosirea

mediilor selective (ex. cu bacitracină, vancomicină, clindamicină şi amfotericină B).

Coloniile sunt de tip S sau M şi ating un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de ore, respectiv 1-

2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe geloză-chocolate. Pe geloză-sânge

cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore

prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 µm), dispuşi

separat sau în grămezi, uneori dispuşi în lanţuri scurte. În medii complexe, la 6-8 ore,

predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă. În culturile vechi se caracterizează

prin pleomorfism şi pierderea capsulei (dificultăţi de diagnostic diferenţial

microbiologic).

Caractere de cultură: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm

după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având pe geloză-chocolate aspectul unor

picături de rouă. Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V).

Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de

Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei

linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul

Page 7: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

de satelitism). Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde,

convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu

apare hemoliză.

Caractere biochimice:

Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesităţile de factor X.

Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transformă triptofanul în

indol).

Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice

(ex. indol, urează, ornitin decarboxilază) specia a putut fi împărţită în opt

biotipuri.

Utilizând galeria API NH (manuală) putem identifica specii de Neisseria,

Haemophilus şi Branhamella catarrhalis, în numai 4 ore.

Caractere antigenice:

Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de

Haemophilus influenzae, prin tehnici imunologice, în funcţie de Ag K.

Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei,

imunofluorescenţă, aglutinare, latex-aglutinare şi coaglutinare.

Tiparea LOZ poate fi realizată prin Western blot, imunoprecipitare sau

imunoradiotestare în gel. Au fost caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae.

Prin aceleaşi tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în

gel), tipul b capsular poate fi subtipat (11 subtipuri).

Tulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Multilocus Enzyme

Electrophoresis (MLEE) sau prin tipizarea antigenelor OMP (electroforeză în

gel de poliacrilamidă; această metodă poate fi utilizată şi pentru subtiparea

tulpinilor cu capsulă de tip b).

Alte teste: există sonde nucleotidice şi amorse (pentru PCR) produse comercial pentru

identificarea H. influenzae (atât din cultură cât şi din produse patologice).

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii

tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este

recomandată utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se

pot utiliza şi truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi interpretare după

18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea

CMI şi CMB poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului E

(vezi capitolul 7).

Page 8: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae

Identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. influenzae ar putea fi utilă pentru verificarea

răspunsului imun în urma vaccinării. În acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA.

31. 2. 4. Tratament

Deoarece se estimează că mortalitatea datorită meningitei cu Haemophilus influenzae, în

lipsa tratamentului, poate fi de până la 90%, la copii, punerea diagnosticului şi instituirea

tratamentului corect reprezintă un deziderat major. Diagnosticul prompt şi tratamentul

antimicrobian sunt esenţiale şi pentru scăderea implicării ulterioare neurologice şi

intelectuale. Multe din tulpini sunt încă sensibile la ampicilină (circa 25% produc β lactamaze

sub control plasmidic). Pentru infecţiile grave, până la obţinerea rezultatelor antibiogramei se

poate administra ceftriaxonă.

31. 2. 5. Epidemiologie. Prevenire. Control

Haemophilus influenzae tip b se transmite pe cale aeriană, interuman.

Deoarece vaccinurile polizaharidice care conţin şi polimeri aparţinând peretelui celular,

sunt slab imunogenice la copiii sub 2 ani, s-a realizat un vaccin la care polizaharidul este

cuplat cu anatoxina difterică. Acest vaccin conjugat se administrează la copiii în vârstă de

peste 18 luni. La minimum 2 luni după prima doză se poate administra a doua doză (între 18

şi 23 de luni).

Deoarece vaccinul nu împiedică portajul, în situaţii epidemiologice se pot administra

antibiotice în scop profilactic (ex. rifampicină 20 mg/kg-corp, timp de patru zile).

În România nu se raportează (s-au nu s-au raportat) infecţiile invazive meningeale,

produse de H. influenzae. Se raportează în schimb pneumoniile la care agentul etiologic este

acest microorganism. Dacă în 1998 au fost raportate 425 cazuri iar în 2003 au fost raportate

307 cazuri, cel mai mare număr de cazuri s-a înregistrat în 2004 (969 cazuri, cu o incidenţă

de 4,50/0000). În anul 2005 au fost înregistrate 263 cazuri iar în anul 2006, 313 cazuri

(incidenţa fiind 1,50/0000). Subiectul „diagnosticul de laborator în infecţii cu H. influenzae” a

fost de asemenea tratat în cursul de pregătire pe care dr. M. Popa l-a coordonat în 2004

(proiectul Phare, aprobat pentru România în anul 2000); din păcate, rezultatele nu sunt, încă,

remarcate.

Chiar şi după introducerea recomandării vaccinării anti - H. influenzae la copii, în SUA au

fost înregistrate infecţii invazive cu acest microorganism. Incidenţa acestor manifestări a atins

în 1996 cifra de 0,450/0000, cu 1.170 cazuri raportate, în 1998 s-au înregistrat 1.194 cazuri

Page 9: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

(incidenţă 0,440/0000) iar în 1999, 1.309 cazuri (incidenţă 0,480/0000). În următorii ani,

incidenţa s-a situat în jurul valorii de 0,700/0000 (0,7 în 2003; 0,72 în 2004 şi respectiv 0,78 în

2005, cu 2.304 cazuri raportate la nivel naţional). Autorităţile de sănătate publică americane

supraveghează în mod special meningitele cu H. influenzae la copiii cu vârsta mai mică de 5

ani, situaţie pentru care sunt raportate şi serotipurile mai frecvent identificate (serotipul b este

identificat într-un procent mai mic decât alte serotipuri; au existat şi tulpini „ne-tipabile”, în

2005).

31. 3. Haemophilus ducreyi

Haemophilus ducreyi este agentul patogen al şancrului moale, maladie veneriană umană,

identificată pentru prima dată în anul 1889, de către Ducrey. A fost izolat în anul 1900. Cu

toate că studiile genetice arată că ar aparţine unui alt grup (1985-1991), deocamdată nu a fost

propusă re-clasificarea acestei specii.

În SUA au fost raportate 386 de cazuri (incidenţă 0,150/0000) în 1996, respectiv 189 cazuri

în 1998 (0,070/0000) şi 143 cazuri în 1999 (0,060/0000). În următorii ani, numărul de cazuri

raportate a fluctuat, dar nu a mai depăşit niciodată o valoare mai mare de 80 cazuri / an (78

cazuri raportate în 2000, 38 în 2001, 67 în 2002, 54 în 2003, 30 în 2004 şi respectiv 17 cazuri

raportate în anul 2005).

România nu a raportat cazuri de infecţie cu H. ducreyi (la nivel naţional); însă acest lucru

nu înseamnă că astfel de cazuri nu ar exista.

31. 3. 1. Habitat

Este strict patogen pentru specia umană; se poate izola uneori din leziunile bolnavului. Se

dezvoltă intra- şi extracelular (mai frecvent).

31. 3. 2. Caractere morfologice

Bacil scurt (sau cocobacil), dispus în perechi sau lanţuri paralele, Gram-negativ. Se

colorează bipolar. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20

secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu bacterii Gram-

pozitive, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci cu

fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 20-30 minute. Frotiul colorat poate depista H. ducreyi în

40-70% dintre cazurile însoţite de secreţii şancroide [cocobacili, intra- şi extraleucocitari,

coloraţi bipolar, dispuşi în lanţuri scurte sau medii, aspect asemănat de unii autori cu

„lanţurile de bicicletă” ].

31. 3. 3. Caractere de cultură

Page 10: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Necesită pentru cultivare factorul X. Creşte optim dacă produsul patologic este recoltat de

la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 µg/ml la 33-35ºC şi

atmosferă de 10% CO2. Coloniile sunt de dimensiuni mici şi apar după 3-7 zile de la

cultivare.

31. 3. 4. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici.

Sensibil la acţiunea căldurii, uscăciunii şi dezinfectanţilor obişnuiţi. Sensibil la

ampicilină, ceftriaxonă, cloramfenicol, rifampicină, biseptol, eritromicină, azitromicină,

claritromicină. Poate deveni rezistent.

31. 3. 5. Structură antigenică

Toate tulpinile sunt identice şi posedă un antigen cu capacitate sensibilizantă, precum şi

antigenul O. Prezintă receptori pentru hemoglobină.

31. 3. 6. Patogenitate

Caracterele de patogenitate includ: pilii, LOZ, toxina citotoxică, OMP care leagă

hemoglobina, hemolizina, Cu-Zn superoxid dismutaza şi o proteină filamentoasă

asemănătoare hemaglutininei.

La om, după câteva zile (în medie 5-7 zile) de la contactul sexual infectant, în regiunea

genitală apare şancrul moale (iniţial se formează o papulă sensibilă, cu eritem în jur, urmată

de apariţia unei pustule şi apoi a unei eroziuni care ulcerează), dureros, cu eritem şi edem. Pot

exista şancre multiple. Sângerează uşor dacă este manipulat. Ganglionii regionali sunt măriţi,

dureroşi şi pot supura. Nu sunt depăşite limfaticele învecinate. Diagnosticul diferenţial

trebuie făcut cu sifilisul, infecţia cu virusul Herpes simplex, limfogranulomatoza veneriană.

31. 3. 7. Diagnostic de laborator

31. 3. 7. 1. Diagnosticul de laborator este în special microbiologic (bacteriologic,

direct).

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie

de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât

mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de

asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreţii

de la nivel genital (raclarea secreţiei de sub marginea şancrului; puroi din abces).

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu

albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de

Page 11: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau lanţuri paralele (în şiruri),

frecvent în asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.

2). Cultivarea H. ducreyi este dificilă. Necesită pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta

dacă produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus

vancomicină 3 µg/ml la 33°C în atmosferă de 7-10% CO2, timp de 3-7 zile.

4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi

în perechi sau lanţuri paralele. Se pot colora bipolar.

Caractere de cultură: produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, după 3-7 zile de la

cultivare. Pe geloză-sânge pot produce hemoliză.

Caractere biochimice:

Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X);

Haemophilus ducreyi este catalază-negativ.

- Caractere antigenice:

- Tiparea antigenelor OMP permit clasificarea în 7 subtipuri;

- Pot fi utilizate în cadrul reacţiei de imunofluorescenţă indirectă.

5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea

stabilirii tratamentului) este necesară şi poate realiza (cu dificultate) prin metode

difuzimetrice.

31. 3. 7. 2. Diagnosticul de laborator imunologic

Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus

în care diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi

în scop epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor

IgG sau IgM care apar faţă de H. ducreyi.

Este încă în discuţie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultură de bacili Ducreyi.

31. 3. 8. Imunitate

Există răspuns imun umoral şi celular dar nu există imunitate faţă de reinfecţie.

31. 3. 9. Tratament

În şancrul moale se poate utiliza biseptol sau eritromicină pentru o perioadă de 2

săptămâni.

Page 12: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

31. 4. Povestiri adevărate

31. 4. 1. Meningită cu H. influenzae

Un copil de sex masculin, în vârstă de 3 ani este adus la camera de gardă a unui spital din

provincie, cu febră, letargie (stare de toropeală, apatie, oboseală foarte mare, la limita

păstrării stării de conştienţă, stare de somn prelungit); copilul plânge fără ca părinţii să poată

găsi o explicaţie.

La camera de gardă, prin discuţie cu mama se află că letargia a apărut cu o seară înainte,

iar starea actuală (plâns quasi-continuu şi febră) au apărut în ziua prezentării la spital. Mama

nu a pus termometrul apreciind personal că este vorba de febră. Termometrizarea la camera

de gardă arată că acest copil are 39ºC. Examenul clinic demonstrează areactivitate, tensiunea

arterială este 110/52 mm Hg, iar numărul de bătăi cardiace pe minut este 144.

Medicul de gardă ia decizia de a recolta 2 probe de sânge pentru hemoculturi ca şi pentru

alte analize de laborator, începe ulterior recoltării sângelui administrarea unei cefalosporine

de generaţia a 3-a şi ia legătură cu spitalul judeţean unde solicită ca pacientul să fie primit;

primeşte acordul şi o salvare transportă copilul însoţit de mamă şi de medic la al doilea spital.

Se efectuează puncţia lombară şi se constată că LCR este opalescent, uşor hipertensiv,

reacţia Pandy ++, 200 celule / mm3 (dintre care 93% PMN). Examenul microscopic al p.p.

este „negativ” (sunt vizibile PMN dar nu şi microorganisme).

În baza datelor clinice şi de laborator, diagnosticul este „meningită bacteriană”; se continuă

tratamentul cu medicamentul prescris la primul spital.

A treia zi, se primeşte rezultatul hemoculturilor efectuate înainte de administrarea

antibioticelor; microorganismul vizualizat pe frotiul colorat este de formă cocobacilară,

Gram-negativ. Primul spital transferă către spitalul judeţean şi culturile obţinute, iar

diagnosticul bacteriologic continuă la acest nivel.

Diagnosticul bacteriologic confirmă ceea ce fusese presupus: meningită cu Haemophilus

influenzae, tip capsular b, sensibil la medicamentul prescris la primul spital.

Tratamentul continuă până la împlinirea unei cure de tratament de 2 săptămâni. Copilul este

externat: vindecat, fără sechele.

Prezentarea „la timp” la camera de gardă, recoltarea sângelui pentru hemoculturi,

consultul cu spitalul „de nivel superior” şi tratamentul medicamentos au asigurat un

prognostic bun pentru micul pacient. De subliniat: meningita cu H. influenzae la copilul ≤3

ani poate avea o evoluţie gravă, uneori fatală.

31. 4. 2. Epiglotita, o situaţie care poate fi foarte gravă

Page 13: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Nu foarte greu de tratat, dar destul de greu de cultivat (H. influenzae)! Câteva sindroame

clinice sunt mai frecvent produse de hemofil, de exemplu epiglotita acută a copilului.

La un copil febril, cu dureri mari de gât, cu semne de respiraţie dificilă, fără semne

importante de tiraj costal, cu o poziţie specifică în cursul respiraţiei (aplecat în faţă), trebuie

evitată examinarea laborioasă a faringelui, dacă nu ne aflăm într-un serviciu ORL.

Vizualizarea epiglotei (omuşor) intens roşie contraindică apăsarea cu abeslangul pentru a

recolta exudatul. Această manevră poate induce (reflex) sufocarea. Etiologia cea mai

frecventă este H. influenzae. Se administrează i.v. o cefalosporină de generaţia a 3-a cu sau

fără asocierea unui macrolid şi se trimite, rapid, într-o secţie ORL, fără a încerca confirmarea

bacteriologică înainte de începerea tratamentului.

31. 4. 3. Izbucnire epidemică de infecţii produse de H. ducreyi, în USA

În perioada mai 1981 - ianuarie 1982, într-un district din statul California, au fost

raportate peste 1.000 de cazuri de infecţie cu Haemophilus ducreyi, dintre care aproximativ

400 prezentau afecţiuni în sfera genitală (şancru moale, ulceraţie genitală etc.). Având în

vedere această izbucnire epidemică („outbreak”), reacţia autorităţilor de sănătate publică a

fost substanţială. Toate cazurile confirmate, precum şi contacţii acestora au primit

eritromicină şi cotrimoxazol. Totuşi, numărul cazurilor raportate a continuat să crească în

următoarele şase luni, înregistrându-se circa 30 de cazuri noi pe lună. În încercarea de a

reduce dimensiunile acestei adevărate probleme de sănătate publică, tratamentul

antimicrobian a fost administrat şi la alţi 287 de contacţi, descoperiţi ulterior, în mod activ

(majoritatea prostituate) ca şi în alte 700 de cazuri considerate probabile, încă neconfirmate.

Măsurile adoptate au avut succes, numărul cazurilor înregistrate scăzând la 14 în luna iulie şi

10 cazuri în luna august. Ultimul caz confirmat prin diagnostic de laborator a fost raportat în

ianuarie 1983.

Până în 1981 nu se mai raportaseră atât de multe cazuri de infecţie cu H. ducreyi, iar după

1983, numărul acestora a scăzut în mod constant.

În cadrul acestei izbucniri epidemice, 96% dintre pacienţi au fost de origine hispanică şi

86% dintre aceştia au recunoscut faptul că au avut cel puţin un contact sexual neprotejat cu

prostituate. Pentru obţinerea acestor informaţii, echipele de sănătate publică s-au deplasat

„din uşă în uşă”. În 15 cazuri, a fost confirmată o dublă infecţie, cu H. ducreyi şi Treponema

pallidum. Într-un singur caz s-a pus în evidenţă infecţia cu herpes simplex virus de tip II

(HSV II), alături de H. ducreyi. Numărul cazurilor din cursul acestei epidemii a fost de peste

şapte ori mai mare decât în anii precedenţi.

Page 14: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Instituirea antibioterapiei la pacienţi şi contacţii confirmaţi ai acestora a fost utilă, însă nu

suficientă, epidemia evoluând în continuare. Situaţia s-a ameliorat numai după instituirea

tratamentului profilactic atât în cadrul comunităţilor de femei cu moravuri uşoare din

districtul respectiv (neţinându-se seamă de existenţa tabloului clinic asimptomatic sau de

prezenţa unor ulceraţii genitale de natură neprecizată), cât şi în rândul „clienţilor” acestora,

care prezentau sau nu semne ale bolii.

Discuţii

Situaţia prezentată poate fi considerată de excepţie, întrucât izbucnirile epidemice care au

drept agent etiologic Haemophilus ducreyi sunt rare iar numărul de cazuri este, de regulă,

relativ mic („discrete outbreaks”). În aproximativ 10% dintre cazurile confirmate de şancru

moale poate apărea co-infecţia cu T. pallidum sau cu HSV II. Tulpinile izolate au fost

rezistente la sulfametoxazol şi tetraciclină şi sensibile la eritromicină. Şancrul moale în

infecţia cu H. ducreyi (în limba engleză „chancroid”) ar putea fi confundat cu sifilisul primar

sau cu herpesul genital.

Supravegherea epidemiologică a continuat timp de şase luni de la raportarea ultimului caz

confirmat, punându-se în evidenţă încă o dată necesitatea emiterii unui diagnostic corect într-

un timp cât mai scurt şi a instituirii anchetei epidemiologice extensive în orice epidemie.

Istoricul acestei izbucniri epidemice subliniază pe de o parte existenţa unor particularităţi

în relaţie cu infecţiile cu transmitere pe cale sexuală iar pe de altă parte necesitatea unui

sistem de sănătate publică care să funcţioneze corespunzător, în permanenţă.

32. Genul Bordetella. Bordetella pertussis (MI Popa)

32. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram-negativi asemănători celor din genul

Haemophilus, strict aerobi. Specia tip este reprezentată de B. pertussis agentul etiologic al

tusei convulsive izolată în 1906 de Bordet şi Gengou; alte exemple sunt reprezentate de

Bordetella parapertussis şi Bordetella bronchiseptica. În afară de aceste trei specii (foarte

înrudite din punct de vedere genetic) mai sunt cunoscute încă alte cinci.

Page 15: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

32. 2. Caractere generale

32. 2. 1. Habitat

Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea de a

invada. Reprezintă microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu

sânge cald.

32. 2. 2. Caractere morfologice

Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm / 0,5-2

μm, imobil. Atunci când este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare

prezintă pili ataşaţi de peretele bacterian. După 24 ore, pilii se pot identifica în mediul de

cultură. Prin treceri succesive microorganismul devine polimorf, lipsit de capsulă şi pili. De

regulă celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte rar în lanţuri. Dacă se practică o

colorare cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar.

32. 2. 3. Caractere de cultură

B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil. Fiind inhibat de

acizi graşi, peroxizi organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în diagnosticul

bacteriologic. Necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură

optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care

conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină

sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea

microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S mici,

convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de

hemoliză (faza I). În lumina transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este

necesar mediul Bordet-Gengou, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe

geloză-sânge sau pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor

fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale,

virulenţa fiind scăzută.

Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în

această etapă de izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea

microorganismului prin imunofluorescenţă.

Aspecte genetice

Page 16: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella

pertussis variaţia de fază.

Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii

îmbogăţite. Sunt tulpini în formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă.

Vaccinurile se prepară folosind culturi în faza I. Fazele II şi III sunt intermediare.

Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul

caracteristic formelor R. Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi

factori de patogenitate.

32. 2. 4. Caractere biochimice

Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-37ºC, nu necesită

prezenţa factorilor X sau V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex. acidul

glutamic) etc. Tulpinile virulente produc hemoliză.

32. 2. 5. Acţiunea factorilor fizici, chimici

În afara organismului Bordetella pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2

ore la temperatura camerei. Lumina solară o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă

în 30 de minute.

32. 2. 6. Structură antigenică

Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu:

- 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA);

- aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi

de specie. Datorită implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are

capacitatea de a-şi modifica serotipul in vitro;

- la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun

germenilor Gram-negativi.

În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în

patogenia bolii şi care ar putea fi grupate astfel:

- toxina pertussis (TP), factor major de virulenţă, dar şi cel mai important antigen şi

imunogen. Este o exotoxină formată din 2 subunităţi (A şi B);

- adenilatciclaza;

- toxina letală (dermonecrotică);

- citotoxina traheală.

Page 17: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

32. 2. 7. Răspuns imun

După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-TP şi anti-FHA. Titrul anticorpilor anti-

TP persistă timp îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă

de o nouă îmbolnăvire.

32. 2 .8. Caractere de patogenitate

B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză.

În realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au:

- fimbriile;

- aglutinogenele;

- hemaglutinina filamentoasă (FHA);

- pertactinele (PRNs);

- toxina pertussis.

Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce toxine

care determină apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior).

Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate.

32. 3. Patogenie. Principalele afecţiuni produse

Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în special

pe cale aeriană (picături Pflügge) într-un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în

primul stadiu de boală şi la începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică).

Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală,

apar primele manifestări clinice care se agravează treptat.

Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni:

- după legarea subunităţii B (a TP) pe suprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea

subunităţii A. Subunitatea A se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o

inhibă şi rezultă o stimulare a adenilatciclazei şi respectiv o creştere a sintezei de AMPc.

Dintre efectele negative care se datorează sintezei de TP putem enumera hipoglicemia,

sensibilizarea la histamină, reducerea activităţii macrofagelor, diminuarea răspunsului imun

umoral (sinteza de anticorpi);

- adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor;

- toxina letală produce necroze locale;

- citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate

(favorizând, probabil, acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).

Page 18: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Boala la om se numeşte tuse convulsivă („tuse măgărească”).

După o incubaţie de 7-10 zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze.

În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează

căile respiratorii superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei

infecţii respiratorii obişnuite: tuse, strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte

contagios, elimină prin tuse un număr foarte mare de microorganisme. Diagnosticul de

laborator bacteriologic este posibil prin prelevări cu tampon steril de la nivelul faringelui sau

prin metoda „plăcilor tuşite”. Gravitatea şi durata bolii pot fi reduse dacă se face tratament

antimicrobian corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat.

Faza a doua (paroxistică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese

adeseori tipice, cu sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată,

urmează 5-10 secuse expiratorii spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi

glotice (de unde şi denumirea de „tuse măgărească” dată bolii în ţara noastră sau de

„cocqueleuche” în limba franceză). Adesea accesul se termină cu vomă şi cu aspirarea

vomismentelor. Pot apărea cianoză, convulsii, anxietate.

La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până

la 30 accese pe zi, mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi

limfocitoza periferică caracteristică, precum şi hipoglicemia.

Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită

tusei şi inspirului amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării

secreţiilor este mai importantă la copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea

hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar complicaţii şi la nivelul sistemului nervos

central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis).

Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3

săptămâni.

32. 4. Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic sau imunologic.

32. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis

este bacteriologic, direct.

Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este

foarte contagios iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de

antibiotice). Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat în timpul fazei catarale şi în prima

parte a fazei paroxistice (foarte rar se mai pot obţine rezultate, la mai mult de 4 săptămâni de

Page 19: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

la debut, în special pentru că, se administrează antibiotice şi chimioterapice). Detectarea

adenilat ciclazei (prin activitatea enzimatică) şi a toxinei pertussis (prin efectul citotoxic sau

imunoteste), în produsul patologic, eventual după îmbogăţire, sunt promiţătoare, dar nu au

intrat în practică.

O valoare a numărului de leucocite de 16-50.000 / dL sânge, cu limfocitoză absolută, vine

în sprijinul diagnosticului de tuse convulsivă.

Identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice (sau cu simptome nespecifice) şi

respectiv la contacţi ar permite aplicarea unor măsuri preventive.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie

de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât

mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de

asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii

de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian). Vom realiza recoltarea cu ajutorul

tamponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza

adsorbţia B. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea

secreţiilor traheobronşice. Este descrisă (istoric) şi metoda „plăcilor tuşite” (se expune o

placă Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ

20 cm în faţa gurii bolnavului în timpul accesului de tuse).

Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului

(microorganismul este foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă

pentru recoltarea p.p. atunci când se suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele

au diferite limite atât din punctul de vedere al sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct

de vedere practic).

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv

Gram. Examinăm frotiurile la microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor

inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, dispuşi separat sau în

perechi, rareori în lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează

relativ slab în coloraţia ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă

(imunofluorescenţă directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină sau safranină.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.

2). Bordetella pertussis este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe

medii de cultură obişnuite; este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B.

Page 20: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentru a putea fi evaluată variaţia

genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la

antibiotice şi chimioterapice.

Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o

temperatură optimă de 35-37˚C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă

umedă. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar,

macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină / meticilină

sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea

microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat

de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile).

Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport, care

include geloză nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest mediu

poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.

În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune

activat, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe

geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor

apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

Caractere morfotinctoriale:

Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm,

imobili, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a

deveni pleomorfi în urma subcultivărilor (pot apărea şi forme filamentoase).

Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia

structurile capsulare. Dacă frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în

evidenţă granule metacromatice situate bipolar.

Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după

cultivare.

Caractere de cultură:

Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37˚C pe mediul Bordet-

Gengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu

strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de hemoliză (faza I).

Page 21: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu

cărbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre,

cu suprafaţa perlată.

Caractere biochimice:

Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă.

Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gram-

negativi (BGN) (ex. API 20 E, API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste

adiţionale de identificare.

Caractere antigenice:

Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de

Bordetella pertussis, prin reacţia de aglutinare pe lamă.

Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă:

Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica

PCR are o bună specificitate şi sensibilitate dezavantajul principal fiind

reprezentat de costul ridicat.

5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea

stabilirii tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de

rezistenţă la antibiotice şi se realizează prin metode difuzimetrice.

32. 4. 2. Diagnosticul serologic

Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă,

deoarece o creştere semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia

din a doua sau a treia săptămână de boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC,

reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA.

Diagnosticul serologic poate fi realizat în cadrul unor studii epidemiologice, în scop de

cercetare; ar putea fi, eventual, util în diagnosticul diferenţial (retrospectiv).

32. 5. Tratament

Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării

microorganismului, reduce gravitatea simptomelor şi are valoare profilactică diminuând

perioada în care pacientul este contagios. Se mai pot administra rifampicină, tetraciclină,

cloramfenicol, gentamicină dar nu ampicilină.

Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai poate

influenţa cursul boli. În general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii pacientului

respectiv.

Page 22: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Deosebit de important sunt tratamentul simptomatic, oxigenoterapia şi respiraţia asistată,

hidratarea, eliminarea secreţiilor, măsurile generale nespecifice, în special la nou-născuţi şi

copii mici la care tusea convulsivă rămâne o importantă problemă medicală. Eficiente sunt şi

administrarea de sedative şi aspirarea secreţiilor.

32. 6. Epidemiologie

Boala este endemică în zonele dens populate din orice parte a lumii şi adesea pot apare

epidemii, în cicluri la 3-5 ani, prin acumularea indivizilor susceptibili în populaţie.

Sursa cea mai frecventă este reprezentată de pacientul în faza catarală, infecţia

răspândindu-se de obicei pe cale aeriană. Contagiozitatea este foarte mare, 30-90% din

contacţi receptivi putând face boala. Multe cazuri apar înaintea vârstei de 5 ani, însă

majoritatea cazurilor grave apar înaintea vârstei de un an. Odată cu limitarea numărului de

cazuri la copiii mici, este evident că adulţii cu boală atipică, nediagnosticată, reprezintă

populaţia cu rol major în transmitere. Boala este mai puţin periculoasă la adulţi, dar la copii

rata mortalităţii este destul de mare. Frecvenţa bolii a scăzut mult după 1930, odată cu

introducerea vaccinării; totuşi evoluţia numărului de îmbolnăviri în diferite ţări în care

programele de imunizări sunt, în general, eficiente, pun întrebări cu privire la eficacitatea

vaccinului pertussis şi solicită găsirea unor soluţii.

În România, cazurile de tuse convulsivă raportate în anul 1997 au fost în număr de 263,

incidenţa bolii ajungând la valoarea de 1,20/0000. Pentru anul 1998, incidenţa bolii a scăzut la

0,40/0000, numărul de cazuri înregistrate fiind de 97, la fel ca şi în 1999. Cel mai mare număr

de cazuri în ultimii 10 ani a fost înregistrat în anul 2000 (493 cazuri, incidenţă 2,20/0000). În

perioada 2001-2006 au fost înregistrate anual între 37 (2006) şi 233 (2004) cazuri, evoluţia

fiind imprevizibilă şi fără o legătură / influenţă epidemiologică demonstrată (sau studiată).

Cu toate că vaccinarea DTP se realizează pe scară naţională în SUA, în 1997 au fost

raportate 6.564 cazuri de tuse convulsivă (incidenţă 2,460/0000), iar în 1999, 7.288 de cazuri,

corespunzând la o incidenţă de 2,670/0000. În anul 2001 incidenţa tusei convulsive a fost de

2,690/0000, cu 7.580 cazuri raportate. În perioada 2002-2004 numărul de cazuri şi respectiv

incidenţa au înregistrat valori în continuă creştere, valoarea maximă fiind raportată în 2004

(25.827 cazuri de tuse convulsivă). În anul 2005 au fost înregistrate 25.616 cazuri, incidenţa

fiind de 8,720/0000. Această evoluţie ridică semne de întrebare cu privire la raportarea

cazurilor în ţara noastră şi certifică necesitatea întăririi sistemului de supraveghere, inclusiv

prin metode de laborator.

Page 23: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

32. 7. Prevenire. Control

Vaccinul este o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, distruşi fie cu

formol, mertiolat de sodiu etc, fie prin căldură, fie prin acţiunea combinată a agentului fizic şi

chimic. Vaccinul pertussis se administrează în mod curent combinat cu anatoxina difterică şi

tetanică sub forma trivaccinului diftero-tetano-pertussis (DTP).

Dezavantajul acestui vaccin este faptul că, pe lângă componentele care duc la protecţie,

conţine şi anumite componente care induc la reacţii adverse, uneori necontrolabile. Însă,

punându-se în balanţă beneficiile vaccinării şi respectiv dezavantajele datorită reacţiilor

adverse (care apar relativ rar), este unanim recunoscută utilitatea vaccinării. Reacţiile adverse

sunt de obicei reprezentate de reacţii locale şi febră, probabil datorită conţinutului în

lipopolizaharide.

Primovaccinarea se începe la 2 luni, administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4,

6 luni). Pentru menţinerea imunităţii se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare

iar revaccinarea a II-a se practică la 36 de luni de viaţă a copilului respectiv.

Datorită reacţiilor adverse mai sus menţionate se recomandă eliminarea componentei

pertussis la nou-născuţii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei

care au avut o reacţie adversă semnificativă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se

studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui vaccin acelular în care să fie inclusă

toxina pertussis inactivată, evitându-se astfel reacţiile adverse (vaccinul acelular este deja

recomandat în cadrul programului de imunizare din SUA, Japonia şi o bună parte din ţările

din UE). Componenta principală a vaccinului acelular este reprezentată de anatoxina pertussis

inactivată genetic (modificarea a 2 aminoacizi). Cu toate acestea, în ultimii ani există o serie

de discuţii privind eficacitatea acestui vaccin. Ceea ce este cert este că există o recrudescenţă

a tusei convulsive în ţări în care acoperirea vaccinală este mare (USA, Australia, Canada,

Olanda etc).

Imunizarea activă a adulţilor ar putea fi eficace în stăpânirea unei epidemii izbucnite într-

o colectivitate (ex. personalul unui spital). Utilizarea eritromicinei administrate imediat după

contactul cu un bolnav are valoare profilactică. Se recomandă şi în cazul copiilor vaccinaţi,

cu vârsta mai mică de 4 ani, deoarece vaccinarea nu are o eficacitate de 100%.

32. 8. Povestiri adevărate

Tusea convulsivă este o maladie cu potenţial sever, care în lipsa tratamentului poate

conduce la insuficienţă respiratorie şi chiar la deces. În „forma tipică” boala este uşor de

recunoscut clinic, însă există situaţii în care diagnosticul şi diagnosticul diferenţial se

Page 24: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

stabilesc dificil. Având în vedere existenţa a numeroase cazuri care pun probleme, în Statele

Unite a fost stabilit un site prin intermediul căruia persoanele afectate pot transmite informaţii

care ar putea fi utile pentru cei care doresc să ştie mai multe cu privire la această boală.

Dintre numeroasele informaţii postate pe acest site, dorim să redăm câteva situaţii

exemplificative.

Spre exemplu, este destul de relevant în acest sens cazul lui KG, care povesteşte că fiul

său în vârstă de 10 ani, astmatic, a dezvoltat simptome asemănătoare gripei, însoţite însă cu

dificultăţi majore de respiraţie (dacă povestea ar fi avut loc după anul 2005 şi ar fi putut fi

identificată o legătură cu prezenţa unor păsări moarte, cineva ar fi putut să se gândească la o

infecţie cu virus gripal aviar). După ce a văzut că nu pare să fie vorba de o gripă „obişnuită”

(se mai întâlnise cu altfel de situaţii în anii anteriori), întrucât simptomele nu regresau, ci din

contră s-au agravat, cu o oarecare întârziere (iată că şi în USA se „practică” această lentoare

în prezentarea la medic) tatăl a însoţit copilul la un consult medical de specialitate. Aici însă

diagnosticul a fost de „alergie nazală” (în baza antecedentelor astmatice şi a simptomelor

asemănătoare celor din gripă). După 2 săptămâni de tratament (cam „la întâmplare”, am putea

spune), copilul se simţea din ce în ce mai rău (tulburările respiratorii se agravaseră

substanţial), aşa că fost dus la un alt medic. Şi în acest al doilea caz, consultul medical a fost

condus aparent eronat, medicul s-a bazat pe simptomele care sugerau o gripă şi a pus

diagnosticul „generic” de viroză. După numai câteva zile după acest al doilea diagnostic

superficial şi eronat, copilul a ajuns la camera de gardă cu insuficienţă respiratorie. Din

fericire, această întâmplare nu s-a soldat cu deces, copilul revenind în familie după mai multe

zile de tratament intensiv.

Este cunoscut faptul că majoritatea populaţiei este vaccinată la naştere cu DTP şi din

această cauză puţini cetăţeni se gândesc, chiar şi în cazul în care prezintă simptome ce ar

putea părea specifice, că acestea ar putea fi determinate de Bordetella pertussis. Acesta a fost

şi cazul lui BL, care menţionează pe site că fiind muncitor în construcţii şi lucrând într-un

mediu cu praf excesiv, nu a dat mare importanţă momentului în care a început să tuşească.

Nici atunci când au apărut paroxismele şi convulsiile nu s-a gândit că ar putea avea tuse

convulsivă deoarece ştia că fusese vaccinat în copilărie. Ceea ce a aflat până la urmă domnul

BL (în vârstă de 46 ani), după ce finalmente a trecut pe la o serie de medici iar ultimul i-a

recomandat să facă şi o serie de analize de laborator, ar trebui să ştim cu toţii şi anume că

titrul anticorpilor scade o dată cu vârsta astfel încât putem să ne infectăm cu un germen

contra căruia am fost vaccinaţi în copilărie. Este un sfat bun atât pentru populaţie cât şi

pentru destul de mulţi dintre medici.

Page 25: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

O alta preconcepţie care face tusea convulsivă greu de evidenţiat şi uneori poate crea

probleme deosebite, în afară de faptul că uneori boala poate să se manifeste atipic, sau că

oamenii cred că dacă au fost vaccinaţi în copilărie sunt imuni (cu certitudine) pentru tot restul

vieţii, este faptul că tusea este de multe ori desconsiderată ca producătoare a unui simptom

agravant iar cei afectaţi vin foarte târziu pentru a solicita un ajutor medical. Este cazul lui BB

care a venit foarte tardiv, moment în care a fost obligatorie utilizarea medicaţiei cortizonice

pentru diminuarea simptomatologiei. Tusea a dispărut, aminteşte pe site această pacientă,

după 6 săptămâni de tratament, iar vindecarea totală a avut loc în 3 luni. Afectarea muşchilor

respiratori s-a remis încă şi mai târziu, intercostalii în 3 luni iar trapezul mic în 6 luni.

Iată, aşadar, numai câteva dintre exemplele împărtăşite de pacienţi pe site-ul dedicat tusei

convulsive, o boală cu potenţial sever, de multe ori percepută greşit şi care dacă nu este

diagnosticată şi tratată corespunzător (de regulă patogenic şi simptomatic, pentru că

diagnosticul etiologic este pus foarte târziu) poate conduce la probleme deosebite.

33. Genul Brucella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

33. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Brucella cuprinde mai multe specii care infectează animalele şi se pot transmite

omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi; 3 serogrupuri), Brucella abortus (vaci; 9

serogrupuri), Brucella suis (porci; 5 serogrupuri), Brucella canis (câini), Brucella ovis (oi),

Brucella neotomae (şobolan) şi Brucella maris (mamifere marine).

Sunt cocobacili Gram-negativi, imobili, eventual prezentând capsulă, nesporulaţi, care

parazitează în special animalele, caracteristic localizaţi intracelular, relativ inactivi metabolic.

Primele trei sunt principalele specii implicate şi în patologia umană.

Primul microorganism al genului a fost izolat în 1887 de Bruce, din piese recoltate

anatomopatologic (splină de la patru soldaţi decedaţi în insula Malta) şi a fost numit

Micrococcus melitensis. Denumirile istorice ale bolii sunt: febra ondulantă, febră de Malta,

febră mediteraneană etc (o boală în care febra avea un caracter „ondulant”, a fost descrisă ca

fiind prezentă în zona litoralului Mării Mediterane, încă de pe vremea lui Hipocrate). Zece

ani mai târziu, Wright pune la punct reacţia de aglutinare pentru evidenţierea anticorpilor

anti-M. melitensis. În onoarea şi amintirea lui Sir David Bruce, în anul 1920 se stabileşte

încadrarea în genul Brucella atât pentru germenul descoperit în 1887 cât şi pentru o a doua

specie, care producea avort la capre (descrisă de Alice Evans).

Page 26: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

33. 2. Caractere generale

33. 2. 1. Habitat

Habitatul principal al brucelelor este reprezentat de organismul infectat (în sistemul

reticuloendotelial, la nivel genital), dar germenii pot supravieţui şi în mediul înconjurător.

Animalele menţionate mai sus reprezintă gazdele cele mai frecvente, dar infecţia se poate

întâlni şi la alte animale. Există o serie de mecanisme care le asigură persistenţa, dintre care

se poate aminti posibilitatea transformării în condiţii nefavorabile în forme L („persister”).

33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

În culturi proaspete, brucelele sunt cocobacili Gram-negativi, imobili (se poate observa o

capsulă fină utilizând tehnici speciale de colorare), nesporulaţi, izolaţi sau mai rar prezenţi în

grămezi neregulate. În produsul patologic sunt găsiţi în special intracelular. În culturi mai

vechi prezintă un important grad de polimorfism.

33. 2. 3. Caractere de cultură

Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare, la prima

izolare, medii îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri,

vitamine, factori de creştere etc). Dacă produsul patologic este potenţial contaminat, se

recomandă utilizarea mediilor selective (cu bacitracină, cicloheximidă, acid nalidixic,

nistatină, polimixină B şi vancomicină).

Microorganismele sunt aerobe, facultativ anaerobe. Dintre cele patru specii considerate

importante şi pentru om, numai Brucella abortus necesită la prima izolare o atmosferă cu 5-

10% CO2.

Creşterea este lentă, mai ales la prima cultivare, iar coloniile (de tip S) devin vizibile după

2 sau mai multe zile. Plăcile cultivate se vor menţine la incubator un timp suficient de lung

(uneori câteva săptămâni). Pentru hemoculturi este utilizat în mod curent mediul bifazic

Castaneda (hemocultura trebuie supravegheată minimum 3-4 săptămâni). Mediul lichid este

tulburat uniform (dar pot apărea depozite sau o peliculă la suprafaţă).

Tulpinile de Brucella spp. au fost implicate de multe ori în „accidente de laborator”,

motiv pentru care manipularea produselor şi culturilor trebuie să se realizeze cu precauţie.

Page 27: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

33. 2. 4. Caractere biochimice

Activitatea metabolică este scăzută. Utilizează carbohidraţi, dar nu produc hidrogen sau

gaz în cantităţi suficiente pentru o eventuală utilitate în clasificare. Toate brucelele produc

catalază şi descompun în mod variabil ureea. Se pot folosi o serie de aminoacizi (ex. L-

alanina, L-asparagina) şi o serie de carbohidraţi (ex. L-arabinoza, D-galactoza) pentru

evaluarea metabolismului oxidativ al tulpinilor de Brucella spp.

33. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici

Brucelele sunt destul de rezistente în mediu, mai ales dacă sunt înconjurate de un strat

protector (în ţesuturile fetale infectate eliminate pot rezista săptămâni de zile; B. melitensis

poate rezista 6 zile în urină, 5-6 săptămâni în praf şi 9-10 săptămâni în apă sau sol). Sunt

moderat sensibile la temperatură şi aciditate. Pasteurizarea laptelui le distruge. Sunt sensibile

la majoritatea substanţelor dezinfectante, respectând protocolul de lucru (concentraţie, timp

de expunere etc. stabilit).

33. 2. 6. Structură antigenică

Brucella spp. are o structură antigenică relativ complexă.

Antiserurile de la animale imunizate cu o tulpină de tip S aglutinează cu cele patru specii

principale. Au fost propuşi doi determinanţi antigenici diferiţi, A şi M (polizaharide de

suprafaţă). Aceştia sunt prezenţi în proporţii diferite la speciile studiate. Antigenul abortus

(A) este determinantul major de suprafaţă la Brucella abortus şi Brucella suis şi determinant

minor (a) la Brucella melitensis. Antigenul M predomină la Brucella melitensis şi este

determinant minor (m) la celelalte două specii.

A fost descoperit un antigen de suprafaţă L asemănător cu antigenul Vi de la Salmonella.

Tulpinile capsulate prezintă un antigen de tip K.

La nivel parietal există lipopolizaharidul (Ag O, endotoxina), care diferă de Ag O al altor

germeni Gram-negativ prin compoziţia în acizi graşi şi faptul că este strâns legat de proteine,

formând împreună un complex, ceea ce îi determină o activitate biologică distinctă.

33. 2. 7. Răspuns imun

Bruceloza acută, la fel ca şi administrarea de vaccinuri cu tulpini vii atenuate, determină

atât un răspuns imun umoral cât şi un răspuns imun celular.

În principiu, o dată cu apariţia semnelor şi simptomelor se pot detecta anticorpi, dar

prezenţa lor nu previne bacteriemia şi nici reinfecţia (care este relativ frecventă).

Page 28: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Imunitatea celulară are un rol critic în rezistenţa faţă de o nouă îmbolnăvire. Răspunsul

imun celular este în mod cert necesar pentru eradicarea brucelelor situate intracelular.

33. 2. 8. Caractere de patogenitate

Caracterele de patogenitate se manifestă prin capacitatea germenilor de a se multiplica şi

de a invada organismul. Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau

pentru om, capabile să determine infecţii acute, cronice dar şi infecţii inaparente. Dintre

animalele de laborator, cobaiul pare să fie animalul cel mai constant sensibil. Cronicizarea

depinde de capacitatea de multiplicare în celule fagocitare. Cele mai patogene specii sunt

Brucella melitensis, urmată de Brucella suis şi de Brucella abortus.

Nu s-au detectat exotoxine; nu s-au pus în evidenţă constituenţi antifagocitari capsulari

sau ai peretelui celular. Brucelele prezintă, însă, un grad de rezistenţă faţă de distrugerea de

către PMM explicabilă prin faptul că nu are loc stimularea metabolismului oxidativ şi este

inhibată degranularea neutrofilelor, precum şi descărcarea enzimelor din granulaţii.

Supravieţuirea intracelulară pare să fie favorizată de existenţa: Cu-Zn superoxid-dismutazei,

unor proteine de şoc termic (de „tip” Gro EL, HtrA etc).

Pare să existe şi un factor de patogenitate neprecizat, produs numai in vivo, care ajută

supravieţuirea intracelulară (de ex. tulpini de Brucella abortus virulente provenite din culturi

de monocite sau din placentă bovină infectată supravieţuiesc mai bine decât aceleaşi tulpini

cultivate pe medii artificiale).

Endotoxina (antigenul O, LPZ) este implicată în patogenitate.

33. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între momentul

infectării şi apariţia fenomenelor clinice.

Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii,

febră moderată, transpiraţii abundente.

În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de

greu de recunoscut clinic. Febra „ondulantă” (care creşte în cursul după amiezii şi scade în

timpul nopţii) însoţită de frisoane are mai mult o valoare istorică. În realitate, curba febrilă

are un aspect variabil (poate fi ondulantă, neregulată, renitentă şi intermitentă). Transpiraţiile

abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă

alte elemente care pot fi comune în cursul bolii.

S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.

Page 29: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în

formele cronice la ani de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.

Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de

infecţia cu Brucella suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.

33. 4. Diagnostic de laborator

În principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de la aspecte clinice şi

epidemiologice, însă diagnosticul de laborator este esenţial, reprezentând unica metodă certă

(„golden standard”) de diagnostic.

Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau imunologic.

33. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic include următoarele etape.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile

cunoscute (vezi anexa nr. 2), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea

antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea

recolta şi prin puncţie ganglionară, puncţie medulară (rata de izolare creşte), puncţie hepatică

sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă, lapte, materiale necroptice etc.,

în funcţie de simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare vom discuta situaţia în care se

realizează o hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare rapide, de tipul

BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi şi anexa nr. 6 / A.6.8.).

Tehnica PCR, utilizând un fragment de 223 perechi de baze, ar putea fi utilizată atât în

bruceloza acută, cât şi în bruceloza cronică. Este de luat în considerare la pacienţii care au

primit, deja, antibiotice sau chimioterapice.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile

diagnosticului, în special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă

care uneori duce la rezultate pozitive.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.

2). Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite

cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc).

Se recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda.

Cultura se incubează în atmosferă de 5-10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3

zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom

însămânţa panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.

Page 30: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi cu dimensiuni de 0,5-0,6 µm/ 0,6-

1,5 µm, dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi

necesară o prelungire a timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.

Caractere de cultură:

Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii

de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte

astfel încât la 1 săptămână de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi

identificate (în special după incubare prelungită) colonii de tip R sau M;

Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-

deschis, asemănător „picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată

prezintă o transparenţă cenuşiu-albăstruie.

Caractere biochimice:

Brucella spp. după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism

oxidativ;

Microorganismele sunt catalază-pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei,

ureazei şi producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme

clasice de testare, dar este posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex. API 20E);

Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare;

Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la

diferiţi coloranţi incluşi de ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină

bazică).

Caractere antigenice:

Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă

(există reacţii încrucişate); în cazul unei reacţii pozitive, la nivelul

laboratoarelor de referinţă se pot realiza reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri

imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R).

Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în

scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi

lizează tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar

nu lizează tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile în formă R.

Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:

Page 31: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

- tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru

diferite biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; s-a

pus la punct şi tehnica PCR, pornind de la cultura bacteriană).

5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează

prin metoda difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei

unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene, cât şi pentru stabilirea tratamentului

corespunzător în cazul unei maladii infecţioase în general dificil de tratat.

33. 4. 2. Diagnosticul serologic

Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile obţinerii diagnosticului bacteriologic

pozitiv. Utilizăm antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor

specifici în sângele pacientului, valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acestui titru

în dinamică. Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip IgM cresc în infecţia acută (în câteva

săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul antibiotic realizat

corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni de la

debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii

cronice.

În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor

practice, aglutinarea pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută

şi utilizată tehnică de diagnostic serologic este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin

care putem determina atât titrul anticorpilor de tip IgM cât şi cel al anticorpilor de tip IgG.

Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care

blochează activitatea aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există

dificultăţi şi în ceea ce priveşte interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.

Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de 4

ori în dinamică a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.

Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:

diluarea suplimentară a serurilor de cercetat;

testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură de ser

imun anti-Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare aglutinarea,

concluzionăm că în serul de cercetat există anticorpi blocanţi);

testul Coombs;

utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă de

proteinele membranei externe etc.

Page 32: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Un test Wright negativ nu exclude diagnosticul de bruceloză. Există studii în care s-a

demonstrat că există pacienţi la care reacţia de aglutinare a fost negativă, dar Brucella spp. a

fost izolată prin hemocultură.

33. 4. 3. Diagnosticul imunobiologic

Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun

mediat celular, diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în

investigarea unui caz suspect de bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei

stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.

33. 5. Tratament

Brucelele pot fi sensibile la tetraciclină sau ampicilină. Se recomandă utilizarea

tetraciclinei în combinaţie cu gentamicina sau varianta recomandată de OMS (rifampicină +

doxiciclină, timp de minim şase săptămâni). Ameliorarea simptomatologiei se poate produce

în câteva zile de la începerea tratamentului. Totuşi, datorită localizării intracelulare a

germenului, tratamentul trebuie să fie prelungit (mai multe săptămâni).

33. 6. Epidemiologie

Sursa de microorganisme din genul Brucella este reprezentată de animalele bolnave.

Transmiterea infecţiei la om se realizează prin ingestia de lapte sau de produse contaminate

provenite de la animalele bolnave, prin contactul cu Brucella la nivelul leziunilor

tegumentare, la nivelul conjunctivei sau prin inhalarea microorganismului.

Bruceloza este în principal o boală profesională, apărând la lucrătorii din sectorul

zootehnic, fermieri etc.

În România, în anul 1999 au fost raportate 3 cazuri iar în anul 2000, 5 cazuri de bruceloză

(incidenţă 0,020/0000). Numărul de cazuri a fost mic şi în următorii ani (de ex. 2 cazuri în 2005

şi 1 caz în anul 2006).

Incidenţa brucelozei s-a menţinut relativ constantă în ultimii 20 de ani în SUA, cu o

uşoară scădere; în 1998 şi 1999 valoarea a fost de 0,030/0000, cu 79 şi respectiv 82 de cazuri

notificate. Având în vedere sursa de infecţie, autorităţile de sănătate publică americane includ

în raportul anual şi bruceloza la animale (în 2005, 3 cirezi de cornute şi 2 cirezi de porci au

fost identificate cu bruceloză; 48 de state nu au raportat cazuri de bruceloză la animale).

Numărul de cazuri de bruceloză la om, în 2005, a fost 120 (incidenţă 0,040/0000).

Page 33: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

33. 7. Profilaxie

Elementul esenţial pentru eliminarea brucelozei umane este eradicarea bolii la animale.

Acest lucru s-ar putea realiza folosind un vaccin viu atenuat, care determină imunitate.

Animalele bolnave trebuie sacrificate.

Între metode de prevenire a infecţiei cu Brucella se pot aminti şi pasteurizarea laptelui,

evitarea contactului cu produsele animale contaminate şi aplicarea măsurilor de protecţie a

personalului aflat la risc pentru contractarea bolii.

33. 8. Povestiri adevărate

33. 8. 1. Probleme de diagnostic diferenţial

Bruceloza este o boală cu un larg spectru de manifestări clinice. Complicaţiile

osteoarticulare sunt relativ frecvente, dar se mai pot înregistra afectările cutanată,

genitourinară, nervoasă, respiratorie sau hematologică.

Cazul unui pacient de sex masculin, în vârstă de 17 ani (bruceloză cu complicaţii la nivel

renal), este relevant pentru implicaţiile mai rare dar serioase, ale acestei boli.

Tânărul de 17 ani, care lucra la o stână de oi, se prezintă la medic cu hematurie şi dureri în

flancul drept, dureri ce durau de aproximativ 3 luni. Aceste simptome erau însoţite de greaţă,

vărsături, febră şi slăbiciune la nivelul membrelor inferioare, cu dureri de genunchi. Tânărul

nu avea antecedente de infecţii ale tractului respirator superior şi nici de tratamente

medicamentoase de lungă durată.

Examenul clinic a pus în evidenţă febra (38,5°C), paloarea tegumentară şi conjunctivală,

prezenţa edemelor pretibiale şi a hepatomegaliei. Tensiunea arterială a fost normală.

Analizele de sânge, sumarul de urină şi investigaţiile paraclinice (ecografie, ecocardiografie)

stabilesc diagnosticul la internare: glomerulonefrită acută. Titrul ASLO a fost în limite

normale.

Având în vedere locul de muncă, a fost solicitată testarea prezenţei anticorpilor anti-

Brucella spp. Reacţiile Ag-Ac (aglutinare) au fost pozitive (atât pentru anticorpii de tip IgM

cât şi IgG). Prin imunofluorescenţă, a fost demonstrată acumularea componentei C3 a

sistemului C', la nivelul glomerulilor renali.

S-a luat decizia efectuării unei biopsii renale, iar analiza rezultatelor a sugerat: nefrită

difuză tubulointestinală şi glomerulonefrită proliferativă difuză.

În contextul clinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator (în lipsa diagnosticului

bacteriologic), s-a început tratamentul cu medicamente antimicrobiene în asociere

Page 34: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

(rifampicină şi doxiciclină). Evoluţia a fost favorabilă; pacientul a fost externat după

dispariţia proteinuriei şi febrei (între timp şi valorile analizelor de laborator s-au normalizat).

Discuţie

Implicarea renală în bruceloză este destul de rară. Mecanismul patogenic include fie

invazia bacteriană directă (în nefrită interstiţială), fie afectarea glomerulară indirectă datorită

complexelor imune circulante (în glomerulonefrită). În cazul descris, au fost implicate

ambele mecanisme.

Cazul descris atrage atenţia asupra unui scenariu clinic rar, nefrită în cursul brucelozei.

Infecţia cu Brucella spp. trebuie suspectată la pacienţii cu glomerulonefrită acută de etiologie

necunoscută (idiopatică), în special în regiunile endemice, diagnosticul de certitudine fiind

pus prin coroborarea datelor clinice, epidemiologice, paraclinice şi de laborator. Diagnosticul

bacteriologic rămâne „golden standard” şi este bine ca să fie finalizat prin testarea

sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a tulpinii izolate. În cazul prezentat, evoluţia a

fost favorabilă, dar dacă ar fi fost implicată o tulpină rezistentă la medicamentele indicate,

prognosticul ar fi putut să fie nefast.

33. 8. 2. Leziunile cazeoase nu „ascund” doar bacili acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR)

Deşi în scădere semnificativă prin implicarea în patologie, faţă de deceniile anterioare,

Brucella spp. trebuie căutată sistematic în leziunile cazeoase descoperite la biopsie, şi dacă o

coloraţie Ziehl este negativă pentru BAAR, trebuie ca frotiul de rezervă să fie colorat Gram.

Nu rareori vom putea vizualiza bacili Gram-negativi, ulterior identificaţi ca fiind brucele!

Histologia este uneori similară cu ceea ce vedem în cazul leziunilor granulomatoase

cazeificate. Absenţa cazeumului la nivelul granulomului ridică suspiciunea de sarcoidoză.

34. Genul Francisella (Gabriela Loredana Popa)

34. 1. Definiţie. Încadrare

Microorganismele din genul Francisella sunt cocobacili Gram-negativi, aerobi, facultativi

anaerobi, pleomorfi, imobili, care produc tularemia, o boală infecţioasă a unor specii de

animale (mai ales rozătoare), care poate fi transmisă incidental pe diferite căi la om.

Tularemia este o zooantroponoză. Specia Francisella tularensis reprezintă singura specie a

genului importantă pentru patologia animală şi umană.

Agentul etiologic al tularemiei a fost izolat pentru prima dată în anul 1912, într-o

izbucnire epidemică („outbreak”) în care boala a fost asemănată cu ciuma, în districtul Tulare

(California). Dacă preocuparea pentru infecţiile cu F. tularensis a scăzut destul de mult în

Page 35: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

secolul 20, în momentul de faţă, datorită faptului că microorganismul este considerat drept un

agent potenţial utilizabil în acţiuni bioteroriste, studiile în domeniu au înregistrat o evidentă

creştere.

34. 2. Caractere generale

34. 2. 1. Habitat

Francisella tularensis infectează animalele sălbatice şi domestice (iepuri, şobolani,

şoareci, popândăi, hârciogi, bizami, veveriţe etc) precum şi păsările. Agentul patogen este

prezent şi la unele căpuşe, muşte de animale şi ţânţari. În focarele de infecţie căpuşele joacă

un rol important (în ele microorganismul poate persista 2-3 ani). În plus, ele pot transmite

microorganismul transovarian.

34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Francisella tularensis este un cocobacil Gram-negativ, foarte mic (0,2-0,3 μm /0,6-1 μm)

coloraţia fiind adesea bipolară şi relativ slabă. Prezintă o capsulă fină. Microscopul electronic

a pus în evidenţă şi elemente cocobacilare mai mici, de 0,1μm, sub posibilităţile de rezoluţie

ale microscopului optic, care pot trece prin filtrele uzuale pentru sterilizare bacteriologică.

Microorganismul este imobil, necapsulat (la microscopul optic), nesporulat.

34. 2. 3. Caractere de cultură

Coloniile cresc lent (2-10 zile) la prima inoculare. Se preferă folosirea unor medii

speciale, cu gălbenuş de ou coagulat (McCoy) sau cu cisteină-glucoză-sânge la temperatura

de 37°C, în condiţii de aerobioză. Coloniile sunt mici, transparente şi uşor de emulsionat (tip

S).

34. 2. 4. Caractere biochimice

Francisella tularensis prezintă o activitate biochimică redusă. Poate fermenta unii

carbohidraţi sau alcooli fără producere de gaz. Este catalază-pozitivă şi oxidază-negativă.

Testele biochimice nu prezintă importanţă în diagnosticul curent.

34. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici

În mediul extern F. tularensis poate fi distrusă rapid de căldură. Este rezistentă la frig (de

exemplu, carnea de iepure îngheţată poate rămâne infecţioasă în anumite condiţii). Muştele

Page 36: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

pot purta agentul patogen circa 14 zile, iar căpuşele 2-3 ani. Este distrusă de antisepticele şi

dezinfectantele uzuale.

34. 2. 6. Structura antigenică

Tulpinile de Francisella tularensis sunt omogene antigenic, dar genul poate fi împărţit în

două serotipuri. Tipul A este întâlnit în special în America de Nord şi include două subspecii

(tularensis şi nearctica). Tipul B include două subspecii (holarctica şi mediasiatica).

Materialul extracelular (capsula) conţine lipopolizaharide şi carbohidraţi. Au fost extrase

şi o serie de antigene localizate la nivelul peretelui.

Există unul sau mai multe antigene proteice înrudite cu antigenele aglutinante ale genului

Brucella. Francisella tularensis prezintă de asemenea antigenul somatic O (endotoxina,

LPZ).

34. 2. 7. Caractere de patogenitate

Factorii responsabili pentru patogenitatea F. tularensis nu sunt foarte bine definiţi. Totuşi,

componentele de suprafaţă ale celulei (materialul extracelular, capsula) sunt implicate în

patogenitate.

Endotoxina pare să aibă un rol în patogeneză similar cu cel al endotoxinei Salmonellei

typhi.

F. tularensis subspecia tularensis include cele mai virulente tulpini. DL 50 este de 10

microorganisme. Rata fatalităţii (în lipsa tratamentului) este de circa 10-20%. Circa 1-2%

dintre persoanele tratate cu antibiotice şi chimioterapice pot avea o evoluţie nefastă, spre

deces.

34. 2. 8. Imunitate

Imunitatea după infecţie este durabilă (ţine toată viaţa), deşi au fost înregistrate câteva

cazuri de reinfecţie la persoane care lucrau în laborator. Anticorpii aglutinanţi apar de regulă

după 7-10 zile de la debutul bolii, cresc până la un nivel maxim care se menţine pe toată

durata bolii şi scad în convalescenţă, rămânând la aceste valori ani de zile. Nu au efect

protector. Tendinţa bolii de a progresa precum şi desele recăderi sau cronicizarea, care pot

apărea în ciuda titrurilor ridicate de anticorpi serici sau a răspunsului imun persistent, se

datorează în mod cert capacităţii de supravieţuire intracelulară a microorganismului.

Imunitatea celulară reprezintă modalitatea principală de apărare faţă de infecţie.

Page 37: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

34. 3. Patogenie

Francisella tularensis are o infecţiozitate foarte mare. Infecţia poate apărea după

penetrarea tegumentelor sau mucoaselor sau după inhalarea a numai 10-50 de

microorganisme. Cel mai adesea contaminarea se realizează printr-o soluţie de continuitate

tegumentară. Microorganismele se multiplică şi la locul de pătrundere, în 2-6 zile apare o

inflamaţie, apoi o papulă care se transformă într-o ulceraţie. Infecţia se propagă mai departe

pe cale limfatică prinzând ganglionii limfatici regionali, care se măresc şi încep să supureze.

Microorganismele se pot multiplica intracelular, supravieţuind mult timp în monocite sau în

alte celule ale organismului.

Diseminarea limfatică este urmată de o bacteriemie tranzitorie, cu formarea de focare în

diferite organe parenchimatoase, în special plămâni, ficat şi splină. Leziunile caracteristice

sunt reprezentate de noduli granulomatoşi care se pot necroza sau cazeifica. Mai pot apărea

frison, febră, cefalee, greaţă, vărsături, afectarea stării generale. În lipsa tratamentului

corespunzător se poate ajunge la delir şi comă.

Alte forme clinice sunt forma oculoganglionară, tularemia orofaringiană, pneumonia

tularemică, forma tifoidică etc.

34. 4. Diagnostic de laborator

De menţionat că diagnosticul pozitiv este sugerat de datele clinice, întărit de cele

epidemiologice şi confirmat de datele de laborator.

De subliniat faptul că un laborator în care se presupune că se lucrează cu F. tularensis

trebuie să asigure condiţii stricte de biosecuritate şi biosiguranţă.

Diagnosticul de laborator bacteriologic, deşi relativ dificil poate fi realizat (în laboratoare

de referinţă), dar în principiu, datorită riscurilor de infectare a personalului de laborator mai

ales prin formarea de nuclei de picătură contaminanţi, majoritatea cazurilor se

diagnostichează imunologic (în special serologic). Se foloseşte tehnica micro-aglutinării.

În vederea diagnosticului serologic este de reţinut că, anticorpii aglutinanţi apar la 7-10

zile de la debutul bolii, ating un nivel maxim la 4-8 săptămâni; titruri dozabile pot persista

mai mulţi ani. Se preferă recoltarea a două probe la interval de 2 săptămâni. O creştere a

titrului de 4 ori la a doua recoltare pune diagnosticul unei infecţii recente.

34. 5. Tratament

Antibioticul de elecţie a fost streptomicina (interesul pentru streptomicină a scăzut nu

datorită apariţiei unor tulpini rezistente ci datorită efectelor adverse ale medicamentului).

Page 38: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Gentamicina şi ciprofloxacina par a fi la fel de eficace. Pot apărea recăderi. Pot fi folosite şi

tetraciclina şi cloramfenicolul, dar recăderile sunt mai frecvente, mai ales dacă tratamentul

este întrerupt prematur (este recomandată o cură de 2-4 săptămâni). Multiplicarea

intracelulară a F. tularensis creează dificultăţi în vindecarea tularemiei şi explică procentul de

circa 5-10% recăderi.

34. 6. Epidemiologie

Tularemia a fost raportată în toată America de Nord, în multe părţi ale Europei (mai ales

în Scandinavia), în fosta URSS, Japonia. Pare să fie o boală care afectează mai ales emisfera

nordică. Apare sporadic sau în epidemii.

Transmiterea agentului patogen de la animalul bolnav la om se face printr-una din

următoarele căi: a. contactul direct cu animalele bolnave sau cu produsele lor, agentul

pătrunzând uşor prin tegumente sau mucoase (inclusiv intacte). De notat frecvenţa crescută a

transmiterii a. după muşcătura de animal; b. pe cale digestivă, prin ingestia de apă sau

alimente contaminate; c. prin intermediul unor vectori (artropode hematofage: căpuşe, muşte,

ţânţari, ploşniţe); d. pe cale respiratorie, prin aerosoli (foarte rar).

Boala are şi un caracter profesional survenind la vânători, agricultori, crescători de

animale. În unele ţări, 90% din cazurile de tularemie apar prin contact cu iepurii sălbatici

infectaţi.

În perioada 2000-2005, în USA au fost raportate între 90 şi 154 cazuri de tularemie, pe an.

Cel mai mare număr de cazuri a fost raportat în anul 2005 (154 cazuri, incidenţă 0,050/0000).

34. 7. Prevenire şi control

Deoarece infecţia animalelor sălbatice nu poate fi controlată, cheia prevenirii infecţiei

umane este reprezentată de evitarea contaminării (evitarea prelucrării produselor animalelor

sălbatice, mănuşi etc).

Pentru persoanele cu risc crescut de infecţie, în special pentru cele care lucrează în

laborator, este posibilă administrarea intradermică a unui vaccin viu atenuat (considerat, încă,

experimental). Nu realizează o protecţie completă, dar persoanele vaccinate fac o formă mai

uşoară de boală (dacă se contaminează).

Page 39: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

34. 8. Povestire adevărată

Tularemia este o zoonoză produsă de Francisella tularensis; afectează în principal

animalele şi ocazional omul. Comerţul necontrolat cu animale „exotice” poate reprezenta o

sursă de transmitere a tularemiei, la om.

Pacientul, în vârstă de 4 ani şi 5 luni, a fost adus la camera de gardă a spitalului având un

sindrom febril persistent (de 6 zile; temperatura maximă înregistrată fiind 40ºC), cu stare

generală modificată. Primise de curând un popândău, ca animal de companie (familia îl

omorâse în urmă cu 72 de ore, după ce acesta îl muşcase pe copil). Înainte de prezentarea la

medic, mama îi administrase amoxicilină plus acid clavulanic, fără a observa o îmbunătăţire a

stării generale.

Examenul clinic la camera de gardă a relevat febră, stare generală alterată, uşoară infecţie

conjunctivală bilaterală; cardiopulmonar normal, uşoară hepatosplenomegalie, numeroase

adenopatii axilare, inghinale şi laterocervicale de circa 1 cm diametru (nedureroase, mobile).

În zona palmei stângi se observa locul unde fusese muşcat, fără semne de ulceraţie sau

necroză. Nu existau semne de afectare neurologică.

Examenul sângelui a demonstrat leucocitoză (11.780/mm3) cu neotrofilie (73%) şi

creşterea valorii reactanţilor de fază acută (VSH, fibrinogen, proteina C reactivă). Radiografia

cardio-toraco-pulmonară a fost normală. S-a practicat puncţie pentru recoltarea LCR (aspect

macroscopic normal, fără leucocite, celule sau microorganisme).

S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi sânge pentru diagnostic serologic, apoi s-a

administrat o combinaţie de medicamente antimicrobiene, respectiv ceftriaxonă plus

gentamicină. Culturile au fost negative (cum era şi de aşteptat, copilul primind antibiotice

înainte de prezentarea la spital).

Evoluţia sub tratament a fost favorabilă, starea generală s-a îmbunătăţit, iar la 3 zile din

momentul internării copilul a devenit afebril. Examenul serologic a demonstrat că fusese

vorba de infecţie cu Francisella tularensis. Tratamentul a continuat 3 săptămâni.

Discuţii

Francisella tularensis a fost detectată la aproximativ 100 de specii de animale, însă cel

mai frecvent este transmisă la om prin înţepătura artropodelor hematofage infectate şi prin

contact direct cu diferite specii de rozătoare (ex. după jupuirea iepurilor). Omul se mai poate

infecta prin muşcături de animale, aerosoli, apă contaminată şi carne neprelucrată termic (de

la animalele infectate).

Page 40: 31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus Gabriela ...seria7.weebly.com/uploads/4/0/8/5/4085189/cocobacili_gram_negativi.… · tomate, diferite bacterii: stafilococ, ... dar

Popândăii din America de Nord pot fi purtători atât de Francisella tularensis cât şi de

Yersinia pestis, aşadar, în nici un caz nu este recomandată „folosirea” lor ca şi animale de

companie.