3.2 Molekulinių žymenų 3.2 Molekulinių žymenų sistemossistemos

3.2.1 Įvadas (D. Danusevičius).

3.2.2 DNR pagrįsti žymenys: restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (RFLP) (D. Danusevičius).

3.2.3 Polimerine grandinine reakcija (PCR) pagrįsti žymenys (D. Danusevičius):

• Polimerinė grandininė reakcija (PCR),

• Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (RAPD),

• Pagausintų (amplifikuotų) fragmentų ilgio polimorfizmas (AFLP),

• Specifinių sekų atkarpos (STS),

• Naujos sistemos (išreikštų sekų žymenys (EST), DNR mikro gardelės, pavienių nukleotidų polimorfizmas (SNP)).3.2.4 Žymenų sistemų palyginimas (A. Pliūra).

3.2.1 Įvadas 3.2.1 Įvadas ApibrėžimaiApibrėžimai

•Genetinis žymuo yra išmatuojamas požymis, kurio pagalba galima nustatyti DNR sekų ar baltymų skirtumus. •Morfologiniai požymiai.

•Baltyminiai (biochemical) žymenys.

•DNA (molekuliniai) žymenys.

•Principas: molekulinio žymens seka yra tam tikro geno atkarpoje ar netoli nuo jos, vienoje genų sukibimo grupėje.

QTL geno vieta chromosomoje

Žymuo, susijęs su QTL

QTL geno vieta chromosomoje

Žymuo, susijęs su QTL

•Molekulinis žymuo yra specifinė lengvai identifikuojama DNR nukleotidų seka, susijusi su tam tikrus požymius sąlygojančiais genais.

Stipriai paveldimas požymis (pvz. sezoninio augimo pradžia) taip pat gali būti genetinis žymuo: ankstyvą augimą sąlygojančius genus turinti genotipas aiškiai išsiskiria iš aplinkinių.

Neutralūs ir išreikšti žymenysNeutralūs ir išreikšti žymenys

Žymenų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo

Siekiant įvertinti genetinę įvairovę ar genetinius skirtumus, neutralūs žymenys tinkamiausi

Ieškant genų ir požymių sąsajos, išreikštus genus identifikuojantys žymenys yra pranašesni (atsitiktinė paieška neefektyvi)

Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR, dauguma tradicinių žymenų sistemų žymi nekoduojama sekas, kurios nepriklausomos nuo atrankos (žymenys neutralūs atrankai)

Genominė DNR (visų chromosomų DNR laisvoje formoje): dalys kur yra aktyvūs genai sudaro tik 15 proc.

Žymenų tikslumasŽymenų tikslumasDominantiniai žymenys: negali atskirti vieno geno alternatyvių formų (alelių). Gali tik identifikuoti ar genas (vienas iš alelių) yra, pvz. RAPD

Q1Q1= homozigotinis

ankstyvas

Q1Q2= heterozigotinis tarpinis

Q2Q2= homozigotinis

vėlyvas

1 2 3

M

RAPD analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje

žymuo

Žymuo M gali identifikuoti ankstyvos augimo pradžios alelį Q1 (bet ne jo alternatyvią formą- vėlyvos augimo pradžios alelį Q2)

Kodominantiniai žymenys: gali identifikuoti alternatyvias vieno geno formas (alelius)

Q1Q1= homozigotinis

ankstyvas

Q1Q2= heterozigotinis tarpinis

Q2Q2= homozigotinis

vėlyvas

1 2 3

N

RFLP analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje

Žymuo

Žymuo N gali identifikuoti abu ankstyvos Q1 ir vėlyvos augimo pradžios alelį Q2. Todėl gali atskirti heterozigotinius genotipus= tikslesni, bet sudėtingesni.

GT

AT

AT

GA

GT

GG

TT

AG

GT

GA

GT

GG

Q1 Q2

GT

AT

AT

GA

GT

GG

TT

AG

GT

GA

GT

GG

Q1 Q2

Q1 ir Q2 aleliai porinėse

chromosomose gali skirtis tik keliais

nukleotidais

Svarbiausi aspektai įsisavinant molekulinių žymenų metodikas

•Restriktazių DNR sukarpymo principai.

•Polimerinės grandinės reakcijos (PCR) ir elektroforezės principai.

•Išreikštų genų kodo nustatymo esmę (iRNR-cDNR) ir mokėti naudotis DNR sekų duomenų bazėmis.

•Žymenų sistemos iš esmės yra šių metodo deriniai (restriktazių tikslumas su PCR efektyvumu) ir PCR žymenų pasirinkimo ar identifikacijos alternatyvos.

•Žymenų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tikslo: genetinės įvairovės tyrimai (viena ašies dalis) ar QTL paieška (kita ašies dalis).

3.2.2 DNR pagrįsti žymenys: 3.2.2 DNR pagrįsti žymenys: restrikcinių fragmentų ilgio restrikcinių fragmentų ilgio

polimorfizmas (RFLP)polimorfizmas (RFLP)RFLP tai DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal restriktazėmis sukarpytų ir specialių markerių pažymėtų DNR fragmentų dydį.

Restriktazės tai specialūs enzimai kurie kerpa DNR grandinę specifinėse vietose, veikiant elektros laukui įvairaus dydžio DNR fragmentai juda nevienodai, sudarydami specifinius DNR fragmentų profilius.

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

E c o R i

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

E c o R i

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

E c o R i

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

3 ’5 ’G A A T T C

3 ’5 ’ 3 ’5 ’G A A T T C

C T T A A G 3 ’ 5 ’

C T T A A G 3 ’ 5 ’

Restriktazė

DNR Sukarpytų DNR fragmentų klasterių (bangų) profilis: genetinių skirtumų tarp individų atskleidimas.

Ang. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

RFLP etapų apžvalgaRFLP etapų apžvalga

DNR sukarpymas į fragmentus. Išskiriama DNR ir sukarpoma į įvairaus dydžio fragmentus restriktazių pagalba.

DNR sukarpymas į fragmentus. Išskiriama DNR ir sukarpoma į įvairaus dydžio fragmentus restriktazių pagalba.

DNR+ restriktazė

DNR fragmentai

Elektroforezė. Veikiant elektrai DNR fragmentai juda skirtingu greičiu=

DNR fragmentų atskyrimas

Elektroforezė. Veikiant elektrai DNR fragmentai juda skirtingu greičiu=

DNR fragmentų atskyrimas

1 2 DNR perkėlimas. Veikiant kapiliarinėms jėgoms šarminis tirpalas kyla

aukštyn: DNR fragmentai išsivynioja ir patenka iš gelio į spec. membraną

DNR perkėlimas. Veikiant kapiliarinėms jėgoms šarminis tirpalas kyla

aukštyn: DNR fragmentai išsivynioja ir patenka iš gelio į spec. membraną

3

Hibridizacija. Membrana su DNR panardinama skystyje su radioaktyviais

DNR markeriais, kurie prisijungia tik prie tam tikrų DNR fragmentų.

Hibridizacija. Membrana su DNR panardinama skystyje su radioaktyviais

DNR markeriais, kurie prisijungia tik prie tam tikrų DNR fragmentų.

4 Perkėlimas į fotopopierių. Fotopopierius uždedamas ant membranos su DNR. Radioaktyvūs žymenis palieka DNR

fragmentų grupių žymes.

Perkėlimas į fotopopierių. Fotopopierius uždedamas ant membranos su DNR. Radioaktyvūs žymenis palieka DNR

fragmentų grupių žymes.

5

Nuplauti neapisijungusius žymenis

Foto popierius

Membrana su DNR fragmentais

DNR markeriai maišelyje

Spec. membrana

Servetėlės traukai

Gelis

Kempinė

Šarminis

tirpalas

DNR izoliavimasDNR izoliavimas1. Augalo audiniai užšaldomi skystu azotu ir sutrinami, taip suardant ląstelių sieneles.

2. Sutrinti audiniai ištirpinami druskingame tirpale ir centrifuguojami: tirpalas sluoksniuojasi ir DNR, RNR ir kitos sunkesnės molekulės nusėda mėgintuvėlio dugne.

3. Įpylus organinio tirpiklio (pvz. fenolis), ištirpsta prie DNR ir RNR prisijungę baltymai; įpylus vandens su pamaišius, tirpalas sluoksniuojasi: tirpiklis su baltymais nusėda, palikdamas DNR ir RNR molekules viršutiniame sluoksnyje.

4. Paveikus tirpalą ribonukleazės enzimu degraduodama RNR, o įpylus alkoholio, DNR molekulės koncentruojasi taip yra išsiskirdamos iš tirpalo.

5. DNR izoliuojama ir laikoma pastovaus PH tirpale

DNR

DNR sukarpymas: restriktazėsDNR sukarpymas: restriktazės

Restriktazės tai baltymai, kurie sukarpo DNR molekulę specifinių DNR nukleotidų sekų radimosi vietose.

a) b)

C T T A A G C T T A A G

EcoRi

EcoRiEcoRi

EcoRiEcoRi

G A A T T C

Atpažįstama seka

A A T T C

C T T A A

GEcoRiEcoRi

G

A A T T C

C T T A A

GEcoRiEcoRi

G

Priklausomai nuo restriktazės lieka (a) aktyvūs (galintys jungtis) ar (b) neaktyvius DNR fragmentų galai.

Restriktazės EcoRI veikimo principas

a) atpažįstama kirpimo vieta

b) kirpimas

c) rezultatas: daug įvairaus dydžio fragmentų

DNR patalpinama į specialią terpę ir sukarpoma į fragmentus restriktazių pagalba.

Restriktazių tipaiRestriktazių tipai

Restriktazė

Motininė bakterija Atpažįstama seka Kirpimas

EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G AATTC---3‘ 3'---CTTAA G---5'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'

HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'

MstII Microcoleus rūšys 5'CCTNAGG 3'GGANTCC

TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'

NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG

HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC 3'CTNAG

AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT 3'TCGA 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'

Ne sekoje

Ne sekoje

Ne sekoje

ElektroforezėElektroforezė

Elektroforezės dėžutė

Elektroforezė tai metodas skirtas DNR fragmentų (molekulių) atskyrimui pagal dydį.

Principas: veikiant elektros srovei, neigiamą krūvį turinčių DNR fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų dydžio

Elektros šaltinisGelis perdedamas analizei

DNR fragmentų judėjimo kryptis

Fragmentų dydžio matavimo skalė

DNR pavydžių takeliai

Dėžutė pripildyta agarozės ar akrilamino gelio

Elektroforezės animacija

DNR perkėlimas į membranąDNR perkėlimas į membranąTikslas perkelti DNR fragmentus iš elektroforezės gelio į membraną tolesnei hibridizacijai su radioaktyviais žymenims.

Gelis panardinamas aukštos Ph terpėje, DNR išsivynioja į vienos grandinės molekules, ant gelio uždedama tinklinė membrana ir servetėlių sluoksnis, kuris traukia terpę aukštyn per gelį į membraną, kurioje DNR fragmentai įstringa.

Gelis

Servetėlių sluoksnis

Membrana

Šarminis tirpalas

Kempinė

Membranos dalis su įstrigusiais DNR fragmentais

DNR hibridizacijos procedūra (1)DNR hibridizacijos procedūra (1)Tikslas- prie sukarpytų DNR fragmentų prijungti specialiai pagamintus radioaktyvius DNR žymenis.

Radioaktyvūs žymenys (ang. probe) jungsis tik prie tų DNR fragmentų, kurie turės jiems tinkančias DNR nukleotidų sekas.

Radioaktyvus DNR žymuo tai trumpa vienos grandinės DNR molekulė (pvz. tam tikro geno dalies kopija).

Žymuo prisijungė prie DNR fragmento

C T T G A A G

Žymuo

G A A C T T C

DNR fragmentasC T A G A A G

ŽymuoG A A C T T C

DNR fragmentas

Žymuo NEprisijungė prie DNR fragmento

DNR hibridizacijos procedūra (2)DNR hibridizacijos procedūra (2)

Membrana su DNR fragmentais įdedama į maišelį su radioaktyviais DNR žymenimis

Žymenys jungiasi prie jiems tinkančių DNR fragmentų

Neprisijungę fragmentai nuplaunami

Ant membranos padedamas rentgeno filmas ir nuotraukoje matomi tik tie fragmentai, prie kurių prisiginė žymenys

Gelis be DNR fragmentų

Membrana su DNR fragmentais nuimama

DNR žymenų hibridizacija su DNR fragmentais

DNR žymenys

Maišelis

Rentgeno nuotrauka: matosi DNR žymenys, kurie prisijungė prie jiems tinkančių fragmentų

Fragmentų dydžio

skalė

Prisijungę DNR žymenys

Hibridizacijos efektasHibridizacijos efektas

RFLP gelis tuoj po elektroforezės: sukarpyti fragmentai sudaro tęstinius brūkšnius.

Po hibridizacijos matyti tik radioaktyviu žymeniu pažymėti DNR fragmentai

DNR hibridizacija: markerių DNR hibridizacija: markerių parinkimasparinkimas

•Reikalinga informacija apie tikslinius požymius sąlygojančių ar su jais susėjusių genų nukleotidų sekas (genties ar rūšies lygmenyje).

•Genominės bibliotekos (bendra DNR, turinti ir aktyvias ir neaktyvias DNR sekas)

•Išreikštos DNR (cDNR) bibliotekos (iRNR- klonavimas – cDNR). Tik išreikšti genai, izoliuoti specifiniuose audiniuose (EST žymenys)

Ilgis- nuo 10-60 (minisatelitai) iki kelių tūkstančių bp (cDNR)

Išreikšta iRNA

cDNA

DNRmicrogardelės: hibridizacija su žinomų genų

dalimis

Žinomų genų dalių DNR gardelė

Pagal Benfey P. 2004. Essentials of genomics. Prentice Hall, 400 p.

Kukurūzo RFLP markerių Kukurūzo RFLP markerių duomenų bazė interneteduomenų bazė internete

RFLP rezultatų interpretacija (1)RFLP rezultatų interpretacija (1)

•Jeigu atstumai tarp tam tikros restriktazės atpažinimo vietų DNR molekulėse yra skirtingi tarp dviejų lyginamų genotipų, tai restriktazės sukarpytų fragmentų ilgis bus skirtingas.

•Todėl sukarpytų fragmentų ilgio profiliai gali būti panaudojami skirtumams tarp genotipų nustatyti.

Genotipas A Genotipas BRestriktazių

atpažįstamos vietos

Po sukarpymo

A B

Genotipas A: mutacija DNR žymens atpažinimo atkarpoje atitiko restriktazės atpažinimo seką ir

restriktazė sukarpė DNR į 2 dalis.

Elektroforezės gelyje

a)

b)

c)

Genotipas B. DNR žymens atpažinimo atkarpoje restriktazė DNR segmento nekirpo= vienas didesnis fragmentas.

RFLP rezultatų interpretacija (2) RFLP rezultatų interpretacija (2)

Genotipe A mutacija sudarė naują restriktazės atpažinimo vietą DNR markerio atpažinimo regione= Genotipas A turės 2 fragmentus. Genotipas B tik vieną.

RFLP rezultatų interpretacija (3)RFLP rezultatų interpretacija (3)

Genotipe A mutacija sudarė naują restriktazės atpažinimo vietą už DNR markerio atpažinimo regiono ribų = Genotipas A turės mažesnį fragmentą, kuris gelyje judės greičiau.

A

B

Viena-grandinė DNR

Restriktazės kirpimas

Žymuo

Naujas kirpimas

A B

Elektroforezės gelyje

Fragmentai po kirpimo ir hibridizacijos

RFLP rezultatų interpretacija (4)RFLP rezultatų interpretacija (4)

Genotipe A mutacija įterpė naują DNR atkarpą = genotipas A turės atitinkamai ilgesnį fragmentą, kuris gelyje judės lėčiau

Viena-grandinė DNR

A

B

Restriktazės kirpimas

Žymuo

Nauja atkarpa

A B

Elektroforezės gelyje

RFLP privalumaiRFLP privalumai• Gali atskirti homozigotinius (AA) nuo heterozigotinių (Aa) individų

(kodominantinis žymuo).

• Stabilumas: tie patys rezultatai pakartojus analizes su genetiškai identiškais individais, augančiais skirtingose aplinkose ar pakartojus analizes po tam tikro laiko tarpo.

• Detalumas: gebėjimas nustatyti kelių nukleotidų sekų skirtumus.

• Paprastumas (išskyrus DNR žymenų parinkimą hibridizacijai).

RFLP trūkumaiRFLP trūkumai• Daug darbo reikalaujantys ir laboratoriniai metodai (aukštesni

kaštai).

• 3. Reikalauja geros DNR izoliavimo kokybės ir santykinai didesnio kiekio.

• 4. Darbas su radioaktyviomis medžiagomis.

• Sudėtinga parinkti tinkamas DNR žymenų ir restriktazių kombinacijas (riekia išankstinių žinių ar DNR bibliotekų).

• Pvz., jeigu žymuo per trumpas, gauna per daug skirtingų DNR fragmentų.

RFLP tyrimų pavyzdys: p. pušisRFLP tyrimų pavyzdys: p. pušis• P. pušies re-emigracijos dėsningumai po paskutinio ledynmečio Europoje

(Mol. Ecol. 1999. 8: 8-888)

• Tikslas: nustatyti geografinius mitochondrinės DNR (mtDNR- iš motinos) haplotipų išsidėstymo dėsningumus tarp Europos p. pušies populiacijų

• Metodai: 20 populiacijų iš Škotijos, 18 iš kontinentinės Europos (20 medžių iš populiacijos (medyno)). RFLP žymenų sistema.

•Gauti 3 pagrindiniai mtDNR haplotipai A, B, D:

•Ispanijos populiacijose buvo rasti visų trijų haplotipų atstovai= didelė genetinė įvairovė, pagrinde tarp populiacijų; D buvo rastas tik vienoje pietinėje populiacijoje

•Prancūzijos, Vokietijos, Lenkijos, Rusijos ir p. Švedijos – haplotipas A.

•Šiaurės Skandinavija – haplotipas B.

•Škotija – pagrinde A, bet polimorfinėse populiacijose rastas ir B.

Rezultatai

IšvadosIšvados•Europis p. pušies populiacijų mtDNR genomai skirtingi ir atspindi iš motinos pavedimus poledynmečio vykusios emigracijos dėsningumus.

•Aukšta Ispanijos populiacijų įvairovė: tai palikuonys pietinės arealo dalies populiacijų “pabėgusių” nuo ledyno ir natūraliai augusių prieš ledynmetį.

•Po ledynmečio, p. pušies pasklidimas vyko iš 3-jų pagrindinių adaptacinių aplinkų: Ispanija, centrinė Europa ir šiaurinė Skandinavija.

•mtDNR tyrimai gali atskleisti rūšių vystymosi dėsningumus bei ekologinių populiacijų grupių ribas.

RFLP pagrindinė literatūra Botstein, D., R.L. White, M. Skolnick and R.W. Davis. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Human Genet. 32:314-331.

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin and W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman and Co., NY.

Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 314:67-73.

Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316:76-79.

Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E.Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin and R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat(VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622.

Rogstad, S.H., J.C. Patton, II and B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9176-9178.

Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov and S.A. Limborska. 1988.M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392.

Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.

3.2.3 Polimerine grandinine 3.2.3 Polimerine grandinine reakcija (reakcija (PCRPCR)) pagrįsti žymenyspagrįsti žymenys

• Polimerinė grandininė reakcija (PCR).

• RAPD: atsitiktinai pagausintinos DNR polimorfizmas (Randomly Amplified Polymorphic DNR).

• AFLP: amplifikuotų (pagausintų) fragmentų ilgio polimorfizmas (Amplified Fragment Length Polymorphism).

• Specifinių sekų atkarpos (STS): (Mikrosatelitai (SSR), SCAR, CAPS, ISSR).

• Naujos sistemos: Išreikštų sekų žymenys (EST),

DNR mikrosekos,

Pavienių nukleotidų polimorfizmas (SNP).

Polimerinė grandininė reakcija Polimerinė grandininė reakcija (PCR)(PCR)

•Polimerinė grandinė reakcija (PCR) tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų pagausinimo (kopijavimo) metodas, galintis per keliolika minučių pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR.

•Nereikalauja radioaktyvių ar nuodingų chemikalų.

•Tereikia paruošti izoliuoti DNR ir paruošti reakcijos tirpalą su pradais, enzimais ir nukleotidais, bei įvertinti rezultatu elektroforezėje. PCR ang. Polymerise chain

reaction

Ciklas kartojamas

Naujos DNR sintezė t 72C

Pradai prisijungia t ~50C

DNR išvyniojimas t>90 C

PCR principas ir ciklo dalysPCR principas ir ciklo dalys

PCR ciklas susideda iš 3 etapų:

1. DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandinė išsivynioja ir tampa prieinama jungčiai su vienos DNR grandinės specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis.

2. Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradai prisijungia prie bandomos DNR molekulės atkarpose, kurių sekos sutampa su prado sekomis.

3. DNR sintezė: pakėlus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR grandinė DNR polimerazės enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas.

Ciklas kartojamas kelis kartus; kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR fragmentų.

MedžiagosMedžiagos

Tag polimerazė (DNR sintezės enzimas)

Mineralinis aliejus izoliuoja tirpalą

Reakcijos tirpalas

Medžiagos supilamos į mėgintuvėlį

Nukleotidai Pradas

Tiriama DNR

RCR įranga: DNR gausintuvas RCR įranga: DNR gausintuvas

Mėgintuvėlis dedamas į DNR gausintuvą (amplifikatorių) - ciklinio temperatūros keitimo įrenginį, galinti greitai padidinti ar sumažinti tirpalo temperatūrą iki tikslių verčių.

DNR polimerazė

Nukleotidai

Pradas

Tiriama DNR

Garsintuvų nuotraukos

PCR metodai: ciklas 1PCR metodai: ciklas 1

3) T didinama iki 72C: polimerazė prisijungia ir sintetina naujas DNR grandines

1. T didinama iki 95 C: DNR grandinės išsivynioja

2) T mažinama iki 54 C: pradmenys prilimpa

Pirmo ciklo rezultatas 2 fragmento kopijos

DNR polimeraz

ė

Nukleotidai

Pradmuo

Tiriama DNR

PCR metodai: ciklas 2PCR metodai: ciklas 2

Sekančio ciklo “kaitinimas atšaldymas šildymas”metu procesas kartojamas ir vietoje 2 pagamintos 4 DNR fragmento kopijos

PCR metodai: tolesni ciklaiPCR metodai: tolesni ciklai

Taip kartojant ciklus per kelias valandas galima pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų kopijų.

1 ciklas

2 ciklas

3 ciklas

4 ciklas

5 ciklas

Elektro-forezė

Rezultatų vizualizacija: elektroforezėRezultatų vizualizacija: elektroforezė

PCR amplifikuoti DNR fragmentai atskiriami elektroforezės pagalba.

Principas: veikiant elektros srovei, neigiamą krūvį turinčių DNR fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų dydžio

PCR elektroforezės privalumas: DNR fragmentų gausumas pakankamas, kad pamatyti jų junginius su etidium bromidu (nereikia

pavojingesnių radioaktyvių ar brangių dažymo metodų )

DNR fragmentai

Gelis

Elektroforezė iš viršaus

Elektroforezės rezultatas

Elektroforezės aparatas

Svarbiausi PCR aspektaiSvarbiausi PCR aspektai

• Pradmenys: trumpos DNR atkarpos (10-30 bp), naudojamos kaip naujų DNR grandinių sintezės pradai.

• Pradmuo prijungia prie specifinės DNR vietos.

• Pradmenų prisijungimas: po to kai pakėlus temperatūrą DNR grandinės išsiskiria, temperatūra lėtai mažinama, kad pradmenys galėtų prisijungti

• Reikalingas karščiui atsparus DNR polimerazės enzimas.

• Paprastai pagausinami 150-3000 bp ilgio DNR fragmentai.

•Svarbu, kad DNR pilnai išsivyniotų pakėlus temperatūrą.

•Optimali pradmenų prisijungimo temperatūra ir optimali DNR sintezės temperatūra.

•Ciklų skaičius (optimalus fragmentų skaičius).

•Ilgesnis paskutinis DNR sintezės etapas, kad susintetinti pilnai “uždarus” fragmentus.

•Pradmenys vieni iš svarbiausių aspektų sėkmingai amplifikacijai: pagausinti tik polimorfines DNR dalis.

•Pradmens ilgis: trumpas- pagausins daug fragmentų, ilgas- mažai (optimalus dydis 10 - 30 bp).

•Pusiausvyra tarp G-C ir A-T nukleotidų.

•Dviejų pradų sekos nebūtų komplimentarios viena kitai.

PCR įranga ir medžiagosPCR įranga ir medžiagosĮranga:

•Mikro-pipetės.

•DNR gausintuvas (tikslus, ciklinis temperatūros keitimas).

•Elektroforezės įranga.

•Fotokamera.

Medžiagos: pradai, nukleotidai, reakcijas skatinantis tirpalas, DNR polimerazės enzimas (pvz. Tag), tiriama DNR.

DNR gausintuvas (tikslus temperatūros keitimas)

Elektroforezės įranga (DNR fragmentų atskyrimas)

Atsitiktinai pagausinta Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (RAPD)polimorfinė DNR (RAPD)

•Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (ang. Randomly amplified polymorhic DNA (RAPD)) tai polimerinės grandininės reakcijos būdu pagausinti DNR fragmentai, naudojant 10 bp dydžio atsitiktinės sekos pradmenį (naudojamas vienas pradmuo - vienos grandinės trumpa DNR atkarpa).

•Parastai amplifikuotų fragmentų dydis 500-5000 pb (vidutinio dydžio genomuose pagausinama 5-10 skirtingo dydžio DNR fragmentų).

•Pagausinti fragmentai sudaro pakankamai DNR, kas leidžia juos atskirti agarozės gelio elektroforezės būdu, pažymint pradus etidžio bromidu, kuris šviečia UV šviesoje.

RAPD metodas RAPD metodas RAPD pradmuo tai 10 bp DNR atkarpa (nukleotidai pasirenkami atsitiktinai, panašūs principai kaip PCR pradų). Pradmuo atsitiktinai pagausina DNR molekulės atkarpas (vietas tarp pradmens sekų ir atvirkštinių pradmens sekų)

ATCAGTT

(5’→3’) (3’←5’)

ATCAGTT

5’ 3’Vieta tinkanti

pradmeniui 5’→3’ DNR grandinėje

TAGTCAA

3’

5’

AACTGAT

Vieta tinkanti pradmeniui 3’←5’ DNR

grandinėje

Dvi vieno prado

kopijos

5’ 3’

TAGTCAA

3’

5’

AACTGAT

ATCAGTT ATCAGTT

2. RCR reakcija: DNR išsivynioja prado kopijos jungiasi ir sintetina naujus DNR fragmentus

1. Dviguba DNR grandinė ir 2 vieno prado kopijos (viena parodyta apversta jungimuisi su priešinga DNR grandine

ATCAGTT

ATCAGTT

ATCAGTT

ATCAGTT

ATCAGTT

ATCAGTT3. Po keliolikos PCR ciklų bus pagausinta eilė DNR fragmentų tarp prado prisijungimo vietų

RAPD rezultatų RAPD rezultatų interpretacijainterpretacijaLyginant genotipus, RAPD parodo skirtumus tarp

pradmenų prisijungimo vietų pasikartojimo atstumų (t.y. specifinių DNR sekų buvimo vietų skaičiaus).

Pradmuo jungsis DNR vietose kur nukleotidų sekos atitiks prado sekas. Jei A ir B genotipai yra skirtingi, jų nukleotidų sekos taip pat yra skirtingos ir intervalai tarp pradui tinkančių sekų pasikartojimo bus skirtingi, todėl bus pagausint) skirtingo ilgio fragmentai

Tiriama DNR

Gen

otip

as A

Pradų jungimuisi tinkančių sekų vietos

Pagausinti fragmentai

Gen

otip

as B

Pradų jungimuisi tinkančių sekų vietos

Pagausinti fragmentai

Elektroforezės gelyje

A B

ATCAGTT

(5’→3’)

Pradas priešingoms sintetinimo kryptimis

(3’←5’)

ATCAGTT

RAPD dominantinis žymuo, nes parodys tik geno/sekos buvimą

ar nebuvimą (pradas jungsis arba ne)

RAPD privalumai:RAPD privalumai:•Nereikia iš anksto žinoti prado sekų (galima įsigyti pradus iš komercinių įmonių).

•Pakanka palyginti nedidelio DNR kiekio (5-20 mg).

•Darbo ir kaštų požiūriu efektyvi polimorfizmo paieška.

•Nereikia darbo su radioaktyviomis medžiagomis.

•Paprastesnis ir pigesnis nei RFLP.

RAPD trūkumai:RAPD trūkumai:•Negalima atskirti homozigotinių ir heterozigotinių genotipų (dominantinis žymuo).

•Jautrumas aplinkos sąlygoms ir prastas pakartojamumas (dėl jautrumo DNR kokybei, PCR sąlygoms- gaunami skirtingi fragmentai).

•Vienodo ilgio DNR fragmentai, gali būti skirtingos nukleotidų sudėties (komigracija).

RAPD rezultatų RAPD rezultatų panaudojimaspanaudojimas

•Atsitiktinai pagausinta PCR (AP-PCR (arbitrary primed PCR))- naudojami ilgesni pradai, gaunam mažiau fragmentų.

•DAF (ang. DNA amplification fingerprinting)- naudoja trumpesnius 5-8 bp dydžio pradus, kad gauti didesnį fragmentų skaičių gelyje.

•SCAR: neaiškų, susiliejusių (įtariamų polimorfinėmis) DNR fragmentų grupių (bangų gelyje) po PCR analizės tikslesnis palyginimas (naudojami du skritingi DNR fragmentą identifikuojantys pradai).

•CAPS nepolimorfinių bangų gelyje tikslesni tyrimai: fragmentų pagausinimas su specialiai s pradais ir jų sukarpymas restriktazėmis.

RAPD panaudojimas tyrimuoseRAPD panaudojimas tyrimuose

•QTL tyrimuose genotipų ir fenotipų ryšiams nustatyti ir žymenų genolapiams sudaryti.

•Genetinės įvairovės tyrimai.

•Populiacijų ar variatetų identifikacijai.

•Hibridizacijos sėkmingumui nustatyti.

•RAPD tai efektyvus ir paprastas metodas pirminiam polimorfizmo ar genotipų-fenotipo ryšių įvertinimui.

PCR pPCR pagrindinė literatūraagrindinė literatūra•Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam and P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4):294-307.

•Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam and P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:553-557.

•Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam and P.M. Gresshoff. 1992. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10(9):937.

•Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin and W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman and Co., NY.

•Lowe, A.J., O. Hanotte and L. Guarino. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107:50-54.

•Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd and H.J. Newbury. 1992. The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):274-276.

•Welsh, J. and M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):7213-7218.

•Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18(22):6531-6535.

Amplifikuotų fragmentų ilgio Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (AFLP)polimorfizmas (AFLP)

Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (ang. Amplified Fragment Length Polymorphizm (AFLP)) tai DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal specialiais enzimais sukarpytų, specialių žymenų atrinktų ir polimerinės grandinės reakcijos (PCR) pagausintų DNR fragmentų dydį. RestriktazėBandoma DNR

Adapteris

Adapteris

Pradas

Pradas

Pradas

Pradas

AFLP tai restriktazių karpymo tikslumo ir PCR efektyvumo derinys.

Dominantinė sistema, nes polimorfizmas nustatomas pagal tam tikrų sekų buvimą arba nebuvimą (PCR pradai jungiasi arba ne).

Tiksli technologija, kleidžianti nustatyti skirtumus tarp individualių genotipų.

Galima analizuoti tiek bendrą genominę DNR (tDNR) tiek komplimentarią DNR (cDNR)

AFLP metodas (AFLP metodas (11))AFLP sudaro 4 pagrindiniai etapai:

1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazėmis (dažnai ir retai kerpanti; fragmentų dydis ~80-500 bp),

2. Vienos DNR grandinės adapterių prijungimas (“lipnių” fragmentų galų neutralizavimas),

3. Tam tikrų DNR fragmentų atranka ir pagausinimas dviejų pakopų PCR ciklų ir specialių pradų pagalba (pradų gamyba- restriktazės seka + 1 ir +2 ar 5 nukleotidai),

4. DNR polimorfizmas nustatomas elektroforezės pagalba (poliakrilamino gelis, sidabro nitratas + UV šviesa ar radioizotopai, švytintys markeriai) (paprastai gaunama 50-100 skirtingo dydžio fragmentų)

AFLP metodas (2)AFLP metodas (2)

DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazėmis,

Adapterių prijungimas (“lipnių” fragmentų galų neutralizavimas),

Pirmas PCR ciklas: pradas= restriktazės atpažįstama seka + 1 naujas nukleotidas; PCR pagausinimas tik tam tikrų fragmentų, turinčių naują nukleotidą po restriktazės sekos.

Antras PCR ciklas: specialių pradų gamyba- restriktazės seka + 1 + 2 nukleotidai; PCR amplifikacija (tam tikrų fragmentų atranka)

RestriktazėBandoma DNR

Adapteris

Adapteris

Pradas

Pradas

Pradas

Pradas

Adapterių prijungimo ir PGR pradų gamybos ir DNR pagausino principai

DNR sukarpymas 2 skirtingų restriktazių pagalba

DNR fragmentų “lipnių”galų jungimosi neutralizavimas prijungiant adapterius

Pirmas PCR ciklas: 2 pradai (po vieną kiekvienos – restriktazės restriktazės sekoms); prado sekos- restriktazės atpažįstamos sekos + 1 naujas nukleotidas. Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai

Antras PCR ciklas: 2 pradai; prado sekos- restriktazės atpažįstamos sekos + 1 +2 nauji nukleotidai. Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai

Elektroforezės gelyje bus matomi 2 atrankos ciklus praėję DNR fragmentai.

DNR sukarpymas 2 skirtingų restriktazių pagalba

Elektroforezės gelyje bus matomi 2 atrankos ciklus praėję DNR fragmentai.

AFLP metodas (3)AFLP metodas (3)4 pagrindinių etapų apžvalga (lyginami 2 genotipai).

Dažnai kerpanti restriktazė (pvz. EcoRI) = PCR pagausins daug fragmentų

DNR

Restriktazė

Sukarpyti ir PCR paruošti fragmentai

Retai kerpanti restriktazė (pvz. Msel) = PCR pagausins mažai fragmentų

Retai ir dažnai kerpančios restriktazės naudojamos kartu = PCR pagausins optimalų skaičių fragmentų

AFLP metodas (AFLP metodas (44) ) Restriktazių parinkimas. Parenkamos 2 restriktazės: viena dažnai kerpanti (pvz. Msel, atpažįstamos 4 nukleotidų ilgio sekos, gaunami ~250-300 pb dydžio fragmentai) ir retai kerpanti (pvz. EcoRI atpažįstamos 6 nukleotidų sekos). Dažnai ir retai kerpančių restriktazių derinys padeda gauti optimalų DNR fragmentų skaičių

AFLP metodas (AFLP metodas (55))

AFLP gelis, kur PCR pagausinti DNR fragmentai buvo pažymėti sidabro nitratu, švytinčiu UV šviesoje ir gelis buvo nufotografuotas tolesnei DNR bangų išsidėstymo analizei.

Rezultatų interpretacijaRezultatų interpretacija

•AFLP nustato DNR skirtumus (skirtingų nukleotidų buvimą) restriktazių jungimosi vietose ar netoli nuo jų.

•Viena PCR pradų pora produkuoja daug DNR fragmentų, iš kurių 10-20 parastai būna polimorfiniai (gali būti naudojamos kelios restriktazių –PCR pradų kombinacijos, kas padidintų polimorfizmo aptikimo tikimybę).

•Kuo stipresnė pradų atrenkamoji geba (1+2; 1+3 ar 1+4 nukleotidai) tuo mažiau fragmentų bus atrenkama.

•Paprastai fragmentai gelyje vertinami kaip dominantiniai žymenys (0-yra, 1 nėra), tačiau alternatyvinės alelio formos gali būti identifikuojamos kaip nedideli įtarpai ar ištrynimai restriktazės jungimosi sekoje (reikalinga aukšta gelio rezoliucija).

AFLP privalumai ir trūkumaiAFLP privalumai ir trūkumaiPrivalumai:

•Gebėjimas atskleisti polimorfizmą (generuoja daug fragmentų) ir geras rezultatų pakartojamumas (ne taip jautrūs reakcijos sąlygoms kaip RAPD).

•Nereikia iš anksto žinoti pradų sekų.

•Ypač naudinga norint greitai sukurti genolapius ir nustatyti tikslius cDNR polimorfizmus.

•Trūkumai:

•Generuoja daug fragmentų, kurių analizei gali reikėti kompiuterizuotos sistemos.

•Pagrinde dominantiniai žymenys.

•Gonolapiuose AFLP dažnai randasi netoli telomerų (chromosomų galų) ar cetromerų (vidurio).

•Aukštos darbo sąnaudos ir sudėtinga techninė įranga.

AFLP panaudojimasAFLP panaudojimas

•Genetinės įvairovės tyrimai.

•cDNR polimorfizmas.

•QTL žymenų paieškos tyrimai (genotipo-fenotipų ryšiai ir genolapiai).

•Populiacijų skirtumai.

•Genotipų (“pirštų antspaudų”) identifikacija.

AFLP pagrindinė literatūraAFLP pagrindinė literatūra

•Brown, S.M. and S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. Pp. 85-93 in Genome Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company and Academic Press, Austin, TX.

•KeyGene, N.V. 2001. Empowering genomics. http://www.keygene.com (30 June 2002)

•Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper and M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNAfingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414.

•Zabeau, M. and P. Vos. 1993. Selective restriction amplification: a general method forDNA fingerprinting. European Patent Publication 92402629 (Publication No. EP0534858A1).

•Zhao, S., S.E. Mitchell, J. Meng, S. Kresovich, M.P. Doyle, R.E. Dean, A.M. Casa and

•J.W. Weller. 2000. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semi-automated fluorescent AFLP analysis. Microbes Infect. 2:107-113.

Specifinių sekų atkarpos Specifinių sekų atkarpos (sequence tagged sites (STS))(sequence tagged sites (STS))

A. Specifinių sekų atkarpos (STS) įvadas.

B. Mikrosatelitai arba kartotinių sekų atkarpos (SSR).

C. Apibrėžtų sekų atkarpos (SCAR).

D. Pagausintos ir sukarpytos polimorfinės sekos (CAPS).

E. Kartotinių paprastų sekų intarpai (ISSR).

A) STS įvadasA) STS įvadas

•Specifinių sekų atkarpos (ang. sequence tagged sites (STS)) žymenys tai unikalių DNR nukleotidų sekų atkarpos, kurių vieta chromosomoje yra žinoma (paprastai 200-400 bp ilgio sekos, pagausimos PCR pagalba).

•Skirtingai nuo atsitiktinių RAPD pradų, STS pradai parenkami taip, kad paženklintų specifines DNR vietas.

•STS yra pagrinde kodominantiniai žymenys.

•Pakartotinių STS žymenų analizės rezultatų tapatumas yra didesnis, kadangi naudojami ilgesni pradai nei RAPD.

•Radus specialias sekas identifikuojančius žymenis, tolesnis darbas palengvėja ir prigysta standartinėms PCR analizėms.

•Rasti STS nelengva vienas iš efektyviausių būtų cDNR bibliotekos ir EST žymenų polimorfizmo tyrimai (EST 200-400 bp atkarpos identifikuojančios cDNR galus).

B) Mikrosatelitai (kartotinių sekų B) Mikrosatelitai (kartotinių sekų atkarpos (SSR))atkarpos (SSR))

Mikrosatelitai tai trumpos DNR atkarpos, sudarytos iš viena po kitos pakartotų kelių nukleotidų dydžio sekų (pvz. AT-AT-AT).

ATG(…)ATA AT-AT-AT-AT-AT ATG(…)GTT

pvz. 25 bp pvz. 25 bp

DNRPradmenų atpažįstamos sekos, identifikuojančios mikrosatelitų atkarpą

Paprastų sekų (AT) pasikartojimo atkarpa, kur AT atkartota 5 kartus

kartotinė seka

Mikrosatelitai dar vadinami SSR (ang. simple sequence repeats) kartotinių sekų atkarpos (sekos ilgis 2-6 bp, paprastai 2-4 bp (AT)n (AG)n, (TCT)n, (TATG)n)). (AT)n būdingi augalams

SSR vieta chromosomoje

GTGTGTGT

Tam, kad identifikuoti SSR, reikia žinoti juos juosiančių DNR atkarpų sekas (pakankamo ilgio, kad identifikuoti šiuos regionus, paprastai 20-25 bp), pagal jas gaminti specialias vienos grandinės DNR atkarpas- PCR pradmenis.

Turint pradmenis identifikuojamas ir PCR pagalba pagausinamas unikalus SSR regionas (t.y. nustatomi vieno lokuso alelių skirtumai).

Skirtumai tarp dviejų genotipų SSR pakartojimo skaičiaus nustatomi PCR pagalba. Parenkami 2 pradmenys identifikuojantys SSR atkarpą iš abiejų pusių (pvz. 25 pb ilgio). Pradmenų sekos nustatomos iš cDNR bibliotekų ar specialių tyrimų pagalba. PCR metu pradai pagausina SSR sekų atkarpas. Jei genotipas neturės SSR atkarpos, fragmentų ilgis bus lygus abiejų pradų sudėtam ilgiui (25+25=50 bp). Jei SSR pakartojimų skaičius bus skirtingas, bus pagausinti skirtingo dydžio DNR fragmentai. Žinant pradų ir fragmentų dydį, galima apskaičiuoti SSR kartojimų skaičių (genotipas A : fragmentas 64 bp minus 50 bp pradai = 14 bp SSR ilgis / 2 (SSR dydis 2pb) =7 kartai.

Mikrosatelitų metodas (1)Mikrosatelitų metodas (1)Mikrosatelitai parodo paprastų sekų pasikartojimo skaičiaus skirtumus tarp lyginamų genotipų (kartotinių sekų atkarpos ilgio polimorfizmą). Pakartojimų skaičius gali siekti 50.

CACACACAGTGTGTGT

25 bp 25 bp8 bp

Genotipas A Genotipas B

CACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGT

25 bp 25 bp14 bp

SSR

vie

ta

chro

moso

moje

GT

GT

GT

GT

SSR

vie

ta

chro

moso

moje

GT

TG

T

Elektroforezė

PCR pagausinimasPCR

pagausinimas

Elektroforezė

Vertikali elektroforezė (agarozės gelis, etidium bromidas šviečia UV šviesoje)

Mikrosatelitų metodas (2)Mikrosatelitų metodas (2)

Analizės seka:

•DNR izoliavimas.

•PCR su pradmenimis, kurie pagausins pakartotinių sekų DNR atkarpas.

•Elektroforezė:

•kai skirtumai tarp fragmentų dideli (10-20 bp) ir patys fragmentai ilgesni (200-300 bp)- akarozės gelis ir jungtis su UV šviesoje švytinčiomis etidžio bromido molekulėmis),

•Alternatyva: akrilamino gelis ir jungtis su sidabro nitratu.Qr 11Qr 11

Mikrosatelitų pradmenysMikrosatelitų pradmenys

•Problema rasti tinkamus pradus identifikuojančius SSR atkarpą. Sprendimai:

•EST bibliotekų duomenų bazės (EST išreikštą geną identifikuojanti 200-500 bp dydžio šio geno DNR atkarpa, pagaminta iš cDNR); SSR sekų ir jas juosiančių pradų sekų identifikacija (EST SSR tinkamesnės nei atsitiktinės SSR, nes žymi išreikštus genus).

•Tikslinių cDNR molekulių esančių bibliotekose identifikacija naudojant žinomas SSR atkarpas kaip vieną iš pradų PCR amplifikacijai; identifikuotų cDNR sekevenavimas,

•Išreikštų genų cDNR sukarpymas restriktazių pagalba ir žinomo SSR atkarpų naudojimas kaip markerių tokių pat sekų identifikacijai cDNR fragmentuose.

Privalumai ir trūkumai Privalumai ir trūkumai

Privalumai:

•Pakanka sąlyginai nedaug ir ne tokios aukšto kokybės DNR kaip RFLP.

•Efektyvus polimorfizmo atskleidimas.

•Kodominantinis, dažnai tinkanti giminingų rūšių analizei.

•Aukštas rezultatų pakartojamumas, efektyvus automatizuotas darbas, aiškiai atskiriamos segmentų bangos

Trūkumai:

•SSR identifikuojančių sekų nustatymo poreikis.

•Santykiai aukštesni kaštai nei RAPD.

Mikrosatelitų panaudojimasMikrosatelitų panaudojimas

•Genotipų (“pirštų antspaudų”) identifikacija.

•QTL žymenų paieškos tyrimai (genotipo-fenotipų ryšiai ir genolapiai).

•Populiacijų genetinės įvairovės tyrimai ir identifikacija.

•Evoliuciniu procesų studijos (rūšių emigracija, genų migracija).

C) Pagausinti specifinių sekų C) Pagausinti specifinių sekų regionai (SCAR)regionai (SCAR)

•Pagausinti specifinių sekų regionai (ang. sequence characterized amplified regions (SCAR)) tai RAPD analizės tęsinys, panaudojant polimorfinius ar neaiškius RAPD fragmentus juos identifikuojančių žymenų gamybai ar tikslesniam tyrimui.

•SCAR žymenys tai 16-24 bp ilgio specifinių RAPD fragmentų galai.

SCAR žymuo 1 SCAR žymuo 2

Polimorfinis RAPD fragmentas

DNR

SCAR metodikaSCAR metodika• RAPD gelyje identifikuojamas dominantis

DNR fragmentų klasteris (banga) (pvz. polimorfinis fragmentas)

• Ši banga izoliuojama gelio, klonuojama į bakterijos plazmidę ir sekvenuojama (nustatomos ją sudarančių DNR nukleotidų sekos)

• Nustatomi specifiniai šį fragmentą identifikuojantys PCR pradmenys (paprastai 16-24 bp ilgio) iš vieno ir kito fragmento galo.

• Šie fragmentai naudojami kaip žymenys (PCR pradmenys) pakartotinėje tos pačios medžiagos analizėje (paprastai gaunamas neperpildytas, paprastesnis bangų profilis).

• Fragmentai atskiriami agarozės gelio elektroforezės būdu, pažymint pradmenis etidžio bromidu, kuris šviečia UV šviesoje.

RAPD gelis

Bakterijos plazmidė

Polimorfinė banga

Sekvenavimas

SCAR žymuo 1 SCAR žymuo 2

SCAR pranašumai ir trūkumaiSCAR pranašumai ir trūkumai

Pranašumai:

• Aukštesnė rezoliucija ir rezultatų pakartojamumas nei RAPD (pagrinde dėl to, kad ilgesni pradai),

• Galima atskirti kodominantinius lokusus.

Trūkumai:

• Specifinių žymenų gamyba (klonavimas į bakterijas, sekvenavimas).

•Gali prireikti specifinių žymenų keliolikai lokusų (jei yra daugiau RAPD polimorfinių bangų).

•Aptinka skirtumus ne visame genome, tik mažoje jo dalyje (paprastai apie 5000 bp dydžio fragmentuose).

D) Pagausintos ir sukarpytos D) Pagausintos ir sukarpytos polimorfinės sekos (CAPS)polimorfinės sekos (CAPS)

•Pagausintos ir sukarpytos polimorfinės sekos (ang. cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)) tai RAPD analizės tęsinys, panaudojant tam tikrus RAPD fragmentus juos identifikuojančių žymenų gamybai ir tikslesniam tyrimui, sukarpant pagausintus fragmentus restriktazėmis.

•CAPS metodas gali paverčia neaiškius ar nepolimorfius RAPD pagausintus fragmentus į mažesnius daugiau įvairovės atskleidžiančius fragmentus.

•Lyginant su RFLP, nereikia daug darbo reikalaujančių Soutern hibridizacijos ir radioaktyvių markerių elektroforezės.

•Panašus į SCAR metodas tik turintis tolesnį žingsnį – DNR sukarpymą restriktazėmis.

CAPSCAPS metodika (1) metodika (1)•Identifikuojamas dominantis RAPD fragmentas, (ar kita DNR atkarpa ar geno seka).

•Ši banga izoliuojama iš gelio, klonuojama į bakterijos plazmidę ir sekvenuojama (alternatyviai dominančios DNR atkarpos nukleotidų seka gali būti numatoma iš duomenų bazių ar ankstesnių tyrimų).

•Nustatomi specifiniai DNR fragmentą identifikuojantys PCR pradmenys (20-25 bp ilgio žymenys) iš vieno ir kito fragmento galo.

Bakterijos plazmidė

Sekvenavimas

žymuo 1 žymuo 2

RAPD gelis

A B C

CAPSCAPS metodika (2) metodika (2)

Sukarpymas restriktazėmis (skaičiai= gautų fragmentų skaičius).

•Nauji žymenys naudojami fragmento pagausinimui PCR pagalba,

1 ciklas 2 ciklas 3 ciklas 4 ciklas 5 ciklas1 ciklas 2 ciklas 3 ciklas 4 ciklas 5 ciklas

PCR pagausinimas

1 2 3 4

Genotipas A (homozigotini

s)1 2 3 4 1 2 3 4

Genotipas B (heterozigotinis

)

1 2 3

1 2 3

Genotipas C (homozigotinis)

1 2 3•Sukarpyti fragmentai atskiriami agarozės gelio elektroforezės būdu, pažymint pradus etidžio bromidu, kuris šviečia UV šviesoje.

C

1ab3ab

2ab

a

b

Dvi chromosomos

2b1ab

23a

3a4b

B

1ab

23ab

4ab

A

Kiekvienos restriktazės elektroforezės geliai analizuojami atskirai (tik kai kurios restriktazės gali atskleisti polimorfizmą).

•PCR produktai izoliuojami iš gelio ir sukarpomi eilės restriktazių pagalba.

CAPS pranašumai ir trūkumaiCAPS pranašumai ir trūkumai

Pranašumai:

•Aukštesnė rezoliucija ir nepolimorfinių fragmentų panaudojimas tyrimuose (pavertimas polimorfiniais),

•Galima atskirti kodominantinius lokusus.

•Galimybė panaudoti jau žiniomis žymenis PCR pagausinimui

Trūkumai:

• Specifinių žymenų gamyba (klonavimas į bakterijas, sekvenavimas).

•Aptinka skirtumus ne visame genome, tik mažoje jo dalyje (paprastai apie 5000 bp dydžio fragmentuose).

E) Kartotinių paprastų sekų E) Kartotinių paprastų sekų intarpai (ISSR)intarpai (ISSR)

•Kartotinių paprastų sekų intarpai (ang. inter-simple sequence repeats (ISSR)) tai žymenų sistema, žyminti DNR sekas esančias tarp paprastų kartotinių sekų (mikrosatelitų ar SSR).

•ISSR principas: PCR pagausinimas naudojant PCR pradmenis (ISSR žymenis) pagamintus pagal SSR sekas.

Dviguba DNR grandinė

CACACACACACACA

CACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTG

GTGTGTGTGTGTGTG

NNNNNNNNNN|NNNN

ISSR žymuo

ISSR žymuo

DNR atkarpa, kurią pagausins (pažymės) ISSR

žymenys (N= bet kokie nukleotidai)

NNNNNNNNNN|NNNN

Paprastos kartotinės sekos (CA)n

ISSRISSR metodai metodaiISSR žymenys (PCR pradai) identifikuojami iš mikrosatelitų sekų pratęsiant jas vienu ar keliais nukleotidais:

•Galima naudoti vieną PCR pradmenį.

• Du skirtingus pradus (pratęstų nukleotidų skirtumai tiek kartotinių sekų skirtumai).

• Derinyje su atsitiktiniu RAPD pradu.

•Arba bus amplifikacija arba ne = dominantiniai žymenys).

CACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTG

GTGTGTGTGTGTGTG

GCCAATTTTTTTCCC

ISSR žymuo (CA)AT

ISSR žymuo (CA)GG

CACACACACACACA

ISSR pranašumai ir trūkumaiISSR pranašumai ir trūkumai

Pranašumai:

•Jei atlikta SSR analizė ar duomenys rasti bibliotekose, nereikia iš anksto žinoti žymenų DNR sekų.

•Keliolikos lokusų analizė vienu metu.

•Efektyviai atkleidžia polimorfizmą.

•Individualių genotipų identifikacija.

Trūkumai:

• Dominantiniai žymenys.

• Gali prireikti darbo su radioaktyviomis medžiagomis rezultatų vizualizacijai po elektroforezės.

STS pagrindinė literatūraSTS pagrindinė literatūraAjay, J., C. Apparanda and P.L. Bhalla. 1999. Evaluation of genetic diversity and genome fingerprinting of Pandorea (Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. Genome 42:714-719.

Blair, M.W., O. Panaud and S.R. McCouch. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 98:780-792.

Brown, S.M. and S. Kresovich. 1996. Molecular characterization for plant genetic resources conservation. Pp. 85-93 in Genome Mapping in Plants (H. Paterson, ed.). RG Landes Company, Georgetown, TX.

Buso, G.S.C., P.H.N. Rangel and M.E. Ferreira. 2001. Analysis of random and specific sequences of nuclear and cytoplasmatic DNA in diploid and tetraploid American wild rice species ( Oryza sp.). Genome 44:476-494.

Hajeer, A., J. Worthington and S. John (eds.). 2000. SNP and Microsatellite Genotyping: Markers for Genetic Analysis. Biotechniques Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, UK.

Joshi, S.P., V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar and D.S. Brar. 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor. Appl. Genet. 100:1311-1320.

Kantety, R.V., X.P. Zeng, J.L. Bennetzen and B.E. Zehr. 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn ( Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Mol. Breed. 1:365-373.

Konieczny, A. and F.M. Ausubel. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4(2):403-410.

Lowe, A.J., J.R. Russell, W. Powell and I.K. Dawson. 1998. Identification and characterization of nuclear, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) loci in Irvingia gabonensis and I. wombolu, indigenous fruit trees of west and central Africa. Mol. Ecol. 7(12):1786-1788.

Morgante, M. and A.M. Olivieri. 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J. 3(1):175-182.

Paran, I. and R.W. Michelmore. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.

Zietkiewicz, E., A. Rafalski and D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.

PCR pagrįstos žymenų PCR pagrįstos žymenų sistemos: naujos sistemos: naujos

strategijosstrategijosA. Išreikštų sekų žymenys (EST).

B. DNR mikro gardelių technologija.

C. Pavienių nukleotidų polimorfizmas (SNP).

A) Išreikštų sekų žymenys (EST)A) Išreikštų sekų žymenys (EST)

• Išreikštų sekų žymenys (ang. Expressed sequence tags EST) tai dalinės išreikštų genų DNR nukleotidų sekos (paprastai 200-500 bp), kurias naudojant kaip polimerinės grandininės reakcijos (PCR) pradmenis galima identifikuoti ir pagausinti išreikštus genus.

• EST žymenys gaunami sekvenavus vieną ar abu išreikšto geno (komplimentarios DNR (cDNR)) galus.

• Genas nustatomas iš cDNR bibliotekų ar specialių žymenų sistemų pagalba (pvz. cDNR-AFLP, DNR mikro sekos).

• Geno funkcija nustatoma pagal genų išraiškos vietas (augalo audinius) ir pagal atsaką į aplinkos signalus ar stresą.

• EST ypač efektyvi kandidatinių genų atradimo sistema.EST žymenys

DNRGenas

EST sukūrimas (1)EST sukūrimas (1)

Brandžios iRNR izoliavimas (be intronų)

cDNR sintezė pagal iRNR, cDNR stabilesnė.

Antros cDNR grandinės sintezė; RNR degradacija; cDNR bibliotekų sudarymas; atrinktų cDNR sekvenavimas ir geno seką juosiančių EST žymenų nustatymas.

ACUGACUGiRNR

ACUGACUGiRNR

TGACTGACcDNR

ACTGACTGcDNR

TGACTGACcDNR

5’EST žymuo

3’ EST žymuo

DNR sekvenatoriai

cDNR bibliotekos

EST sukūrimas (2)EST sukūrimas (2)•Genotipai bandomi tam tikroje aplinkoje.

•Iš specifinių audinių, kuriuose vyksta atsakas į stresą, izoliuojama iRNR (geno kopijos), iš jų sintetinamos stabilesnės cDNR molekulės.

•Atsitiktiniu būdu atrankos cDNR dalinai sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR bibliotekose esančiomis žinomos funkcijos cDNR sekomis.

•Nustačius atitikimus, pagaminami EST žymenys, identifikuojantys tam tikrą geną.

•EST žymenys naudojami QTL testavimui ir kandidatinių genų paieškos tymuose.

Sekvenavimas ir atitinkančių sekų

paieška bibliotekose

ACGGACUGcDNR

Genotipo atsakas į stresą= išreikšti genai

Nacionalinio biotechnologijų centro cDNR duomenų bazės

iRNR

2. cDNR sintetinimas pagal iRNR kopijas ir cDNR sukarpymas dviejų skirtingų restriktazių pagalba (viena dažnai, kita retai kerpanti).

3. DNR fragmentų galų jungimosi neutralizavimas prijungiant adapterius (pagal restriktazių sekas)

4a. PCR 1 ciklas: naudojami 2 pradmenys (sekos= restriktazių atpažįstamos sekos + 1 nukleotidas. Atrenkami pradų sekoms tinkantys fragmentai.

4b. PCR 2 ciklas: 2 nauji pradmenys (sekos = restriktazės sekos + 1 +2 ar > naujų nukleotidų). Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai

EST sukūrimas (3)EST sukūrimas (3)Jei nerandama panašių sekų bibliotekose naudojamas “cDNR+AFLP=EST” metodas: tikslas identifikuoti tam tikrose aplinkose išreikštus genus ir iš jų pagaminti EST žymenis.

1. Tam tikroje aplinkoje auginamų genotipų iRNR izoliavimas iš audinių, kuriuose tiksliniai genai yra išreikšti (pvz. pumpuras, jei tiriami pumpurų ramybės būsenos genai).

5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie fragmentai izoliuojami iš gelio, sekvenuojami ir pagaminami EST žymenys tolesniam išbandymui.

5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie fragmentai izoliuojami iš gelio, sekvenuojami ir pagaminami EST žymenys tolesniam išbandymui.

EST sukūrimas (EST sukūrimas (44))

Bandymo tikslas identifikuoti EST genų atsakingų už gravitacinė kontrolę (medžių augimą tiesiai). Sėjinukai laikomi pakreipti, bet augdami išsitiesina. Stiebo išlenkimuose izoliuojama iRNR ir lyginama su kontrolės medelių tos pačios stiebo dalies audinių iRNR bei atitinkančių sekų paieška bibliotekose.

Tikėtina už gravitacinė

kontrolė atsakingų genų išraiškos

vieta

Medelių poveikio, siekiant izoliuoti išreikštus genus, pavyzdys.

EST sukūrimas (EST sukūrimas (44))

Kitas diferencijuotai išreikštų genų identifikacijos metodas (alternatyva cDNR-AFLP metodui) yra DNR mikro gardelės, kuriose yra jau žinomų genų dalys. cDNR hibridizacija su šiais žinomais genais mikro gardelės parodo kokie genai ir kaip stipriai yra išreikšti.

iRNR

cDNA

Hibridizacija DNRmikro gardelėse

Genų išraiškos indukcija tam

tikroje aplinkoje ar audinyje.

Genų identifikacija

Pagal Benfey P. 2004. Essentials of genomics. Prentice Hall, 400 p.

EST naudojimasEST naudojimas

• EST naudojimas pagrįstas tuo, kad šie žymenys yra genų dalys.

• Naudojami kaip PCR pradai tikslinio geno identifikacijai ir geno polimorfizmo paieškoje populiacijoje (ypač naudingi QTL tyrimuose ir naudojimui selekcijoje).

• Naudojami kaip hibridizacijos markeriai RFLP ir AFLP ar DNR mikro gardelėse.

• Pavienių nukleotidų polimorfizmo (SNP) žymenų paieškoje.

• Genetinės įvairovės nustatymo tyrimuose.

• Duomenų bazėse kaip geną žyminčios sekos. Bibliotekose yra nemažai cDNR iš Pinus radiata, Pinus tadea, Picea abies, Populus ir Eucalyptus išreikštų genų (pvz. www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) ar sekvenuotų EST (http://dendrome.ucdavis.edu/gen_res.htm).

EST:EST: pranašumai ir trūkumai pranašumai ir trūkumai

Pranašumai:

• Ypatingai naudingi kaip genetiniai žymenys.

• Kodominantiniai (gali atskirti heterozigotinius genotipus).

• Žymenų sekas galima palyginti greitai sukurti.

• Efektyvus panaudojimas kitų žymenų sistemų tobulinimui (pagrinde PCR pradai, SSR, SNP).

Trūkumai:

• iRNR izoliavimas gali būti sudėtingas (iRNR trapi molekulė).

• Genetinės įvairovės tyrimams būtu naudinga ir intronų DNR įvairovė (kurios nėra išreikštoje cDNR).

B) DNR mikro gardelėsB) DNR mikro gardelės

Ši technologija leidžia analizuoti daug genų vienu metu.

Principas: bandomų genotipų DNR fragmentai hibridizuojami (jungiami) su gardelėse esančiomis žinomų genų dalimis (pagrinde cDNR fragmentai)

DNR mikro gardelės (ang. DNA microarrays) tai trumpos daugelį genų reprezentuojančios DNR atkarpos sistemingai išdėstytos gardelėse ant stiklo ar neilono plokštelių, kurios naudojamos hibridizacijai su tiriamų genotipų DNR.

Fragmento dydis 25 bp

DNR mikro gardelė

DNR plokštelė sudaryta iš daugybės mikro gardelių

DNR mikro gardelių metodas (1)DNR mikro gardelių metodas (1)Tikslas nustatytai kokie genai kada ir kaip stipriai yra išreikšti tam tikroje medžio fiziologinėje būsenoje.

Tai metodas, leidžiantis vienu metu nustatyti tūkstančių genų išraišką, pagal iRNR išraiškos intensyvumą.

0

100

200

300

400

500

Inte

nsyv

umas

Vėlyva augimo pradžia

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 1 63 65 67 69 71 73 787

89 91 93 95 97

Genai

0

100

200

300

400

500Ankstyva augimo pradžia

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 565

67 69

DNR RNRNRR

BaltymaiBaltymaiBranduolys

DNR

LąstelėLąstelė

DNR mikro plokštelės

RNRNRR

DNR mikro plokštelės

Inte

nsyv

umas

Genai

Sprogstantis pumpuras

Nesprogstantis pumpuras

Pagal Benfey P. 2004. Essentials of genomics. Prentice Hall, 400 p.

DNR mikro gardelių metodas (2)DNR mikro gardelių metodas (2)

1. Izoliuojama iRNR=išreikštų genų kopijos 3. cDNR

gamyba

4. cDNR >laikymo trukmė nei RNR

5. cRNRgamyba

cRNR6.cRNR pažymėta biotinu. cRNR jungsis su DNR pavydžiais gardelėse

7. Atsitiktinis cRNRsukarpymas į 30-400 bp dydžio fragmentus8. cRNR

fragmentai dedami į DNR

gardeles

9. Viena iš DNR gardelių su tam tikro geno dalies

kopijomis

Identiški DNR fragmentai

10. Hibridizacija

11. Jei cRNR ir gardelės DNR sekos sutiks, cRNR prisijungs

12. Neprisijungusių cRNR nuplovimas; jungtis su švytinčiomis molekulėmis

kurios jungiasi tik prie biotinio

13. Rezultatų įvertinimas pagal švytinčios medžiagos išraišką gardelėse (kurie genai ir kaip stipriai yra išreikšti)

1. Izoliuojama iRNR=išreikštų genų kopijos 3. cDNR

gamyba

4. cDNR >laikymo trukmė nei RNR

5. cRNRgamyba

cRNR6.cRNR pažymėta biotinu. cRNR jungsis su DNR pavydžiais gardelėse

7. Atsitiktinis cRNRsukarpymas į 30-400 bp dydžio fragmentus8. cRNR

fragmentai dedami į DNR

gardeles

9. Viena iš DNR gardelių su tam tikro geno dalies

kopijomis

Identiški DNR fragmentai

10. Hibridizacija

11. Jei cRNR ir gardelės DNR sekos sutiks, cRNR prisijungs

12. Neprisijungusių cRNR nuplovimas; jungtis su švytinčiomis molekulėmis

kurios jungiasi tik prie biotinio

13. Rezultatų įvertinimas pagal švytinčios medžiagos išraišką gardelėse (kurie genai ir kaip stipriai yra išreikšti)

Iš tikslinių audinių izoliuota iRNR jungiama su iš anksto pagamintose DNR mikro gardelės esančiomis žinomų genų DNR dalimis (mikro sekomis).

DNR mikro gardelių metodas (3)DNR mikro gardelių metodas (3)Plokštelės sandara: ~ 500 000 mikro-gardelių; milijonai identiškų DNR fragmentų ~25 bp ilgio (geno dalių) gardelėje. Išdėstytos sistematiškai, kiekviena pozicija reiškia žinomą geną

1,28 cm

1 2

3

Švytinčiu dažu pažymėtos iš tiriamų individų izoliuotos iRNR molekulės jungiamos su gardelių DNR: iRNR prisijungs tik prie tinkančių DNR, o prisijungusių iRNR kiekis atspindės geno išraiškos stiprumą.

Švytinčių RNR molekulių signalai bus užfiksuoti skeneryje. Spec. analizatoriai nustatys kokie genai ir kaip stipriai buvo išreikšti

Fragmento dydis 25 bp

DNR mikro gardelė

Milijonai DNR fragmentų kiekvienoje mikro gardelėje

DNR plokštelė sudaryta iš daugybės mikro gardelių

DNR gardelių dydisDNR gardelių dydis

~6,500,000 ~6,500,000 mikro mikro gardelių gardelių plokštelėje

1.28cm1.28cm

1.28cm1.28cm

5µm5µm

5µm 5µm

*** ***

Milijonai identiškų DNR fragmentų

kiekvienoje mikro gardelėje

DNR plokštelės išorinis vaizdas

Pranašumai, trūkumai ir taikymasPranašumai, trūkumai ir taikymasPranašumai:

•Viso genomo analizė vienu metu (daugelio genų identifikacija).

•Efektyvūs kaip žymenys genotipo–fenotipo ryšiams nustatyti.

Trūkumai:

•Reikia turėti tikslinių genų sekas ir iš jų sudaryti hibridizacijos gardeles.

•Brangus ir techniškai sudėtingas metodas, reikalaujantis specifinės duomenų analizės metodų žinojimo bei specialios įrangos.• Didelio kiekio išreikštų genų (cDNR) identifikacija vienu metu.

• Specifinės DNR sekos identifikacija (geno or geno mutacijos).

• Genų išreikštumo stiprumo (iRNR kiekio) identifikacija.

• DNR žymenų kūrimas (pvz. SNP).

Pagrindinis taikymasPagrindinis taikymas

C) Pavienių nukleotidų C) Pavienių nukleotidų polimorfizmas polimorfizmas (SNP)(SNP)

• SNP (ang. Single nucleotide polymorphism) tai žymenų sistema galinti nustatyti vieno nukleotido pokyčius tarp homologinių DNR sekų (homologinės: panašios pagal struktūrą, vietą ir funkciją~ alternatyvios geno formos).

• Augaluose, dauguma DNR skirtumų tarp genotipų (DNR polimorfizmas) yra dėl vieno nukleotido vietos pokyčio tikslinėje DNR sekoje (vadinamas vieno nukleotido polimorfizmas).

• Tikslas: žinomų genų alternatyvių formų (alelių) paieška.

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT

Vieno nukleotido pokytis

Genotipas B

GAGTATGT

Vieno nukleotido pokytis

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo

SNP nustatymo metodika (1)SNP nustatymo metodika (1)• SNP ir juos žyminčios specifinės gretimos DNR

nukleotidų atkarpos randamos:

a) sekvenuojant (ar hibridizuojant mikro gardelėse) polimorfinius PCR fragmentus, pagausintus naudojant EST žymenis polimorfinėse populiacijose (kilmės, klonų archyvai)

b) analizuojant cDNR sekų duomenų bazėse esančias genų sekas (vadinami eSNP). Paprastai SNP randamas kas 1000-2000 nukleotidų.

• Žinant SNP vietą žyminčias DNR atkarpų sekas, tolesnis SNP taikymas ženklai palengvėja naudojant DNR mirko sekas ar PCR ir automatinio sekvenavimą.

Toliau SNP identifikuojami pagal tam pagamintus žymenis (specifines DNR sekas abiejose SNP šonuose) ir naudojami geno polimorfizmo paieškoje

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT

Vieno nukleotido pokytis

Genotipas B

GAGTATGT

Vieno nukleotido pokytis

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo SNP žymuo

GAGTCTGTCTCAGACA

EST žymenys (PCR pradai) identifikuojantys geną

CTCAGACAGAGTCTGT

Išreikšto geno dalis (cDNR dalis)

PCR pagausimas ir sekvenavimas

Polimorfinės populiacijos genotipų

analizė ir SNP atradimas

QTL

QTL

QTL

SNP nustatymo metodika (2)SNP nustatymo metodika (2)

SNP paieškos analizės rezultatų pavyzdys (Rafalski (2002)).

Eilutės = 32-jų skirtingų genotipų amplifikuoti fragmentai (naudojant EST žymenis)

Stulpeliuose lyginami pavieniai nukleotidai ir skirtinga spalva pažymėti jų skirtumai (I/D = įterptas ar ištrintas vienas nukleotidas)

Nustatyti 4 haplotipai (haplotipas identiškos DNR sekos = vienodo geno genotipas)

32

gen

oti

pai

Haplotipai

Rafalski, A. 2002. Applications of SNP in crop genetics. Currient Optinion in Plant Breeding 5: 94-100

SNP taikymasSNP taikymas1. SNP žymenų naudojimas geno (cDNR) polimorfizmo nustatymui polimorfinėje populiacijoje.

Išreikštų skirtingų fenotipų atranka polimorfinėje populiacijoje (klonų archyvas ar tolimų populiacijų bandymas)

Polimorfinės populiacijos

pavyzdys: Pinus sylvestris klonų

archyvas

Alternatyvios vieno geno formos gali

skirtis nedideliu

sekų skaičiumi

Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais

Alternatyvios vieno geno formos gali

skirtis nedideliu

sekų skaičiumi

Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais2. PCR produktų sekvenavimas ir SNP polimorfizmo nustatymas

Elektroforezės gelis Bakterijos

Fragmentai izoliuojami iš gelio ir terpiami į bakterijų plazmides (saugojimui) ir sekvenuojami taip nustatant SNP polimorfizmą, kuris lyginamas su fenotipu.

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT

Vieno nukleotido pokytis

Genotipas B

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT

Vieno nukleotido pokytis

Genotipas B

GAGTATGT

Vieno nukleotido pokytis

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuoGAGTATGT

Vieno nukleotido pokytis

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo

Alternatyviai naudojama hibridizacija su žinomų genų cDNR DNR mirko gardelėse

Sekvenatorius

SNP žymenys

Ypač efektyvus metodas svarių genų (major genes) identifikavai (t.y. genų kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipinio požymio išraiškai); būtent svarių genų nustatymas naudingas selekcijai.

Naujos žymenų sistemos trumpaiNaujos žymenų sistemos trumpai

•EST žymenys tai efektyvi priemonė kandidatinių genų identifikacijai ir juos žyminčių žymenų gamybai bei naudojimui selekcijoje (efektyvesnė nei klasikinė QTL strategija nes nustato tiesioginius genus ir nereikalauja kryžminių).

•DNR mikro sekos leidžia vienu metu analizuoti daugybę lokusų ir genotipu.

•SNP efektyvus metodas tiksliam genų polimorfizmui nusakyti ir esminės įtakos genų paieškai (t.y. genų kurių polimorfizmas turi esminę įtaką požymio išraiškai ir tuo pačiu selekcijai).

EST, SNP, Mikro gardelės pagrindinė EST, SNP, Mikro gardelės pagrindinė literatūraliteratūra

Alscher, R. 2001. Grid it: resources for microarray research. http://www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin and W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman and Co., NY.

Hajeer, A., J. Worthington and S. John (eds.). 2000. SNP and Microsatellite Genotyping: Markers for Genetic Analysis. Biotechniques Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, UK.

National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2001. ESTs: gene discovery made easier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html

USDA-ARS. 1999. The Cregan lab. http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm

Wang, D.G., J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky, and others. 1998.Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 280(5366):1077-1082.

Brown, P.O. and D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genet. 21(supp):33-37.

Richmond, T. and S. Somerville. 2000. Chasing the dream: plant EST microarrays. Current Opinion Plant Biol. 3(2):108-116.

• RFLP (+) tiksli , kodominantinė, (-) reikalauja daug darbo, nemažo DNR kiekio, ir darbo su radioaktyviomis medžiagomis.

• RAPD (+) nedaug DNR (tinka sėklų analizėms), pigus, greitas (-) dominantinis ir mažiau tikslus; patobulinimas- AFLP (RFLP ir PCR kombinacija: tikslesnis, vis tiek dominantinis),

• Eilė PCR ir restriktazių panaudojimu pagrįstų naujų sistemų, kurios skiriasi tuo kaip gaunami PCR pradai ar markeriai identifikacijai (kodominantiniai, tikslūs):

• EST, SCAR, STS, SNP (pradų sekos iš cDNR bibliotekų ar genų ekspresijos tyrimų, iš genominės DNR bibliotekų ir polimorfinių RAPD fragmentų)

• Efektyvus miško medžių žymenų generavimo būdas- genų sekų duomenų bazių analizė ar genų ekspresijos tyrimai, EST gamyba ir DNR mikrogardelių panaudojimas

Žymenų sistemų privalumai ir Žymenų sistemų privalumai ir trūkumaitrūkumai

Zymenu sistemosZymenu sistemos

3.2.4 Žymenų sistemų palyginimas

Qr 11Qr 11

A.Pliūra

Genetikos ir selekcijos skyrius

Genetinių ir genų žymenų koncepcijos

Fenotipas – individo požymių visuma

Genotipas – individo genetinės informacijos visuma (arba jos dalis), genų rinkinys

Genas – tai DNR segmentas, siaurąja prasme – atsakingas už tam tikrą organizmo funkciją, plačiąja prasme – genetinės informacijos perdavimo vienetas. Jis apima tiek koduojančią, tiek ir nekoduojančia DNR dalį.

Lokusas – fiksuota vieta chromosomoje kurioje randasi genas (vienas ar kitas alelis)

Alelis – vienas iš geno dviejų arba keleto alternatyvių formų galinčių egzistuoti viename lokuse. Kiekviena individuali chromosoma turi tik vieną alelį lokuse. Populiacija gali turėti du ir daugiau alelių lokuse. Haploidinis lokusas turi vieną alelį, diploidinis – du, poliploidinis – daug.

DefinicijosDefinicijos

Definicijos

Pozymiu tipu lentelėPozymiu tipu lentelė

Fenotipinis požymis – augalo morfologinis, augimo, fenologinis ar kt. požymis ar savybė, susiformavusi sąveikaujant genotipui ir aplinkai

Genetinis požymis – kai skirtingi individai turintys tą patį genotipą turį tą patį požymį nepriklausomai nuo aplinkos sąlygų, tada požymis laikomas genetiniu požymiu.

Genetinis žymuo (genetic marker) - kai paveldimumo analizės pagalba fenotipas gali būti vienareikšmiškai priskirtas genotipų grupei pagal vieną ar daugiau nustatytų lokusų, tada genetinis požymis laikomas genetiniu žymeniu

Genų žymuo (gene marker) - kai fenotipas gali būti vienareikšmiškai priskirtas vienam konkrečiam genotipui, tada genetinis žymuo laikomas genų žymeniu.

Požymio tipas Definicija

Požymis Individas Unikalus fenotipas

Genetinis požymis Genotipas Unikalus fenotipas

Genetinis žymuo Fenotipas Unikali genotipų grupė

Genų žymuo Fenotipas Unikalus genotipas

IstorijaIstorija

•Bartels (1971) ir Bergman (1971) išvystė paprastosios eglės enzimų elektroforezę. Šių tiesioginių DNR produktų paveldimumo analizė įgalino nustatyti jų paveldėjimo pobūdį (mode of inheritance) ir leido naudoti jos kaip genetinius žymenis ir iki 2000 m plačiai naudoti eksperimentinėje populiacinėje genetikoje.

•Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR, dauguma tradicinių žymenų sistemų žymi nekoduojama sekas, kurios yra nepriklau-somos nuo atrankos (žymenys neutralūs atrankai)

•Pirmasis medžių genetinis žymuo atrastas apie 1950 metus buvo paprastosios eglės retas morfologinis požymis - aurea fenotipas – kontroliuojamas alelių viename lokuse (Langner 1953)

Žymenų istorijaŽymenų istorija

IzoenzimaiIzoenzimaiIzoenzimai - elektroforetiškai atskiriami vienos enzimų sistemos variantai – yra koduojami genų viename arba dažniausiai – keliuose lokusuose.

•Izoenzimų molekulės susideda iš amino rūgščių grandinės sudarytos pagal DNR koduojančios dalies seką.

• Enzimų molekulės yra tiesioginiai genų, taigi ir DNR, produktai atliekantys esminį vaidmenį organizmų pirminiame ir antriniame metabolizme

•Izoenzimų elektrostatinio krūvio skirtumai rodo, kad yra skirtumai pagal DNR nukleotidų sekas.

•Allozimai beveik visada skiriasi venas nuo kito dėl to, kad pakeista bent viena paprastai skirtingą elektrostatinį krūvį turinti amino rūgštis.

•Dažniausiai skirtinų lokusų koduoti izoenzimai skiriasi ir dydžiu (dėl įterptų arba išjungtų nkleotidų, kurie pailgina arba sutrumpina amino rūgščių seką).

Izoenzimai

Allozimai - variantai koduojami alelių tame pačiame lokuse

Izoenzimų savybės, lemiančios jų kaip genetinių žymenų naudingumą:

IzoenzimaiIzoenzimai

Izoenzimai iki šiol plačiai naudojami medžių genetiniuose tyrimuose dar ir dėl šių savybių:

•Lyginant su DNR žymenimis jų nustatymas yra nebrangus,

•Laboratoriniai protokolai yra gerai nustatyti daugeliui medžių rūšių,

•Jie yra produktai genų, kurių vaidmuo metabolizme yra gerai žinomas

•Jų variacijos lygmuo yra tinkamas daugeliui tyrimų

•Izoenzimų paveldėjimo pobūdis – perdavimas vienu arba nedaugeliu branduolio genų lokusu

•Genų veikimas kodominantinis (išskyrus nulinius alelius, randamus kaikuriuose izoenzimų lokusuose), kas leidžia identifikuoti abu genus lokuse, taigi – ir heterozigotinius individus

•Vieno, dviejų ar net trijų alelių bei retų alelių vyravimas lokuse visose populiacijose ar net giminingose rūšyse

•Izoenzimai yra selekciškai neutralūs – t.y., jų dažnumų pasiskirstymo pokyčiai vyksta ne dėl selekcijos, bet dėl atsitiktinių veiksnių – mutacijų ir genų dreifo.

Zymenu technologijosZymenu technologijos

Pagrindinės molekulinių žymenų technologijos

2. Kategorija: PGR paremti pasirenkamieji arba pusiau-pasirenkamieji arba daugialokusiniai profiliuojantys metodai:

3.Kategorija: PGR paremti atskirų lokusų tikslinės vietos sekų metodai:

1. Kategorija: ne PGR metodai:RFLP – Apriboto fragmentų ilgio polimorfizmas

RAPD – Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNRDAF – DNR pagausinimo genospaudžiaiAP-PCR – Pasirenkamu pradmenų polimerazės grandininė reakcijaSCAR – Apibrėžtos sekos pagausintas regionasISSR – Paprastų pasikartojančių sekųAFLP – Pagausintų fragmentų ilgio polimorfizmasDAMD, SAMPL ir kt.

PCR-sequencing – PGR sekvenavimasEST – Išreikštos sekos žymėsSNP – Atskirų nukleotidų polimorfizmasCAPS – Sulieta pagausinta polimorfinė sekaTGGE, DGGE, SSCP, STMS ir kt.

Zymenu tyr pasiskirstZymenu tyr pasiskirst

Skirtingų molekulinių žymenų panaudojimo proporcijos miško medžių molekulinėje genetikoje

Mitochond-rijų žymenų

5%

Izozimų

20%

Mikrosatelitų

19%

EST

4% SNP

1%

RAPD

25%

RFLP

6%

AFLP

8%

Chloroplastų žymenų

12%

Idealus zymuoIdealus zymuo

Pageidautinos žymenų savybės

•Didelis polimorfiškumas

•Kodominantiškumas

•Tolygiai pasiskirstęs visame genome

•Išskiriantis (diskriminuojantis)

•Pakartojamumas

•Neįtakojamas aplinkos

•Neutralus

•Nebrangus

•Lengvai matuojamas

Qr 11Qr 11

Paveld pobudis - perdavimoPaveld pobudis - perdavimo Molekulinių žymenų paveldėjimo pobūdis:

1.Perdavimo pobūdis (moda)

• Perdavimas iš abiejų tėvų ar vieno iš tėvų:

• Ploidiškumo laipsnis

- abiejų tėvų branduolinis paveldėjimas – visi augalų branduolio genai

- motinos branduolinis paveldėjimas – motinos alelio išreikštumas spygliuočių sėklų haploidiniame pirminiame endosperme (megametofite)

- motinos organoidų paveldėjimas – visų medžių rūšių mitochondrijų genome, gaubtasėklių chloroplastų DNR, per motinas paveldimas kai kurių spygliuočių pirminis endospermas (megagametofitas)

- tėvų organoidų paveldėjimas – spygiuočių rųšių chloroplasto genomas

- Branduolio genų diploidai ar poliploidai diploidinės fazės medžiagoje

- Branduolio genų haploidai haploidinės fazės medžiagoje

- Organoidų pseudohaploidai - Lokusų, koduojančių fenotipą, skaičius - Alelių skaičius lokuse

Paveld pobudis –genu veiklosPaveld pobudis –genu veiklos

Molekulinių žymenų paveldėjimo pobūdis:

2.Genų veiklos pobūdis (moda)

• Kodominavimas ir dominavimas

- Kodominavimas – kai lokuse (diploidiniame ar poliploidiniame) matomi abu aleliai ir, todėl, - atpažįstamos heterozigotos. Kodominantinis lokusas vadinamas genų žymeniu.

- Dominavimas – kai lokuse dominantinis alelis užmaskuoja kitą – recesyvinį alelį ir, todėl, neįmanoma atskirti heterozigotų (dominantinis + recesysvinis alelis) nuo homozigotų (dominantinis + dominantinis alelis). Dominantinis lokusas vadinamas genetiniu žymeniu (bet ne genų žymeniu)

- Epistazė – sąveika tarp dviejų lokusų kai vieno alelio išreikštumas viename lokuse maskuoja alelio išreikštumą kitame lokuse. Genetinis požymis, kuriam būdinga epistazė vadinamas genetiniu žymeniu (bet ne genų žymeniu)

Dominatiniai zymenysDominatiniai zymenys

1 0 1 1 0 1 1 1 1 1

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A lokusas

B lokusas

D lokusas

0 1 0 0 0 1 0 0 1 0

1 1 1 1 0 1 1 0 1 1

A lokusas

B lokusas

D lokusas

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Individai

Dominavimas – kai lokuse dominantinis alelis užmaskuoja kitą – recesyvinį alelį ir, todėl, neįmanoma atskirti heterozigotų (dominantinis + recesysvinis alelis) nuo homozigotų

Kodominant zymenysKodominant zymenys

1,1 1,0 1,1 0,1 0,1 1,1 1,0 0,1 0,1 0,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A lokusas

B lokusas

D lokusas

1,0 1,0 1,0 1,1 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 1,1 0,1 0,1 1,1 0,1 0,1 1,1 1,1

M

A lokusas

B lokusas

D lokusas

IndividaiM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Kodominavimas – kai lokuse matomi abu aleliai ir, todėl, yra atpažįstamos heterozigotos.

DNR zymen gen savybDNR zymen gen savyb

Izoenzimai RFLP SSR branduolio

SSR chloroplastų

RAPD AFLP fingerprint

STS/EST

Kilmė geninė anoniminė /geninis

anoniminė anoniminė anoniminė anoniminė geninė

Polimorfizmas: lokusų skaičius

1-5,(30) riboja enzimų skaič.

dešimtys tūkstančių

mažai pavieniai dešimtys tūkstančių

daug 10-30 tūkst. -genų skaič

alelių skaičius lokuse

1-7 daug daug nežinomas

Perdavimo pobūdis

abiejų tėvų, branduolinis

abiejų tėvų vieno iš tėvų: spygl. - tėvų,lap. - motinų

abiejų tėvų

Genų veikimo pobūdis

kodominant. išskyrus nul. alelius atski-ruose lokus.

kodominan-tinis

kodominan-tinis

kiekvienas citotipas išreikštas

dominan-tinis

dominant., kituose –lokusuose –kodomin.

kodomi-nantinis

Nuliniai aleliai reti labai reti dažnoki dažnoki nenustato-mi

nenustato-mi

reti

Variacija populiacijose

maža – vidutinė

didelė maža Hypervaria-bilūs, kiekv. indiv.unikal.

Populiacijų diferenciacija

maža maža didelė

Funkcija funkciniai skirtumai tarp alelių

nekoduoja, stabilizuoja genomą

nekoduojanti nežinoma

Atitikimas tarp šeimų ir tarp genčių

gentyje gentyje arba rūšyje

gentyje arba rūšyje

rūšyje rūšyje tarp gimi-ningų rūšių

Molekulinių žymenų genetinės savybės

DNR zymen techn savybDNR zymen techn savyb

Izoenzimai RFLP SSR branduolio

SSR chloroplastų

RAPD AFLP fingerprint

STS/EST

Reikalingas pavyzdys

5-10 mg audinių

2-10 mg DNR

10-20 ng DNR

10-20 ng DNR

2-10 ng DNR

0,2-1 µg DNR

10-20 ng DNR

Pakartoja-mumas

labai geras geras - labai geras

vidutinis- geras

vidutinis- geras

blogas-vidutinis

vidutinis-geras

geras

Išvystymas vidutinis sunkus sunkus sunkus lengvas vidutinis vidutinis

Išvystymo kaštai

vidutiniai dideli dideli maži maži dideli

Įvertinimo lengvumas

lengvas -vidutiniškas

sunkus lengvas -vidutiniškas

lengvas -vidutiniškas

lengvas-vidutiniškas

vidutiniškas - sunkus

lengvas –vidutinišk.

Įvertinimo kaštai (lt/pvz.)

maži vidutiniai-dideli, (6)

vidutiniai (4)

vidutiniai (4)

maži (3) vidutiniai – dideli (5)

vidutiniai– dideli (5-6)

Našumas (pvz./dien.)

20 50 50 50 50 20

Įrangos kaina nebrangi vidutinio brangumo

vid. brangi-brangi

vid. brangi-brangi

vidutinio brangumo

vid. brangi-brangi

vid. brangi-brangi

Automatizavi-mo galimybė

ne taip/ne taip/ne taip/ne taip/ne taip

Automatizavi-mo kaštai

dideli dideli dideli vidutiniai dideli dideli

Reikalinga kvalifikacija

žema žema -vidutinė

žema -vidutinė

žema vidutinė aukšta

Radioaktyvu-mo naudojimas

ne taip/ne taip/ne taip/ne ne taip/ne taip/ne

Molekulinių žymenų technologinės savybės

Tyrimu kryptysTyrimu kryptys

Molekulinių metodų panaudojimas miško genetiniuose tyrimuose

•Genetinės įvairovės lygmens ir pasiskirstymo laike ir erdvėje studijos.

•Poravimosi sistemų, šeimyninių ryšių, tėvystės ir genų pernešimo populiacijose ir tarp populiacijų tyrimai.

•Filogenezės ir taksonomijos studijos, rūšių ir populiacijų giminystės tyrimai.

•Kandidatinių genų atsakingų už atsparumą ligoms, kenkėjams, šalčiui, sausrai ir kt. identifikavimas ir lokalizavimas.

•Kiekybinių požymių (augimo, fenologijos ir medienos savybių) lokusų (QTL) identifikavimas.

•Reguliacinių genų ir genų ekspresijos ir adaptyvinio atsako studijos DNR mikrogardelių ir kitų metodų pagalba.

Miško medžių molekulinės genetikos studijų proporcijos

TyriTyrimu mu krypkrypciu ciu

propproporcijorcijosos

DNR zymen naudojimasDNR zymen naudojimas

Izoenzi-mai

RFLP SSR branduolio

SSR chloroplas

t

RAPD AFLP fingerprint

STS/EST

Adaptacinės genetinės variacijos tyrimams

tinkami mažai tinkami

mažai tinkami

mažai tinkami

mažai tinkami

mažai tinkami

labai tinkami

Genomo ir QTL genolapiams sudaryti

mažai tinkami

tinkami tinkami tinkami labai tinkami

labai tinkami

tinkami

Palyginamie-siems genolapiams

labai tinkami

tinkami mažai tinkami

mažai tinkami

netinkami netinkami tinkami – labai tinkami

Kandidati-niams genams nustatyti

mažai tinkami

mažai tinkami

beverčiai beverčiai beverčiai beverčiai labai tinkami

Molekulinių žymenų panaudojimo sritys ir tinkamumas

Organel vs. Organel vs. Brand zymenysBrand zymenys

•Galima stebėti atskirai motinines ir tėvines linijas•Mažesnis efektyvusis populiacijos dydis•Mažas genų pernešimas (gene flow)

Labiau išryškėja populiacijų diferenciacija

Genetinės diferenciacijos koeficientas pagal branduolio genus yra žymiai mažesnis

chloroplastų 69 0.71mitochondrijų 11 0.61branduolio 42 0.19

mitochondrijų 10 0.76

chloroplastų 24 0.16

branduolio 21 0.11

Organoidų žymenų ypatybės lyginant su branduolio žymenimis

N GST

Gaubtaėkliai(Angiospermous)

Plikasėkliai(Gymnospermous)

Organoidų žymenysOrganoidų žymenys

• cpDNA microsatelitai (SSRs)

pasikartojančių kopijų skaičiaus variacija G.G. Vendrami, L. Lelli, P. Rossi, M. Morgante (1996) - Molecular Ecolog y 5: 153-156.

Organoidų molekulinių žymenų, naudojamų populiacinės genetikos ir filogeografinėse studijose, tipai:

• cpDNA (PCR-)RFLP

pavienės mutacijos, ilgio polmorfizmasD. Grivet, B. Heinze, G.G. Vendramin, R.J. Petit (2001) – Molecular Ecology Notes 1: 345-349

• Tandeminių pasikartojimų regonai mtDNA nad1 gene

pasikartojančių kopijų skaičiaus variacija,pakeitimai/intarpai/delecijos in šoniniuose regionuose

C. Sperisen, U. Buchler, F. Gugerli, G. Matyas, T. Geburek, G.G. Vendramin (2001) - Molecular Ecology 10: 257-263

AleliAleliu u

dazdaznis nis ir ir

kiekkiekisis

Alelių kiekis

Alelių dažnis (q)

svarbūs evoliucijai

svarbūs selekcijaisvarbūs medynų įvairovei

plačiai paplitę aleliairetieji aleliainedažni aleliai

Alelių kiekis ir dažnis bei reikšmingumas evoliucijai, selekcijai ir medynų genetinei įvairovei/tvarumui (pagal Danell 1993)

0 0,25 0,50

Pavyzdžių paėmimas DNR žymenų tyrimams

•Kokiam tikslui imsime pavyzdžius?•Koks skaičius ir kokio dažnio aleliai mus domina?

•Kokia numatoma rūšies populiacinė struktūra?

•Koks numatomas rūšies genetinės variacijos pasiskirstymas tarp populiacijų ir populiacijose?

Aleliu Aleliu tipaitipai

Alelių tipai

Paplitimas

Dažnis

Plačiai paplitę Lokalūs

Dažni Dažni plačiai paplitę Dažni lokalūs

Retieji Retieji plačiai paplitę Retieji lokalūs

Dažniems plačiai paplitusiems aleliams sukaupti pakanka keleto nedidelių pavy-zdžių, nesudėtingas darbų planavimas, maži pavyzdžių paėmimo ir analizės kaštai

Retiems plačiai paplitusiems aleliams sukaupti pakanka apimti nedaug populia-cijų, tačiau pavyzdžių skaičius turi būti didelis (>1000), nesudėtingas darbų plana-vimas, bet dėl didelio pavyzdžių kiekio pavyzdžių paėmimo ir analizės kaštai dideli

Dažniems lokaliai paplitusiems aleliams sukaupti reikia apimti daug populiacijų, o kiekvienoje pakanka nedaug pavyzdžių, sudėtingas darbų planavimas – reikia išskirti populiacijas, ekologinius rajonus ir kt., vidutiniai pavyzdžių paėmimo ir analizės kaštai

Retiems lokaliai paplitusiems aleliams sukaupti reikia paieškomis apimti daug populiacijų, populiacijose pavyzdžių skaičius turi būti didelis, sudėtingas darbų planavimas – reikia išskirti populiacijas, ekologinius rajonus ir kt., pavyzdžių paėmimo ir analizės kaštai dideli

Pvz skaiciusPvz skaicius

Minimalus pavyzdžių skaičius, reikalingas norint nustatyti skirtingo dažnio alelius atskirame lokuse norima tikimybe (pagal Gregorius 1980).

Alelių dažnis

 Reikalingas individų (pavyzdžių) skaičius, esant skirtingoms nustatymo tikimybėms (epsilon)

0.95

0.500  6 0.400  7 0.300  110.200  21 0.100  51 0.090  57 0.080  65 0.070  77 0.060  92 0.050  117 0.040  152 0.030  212 0.020  341 0.010  754 0.009  850 0.008  972 

0.99

810 1528 66 74 84 99 

119 149 192 265 422 916 

1030 1174 

0.999

11 14 22 39 88 99 112131156 194 249 341 536 

1146 1285 1462 

Pilnas homozigotiškumas. Tikrasis alelių skaičius ir dažnis deme nėra žinomas

Dažni aleliai

Nedažni aleliai

Reti aleliai

Pvz skaiciusPvz skaicius

Minimalus pavyzdžių skaičius, reikalingas norint nustatyti skirtingo dažnio alelius atskirame lokuse norima tikimybe (pagal Gregorius 1980).

Genotipai deme pasiskirste pagal Hardžio-Weinbergo proporciją. Tikrasis alelių skaičius ir dažnis deme nėra žinomas. Kodominantinė genų veikla

 Alelių dažnis

 Reikalingas individų (pavyzdžių) skaičius, esant skirtingoms nustatymo tikimybėms (epsilon)

0.95 0.99

0.500 3 40.400 4 50.300 6 80.200 11 140.100 26 330.090 29 370.080 33 420.070 39 500.060 46 600.050 59 750.040 76 960.030 106 1330.020 171 2110.010 377 4580.009 425  5150.008 486  587

0.999

6 7 11 2044 50 56 66 78 97 

125 171 268 573 643 731 

Nedažni aleliai

Pop strukturaPop struktura

- didelė tęstinė populiacija, kur geografinis atstumas sąlygoja panašumo laipsnį tarp populiacijų, pavyzdžiai imami vienodais geografiniais atstumais

Pavyzdžių kiekis ir pavyzdžių ėmimo vietų parinkimas priklauso nuo tiriamos medžių rūšies populiacinės struktūros

- viena didelė populiacija, pakanka nedaug pavyzdžių vos kelios ėmimo vietos

- "kontinento-salų" populiacinė struktūra, genai pernešami iš kontinentinės į salų populiacijas, pavyzdžiai imami kiekvienoje populiacijoje

- mažos atskiros populiacijos be žymesnio genų pernešimo, pavyzdžiai imami kiekvienoje populiacijoje

- pakopinė populiacinė struktūra, genų pernešimas vyksta tarp gretutinių populiacijų, pavyzdžiai imami kas kelias populiacijas

Pagal Eriksson, Ekberg 2001

Pop grupPop grup

ŠilutėsPlungės

Telšių

Trakų

Rietavo

Kretingos

Veisiejų

TauragėsKuršėnų

Rokiškio

Žemaitijos

Vilniaus

Utenos

Mažeikių

Valkininkų

Prienų

Zarasų

Biržų

Šiaulių

Alytaus

Kazlų Rūdos

Anykščių

Ukmergės

Kupiškio

Raseinių

Tytuvėnų

Pakruojo

Šakių

Joniškio

DubravosNemenčinės

Jurbarko

Panevėžio

Marijampolės

Radviliškio

Jonavos

Švenčionėlių

Ignalinos

Kauno

Kėdainių

Kaišiadorių

1-as faktorius

2-as

fakt

oriu

s

Paprastasis uosis

Dru

ŠilKur Bir

Nem

VarANP

Ign

Šve

Šal

Tra

Kai

ValZar

JonKaz DubKupTau KauKėd Jur

JonAny ŠakDNP

RokRie

Rad RasUte

TytPlu

UkmVil

MarPan

Pri

Vei

AlyMažŠia

ŽNPKre

Pak

Tel

1-as faktorius

2-a

s fakto

rius

Karpotasis beržas

Pri

Jur

Pan

Kup

Šak

Bir

Val

Kaz

DNP

Ukm

Tau

Mar

Rok

Var

Any

Tra

Dub

Aly

Vil

ZarUte

Ign

Jon

ANP

Maž

Kau

Nem

Šal

Kre

Šil

Rie

Kėd

Kur

Tel

K.N

JoniRad

Šia

Pak

Tyt

ŽNP

Šve

DruKai

Vei

Ras

1-as faktorius

2-as

fakt

oriu

s

Juodalksnis

Atskirų medžių rūšių populiacinės struktūros ypatumai lemia pavyzdžių atrankos strategiją

U popU pop

Paprastojo uosio populiacinė struktūra Lietuvoje: pavyzdžiai DNR tyrimams turėtų būti paimami kiekvienoje išskirtoje populiacijoje

- Populiacijų ribos

- Miško gamtinių regionų ribos

- Kilmių (provenencijų) ribos

Požymio tipasTinkamumas populiacijų diferenciacijai tirti

Tinkamumas genotipams identifikuoti

Metriniai Tinkami adaptaciniams požymiams

Netinkami

Morfologiniai Netinkami Netinkami

Vienas izoenzimų lokusas Netinkami Netinkami

Daug izoenzimų lokusų Riboto tinkamumo Tinkami

Branduolio DNR AFLP Riboto tinkamumo Tinkami

Branduolio DNR RAPD Riboto tinkamumo Tinkami

Branduolio DNR RFLP Riboto tinkamumo Tinkami

Branduolio DNR EST Riboto tinkamumo Netinkami

Branduolio DNR Mikrosatelitai

Riboto tinkamumo Labai tinkami

Chloroplastų DNR Riboto – esant tėviniam paveldėjimuiTinkami – esant motininiam paveldėjimui

Tinkami, kai daugiau lokusų

Mitochondrijų DNR Tinkami Tinkami, kai daugiau lokusų

Galimybės identifikuoti populiacijų skirtumus ir atskirus genotipusPop/ind identifikavPop/ind identifikav

Studiju skaiciusStudiju skaicius

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

19

79

19

80

19

81

19

82

19

83

19

84

19

85

19

86

19

87

19

88

19

89

19

90

19

91

19

92

19

93

19

94

19

95

19

96

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

Metai

Stu

dijų

ska

ičiu

s

Chloroplastų tyrimai

Mitochondrijų tyrimai

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Metai

Stu

dijų

ska

ičiu

sKitiSSRSequenceProbe-RFLPPurif-RFLPPCR-RFLP

19

79

19

80

19

81

19

82

19

83

19

84

19

85

19

86

19

87

19

88

19

89

19

90

19

91

19

92

19

93

19

94

19

95

19

96

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

Augalų ir gyvūnų populiacijų molekulinių žymenų genetinės įvairovės studijų skaičius

Prakt pritaikymasPrakt pritaikymas

•Genotipų identifikavimas (genų banko kolekcijų medžiagos, klonų, sukauptų sėklinėse plantacijose ar klonų kolekcijose ir kt.).

•Miško reprodukcinės medžiagos kilmės kontrolė

•Genetinės įvairovės monitoringas konservacinėse, selekcinėse, reprodukcinėse ir produkcinėse populiacijose: evoliucinio potencialo antropogeninių trikdžių įvertinimas ir kt.

•Selekcija žymenų pagalba (MAS)

Molekulinių žymenų panaudojimas miškininkystės ir miško selekcijos praktikoje

PublikacijosPublikacijos Literatūros sąrašas•Avise J.C. 2004. Molecular markers, natural history and evolution ISBN 0878930418 2nd edition, Sinauer Associates; 440 p.•Brown T.A, 2002. Genomes 2. Wiley-Liss, 2-nd edition ISBN: 0471250465 520 p. •Benfey P. 2004. Essentials of genomics. Prentice Hall ISBN:0130470198, 400 p.•Conner J.K., Hartl D.L. 2004. A Primer of Ecological Genetics ISBN: 087893202X 304 p •Eriksson G. & Ekberg I. 2001. An introduction to forest genetics. SLU Repro, Uppsala •FAO 2001. Forest genomics for conserving adaptive genetic diversity. Paper prepared by Konstantin V. Krutovskii and David B. Neale. Forest Genetic Resources Working Papers, Working Paper FGR/3 (July 2001). Forest Resources Development Service, Forest Resources Division. FAO, Rome. FAO website www.fao.org/fo•Gillet E.M. (ed.). 1999. Which DNA marker for which purpose? Final compendium of the research project on development optimization and validation of molecular tools for assessment of biodiversity in forest trees in the E U DGXII. IFF Univ. Göttingen. •Howell S.H.. 1998. Molecular genetics and plant development. Cambridge University Press, 384 p. •Hughes M. A.. 1996. Plant molecular genetics. Longman Publishing Group. ISBN 0582247306, 248 p. •Karp A., Kresovich S., Bhat K.V., Ayad W.G. and Hodgkin T.. 1997. Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to technologies. IPGRI, Rome. •Kumar S. and Fladung M.. 2004. Molecular genetics and breeding of forest trees. Food Products Press, ISBN: 1560229594. • Rančelis V. 2000. Genetika. Lietuvos MA leidykla. Vilnius. 663 p. •de Vicente, M.C., López, C. and Fulton, T. (eds.) 2004. Genetic diversity analysis with molecular marker data: learning module. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI) and Institute for Genomic Diversity (IGD), Cornell University. Rome, Italy.