31. cocobacili gram-negativi. genul haemophilus gabriela...
TRANSCRIPT
31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus. (Gabriela
Loredana Popa, MI Popa)
31. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele din acest gen sunt cocobacili polimorfi (pot exista chiar şi forme
filamentoase), imobili, nesporulaţi, Gram-negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni
pretenţioşi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezenţa factorilor de creştere prezenţi în sânge
(de unde şi numele genului). Există mai multe specii. Genul Haemophilus a fost inclus în
Familia Pasteurellaceae, împreună cu genurile Actinobacillus, Pasteurella şi alte 4 grupuri ce
cuprind peste 80 de specii bacteriene. Taxonomic, genul este într-o permanentă schimbare;
unele specii sunt eliminate ori candidate la excludere, altele sunt nou identificate. În prezent
genul Haemophilus cuprinde peste 15 specii. Dintre speciile care colonizează/infectează
omul, amintim: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H.
parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphrophilus şi H.
segnis; în cadrul acestui capitolul vom prezenta două specii, H. influenzae şi H. ducreyi.
31. 2. Haemophilus influenzae
A fost considerat agentul etiologic al gripei în pandemia de gripă din anii 1890-1892
(Pfeiffer). A fost izolat în 1892. Numele a fost stabilit în 1917, în „amintirea erorii” din 1892.
31. 2. 1. Caractere generale
31. 2. 1. 1. Habitat
Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi mucoasa
conjunctivală, precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase. Într-un studiu
recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate
(date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus,
nazal şi / sau faringian dar nici un student nu a fost purtător de H. influenzae. Am identificat
un caz de portaj pentru H. parainfluenzae.
31. 2. 1. 2. Caractere morfologice
În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-negativi, mici
(1-1,5 / 0,3µm), uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot apărea forme
filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20
secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu Streptococcus
pneumoniae, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci
numai cu fucsină bazică 0,1% sau cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 5 minute.
În culturi apar în funcţie de vârsta culturii şi de mediul de cultură:
- în medii bogate, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă.
- în culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (probleme de
diagnostic diferenţial microbiologic). Polimorfismul apare odată cu „îmbătrânirea” culturii şi
este caracteristic tulpinilor în curs de trecere la forma „R”.
31. 2. 1. 3. Caractere de cultură
Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2, atmosferă umedă,
la 35-37ºC, pH=7,6 incubat pentru o perioadă de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt
necesari factori de creştere precum (factorii X şi V). Factorul X, termostabil (rezistă 45
minute la 120°C), este protoporfirina IX sau o protohemă cu fier, prezentă în sânge sau în
derivatele sale cu hemină şi asigurată în mediile de cultură prin adaos de 5% sânge
chocolatat, de suplimente XV, Fildes sau Levinthal, care conţin aproximativ 500 µg/ml factor
X şi 150 µg/ml factor V, sau prin suplimentare cu hemină. Haemophilus influenzae necesită
pentru dezvoltare 0,1-10 µg/ml factor X, iar H. ducreyi 200 µg/ml hemină. Factorul V,
termolabil (rezistă numai 15 minute la 90°C), este nicotin-amid-adenin dinucleotidul (NAD)
sau NADPH (fosfat), prezent în hematii, dar eliberat, este distrus de pirofosfatază şi NAD-
ază, prezente în sângele de om, ovine, caprine, ori bovine (enzime inactivate prin
chocolatizare). Surse de factor V sunt suplimentele XV, extractul de drojdie, de cartof sau
tomate, diferite bacterii: stafilococ, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa mucos,
Sarcina lutea, Escherichia coli, levuri şi preparatele de NAD sau NADPH. Necesităţile de
factor V pentru H. influenzae sunt de 0,2-1 µg/ml, pentru H. parainfluenzae de 1-5 µg/ml sau,
pentru unele tulpini, de 25 µg/ml. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară
eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică).
Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de
Haemophilus influenzae sunt mai numeroase în jurul unor colonii de stafilococ (fenomenul de
satelitism); util în identificare.
Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S,
care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Pe geloză-
chocolate, coloniile ating 1-3 mm abia după 36-48 ore, având aspectul unor picături de rouă.
31. 2. 1. 4. Caractere biochimice şi de metabolism
Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesită pentru dezvoltare factorii X şi V.
Fermentează inconstant carbohidraţii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol-pozitive
(transformă triptofanul în indol). Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi împărţită în 8
biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacienţi se încadrează în biotipurile I-IV;
majoritatea tulpinilor cu capsulă de tip b fac parte din biotipul I.
31. 2. 1. 5. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici
Rezistenţa în mediu este scăzută. Prin uscare sunt distruşi rapid. În spută pot rezista până
la 48 de ore. Sunt distruşi de dezinfectanţii obişnuiţi sau de menţinerea timp de 30 minute la
56ºC. Datorită viabilităţii reduse, cultura trebuie repicată pe mediu proaspăt la un interval de
5-6 zile. Totuşi, în tuburi închise (cu geloză-chocolate), cultivate din abundenţă, culturile de
H. influenzae ar putea rezista până la 4-5 săptămâni, la temperatura camerei. Cele mai bune
metode de conservare sunt reprezentate de a. liofilizare şi de b. menţinerea la -70ºC (după
cultivare în mediu lichid, îmbogăţit, cu 20% glicerol).
31. 2. 1. 6. Structură antigenică
Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică ce are o compoziţie diferită, în
funcţie de tipul serologic. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi
de imunofluorescenţă folosind seruri specifice. Cel mai răspândit şi mai patogen este tipul b,
la care antigenul este poliribozil-ribitol-fosfat (PRP) şi prezintă înrudiri antigenice cu
Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes, Stafiloccocus epidermidis, Enteroccocus
feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora normală a tractului
respirator nu prezintă capsulă). Totuşi, răspunsul imun faţă de structura capsulară de tip b
este slab, ineficient, în primii ani de viaţă (0-2 ani), exact în perioada în care infecţiile cu H.
influenzae au potenţialul cel mai grav.
Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puţin două proteine: substanţa M, un antigen
de suprafaţă labil şi substanţa P, care constituie o parte însemnată a corpului bacterian.
Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate în mediu lichid,
dar natura ei antigenică nu este foarte clară.
Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezintă
activitate faţă de tulpini capsulate de alte tipuri, faţă de tulpinile necapsulate, faţă de alte
specii de Haemophilus şi faţă de unele enterobacterii.
31. 2. 1. 7. Răspuns imun
La nou-născuţi şi la sugarii sub 3 luni există o stare de imunitate, anticorpii provenind de
la mamă. După această vârstă, concentraţia de anticorpi scade. În SUA, Haemophilus
influenzae este cea mai frecventă cauză de meningită la copii între 5 luni şi 5 ani. Diferite
studii demonstrează că la vârsta de 3-5 ani un număr important de copii au anticorpi anti-PRP
care contribuie la realizarea lizei dependentă de complement şi stimulează fagocitoza.
Există o corelaţie (insuficient de bine precizată practic) între anticorpii bactericizi şi
rezistenţa la infecţii grave cu Haemophilus influenzae.
31. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate
Haemophilus influenzae este un microorganism condiţionat patogen. Prezintă adezine de
suprafaţă (filamentoase). Endoxina are un rol redus în patogenitate. Rolul antigenelor
somatice urmează să fie clarificat.
Rolul esenţial îl are capsula, iar din cele şase tipuri, tipul b apare în circa 90% din cazurile
severe de infecţie cu Haemophilus influenzae.
H. influenzae mai produce IgA protează şi 2 proteine pentru achiziţia de fier.
Tulpinile necapsulate se pare că îşi exercită virulenţa datorită structurii peptidoglicanului
(cu acţiune pro-inflamatorie), LOZ, Cu şi Zn-super oxid dismutaza.
31. 2. 2. Patogenie şi principalele boli produse
Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazie.
Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută,
probabil în asociere cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată
de epiglotită, laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de pneumonie, dar şi de meningită
acută purulentă la copiii mici preşcolari.
Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie locală (se poate nota faptul că
Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se numără printre agenţii etiologici comuni ai
otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor acute).
Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin, pe această cale poate infecta
meningele.
Ocazional infecţia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă fulminantă
care necesită traheotomie sau intubare promptă a copilului respectiv.
31. 2. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse deHaemophilus influenzae
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este
bacteriologic, direct.
În vederea discutării examenului de laborator vom avea în vedere meningita. În
meningita produsă de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi /
sau deces), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator.
Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului”, chiar dacă pentru concentrarea
germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR
este utilă în stabilirea etiologiei.
Tulpinile capsulate (prezintă Ag de tip K) se pot identifica în produsul patologic (LCR
sau urină, după centrifugare) prin contraimunoelectroforeză, latex aglutinare, coaglutinare sau
ELISA. Pot apărea reacţii fals-pozitive datorită unor „înrudiri antigenice”, pentru că
antigenele capsulare tip a, b, c şi f, conţin acizi teichoici. O altă problemă tehnică este
reprezentată de faptul că există şi tulpini „autoaglutinabile”.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta
secreţii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreţii din sfera ORL, lichide
recoltate prin puncţie, sânge, LCR etc. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este
reprezentat de LCR (vezi şi anexa nr. 6). Aşa cum am mai menţionat, recoltarea LCR prin
puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de
ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar
pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi
de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). În cazul în care p.p.
urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o
temperatură apropiată de 37°C, refrigerarea este contraindicată). H. influenzae ar putea fi
izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de
vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent frotiurile se pot
executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se
examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, fini, capsulaţi, dispuşi separat sau în
grămezi „aranjate în aceeaşi direcţie”, uneori dispuşi în lanţuri scurte, situaţi intra sau
extraleucocitar. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în
coloraţia Gram, ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă sau,
recolorarea prelungită cu fucsină (vezi şi 31.2.1.2.).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi anexa nr. 2).
Haemophilus influenzae este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe
medii de cultură obişnuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea
creşterii 5-10% CO2. Este necesară pentru incubare o atmosferă umedă, la 35-37°C, şi o
durată de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de creştere precum
hemina (factor X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime.
Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea conţinutului acestora în
mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de
stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai
numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o
tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe de altă parte,
atunci când produsele însămânţate sunt potenţial contaminate, este necesară folosirea
mediilor selective (ex. cu bacitracină, vancomicină, clindamicină şi amfotericină B).
Coloniile sunt de tip S sau M şi ating un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de ore, respectiv 1-
2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe geloză-chocolate. Pe geloză-sânge
cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore
prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 µm), dispuşi
separat sau în grămezi, uneori dispuşi în lanţuri scurte. În medii complexe, la 6-8 ore,
predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă. În culturile vechi se caracterizează
prin pleomorfism şi pierderea capsulei (dificultăţi de diagnostic diferenţial
microbiologic).
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm
după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având pe geloză-chocolate aspectul unor
picături de rouă. Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V).
Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de
Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei
linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul
de satelitism). Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde,
convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu
apare hemoliză.
Caractere biochimice:
Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesităţile de factor X.
Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transformă triptofanul în
indol).
Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice
(ex. indol, urează, ornitin decarboxilază) specia a putut fi împărţită în opt
biotipuri.
Utilizând galeria API NH (manuală) putem identifica specii de Neisseria,
Haemophilus şi Branhamella catarrhalis, în numai 4 ore.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de
Haemophilus influenzae, prin tehnici imunologice, în funcţie de Ag K.
Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei,
imunofluorescenţă, aglutinare, latex-aglutinare şi coaglutinare.
Tiparea LOZ poate fi realizată prin Western blot, imunoprecipitare sau
imunoradiotestare în gel. Au fost caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae.
Prin aceleaşi tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în
gel), tipul b capsular poate fi subtipat (11 subtipuri).
Tulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Multilocus Enzyme
Electrophoresis (MLEE) sau prin tipizarea antigenelor OMP (electroforeză în
gel de poliacrilamidă; această metodă poate fi utilizată şi pentru subtiparea
tulpinilor cu capsulă de tip b).
Alte teste: există sonde nucleotidice şi amorse (pentru PCR) produse comercial pentru
identificarea H. influenzae (atât din cultură cât şi din produse patologice).
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este
recomandată utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se
pot utiliza şi truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi interpretare după
18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea
CMI şi CMB poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului E
(vezi capitolul 7).
Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae
Identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. influenzae ar putea fi utilă pentru verificarea
răspunsului imun în urma vaccinării. În acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA.
31. 2. 4. Tratament
Deoarece se estimează că mortalitatea datorită meningitei cu Haemophilus influenzae, în
lipsa tratamentului, poate fi de până la 90%, la copii, punerea diagnosticului şi instituirea
tratamentului corect reprezintă un deziderat major. Diagnosticul prompt şi tratamentul
antimicrobian sunt esenţiale şi pentru scăderea implicării ulterioare neurologice şi
intelectuale. Multe din tulpini sunt încă sensibile la ampicilină (circa 25% produc β lactamaze
sub control plasmidic). Pentru infecţiile grave, până la obţinerea rezultatelor antibiogramei se
poate administra ceftriaxonă.
31. 2. 5. Epidemiologie. Prevenire. Control
Haemophilus influenzae tip b se transmite pe cale aeriană, interuman.
Deoarece vaccinurile polizaharidice care conţin şi polimeri aparţinând peretelui celular,
sunt slab imunogenice la copiii sub 2 ani, s-a realizat un vaccin la care polizaharidul este
cuplat cu anatoxina difterică. Acest vaccin conjugat se administrează la copiii în vârstă de
peste 18 luni. La minimum 2 luni după prima doză se poate administra a doua doză (între 18
şi 23 de luni).
Deoarece vaccinul nu împiedică portajul, în situaţii epidemiologice se pot administra
antibiotice în scop profilactic (ex. rifampicină 20 mg/kg-corp, timp de patru zile).
În România nu se raportează (s-au nu s-au raportat) infecţiile invazive meningeale,
produse de H. influenzae. Se raportează în schimb pneumoniile la care agentul etiologic este
acest microorganism. Dacă în 1998 au fost raportate 425 cazuri iar în 2003 au fost raportate
307 cazuri, cel mai mare număr de cazuri s-a înregistrat în 2004 (969 cazuri, cu o incidenţă
de 4,50/0000). În anul 2005 au fost înregistrate 263 cazuri iar în anul 2006, 313 cazuri
(incidenţa fiind 1,50/0000). Subiectul „diagnosticul de laborator în infecţii cu H. influenzae” a
fost de asemenea tratat în cursul de pregătire pe care dr. M. Popa l-a coordonat în 2004
(proiectul Phare, aprobat pentru România în anul 2000); din păcate, rezultatele nu sunt, încă,
remarcate.
Chiar şi după introducerea recomandării vaccinării anti - H. influenzae la copii, în SUA au
fost înregistrate infecţii invazive cu acest microorganism. Incidenţa acestor manifestări a atins
în 1996 cifra de 0,450/0000, cu 1.170 cazuri raportate, în 1998 s-au înregistrat 1.194 cazuri
(incidenţă 0,440/0000) iar în 1999, 1.309 cazuri (incidenţă 0,480/0000). În următorii ani,
incidenţa s-a situat în jurul valorii de 0,700/0000 (0,7 în 2003; 0,72 în 2004 şi respectiv 0,78 în
2005, cu 2.304 cazuri raportate la nivel naţional). Autorităţile de sănătate publică americane
supraveghează în mod special meningitele cu H. influenzae la copiii cu vârsta mai mică de 5
ani, situaţie pentru care sunt raportate şi serotipurile mai frecvent identificate (serotipul b este
identificat într-un procent mai mic decât alte serotipuri; au existat şi tulpini „ne-tipabile”, în
2005).
31. 3. Haemophilus ducreyi
Haemophilus ducreyi este agentul patogen al şancrului moale, maladie veneriană umană,
identificată pentru prima dată în anul 1889, de către Ducrey. A fost izolat în anul 1900. Cu
toate că studiile genetice arată că ar aparţine unui alt grup (1985-1991), deocamdată nu a fost
propusă re-clasificarea acestei specii.
În SUA au fost raportate 386 de cazuri (incidenţă 0,150/0000) în 1996, respectiv 189 cazuri
în 1998 (0,070/0000) şi 143 cazuri în 1999 (0,060/0000). În următorii ani, numărul de cazuri
raportate a fluctuat, dar nu a mai depăşit niciodată o valoare mai mare de 80 cazuri / an (78
cazuri raportate în 2000, 38 în 2001, 67 în 2002, 54 în 2003, 30 în 2004 şi respectiv 17 cazuri
raportate în anul 2005).
România nu a raportat cazuri de infecţie cu H. ducreyi (la nivel naţional); însă acest lucru
nu înseamnă că astfel de cazuri nu ar exista.
31. 3. 1. Habitat
Este strict patogen pentru specia umană; se poate izola uneori din leziunile bolnavului. Se
dezvoltă intra- şi extracelular (mai frecvent).
31. 3. 2. Caractere morfologice
Bacil scurt (sau cocobacil), dispus în perechi sau lanţuri paralele, Gram-negativ. Se
colorează bipolar. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20
secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu bacterii Gram-
pozitive, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci cu
fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 20-30 minute. Frotiul colorat poate depista H. ducreyi în
40-70% dintre cazurile însoţite de secreţii şancroide [cocobacili, intra- şi extraleucocitari,
coloraţi bipolar, dispuşi în lanţuri scurte sau medii, aspect asemănat de unii autori cu
„lanţurile de bicicletă” ].
31. 3. 3. Caractere de cultură
Necesită pentru cultivare factorul X. Creşte optim dacă produsul patologic este recoltat de
la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 µg/ml la 33-35ºC şi
atmosferă de 10% CO2. Coloniile sunt de dimensiuni mici şi apar după 3-7 zile de la
cultivare.
31. 3. 4. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici.
Sensibil la acţiunea căldurii, uscăciunii şi dezinfectanţilor obişnuiţi. Sensibil la
ampicilină, ceftriaxonă, cloramfenicol, rifampicină, biseptol, eritromicină, azitromicină,
claritromicină. Poate deveni rezistent.
31. 3. 5. Structură antigenică
Toate tulpinile sunt identice şi posedă un antigen cu capacitate sensibilizantă, precum şi
antigenul O. Prezintă receptori pentru hemoglobină.
31. 3. 6. Patogenitate
Caracterele de patogenitate includ: pilii, LOZ, toxina citotoxică, OMP care leagă
hemoglobina, hemolizina, Cu-Zn superoxid dismutaza şi o proteină filamentoasă
asemănătoare hemaglutininei.
La om, după câteva zile (în medie 5-7 zile) de la contactul sexual infectant, în regiunea
genitală apare şancrul moale (iniţial se formează o papulă sensibilă, cu eritem în jur, urmată
de apariţia unei pustule şi apoi a unei eroziuni care ulcerează), dureros, cu eritem şi edem. Pot
exista şancre multiple. Sângerează uşor dacă este manipulat. Ganglionii regionali sunt măriţi,
dureroşi şi pot supura. Nu sunt depăşite limfaticele învecinate. Diagnosticul diferenţial
trebuie făcut cu sifilisul, infecţia cu virusul Herpes simplex, limfogranulomatoza veneriană.
31. 3. 7. Diagnostic de laborator
31. 3. 7. 1. Diagnosticul de laborator este în special microbiologic (bacteriologic,
direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreţii
de la nivel genital (raclarea secreţiei de sub marginea şancrului; puroi din abces).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de
dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau lanţuri paralele (în şiruri),
frecvent în asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.
2). Cultivarea H. ducreyi este dificilă. Necesită pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta
dacă produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus
vancomicină 3 µg/ml la 33°C în atmosferă de 7-10% CO2, timp de 3-7 zile.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi
în perechi sau lanţuri paralele. Se pot colora bipolar.
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, după 3-7 zile de la
cultivare. Pe geloză-sânge pot produce hemoliză.
Caractere biochimice:
Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X);
Haemophilus ducreyi este catalază-negativ.
- Caractere antigenice:
- Tiparea antigenelor OMP permit clasificarea în 7 subtipuri;
- Pot fi utilizate în cadrul reacţiei de imunofluorescenţă indirectă.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea
stabilirii tratamentului) este necesară şi poate realiza (cu dificultate) prin metode
difuzimetrice.
31. 3. 7. 2. Diagnosticul de laborator imunologic
Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus
în care diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi
în scop epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor
IgG sau IgM care apar faţă de H. ducreyi.
Este încă în discuţie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultură de bacili Ducreyi.
31. 3. 8. Imunitate
Există răspuns imun umoral şi celular dar nu există imunitate faţă de reinfecţie.
31. 3. 9. Tratament
În şancrul moale se poate utiliza biseptol sau eritromicină pentru o perioadă de 2
săptămâni.
31. 4. Povestiri adevărate
31. 4. 1. Meningită cu H. influenzae
Un copil de sex masculin, în vârstă de 3 ani este adus la camera de gardă a unui spital din
provincie, cu febră, letargie (stare de toropeală, apatie, oboseală foarte mare, la limita
păstrării stării de conştienţă, stare de somn prelungit); copilul plânge fără ca părinţii să poată
găsi o explicaţie.
La camera de gardă, prin discuţie cu mama se află că letargia a apărut cu o seară înainte,
iar starea actuală (plâns quasi-continuu şi febră) au apărut în ziua prezentării la spital. Mama
nu a pus termometrul apreciind personal că este vorba de febră. Termometrizarea la camera
de gardă arată că acest copil are 39ºC. Examenul clinic demonstrează areactivitate, tensiunea
arterială este 110/52 mm Hg, iar numărul de bătăi cardiace pe minut este 144.
Medicul de gardă ia decizia de a recolta 2 probe de sânge pentru hemoculturi ca şi pentru
alte analize de laborator, începe ulterior recoltării sângelui administrarea unei cefalosporine
de generaţia a 3-a şi ia legătură cu spitalul judeţean unde solicită ca pacientul să fie primit;
primeşte acordul şi o salvare transportă copilul însoţit de mamă şi de medic la al doilea spital.
Se efectuează puncţia lombară şi se constată că LCR este opalescent, uşor hipertensiv,
reacţia Pandy ++, 200 celule / mm3 (dintre care 93% PMN). Examenul microscopic al p.p.
este „negativ” (sunt vizibile PMN dar nu şi microorganisme).
În baza datelor clinice şi de laborator, diagnosticul este „meningită bacteriană”; se continuă
tratamentul cu medicamentul prescris la primul spital.
A treia zi, se primeşte rezultatul hemoculturilor efectuate înainte de administrarea
antibioticelor; microorganismul vizualizat pe frotiul colorat este de formă cocobacilară,
Gram-negativ. Primul spital transferă către spitalul judeţean şi culturile obţinute, iar
diagnosticul bacteriologic continuă la acest nivel.
Diagnosticul bacteriologic confirmă ceea ce fusese presupus: meningită cu Haemophilus
influenzae, tip capsular b, sensibil la medicamentul prescris la primul spital.
Tratamentul continuă până la împlinirea unei cure de tratament de 2 săptămâni. Copilul este
externat: vindecat, fără sechele.
Prezentarea „la timp” la camera de gardă, recoltarea sângelui pentru hemoculturi,
consultul cu spitalul „de nivel superior” şi tratamentul medicamentos au asigurat un
prognostic bun pentru micul pacient. De subliniat: meningita cu H. influenzae la copilul ≤3
ani poate avea o evoluţie gravă, uneori fatală.
31. 4. 2. Epiglotita, o situaţie care poate fi foarte gravă
Nu foarte greu de tratat, dar destul de greu de cultivat (H. influenzae)! Câteva sindroame
clinice sunt mai frecvent produse de hemofil, de exemplu epiglotita acută a copilului.
La un copil febril, cu dureri mari de gât, cu semne de respiraţie dificilă, fără semne
importante de tiraj costal, cu o poziţie specifică în cursul respiraţiei (aplecat în faţă), trebuie
evitată examinarea laborioasă a faringelui, dacă nu ne aflăm într-un serviciu ORL.
Vizualizarea epiglotei (omuşor) intens roşie contraindică apăsarea cu abeslangul pentru a
recolta exudatul. Această manevră poate induce (reflex) sufocarea. Etiologia cea mai
frecventă este H. influenzae. Se administrează i.v. o cefalosporină de generaţia a 3-a cu sau
fără asocierea unui macrolid şi se trimite, rapid, într-o secţie ORL, fără a încerca confirmarea
bacteriologică înainte de începerea tratamentului.
31. 4. 3. Izbucnire epidemică de infecţii produse de H. ducreyi, în USA
În perioada mai 1981 - ianuarie 1982, într-un district din statul California, au fost
raportate peste 1.000 de cazuri de infecţie cu Haemophilus ducreyi, dintre care aproximativ
400 prezentau afecţiuni în sfera genitală (şancru moale, ulceraţie genitală etc.). Având în
vedere această izbucnire epidemică („outbreak”), reacţia autorităţilor de sănătate publică a
fost substanţială. Toate cazurile confirmate, precum şi contacţii acestora au primit
eritromicină şi cotrimoxazol. Totuşi, numărul cazurilor raportate a continuat să crească în
următoarele şase luni, înregistrându-se circa 30 de cazuri noi pe lună. În încercarea de a
reduce dimensiunile acestei adevărate probleme de sănătate publică, tratamentul
antimicrobian a fost administrat şi la alţi 287 de contacţi, descoperiţi ulterior, în mod activ
(majoritatea prostituate) ca şi în alte 700 de cazuri considerate probabile, încă neconfirmate.
Măsurile adoptate au avut succes, numărul cazurilor înregistrate scăzând la 14 în luna iulie şi
10 cazuri în luna august. Ultimul caz confirmat prin diagnostic de laborator a fost raportat în
ianuarie 1983.
Până în 1981 nu se mai raportaseră atât de multe cazuri de infecţie cu H. ducreyi, iar după
1983, numărul acestora a scăzut în mod constant.
În cadrul acestei izbucniri epidemice, 96% dintre pacienţi au fost de origine hispanică şi
86% dintre aceştia au recunoscut faptul că au avut cel puţin un contact sexual neprotejat cu
prostituate. Pentru obţinerea acestor informaţii, echipele de sănătate publică s-au deplasat
„din uşă în uşă”. În 15 cazuri, a fost confirmată o dublă infecţie, cu H. ducreyi şi Treponema
pallidum. Într-un singur caz s-a pus în evidenţă infecţia cu herpes simplex virus de tip II
(HSV II), alături de H. ducreyi. Numărul cazurilor din cursul acestei epidemii a fost de peste
şapte ori mai mare decât în anii precedenţi.
Instituirea antibioterapiei la pacienţi şi contacţii confirmaţi ai acestora a fost utilă, însă nu
suficientă, epidemia evoluând în continuare. Situaţia s-a ameliorat numai după instituirea
tratamentului profilactic atât în cadrul comunităţilor de femei cu moravuri uşoare din
districtul respectiv (neţinându-se seamă de existenţa tabloului clinic asimptomatic sau de
prezenţa unor ulceraţii genitale de natură neprecizată), cât şi în rândul „clienţilor” acestora,
care prezentau sau nu semne ale bolii.
Discuţii
Situaţia prezentată poate fi considerată de excepţie, întrucât izbucnirile epidemice care au
drept agent etiologic Haemophilus ducreyi sunt rare iar numărul de cazuri este, de regulă,
relativ mic („discrete outbreaks”). În aproximativ 10% dintre cazurile confirmate de şancru
moale poate apărea co-infecţia cu T. pallidum sau cu HSV II. Tulpinile izolate au fost
rezistente la sulfametoxazol şi tetraciclină şi sensibile la eritromicină. Şancrul moale în
infecţia cu H. ducreyi (în limba engleză „chancroid”) ar putea fi confundat cu sifilisul primar
sau cu herpesul genital.
Supravegherea epidemiologică a continuat timp de şase luni de la raportarea ultimului caz
confirmat, punându-se în evidenţă încă o dată necesitatea emiterii unui diagnostic corect într-
un timp cât mai scurt şi a instituirii anchetei epidemiologice extensive în orice epidemie.
Istoricul acestei izbucniri epidemice subliniază pe de o parte existenţa unor particularităţi
în relaţie cu infecţiile cu transmitere pe cale sexuală iar pe de altă parte necesitatea unui
sistem de sănătate publică care să funcţioneze corespunzător, în permanenţă.
32. Genul Bordetella. Bordetella pertussis (MI Popa)
32. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram-negativi asemănători celor din genul
Haemophilus, strict aerobi. Specia tip este reprezentată de B. pertussis agentul etiologic al
tusei convulsive izolată în 1906 de Bordet şi Gengou; alte exemple sunt reprezentate de
Bordetella parapertussis şi Bordetella bronchiseptica. În afară de aceste trei specii (foarte
înrudite din punct de vedere genetic) mai sunt cunoscute încă alte cinci.
32. 2. Caractere generale
32. 2. 1. Habitat
Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea de a
invada. Reprezintă microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu
sânge cald.
32. 2. 2. Caractere morfologice
Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm / 0,5-2
μm, imobil. Atunci când este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare
prezintă pili ataşaţi de peretele bacterian. După 24 ore, pilii se pot identifica în mediul de
cultură. Prin treceri succesive microorganismul devine polimorf, lipsit de capsulă şi pili. De
regulă celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte rar în lanţuri. Dacă se practică o
colorare cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar.
32. 2. 3. Caractere de cultură
B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil. Fiind inhibat de
acizi graşi, peroxizi organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în diagnosticul
bacteriologic. Necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură
optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care
conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină
sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea
microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S mici,
convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de
hemoliză (faza I). În lumina transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este
necesar mediul Bordet-Gengou, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe
geloză-sânge sau pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor
fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale,
virulenţa fiind scăzută.
Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în
această etapă de izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea
microorganismului prin imunofluorescenţă.
Aspecte genetice
Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella
pertussis variaţia de fază.
Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii
îmbogăţite. Sunt tulpini în formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă.
Vaccinurile se prepară folosind culturi în faza I. Fazele II şi III sunt intermediare.
Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul
caracteristic formelor R. Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi
factori de patogenitate.
32. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-37ºC, nu necesită
prezenţa factorilor X sau V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex. acidul
glutamic) etc. Tulpinile virulente produc hemoliză.
32. 2. 5. Acţiunea factorilor fizici, chimici
În afara organismului Bordetella pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2
ore la temperatura camerei. Lumina solară o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă
în 30 de minute.
32. 2. 6. Structură antigenică
Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu:
- 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA);
- aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi
de specie. Datorită implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are
capacitatea de a-şi modifica serotipul in vitro;
- la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun
germenilor Gram-negativi.
În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în
patogenia bolii şi care ar putea fi grupate astfel:
- toxina pertussis (TP), factor major de virulenţă, dar şi cel mai important antigen şi
imunogen. Este o exotoxină formată din 2 subunităţi (A şi B);
- adenilatciclaza;
- toxina letală (dermonecrotică);
- citotoxina traheală.
32. 2. 7. Răspuns imun
După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-TP şi anti-FHA. Titrul anticorpilor anti-
TP persistă timp îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă
de o nouă îmbolnăvire.
32. 2 .8. Caractere de patogenitate
B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză.
În realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au:
- fimbriile;
- aglutinogenele;
- hemaglutinina filamentoasă (FHA);
- pertactinele (PRNs);
- toxina pertussis.
Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce toxine
care determină apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior).
Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate.
32. 3. Patogenie. Principalele afecţiuni produse
Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în special
pe cale aeriană (picături Pflügge) într-un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în
primul stadiu de boală şi la începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică).
Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală,
apar primele manifestări clinice care se agravează treptat.
Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni:
- după legarea subunităţii B (a TP) pe suprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea
subunităţii A. Subunitatea A se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o
inhibă şi rezultă o stimulare a adenilatciclazei şi respectiv o creştere a sintezei de AMPc.
Dintre efectele negative care se datorează sintezei de TP putem enumera hipoglicemia,
sensibilizarea la histamină, reducerea activităţii macrofagelor, diminuarea răspunsului imun
umoral (sinteza de anticorpi);
- adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor;
- toxina letală produce necroze locale;
- citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate
(favorizând, probabil, acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).
Boala la om se numeşte tuse convulsivă („tuse măgărească”).
După o incubaţie de 7-10 zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze.
În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează
căile respiratorii superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei
infecţii respiratorii obişnuite: tuse, strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte
contagios, elimină prin tuse un număr foarte mare de microorganisme. Diagnosticul de
laborator bacteriologic este posibil prin prelevări cu tampon steril de la nivelul faringelui sau
prin metoda „plăcilor tuşite”. Gravitatea şi durata bolii pot fi reduse dacă se face tratament
antimicrobian corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat.
Faza a doua (paroxistică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese
adeseori tipice, cu sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată,
urmează 5-10 secuse expiratorii spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi
glotice (de unde şi denumirea de „tuse măgărească” dată bolii în ţara noastră sau de
„cocqueleuche” în limba franceză). Adesea accesul se termină cu vomă şi cu aspirarea
vomismentelor. Pot apărea cianoză, convulsii, anxietate.
La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până
la 30 accese pe zi, mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi
limfocitoza periferică caracteristică, precum şi hipoglicemia.
Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită
tusei şi inspirului amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării
secreţiilor este mai importantă la copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea
hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar complicaţii şi la nivelul sistemului nervos
central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis).
Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3
săptămâni.
32. 4. Diagnosticul de laborator
Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic sau imunologic.
32. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis
este bacteriologic, direct.
Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este
foarte contagios iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de
antibiotice). Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat în timpul fazei catarale şi în prima
parte a fazei paroxistice (foarte rar se mai pot obţine rezultate, la mai mult de 4 săptămâni de
la debut, în special pentru că, se administrează antibiotice şi chimioterapice). Detectarea
adenilat ciclazei (prin activitatea enzimatică) şi a toxinei pertussis (prin efectul citotoxic sau
imunoteste), în produsul patologic, eventual după îmbogăţire, sunt promiţătoare, dar nu au
intrat în practică.
O valoare a numărului de leucocite de 16-50.000 / dL sânge, cu limfocitoză absolută, vine
în sprijinul diagnosticului de tuse convulsivă.
Identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice (sau cu simptome nespecifice) şi
respectiv la contacţi ar permite aplicarea unor măsuri preventive.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii
de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian). Vom realiza recoltarea cu ajutorul
tamponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza
adsorbţia B. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea
secreţiilor traheobronşice. Este descrisă (istoric) şi metoda „plăcilor tuşite” (se expune o
placă Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ
20 cm în faţa gurii bolnavului în timpul accesului de tuse).
Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului
(microorganismul este foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă
pentru recoltarea p.p. atunci când se suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele
au diferite limite atât din punctul de vedere al sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct
de vedere practic).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Examinăm frotiurile la microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor
inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, dispuşi separat sau în
perechi, rareori în lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează
relativ slab în coloraţia ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă
(imunofluorescenţă directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină sau safranină.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.
2). Bordetella pertussis este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe
medii de cultură obişnuite; este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B.
pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentru a putea fi evaluată variaţia
genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la
antibiotice şi chimioterapice.
Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o
temperatură optimă de 35-37˚C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă
umedă. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar,
macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină / meticilină
sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea
microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat
de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile).
Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport, care
include geloză nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest mediu
poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.
În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune
activat, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe
geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor
apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale:
Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm,
imobili, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a
deveni pleomorfi în urma subcultivărilor (pot apărea şi forme filamentoase).
Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia
structurile capsulare. Dacă frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în
evidenţă granule metacromatice situate bipolar.
Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după
cultivare.
Caractere de cultură:
Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37˚C pe mediul Bordet-
Gengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu
strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de hemoliză (faza I).
În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu
cărbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre,
cu suprafaţa perlată.
Caractere biochimice:
Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă.
Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gram-
negativi (BGN) (ex. API 20 E, API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste
adiţionale de identificare.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de
Bordetella pertussis, prin reacţia de aglutinare pe lamă.
Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă:
Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica
PCR are o bună specificitate şi sensibilitate dezavantajul principal fiind
reprezentat de costul ridicat.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea
stabilirii tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de
rezistenţă la antibiotice şi se realizează prin metode difuzimetrice.
32. 4. 2. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă,
deoarece o creştere semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia
din a doua sau a treia săptămână de boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC,
reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA.
Diagnosticul serologic poate fi realizat în cadrul unor studii epidemiologice, în scop de
cercetare; ar putea fi, eventual, util în diagnosticul diferenţial (retrospectiv).
32. 5. Tratament
Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării
microorganismului, reduce gravitatea simptomelor şi are valoare profilactică diminuând
perioada în care pacientul este contagios. Se mai pot administra rifampicină, tetraciclină,
cloramfenicol, gentamicină dar nu ampicilină.
Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai poate
influenţa cursul boli. În general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii pacientului
respectiv.
Deosebit de important sunt tratamentul simptomatic, oxigenoterapia şi respiraţia asistată,
hidratarea, eliminarea secreţiilor, măsurile generale nespecifice, în special la nou-născuţi şi
copii mici la care tusea convulsivă rămâne o importantă problemă medicală. Eficiente sunt şi
administrarea de sedative şi aspirarea secreţiilor.
32. 6. Epidemiologie
Boala este endemică în zonele dens populate din orice parte a lumii şi adesea pot apare
epidemii, în cicluri la 3-5 ani, prin acumularea indivizilor susceptibili în populaţie.
Sursa cea mai frecventă este reprezentată de pacientul în faza catarală, infecţia
răspândindu-se de obicei pe cale aeriană. Contagiozitatea este foarte mare, 30-90% din
contacţi receptivi putând face boala. Multe cazuri apar înaintea vârstei de 5 ani, însă
majoritatea cazurilor grave apar înaintea vârstei de un an. Odată cu limitarea numărului de
cazuri la copiii mici, este evident că adulţii cu boală atipică, nediagnosticată, reprezintă
populaţia cu rol major în transmitere. Boala este mai puţin periculoasă la adulţi, dar la copii
rata mortalităţii este destul de mare. Frecvenţa bolii a scăzut mult după 1930, odată cu
introducerea vaccinării; totuşi evoluţia numărului de îmbolnăviri în diferite ţări în care
programele de imunizări sunt, în general, eficiente, pun întrebări cu privire la eficacitatea
vaccinului pertussis şi solicită găsirea unor soluţii.
În România, cazurile de tuse convulsivă raportate în anul 1997 au fost în număr de 263,
incidenţa bolii ajungând la valoarea de 1,20/0000. Pentru anul 1998, incidenţa bolii a scăzut la
0,40/0000, numărul de cazuri înregistrate fiind de 97, la fel ca şi în 1999. Cel mai mare număr
de cazuri în ultimii 10 ani a fost înregistrat în anul 2000 (493 cazuri, incidenţă 2,20/0000). În
perioada 2001-2006 au fost înregistrate anual între 37 (2006) şi 233 (2004) cazuri, evoluţia
fiind imprevizibilă şi fără o legătură / influenţă epidemiologică demonstrată (sau studiată).
Cu toate că vaccinarea DTP se realizează pe scară naţională în SUA, în 1997 au fost
raportate 6.564 cazuri de tuse convulsivă (incidenţă 2,460/0000), iar în 1999, 7.288 de cazuri,
corespunzând la o incidenţă de 2,670/0000. În anul 2001 incidenţa tusei convulsive a fost de
2,690/0000, cu 7.580 cazuri raportate. În perioada 2002-2004 numărul de cazuri şi respectiv
incidenţa au înregistrat valori în continuă creştere, valoarea maximă fiind raportată în 2004
(25.827 cazuri de tuse convulsivă). În anul 2005 au fost înregistrate 25.616 cazuri, incidenţa
fiind de 8,720/0000. Această evoluţie ridică semne de întrebare cu privire la raportarea
cazurilor în ţara noastră şi certifică necesitatea întăririi sistemului de supraveghere, inclusiv
prin metode de laborator.
32. 7. Prevenire. Control
Vaccinul este o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, distruşi fie cu
formol, mertiolat de sodiu etc, fie prin căldură, fie prin acţiunea combinată a agentului fizic şi
chimic. Vaccinul pertussis se administrează în mod curent combinat cu anatoxina difterică şi
tetanică sub forma trivaccinului diftero-tetano-pertussis (DTP).
Dezavantajul acestui vaccin este faptul că, pe lângă componentele care duc la protecţie,
conţine şi anumite componente care induc la reacţii adverse, uneori necontrolabile. Însă,
punându-se în balanţă beneficiile vaccinării şi respectiv dezavantajele datorită reacţiilor
adverse (care apar relativ rar), este unanim recunoscută utilitatea vaccinării. Reacţiile adverse
sunt de obicei reprezentate de reacţii locale şi febră, probabil datorită conţinutului în
lipopolizaharide.
Primovaccinarea se începe la 2 luni, administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4,
6 luni). Pentru menţinerea imunităţii se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare
iar revaccinarea a II-a se practică la 36 de luni de viaţă a copilului respectiv.
Datorită reacţiilor adverse mai sus menţionate se recomandă eliminarea componentei
pertussis la nou-născuţii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei
care au avut o reacţie adversă semnificativă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se
studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui vaccin acelular în care să fie inclusă
toxina pertussis inactivată, evitându-se astfel reacţiile adverse (vaccinul acelular este deja
recomandat în cadrul programului de imunizare din SUA, Japonia şi o bună parte din ţările
din UE). Componenta principală a vaccinului acelular este reprezentată de anatoxina pertussis
inactivată genetic (modificarea a 2 aminoacizi). Cu toate acestea, în ultimii ani există o serie
de discuţii privind eficacitatea acestui vaccin. Ceea ce este cert este că există o recrudescenţă
a tusei convulsive în ţări în care acoperirea vaccinală este mare (USA, Australia, Canada,
Olanda etc).
Imunizarea activă a adulţilor ar putea fi eficace în stăpânirea unei epidemii izbucnite într-
o colectivitate (ex. personalul unui spital). Utilizarea eritromicinei administrate imediat după
contactul cu un bolnav are valoare profilactică. Se recomandă şi în cazul copiilor vaccinaţi,
cu vârsta mai mică de 4 ani, deoarece vaccinarea nu are o eficacitate de 100%.
32. 8. Povestiri adevărate
Tusea convulsivă este o maladie cu potenţial sever, care în lipsa tratamentului poate
conduce la insuficienţă respiratorie şi chiar la deces. În „forma tipică” boala este uşor de
recunoscut clinic, însă există situaţii în care diagnosticul şi diagnosticul diferenţial se
stabilesc dificil. Având în vedere existenţa a numeroase cazuri care pun probleme, în Statele
Unite a fost stabilit un site prin intermediul căruia persoanele afectate pot transmite informaţii
care ar putea fi utile pentru cei care doresc să ştie mai multe cu privire la această boală.
Dintre numeroasele informaţii postate pe acest site, dorim să redăm câteva situaţii
exemplificative.
Spre exemplu, este destul de relevant în acest sens cazul lui KG, care povesteşte că fiul
său în vârstă de 10 ani, astmatic, a dezvoltat simptome asemănătoare gripei, însoţite însă cu
dificultăţi majore de respiraţie (dacă povestea ar fi avut loc după anul 2005 şi ar fi putut fi
identificată o legătură cu prezenţa unor păsări moarte, cineva ar fi putut să se gândească la o
infecţie cu virus gripal aviar). După ce a văzut că nu pare să fie vorba de o gripă „obişnuită”
(se mai întâlnise cu altfel de situaţii în anii anteriori), întrucât simptomele nu regresau, ci din
contră s-au agravat, cu o oarecare întârziere (iată că şi în USA se „practică” această lentoare
în prezentarea la medic) tatăl a însoţit copilul la un consult medical de specialitate. Aici însă
diagnosticul a fost de „alergie nazală” (în baza antecedentelor astmatice şi a simptomelor
asemănătoare celor din gripă). După 2 săptămâni de tratament (cam „la întâmplare”, am putea
spune), copilul se simţea din ce în ce mai rău (tulburările respiratorii se agravaseră
substanţial), aşa că fost dus la un alt medic. Şi în acest al doilea caz, consultul medical a fost
condus aparent eronat, medicul s-a bazat pe simptomele care sugerau o gripă şi a pus
diagnosticul „generic” de viroză. După numai câteva zile după acest al doilea diagnostic
superficial şi eronat, copilul a ajuns la camera de gardă cu insuficienţă respiratorie. Din
fericire, această întâmplare nu s-a soldat cu deces, copilul revenind în familie după mai multe
zile de tratament intensiv.
Este cunoscut faptul că majoritatea populaţiei este vaccinată la naştere cu DTP şi din
această cauză puţini cetăţeni se gândesc, chiar şi în cazul în care prezintă simptome ce ar
putea părea specifice, că acestea ar putea fi determinate de Bordetella pertussis. Acesta a fost
şi cazul lui BL, care menţionează pe site că fiind muncitor în construcţii şi lucrând într-un
mediu cu praf excesiv, nu a dat mare importanţă momentului în care a început să tuşească.
Nici atunci când au apărut paroxismele şi convulsiile nu s-a gândit că ar putea avea tuse
convulsivă deoarece ştia că fusese vaccinat în copilărie. Ceea ce a aflat până la urmă domnul
BL (în vârstă de 46 ani), după ce finalmente a trecut pe la o serie de medici iar ultimul i-a
recomandat să facă şi o serie de analize de laborator, ar trebui să ştim cu toţii şi anume că
titrul anticorpilor scade o dată cu vârsta astfel încât putem să ne infectăm cu un germen
contra căruia am fost vaccinaţi în copilărie. Este un sfat bun atât pentru populaţie cât şi
pentru destul de mulţi dintre medici.
O alta preconcepţie care face tusea convulsivă greu de evidenţiat şi uneori poate crea
probleme deosebite, în afară de faptul că uneori boala poate să se manifeste atipic, sau că
oamenii cred că dacă au fost vaccinaţi în copilărie sunt imuni (cu certitudine) pentru tot restul
vieţii, este faptul că tusea este de multe ori desconsiderată ca producătoare a unui simptom
agravant iar cei afectaţi vin foarte târziu pentru a solicita un ajutor medical. Este cazul lui BB
care a venit foarte tardiv, moment în care a fost obligatorie utilizarea medicaţiei cortizonice
pentru diminuarea simptomatologiei. Tusea a dispărut, aminteşte pe site această pacientă,
după 6 săptămâni de tratament, iar vindecarea totală a avut loc în 3 luni. Afectarea muşchilor
respiratori s-a remis încă şi mai târziu, intercostalii în 3 luni iar trapezul mic în 6 luni.
Iată, aşadar, numai câteva dintre exemplele împărtăşite de pacienţi pe site-ul dedicat tusei
convulsive, o boală cu potenţial sever, de multe ori percepută greşit şi care dacă nu este
diagnosticată şi tratată corespunzător (de regulă patogenic şi simptomatic, pentru că
diagnosticul etiologic este pus foarte târziu) poate conduce la probleme deosebite.
33. Genul Brucella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
33. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Brucella cuprinde mai multe specii care infectează animalele şi se pot transmite
omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi; 3 serogrupuri), Brucella abortus (vaci; 9
serogrupuri), Brucella suis (porci; 5 serogrupuri), Brucella canis (câini), Brucella ovis (oi),
Brucella neotomae (şobolan) şi Brucella maris (mamifere marine).
Sunt cocobacili Gram-negativi, imobili, eventual prezentând capsulă, nesporulaţi, care
parazitează în special animalele, caracteristic localizaţi intracelular, relativ inactivi metabolic.
Primele trei sunt principalele specii implicate şi în patologia umană.
Primul microorganism al genului a fost izolat în 1887 de Bruce, din piese recoltate
anatomopatologic (splină de la patru soldaţi decedaţi în insula Malta) şi a fost numit
Micrococcus melitensis. Denumirile istorice ale bolii sunt: febra ondulantă, febră de Malta,
febră mediteraneană etc (o boală în care febra avea un caracter „ondulant”, a fost descrisă ca
fiind prezentă în zona litoralului Mării Mediterane, încă de pe vremea lui Hipocrate). Zece
ani mai târziu, Wright pune la punct reacţia de aglutinare pentru evidenţierea anticorpilor
anti-M. melitensis. În onoarea şi amintirea lui Sir David Bruce, în anul 1920 se stabileşte
încadrarea în genul Brucella atât pentru germenul descoperit în 1887 cât şi pentru o a doua
specie, care producea avort la capre (descrisă de Alice Evans).
33. 2. Caractere generale
33. 2. 1. Habitat
Habitatul principal al brucelelor este reprezentat de organismul infectat (în sistemul
reticuloendotelial, la nivel genital), dar germenii pot supravieţui şi în mediul înconjurător.
Animalele menţionate mai sus reprezintă gazdele cele mai frecvente, dar infecţia se poate
întâlni şi la alte animale. Există o serie de mecanisme care le asigură persistenţa, dintre care
se poate aminti posibilitatea transformării în condiţii nefavorabile în forme L („persister”).
33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
În culturi proaspete, brucelele sunt cocobacili Gram-negativi, imobili (se poate observa o
capsulă fină utilizând tehnici speciale de colorare), nesporulaţi, izolaţi sau mai rar prezenţi în
grămezi neregulate. În produsul patologic sunt găsiţi în special intracelular. În culturi mai
vechi prezintă un important grad de polimorfism.
33. 2. 3. Caractere de cultură
Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare, la prima
izolare, medii îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri,
vitamine, factori de creştere etc). Dacă produsul patologic este potenţial contaminat, se
recomandă utilizarea mediilor selective (cu bacitracină, cicloheximidă, acid nalidixic,
nistatină, polimixină B şi vancomicină).
Microorganismele sunt aerobe, facultativ anaerobe. Dintre cele patru specii considerate
importante şi pentru om, numai Brucella abortus necesită la prima izolare o atmosferă cu 5-
10% CO2.
Creşterea este lentă, mai ales la prima cultivare, iar coloniile (de tip S) devin vizibile după
2 sau mai multe zile. Plăcile cultivate se vor menţine la incubator un timp suficient de lung
(uneori câteva săptămâni). Pentru hemoculturi este utilizat în mod curent mediul bifazic
Castaneda (hemocultura trebuie supravegheată minimum 3-4 săptămâni). Mediul lichid este
tulburat uniform (dar pot apărea depozite sau o peliculă la suprafaţă).
Tulpinile de Brucella spp. au fost implicate de multe ori în „accidente de laborator”,
motiv pentru care manipularea produselor şi culturilor trebuie să se realizeze cu precauţie.
33. 2. 4. Caractere biochimice
Activitatea metabolică este scăzută. Utilizează carbohidraţi, dar nu produc hidrogen sau
gaz în cantităţi suficiente pentru o eventuală utilitate în clasificare. Toate brucelele produc
catalază şi descompun în mod variabil ureea. Se pot folosi o serie de aminoacizi (ex. L-
alanina, L-asparagina) şi o serie de carbohidraţi (ex. L-arabinoza, D-galactoza) pentru
evaluarea metabolismului oxidativ al tulpinilor de Brucella spp.
33. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici
Brucelele sunt destul de rezistente în mediu, mai ales dacă sunt înconjurate de un strat
protector (în ţesuturile fetale infectate eliminate pot rezista săptămâni de zile; B. melitensis
poate rezista 6 zile în urină, 5-6 săptămâni în praf şi 9-10 săptămâni în apă sau sol). Sunt
moderat sensibile la temperatură şi aciditate. Pasteurizarea laptelui le distruge. Sunt sensibile
la majoritatea substanţelor dezinfectante, respectând protocolul de lucru (concentraţie, timp
de expunere etc. stabilit).
33. 2. 6. Structură antigenică
Brucella spp. are o structură antigenică relativ complexă.
Antiserurile de la animale imunizate cu o tulpină de tip S aglutinează cu cele patru specii
principale. Au fost propuşi doi determinanţi antigenici diferiţi, A şi M (polizaharide de
suprafaţă). Aceştia sunt prezenţi în proporţii diferite la speciile studiate. Antigenul abortus
(A) este determinantul major de suprafaţă la Brucella abortus şi Brucella suis şi determinant
minor (a) la Brucella melitensis. Antigenul M predomină la Brucella melitensis şi este
determinant minor (m) la celelalte două specii.
A fost descoperit un antigen de suprafaţă L asemănător cu antigenul Vi de la Salmonella.
Tulpinile capsulate prezintă un antigen de tip K.
La nivel parietal există lipopolizaharidul (Ag O, endotoxina), care diferă de Ag O al altor
germeni Gram-negativ prin compoziţia în acizi graşi şi faptul că este strâns legat de proteine,
formând împreună un complex, ceea ce îi determină o activitate biologică distinctă.
33. 2. 7. Răspuns imun
Bruceloza acută, la fel ca şi administrarea de vaccinuri cu tulpini vii atenuate, determină
atât un răspuns imun umoral cât şi un răspuns imun celular.
În principiu, o dată cu apariţia semnelor şi simptomelor se pot detecta anticorpi, dar
prezenţa lor nu previne bacteriemia şi nici reinfecţia (care este relativ frecventă).
Imunitatea celulară are un rol critic în rezistenţa faţă de o nouă îmbolnăvire. Răspunsul
imun celular este în mod cert necesar pentru eradicarea brucelelor situate intracelular.
33. 2. 8. Caractere de patogenitate
Caracterele de patogenitate se manifestă prin capacitatea germenilor de a se multiplica şi
de a invada organismul. Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau
pentru om, capabile să determine infecţii acute, cronice dar şi infecţii inaparente. Dintre
animalele de laborator, cobaiul pare să fie animalul cel mai constant sensibil. Cronicizarea
depinde de capacitatea de multiplicare în celule fagocitare. Cele mai patogene specii sunt
Brucella melitensis, urmată de Brucella suis şi de Brucella abortus.
Nu s-au detectat exotoxine; nu s-au pus în evidenţă constituenţi antifagocitari capsulari
sau ai peretelui celular. Brucelele prezintă, însă, un grad de rezistenţă faţă de distrugerea de
către PMM explicabilă prin faptul că nu are loc stimularea metabolismului oxidativ şi este
inhibată degranularea neutrofilelor, precum şi descărcarea enzimelor din granulaţii.
Supravieţuirea intracelulară pare să fie favorizată de existenţa: Cu-Zn superoxid-dismutazei,
unor proteine de şoc termic (de „tip” Gro EL, HtrA etc).
Pare să existe şi un factor de patogenitate neprecizat, produs numai in vivo, care ajută
supravieţuirea intracelulară (de ex. tulpini de Brucella abortus virulente provenite din culturi
de monocite sau din placentă bovină infectată supravieţuiesc mai bine decât aceleaşi tulpini
cultivate pe medii artificiale).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) este implicată în patogenitate.
33. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse
Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între momentul
infectării şi apariţia fenomenelor clinice.
Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii,
febră moderată, transpiraţii abundente.
În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de
greu de recunoscut clinic. Febra „ondulantă” (care creşte în cursul după amiezii şi scade în
timpul nopţii) însoţită de frisoane are mai mult o valoare istorică. În realitate, curba febrilă
are un aspect variabil (poate fi ondulantă, neregulată, renitentă şi intermitentă). Transpiraţiile
abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă
alte elemente care pot fi comune în cursul bolii.
S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.
Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în
formele cronice la ani de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.
Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de
infecţia cu Brucella suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.
33. 4. Diagnostic de laborator
În principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de la aspecte clinice şi
epidemiologice, însă diagnosticul de laborator este esenţial, reprezentând unica metodă certă
(„golden standard”) de diagnostic.
Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau imunologic.
33. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic include următoarele etape.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute (vezi anexa nr. 2), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea
recolta şi prin puncţie ganglionară, puncţie medulară (rata de izolare creşte), puncţie hepatică
sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă, lapte, materiale necroptice etc.,
în funcţie de simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare vom discuta situaţia în care se
realizează o hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare rapide, de tipul
BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi şi anexa nr. 6 / A.6.8.).
Tehnica PCR, utilizând un fragment de 223 perechi de baze, ar putea fi utilizată atât în
bruceloza acută, cât şi în bruceloza cronică. Este de luat în considerare la pacienţii care au
primit, deja, antibiotice sau chimioterapice.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile
diagnosticului, în special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă
care uneori duce la rezultate pozitive.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr.
2). Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite
cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc).
Se recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda.
Cultura se incubează în atmosferă de 5-10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3
zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom
însămânţa panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi cu dimensiuni de 0,5-0,6 µm/ 0,6-
1,5 µm, dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi
necesară o prelungire a timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.
Caractere de cultură:
Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii
de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte
astfel încât la 1 săptămână de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi
identificate (în special după incubare prelungită) colonii de tip R sau M;
Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-
deschis, asemănător „picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată
prezintă o transparenţă cenuşiu-albăstruie.
Caractere biochimice:
Brucella spp. după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism
oxidativ;
Microorganismele sunt catalază-pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei,
ureazei şi producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme
clasice de testare, dar este posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex. API 20E);
Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare;
Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la
diferiţi coloranţi incluşi de ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină
bazică).
Caractere antigenice:
Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă
(există reacţii încrucişate); în cazul unei reacţii pozitive, la nivelul
laboratoarelor de referinţă se pot realiza reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri
imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R).
Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în
scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi
lizează tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar
nu lizează tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile în formă R.
Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
- tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru
diferite biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; s-a
pus la punct şi tehnica PCR, pornind de la cultura bacteriană).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează
prin metoda difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei
unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene, cât şi pentru stabilirea tratamentului
corespunzător în cazul unei maladii infecţioase în general dificil de tratat.
33. 4. 2. Diagnosticul serologic
Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile obţinerii diagnosticului bacteriologic
pozitiv. Utilizăm antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor
specifici în sângele pacientului, valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acestui titru
în dinamică. Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip IgM cresc în infecţia acută (în câteva
săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul antibiotic realizat
corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni de la
debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii
cronice.
În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor
practice, aglutinarea pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută
şi utilizată tehnică de diagnostic serologic este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin
care putem determina atât titrul anticorpilor de tip IgM cât şi cel al anticorpilor de tip IgG.
Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care
blochează activitatea aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există
dificultăţi şi în ceea ce priveşte interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.
Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de 4
ori în dinamică a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.
Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:
diluarea suplimentară a serurilor de cercetat;
testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură de ser
imun anti-Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare aglutinarea,
concluzionăm că în serul de cercetat există anticorpi blocanţi);
testul Coombs;
utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă de
proteinele membranei externe etc.
Un test Wright negativ nu exclude diagnosticul de bruceloză. Există studii în care s-a
demonstrat că există pacienţi la care reacţia de aglutinare a fost negativă, dar Brucella spp. a
fost izolată prin hemocultură.
33. 4. 3. Diagnosticul imunobiologic
Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun
mediat celular, diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în
investigarea unui caz suspect de bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei
stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.
33. 5. Tratament
Brucelele pot fi sensibile la tetraciclină sau ampicilină. Se recomandă utilizarea
tetraciclinei în combinaţie cu gentamicina sau varianta recomandată de OMS (rifampicină +
doxiciclină, timp de minim şase săptămâni). Ameliorarea simptomatologiei se poate produce
în câteva zile de la începerea tratamentului. Totuşi, datorită localizării intracelulare a
germenului, tratamentul trebuie să fie prelungit (mai multe săptămâni).
33. 6. Epidemiologie
Sursa de microorganisme din genul Brucella este reprezentată de animalele bolnave.
Transmiterea infecţiei la om se realizează prin ingestia de lapte sau de produse contaminate
provenite de la animalele bolnave, prin contactul cu Brucella la nivelul leziunilor
tegumentare, la nivelul conjunctivei sau prin inhalarea microorganismului.
Bruceloza este în principal o boală profesională, apărând la lucrătorii din sectorul
zootehnic, fermieri etc.
În România, în anul 1999 au fost raportate 3 cazuri iar în anul 2000, 5 cazuri de bruceloză
(incidenţă 0,020/0000). Numărul de cazuri a fost mic şi în următorii ani (de ex. 2 cazuri în 2005
şi 1 caz în anul 2006).
Incidenţa brucelozei s-a menţinut relativ constantă în ultimii 20 de ani în SUA, cu o
uşoară scădere; în 1998 şi 1999 valoarea a fost de 0,030/0000, cu 79 şi respectiv 82 de cazuri
notificate. Având în vedere sursa de infecţie, autorităţile de sănătate publică americane includ
în raportul anual şi bruceloza la animale (în 2005, 3 cirezi de cornute şi 2 cirezi de porci au
fost identificate cu bruceloză; 48 de state nu au raportat cazuri de bruceloză la animale).
Numărul de cazuri de bruceloză la om, în 2005, a fost 120 (incidenţă 0,040/0000).
33. 7. Profilaxie
Elementul esenţial pentru eliminarea brucelozei umane este eradicarea bolii la animale.
Acest lucru s-ar putea realiza folosind un vaccin viu atenuat, care determină imunitate.
Animalele bolnave trebuie sacrificate.
Între metode de prevenire a infecţiei cu Brucella se pot aminti şi pasteurizarea laptelui,
evitarea contactului cu produsele animale contaminate şi aplicarea măsurilor de protecţie a
personalului aflat la risc pentru contractarea bolii.
33. 8. Povestiri adevărate
33. 8. 1. Probleme de diagnostic diferenţial
Bruceloza este o boală cu un larg spectru de manifestări clinice. Complicaţiile
osteoarticulare sunt relativ frecvente, dar se mai pot înregistra afectările cutanată,
genitourinară, nervoasă, respiratorie sau hematologică.
Cazul unui pacient de sex masculin, în vârstă de 17 ani (bruceloză cu complicaţii la nivel
renal), este relevant pentru implicaţiile mai rare dar serioase, ale acestei boli.
Tânărul de 17 ani, care lucra la o stână de oi, se prezintă la medic cu hematurie şi dureri în
flancul drept, dureri ce durau de aproximativ 3 luni. Aceste simptome erau însoţite de greaţă,
vărsături, febră şi slăbiciune la nivelul membrelor inferioare, cu dureri de genunchi. Tânărul
nu avea antecedente de infecţii ale tractului respirator superior şi nici de tratamente
medicamentoase de lungă durată.
Examenul clinic a pus în evidenţă febra (38,5°C), paloarea tegumentară şi conjunctivală,
prezenţa edemelor pretibiale şi a hepatomegaliei. Tensiunea arterială a fost normală.
Analizele de sânge, sumarul de urină şi investigaţiile paraclinice (ecografie, ecocardiografie)
stabilesc diagnosticul la internare: glomerulonefrită acută. Titrul ASLO a fost în limite
normale.
Având în vedere locul de muncă, a fost solicitată testarea prezenţei anticorpilor anti-
Brucella spp. Reacţiile Ag-Ac (aglutinare) au fost pozitive (atât pentru anticorpii de tip IgM
cât şi IgG). Prin imunofluorescenţă, a fost demonstrată acumularea componentei C3 a
sistemului C', la nivelul glomerulilor renali.
S-a luat decizia efectuării unei biopsii renale, iar analiza rezultatelor a sugerat: nefrită
difuză tubulointestinală şi glomerulonefrită proliferativă difuză.
În contextul clinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator (în lipsa diagnosticului
bacteriologic), s-a început tratamentul cu medicamente antimicrobiene în asociere
(rifampicină şi doxiciclină). Evoluţia a fost favorabilă; pacientul a fost externat după
dispariţia proteinuriei şi febrei (între timp şi valorile analizelor de laborator s-au normalizat).
Discuţie
Implicarea renală în bruceloză este destul de rară. Mecanismul patogenic include fie
invazia bacteriană directă (în nefrită interstiţială), fie afectarea glomerulară indirectă datorită
complexelor imune circulante (în glomerulonefrită). În cazul descris, au fost implicate
ambele mecanisme.
Cazul descris atrage atenţia asupra unui scenariu clinic rar, nefrită în cursul brucelozei.
Infecţia cu Brucella spp. trebuie suspectată la pacienţii cu glomerulonefrită acută de etiologie
necunoscută (idiopatică), în special în regiunile endemice, diagnosticul de certitudine fiind
pus prin coroborarea datelor clinice, epidemiologice, paraclinice şi de laborator. Diagnosticul
bacteriologic rămâne „golden standard” şi este bine ca să fie finalizat prin testarea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a tulpinii izolate. În cazul prezentat, evoluţia a
fost favorabilă, dar dacă ar fi fost implicată o tulpină rezistentă la medicamentele indicate,
prognosticul ar fi putut să fie nefast.
33. 8. 2. Leziunile cazeoase nu „ascund” doar bacili acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR)
Deşi în scădere semnificativă prin implicarea în patologie, faţă de deceniile anterioare,
Brucella spp. trebuie căutată sistematic în leziunile cazeoase descoperite la biopsie, şi dacă o
coloraţie Ziehl este negativă pentru BAAR, trebuie ca frotiul de rezervă să fie colorat Gram.
Nu rareori vom putea vizualiza bacili Gram-negativi, ulterior identificaţi ca fiind brucele!
Histologia este uneori similară cu ceea ce vedem în cazul leziunilor granulomatoase
cazeificate. Absenţa cazeumului la nivelul granulomului ridică suspiciunea de sarcoidoză.
34. Genul Francisella (Gabriela Loredana Popa)
34. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele din genul Francisella sunt cocobacili Gram-negativi, aerobi, facultativi
anaerobi, pleomorfi, imobili, care produc tularemia, o boală infecţioasă a unor specii de
animale (mai ales rozătoare), care poate fi transmisă incidental pe diferite căi la om.
Tularemia este o zooantroponoză. Specia Francisella tularensis reprezintă singura specie a
genului importantă pentru patologia animală şi umană.
Agentul etiologic al tularemiei a fost izolat pentru prima dată în anul 1912, într-o
izbucnire epidemică („outbreak”) în care boala a fost asemănată cu ciuma, în districtul Tulare
(California). Dacă preocuparea pentru infecţiile cu F. tularensis a scăzut destul de mult în
secolul 20, în momentul de faţă, datorită faptului că microorganismul este considerat drept un
agent potenţial utilizabil în acţiuni bioteroriste, studiile în domeniu au înregistrat o evidentă
creştere.
34. 2. Caractere generale
34. 2. 1. Habitat
Francisella tularensis infectează animalele sălbatice şi domestice (iepuri, şobolani,
şoareci, popândăi, hârciogi, bizami, veveriţe etc) precum şi păsările. Agentul patogen este
prezent şi la unele căpuşe, muşte de animale şi ţânţari. În focarele de infecţie căpuşele joacă
un rol important (în ele microorganismul poate persista 2-3 ani). În plus, ele pot transmite
microorganismul transovarian.
34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Francisella tularensis este un cocobacil Gram-negativ, foarte mic (0,2-0,3 μm /0,6-1 μm)
coloraţia fiind adesea bipolară şi relativ slabă. Prezintă o capsulă fină. Microscopul electronic
a pus în evidenţă şi elemente cocobacilare mai mici, de 0,1μm, sub posibilităţile de rezoluţie
ale microscopului optic, care pot trece prin filtrele uzuale pentru sterilizare bacteriologică.
Microorganismul este imobil, necapsulat (la microscopul optic), nesporulat.
34. 2. 3. Caractere de cultură
Coloniile cresc lent (2-10 zile) la prima inoculare. Se preferă folosirea unor medii
speciale, cu gălbenuş de ou coagulat (McCoy) sau cu cisteină-glucoză-sânge la temperatura
de 37°C, în condiţii de aerobioză. Coloniile sunt mici, transparente şi uşor de emulsionat (tip
S).
34. 2. 4. Caractere biochimice
Francisella tularensis prezintă o activitate biochimică redusă. Poate fermenta unii
carbohidraţi sau alcooli fără producere de gaz. Este catalază-pozitivă şi oxidază-negativă.
Testele biochimice nu prezintă importanţă în diagnosticul curent.
34. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici
În mediul extern F. tularensis poate fi distrusă rapid de căldură. Este rezistentă la frig (de
exemplu, carnea de iepure îngheţată poate rămâne infecţioasă în anumite condiţii). Muştele
pot purta agentul patogen circa 14 zile, iar căpuşele 2-3 ani. Este distrusă de antisepticele şi
dezinfectantele uzuale.
34. 2. 6. Structura antigenică
Tulpinile de Francisella tularensis sunt omogene antigenic, dar genul poate fi împărţit în
două serotipuri. Tipul A este întâlnit în special în America de Nord şi include două subspecii
(tularensis şi nearctica). Tipul B include două subspecii (holarctica şi mediasiatica).
Materialul extracelular (capsula) conţine lipopolizaharide şi carbohidraţi. Au fost extrase
şi o serie de antigene localizate la nivelul peretelui.
Există unul sau mai multe antigene proteice înrudite cu antigenele aglutinante ale genului
Brucella. Francisella tularensis prezintă de asemenea antigenul somatic O (endotoxina,
LPZ).
34. 2. 7. Caractere de patogenitate
Factorii responsabili pentru patogenitatea F. tularensis nu sunt foarte bine definiţi. Totuşi,
componentele de suprafaţă ale celulei (materialul extracelular, capsula) sunt implicate în
patogenitate.
Endotoxina pare să aibă un rol în patogeneză similar cu cel al endotoxinei Salmonellei
typhi.
F. tularensis subspecia tularensis include cele mai virulente tulpini. DL 50 este de 10
microorganisme. Rata fatalităţii (în lipsa tratamentului) este de circa 10-20%. Circa 1-2%
dintre persoanele tratate cu antibiotice şi chimioterapice pot avea o evoluţie nefastă, spre
deces.
34. 2. 8. Imunitate
Imunitatea după infecţie este durabilă (ţine toată viaţa), deşi au fost înregistrate câteva
cazuri de reinfecţie la persoane care lucrau în laborator. Anticorpii aglutinanţi apar de regulă
după 7-10 zile de la debutul bolii, cresc până la un nivel maxim care se menţine pe toată
durata bolii şi scad în convalescenţă, rămânând la aceste valori ani de zile. Nu au efect
protector. Tendinţa bolii de a progresa precum şi desele recăderi sau cronicizarea, care pot
apărea în ciuda titrurilor ridicate de anticorpi serici sau a răspunsului imun persistent, se
datorează în mod cert capacităţii de supravieţuire intracelulară a microorganismului.
Imunitatea celulară reprezintă modalitatea principală de apărare faţă de infecţie.
34. 3. Patogenie
Francisella tularensis are o infecţiozitate foarte mare. Infecţia poate apărea după
penetrarea tegumentelor sau mucoaselor sau după inhalarea a numai 10-50 de
microorganisme. Cel mai adesea contaminarea se realizează printr-o soluţie de continuitate
tegumentară. Microorganismele se multiplică şi la locul de pătrundere, în 2-6 zile apare o
inflamaţie, apoi o papulă care se transformă într-o ulceraţie. Infecţia se propagă mai departe
pe cale limfatică prinzând ganglionii limfatici regionali, care se măresc şi încep să supureze.
Microorganismele se pot multiplica intracelular, supravieţuind mult timp în monocite sau în
alte celule ale organismului.
Diseminarea limfatică este urmată de o bacteriemie tranzitorie, cu formarea de focare în
diferite organe parenchimatoase, în special plămâni, ficat şi splină. Leziunile caracteristice
sunt reprezentate de noduli granulomatoşi care se pot necroza sau cazeifica. Mai pot apărea
frison, febră, cefalee, greaţă, vărsături, afectarea stării generale. În lipsa tratamentului
corespunzător se poate ajunge la delir şi comă.
Alte forme clinice sunt forma oculoganglionară, tularemia orofaringiană, pneumonia
tularemică, forma tifoidică etc.
34. 4. Diagnostic de laborator
De menţionat că diagnosticul pozitiv este sugerat de datele clinice, întărit de cele
epidemiologice şi confirmat de datele de laborator.
De subliniat faptul că un laborator în care se presupune că se lucrează cu F. tularensis
trebuie să asigure condiţii stricte de biosecuritate şi biosiguranţă.
Diagnosticul de laborator bacteriologic, deşi relativ dificil poate fi realizat (în laboratoare
de referinţă), dar în principiu, datorită riscurilor de infectare a personalului de laborator mai
ales prin formarea de nuclei de picătură contaminanţi, majoritatea cazurilor se
diagnostichează imunologic (în special serologic). Se foloseşte tehnica micro-aglutinării.
În vederea diagnosticului serologic este de reţinut că, anticorpii aglutinanţi apar la 7-10
zile de la debutul bolii, ating un nivel maxim la 4-8 săptămâni; titruri dozabile pot persista
mai mulţi ani. Se preferă recoltarea a două probe la interval de 2 săptămâni. O creştere a
titrului de 4 ori la a doua recoltare pune diagnosticul unei infecţii recente.
34. 5. Tratament
Antibioticul de elecţie a fost streptomicina (interesul pentru streptomicină a scăzut nu
datorită apariţiei unor tulpini rezistente ci datorită efectelor adverse ale medicamentului).
Gentamicina şi ciprofloxacina par a fi la fel de eficace. Pot apărea recăderi. Pot fi folosite şi
tetraciclina şi cloramfenicolul, dar recăderile sunt mai frecvente, mai ales dacă tratamentul
este întrerupt prematur (este recomandată o cură de 2-4 săptămâni). Multiplicarea
intracelulară a F. tularensis creează dificultăţi în vindecarea tularemiei şi explică procentul de
circa 5-10% recăderi.
34. 6. Epidemiologie
Tularemia a fost raportată în toată America de Nord, în multe părţi ale Europei (mai ales
în Scandinavia), în fosta URSS, Japonia. Pare să fie o boală care afectează mai ales emisfera
nordică. Apare sporadic sau în epidemii.
Transmiterea agentului patogen de la animalul bolnav la om se face printr-una din
următoarele căi: a. contactul direct cu animalele bolnave sau cu produsele lor, agentul
pătrunzând uşor prin tegumente sau mucoase (inclusiv intacte). De notat frecvenţa crescută a
transmiterii a. după muşcătura de animal; b. pe cale digestivă, prin ingestia de apă sau
alimente contaminate; c. prin intermediul unor vectori (artropode hematofage: căpuşe, muşte,
ţânţari, ploşniţe); d. pe cale respiratorie, prin aerosoli (foarte rar).
Boala are şi un caracter profesional survenind la vânători, agricultori, crescători de
animale. În unele ţări, 90% din cazurile de tularemie apar prin contact cu iepurii sălbatici
infectaţi.
În perioada 2000-2005, în USA au fost raportate între 90 şi 154 cazuri de tularemie, pe an.
Cel mai mare număr de cazuri a fost raportat în anul 2005 (154 cazuri, incidenţă 0,050/0000).
34. 7. Prevenire şi control
Deoarece infecţia animalelor sălbatice nu poate fi controlată, cheia prevenirii infecţiei
umane este reprezentată de evitarea contaminării (evitarea prelucrării produselor animalelor
sălbatice, mănuşi etc).
Pentru persoanele cu risc crescut de infecţie, în special pentru cele care lucrează în
laborator, este posibilă administrarea intradermică a unui vaccin viu atenuat (considerat, încă,
experimental). Nu realizează o protecţie completă, dar persoanele vaccinate fac o formă mai
uşoară de boală (dacă se contaminează).
34. 8. Povestire adevărată
Tularemia este o zoonoză produsă de Francisella tularensis; afectează în principal
animalele şi ocazional omul. Comerţul necontrolat cu animale „exotice” poate reprezenta o
sursă de transmitere a tularemiei, la om.
Pacientul, în vârstă de 4 ani şi 5 luni, a fost adus la camera de gardă a spitalului având un
sindrom febril persistent (de 6 zile; temperatura maximă înregistrată fiind 40ºC), cu stare
generală modificată. Primise de curând un popândău, ca animal de companie (familia îl
omorâse în urmă cu 72 de ore, după ce acesta îl muşcase pe copil). Înainte de prezentarea la
medic, mama îi administrase amoxicilină plus acid clavulanic, fără a observa o îmbunătăţire a
stării generale.
Examenul clinic la camera de gardă a relevat febră, stare generală alterată, uşoară infecţie
conjunctivală bilaterală; cardiopulmonar normal, uşoară hepatosplenomegalie, numeroase
adenopatii axilare, inghinale şi laterocervicale de circa 1 cm diametru (nedureroase, mobile).
În zona palmei stângi se observa locul unde fusese muşcat, fără semne de ulceraţie sau
necroză. Nu existau semne de afectare neurologică.
Examenul sângelui a demonstrat leucocitoză (11.780/mm3) cu neotrofilie (73%) şi
creşterea valorii reactanţilor de fază acută (VSH, fibrinogen, proteina C reactivă). Radiografia
cardio-toraco-pulmonară a fost normală. S-a practicat puncţie pentru recoltarea LCR (aspect
macroscopic normal, fără leucocite, celule sau microorganisme).
S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi sânge pentru diagnostic serologic, apoi s-a
administrat o combinaţie de medicamente antimicrobiene, respectiv ceftriaxonă plus
gentamicină. Culturile au fost negative (cum era şi de aşteptat, copilul primind antibiotice
înainte de prezentarea la spital).
Evoluţia sub tratament a fost favorabilă, starea generală s-a îmbunătăţit, iar la 3 zile din
momentul internării copilul a devenit afebril. Examenul serologic a demonstrat că fusese
vorba de infecţie cu Francisella tularensis. Tratamentul a continuat 3 săptămâni.
Discuţii
Francisella tularensis a fost detectată la aproximativ 100 de specii de animale, însă cel
mai frecvent este transmisă la om prin înţepătura artropodelor hematofage infectate şi prin
contact direct cu diferite specii de rozătoare (ex. după jupuirea iepurilor). Omul se mai poate
infecta prin muşcături de animale, aerosoli, apă contaminată şi carne neprelucrată termic (de
la animalele infectate).
Popândăii din America de Nord pot fi purtători atât de Francisella tularensis cât şi de
Yersinia pestis, aşadar, în nici un caz nu este recomandată „folosirea” lor ca şi animale de
companie.