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ANALITICOS EN ALIMENTARIA METODOS OFICIALES DE ANALISIS Leche y productos lácteos

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D O S A N A L I T I C O S E N A L I M E N T A R I A

M E T O D O S O F I C I A L E S D E A N A L I S I S

Lechey productoslácteos

PANREAC QUIMICA, S.A. publica una nueva

edición de sus folletos de Métodos Analíticos en Ali-

mentaria, en la que podrán apreciar a simple vista

un cambio de formato respecto a las anteriores.

Esta nueva imagen, pretende ser una expresión de

los cambios que con el tiempo hemos experimentado

en nuestros campos de actividad, puesto que si con-

tinuamos manteniendo una importante implanta-

ción en el sector alimentario como fabricantes de

reactivos para análisis PANREAC y de los aditivos

alimentarios ADITIO, actualmente hemos aumen-

tado nuestra aportación de productos para el análisis

alimentario con nuestras líneas de Cromatografía en

Capa Fina PANREAC-TLC y Medios de Cultivo

Deshidratados para Microbiología CULTIMED.

La colección Métodos Analíticos en Alimentaria se

compone de 6 folletos monográficos, por campos de

alimentos, que recogen una transcripción íntegra

de los métodos oficiales de análisis en España, que

a su vez son publicados en los correspondientes

B.O.E. mencionados en el índice de cada

monografía incorporando los reactivos y productos

auxiliares PANREAC en la calidad considerada

más idónea, así como los medios de cultivo

CULTIMED.

M E T O D O S A N A L I T I C O S E N A L I M E N T A R I A

Los títulos de las 6 monografías son:

Aceites y grasas

Aguas potables de consumo público y aguas de bebida envasadas

Carne y productos cárnicos

Cereales, derivados de cereales y cerveza

Leche y productos lácteos

Productos derivados de la uva,aguardientes y sidras

Obviamente esta edición ha sido actualizada con las

disposiciones publicadas hasta el momento, que

establecen nuevos procedimientos o que modifican

notablemente características anteriormente estable-

cidas.

Por último, comentarles que están a su disposición

además de esta colección, nuestros:

Catálogo General de Reactivos PANREAC

Catálogo ADITIO de Aditivos Alimentarios

Catálogo CULTIMED de Medios de Cultivo Deshi-

dratados

Catálogo PANREAC-TLC de Placas, Folios y

Accesorios para Cromatografía en Capa Fina.

M

Leche: I. Leches natu-ral, certificada, higieni-zada, esterilizada, des-natada, concentrada,evaporada, condensaday en polvoMETODOS DE ANALISIS (B.O.E. 20-7-1977,21-7-1977, 31-5-1990 Y 3-1-1994)

0- Métodos oficiales de toma de muestras de leches parcialmente deshidratadas y en polvo ..................... 8

1a- Grasa (Leches natural, certificada,higienizada y esterilizada) ..................... 14

1b- Grasa (Leche desnatada) ..................... 161c- Grasa (Leche concentrada,

evaporada y condensada) .................... 181d- Grasa (Leche en polvo) ........................ 191e- Grasa (Leche natural) (Método Gerber) . 202- Proteínas ............................................. 213- Caseína ............................................... 224- Lactosa ............................................... 235a- Extracto seco (Leches natural,

certificada, higienizada y esterilizada) ... 245b- Extracto seco (Leches concentrada,

evaporada y condensada) .................... 256- Cenizas ............................................... 267- Potasio Dicromato ............................... 278a- Acidez (Leches natural, certificada,

higienizada y esterilizada) ..................... 278b- Acidez (Leche en polvo) ....................... 289- Sacarosa (Determinación polarimétrica

en la leche condensada) ...................... 2810- Humedad (Leche en polvo) .................. 3111- Indice de solubilidad (Leche en polvo) .. 3112- Calcio .................................................. 3213- Fósforo ................................................ 3414a- Harina de alfalfa (Método

comparativo) (B.O.E. 30-8-1979).......... 3514b- Harina de alfalfa (Método gravimétrico). 3615- Fenolftaleína en leche

desnaturalizada (Método cualitativo) ..... 3716- Fécula (Método comparativo) ............... 3717- Salvado ............................................... 3718- Fécula + Salvado ................................. 3819- Sustancias proteicas reductoras

(B.O.E. 14-10-81) ................................ 3820- Residuo insoluble de sangre

(B.O.E. 20-1-1982) .............................. 4021- Detección de leche de vaca en

mezclas con leche de oveja y cabra ..... 4022- Sangre soluble..................................... 42

I N D I C E

23a- Determinación de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (por electroforesis) ...................................... 43

23b- Determinación de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (métodoinmunológico) ...................................... 45

24a- Determinación de leche de cabraen leche de oveja (por electroforesis).... 47

24b- Determinación de leche de cabraen leche de oveja (métodoinmunológico) ...................................... 48

25- Determinación de suero de quesería en leche mediante análisis de los glicomacropéptidos por cromatografía líquida de alta eficacia.......................... 48

Leche: II. Leches eva-porada rica en grasa,entera condensada, enpolvo rica en grasa oextragrasa, concen-trada.METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 4-2-1989)

0- Preparación de la muestra para el análisis químico y consideraciones generales............................................. 53

1- Extracto seco (Estufa) .......................... 542- Humedad (Estufa) ................................ 553- Materia grasa (Método Rose-Gottlieb) .. 564- Materia grasa (Método Rose-Gottlieb) .. 585- Sacarosa (Método polarimétrico) .......... 616- Acido láctico y lactatos ........................ 637- Actividad de la fosfatasa (Método

de Sanders y Sager modificado) .......... 648- Actividad de la fosfatasa (Método

de Aschaffenburg y Mullen) .................. 66

MantequillaMETODOS DE ANALISIS (B.O.E. 21-7-1977, 22-7-1977, 30-8-1979, 30-10-91)

0- Toma de muestra (B.O.E. 5-1-1975, Anejo único apartado 1.)......................... 70

1- Indice de acidez de la grasa ................... 712- Indice de refracción de la grasa .............. 713- Sodio Cloruro ......................................... 724- Agua, extracto seco magro y grasa en

una sola muestra ................................. 72

5- Detección de grasa vegetal en grasa de leche por cromatografía de gases de esteroles.............................................. 74

6- Fosfatasa residual en mantequilla ......... 767- Indices de ácidos grasos volátiles solu-

bles e insolubles .................................. 788- Indice de Kirschner .............................. 809- Acidos grasos de cadena corta............ 8010- Extracción de la grasa en mantequilla .. 84

QuesoI. ORDEN DE 29 DE NOVIEMBRE DE 1985POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMASDE CALIDAD PARA QUESOS Y QUESOSFUNDIDOS DESTINADOS AL MERCADOINTERIOR. (B.O.E. 6-12-1985) ................ 86

II. METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 30-8-1979 Y 30-10-1991)

0- Técnica de toma de muestra (B.O.E. 5-8-1970) ............................................ 91

1- Extracción de la grasa del queso ......... 922- Determinación del contenido en

materia grasa....................................... 933- Determinación del contenido de

extracto seco....................................... 954- Determinación del contenido en fósforo5- Determinación del contenido en ácido

cítrico .................................................. 976- Determinación del contenido en lactosa . 987- Nitratos y nitritos.................................... 1058- Determinación de leche de vaca en

queso de oveja o de cabra (por electro-foresis) ................................................... 108

9- Determinación de leche de cabra en queso de oveja (por electroforesis)......... 109

YogurI. ORDEN DE 1 DE JULIO DE 1987 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DECALIDAD PARA EL YOGUR O YOGHOURTDESTINADO AL MERCADO INTERIOR.(B.O.E. 3-7-1987)....................................... 111

II. METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 3-7-1987).

1- Preparación de la muestra. Norma Chimie Ministerio de Agricultura francésXIV-1 ................................................... 113

2- Determinación del contenido en materiagrasa (Método Acido Butirométrico). Norma Chimie Ministerio de Agricultura francés XIV-3 ....................................... 113

M

3- Determinación de la materia seca (Méto-do por secado). Norma Chimie Ministe-rio de Agricultura francés XIV-2 ............ 115

4- Identificación de colorantes, edulcoran-tes,espesantes y conservadores .......... 116Métodos seleccionados y recomen-dados por el Centro Nacional de Alimentación y Nutrición.

5- Analisis microbiológico. Métodos seleccionados y recomendados por el Centro Nacional de Alimentación y Nutrición.............................................. 116

6- Fenolftaleína (Método cualitativo) (B.O.E. 30-8-1979 apartado 15(b)) ....... 116

CuajadaORDEN DE 14 DE JUNIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DE CALIDAD PARA LA CUAJADA EN EL MERCADO INTERIOR. ............................... 118

NataORDEN DE 12 DE JULIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMAS DE CALIDAD PARA LA NATA Y NATA EN POLVO CON DESTINO AL MERCADOINTERIOR. ..................................................... 121

Relación de reactivosy productos auxiliaresque se utilizan en losmétodos analíticos,Leche y ProductosLácteos ........................................... 127

Aditivos y coadyuvan-tes tecnológicos parauso alimentario industrial .................................... 131

Leche: I. Leches natu-ral, certificada, higie-nizada, esterilizada,desnatada, concentra-da, evaporada, con-densada y en polvo.

M

METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 20-7-1977,21-7-1977, 31-5-1990 Y 3-1-1994)

0. METODOS OFICIALES DE TOMA DEMUESTRAS DE LECHES PARCIALMENTEDESHIDRATADAS Y EN POLVO

0(a). TOMA DE MUESTRAS DE LECHESPARCIALMENTE DESHIDRATADAS

0(a).1. Objeto.Obtener de una partida determinada una

muestra representativa, con carácter oficial, parapoder comprobar a partir de ellas sus característi-cas físico-químicas.

0(a).2. Ambito de aplicación.Este método de toma de muestras se aplicará a:Leche concentrada.Leche evaporada.Leche condensada.Bien sean desnatadas, semidesnatadas, ente-ras y/o ricas en grasa.

0(a).3. Definiciones.Partida: La cantidad de producto que constitu-

ye una unidad de características presuntamenteuniformes.

Cuando la cantidad de producto a muestrearsea superior a 100 Tm, se fraccionará, teórica-mente y a efectos de muestreo, en tantas partidasde hasta 100 Tm como sea necesario.

Toma elemental: Cantidad tomada en un puntode la partida.

Muestra global: Conjunto constituido por lastomas elementales efectuadas de la misma parti-da, homogeneizada o no según se indica másadelante.

Muestra reducida: Parte representativa de lamuestra global obtenida por reducción de ésta.

Muestra final: Parte de la muestra reducida o dela muestra global, previamente homogeneizada.

0(a).4. Material y aparatos.0(a).4.1. Condiciones generales.- Los aparatos

y utensilios destinados a la toma de muestras deleches parcialmente deshidratadas deberán serde acero inoxidable u otro material idóneo, noabsorbente, de resistencia adecuada, que no pro-voque alteración alguna que pudiera afectar a losresultados de los análisis.

El equipo será de construcción lo suficiente-mente fuerte para evitar que se deforme durantesu utilización. Todas las superficies deberán estarpulidas y exentas de grietas, y todos los ángulosdeberán ser redondeados.

0(a).4.2. Agitadores para líquidos.- Los agita-dores para mezclar líquidos a granel tendrán unasuperificie suficiente para remover el producto de

manera adecuada sin que se produzcan malosolores. Considerando los diferentes tamaños yformas de los recipientes, no puede recomendar-se ningún diseño específico de agitador paratodos los fines, pero se diseñarán de forma que seevite arañar la superficie interna de los recipientesdurante la agitación.

Una forma recomendada de agitador parahomogeneizar líquidos en cubos o bidones tienelas siguientes dimensiones (figura 1):

Disco de 150 mm de diámetro, perforado conseis agujeros de 12,5 mm de diámetro cada uno,siguiendo una circunferencia de 100 mm de diá-metro: el centro del disco se fija a una barra metá-lica, cuyo otro extremo es un mango en forma deasa. La longitud de la barra, incluyendo el mango,será de un metro aproximadamente.

Un agitador adecuado para las cisternas decamiones, granjas y trenes deberá tener lassiguientes dimensiones aproximadas (figura 2):

Una barra de no menos de dos metros de lon-gitud, con un disco de 300 mm de diámetro, per-forado con doce agujeros de 30 mm de diámetrocada uno siguiendo una circunferencia de 230mm de diámetro.

Para homogeneizar el contenido de recipientesgrandes, es recomendable la agitación eléctrica omecánica o mediante aire comprimido limpio. Seutilizará un mínimo de presión y de volumen deaire para evitar la formación de malos olores.Siempre que en este método se requiera "airecomprimido limpio", es necesario utilizar aire com-primido exento de contaminantes (incluyendoaceite, agua y polvo).

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DIMENSIONES EN MILIMETROS

Figura 1Agitador de líquidos para bidones y cubos

DIMENSIONES EN MILIMETROS

Figura 2Agitador de líquidos adecuado para cisternas de camiones,

granjas y trenes

0(a).4.3. Agitador.- De hoja ancha, de suficien-te profundidad para alcanzar el fondo del reci-piente del producto y que tenga preferentementeun borde adaptado al contorno del recipiente (verfigura 3).

0(a).4.4. En la figura 4 se muestra un cazo deforma y tamaño adecuado para la toma de mues-tras. El cazo deberá estar dotado de un mangosólido de al menos 150 mm de longitud. La capa-cidad del cazo será de al menos 50 ml. Es prefe-rible que el mango sea curvado.

También puede utilizarse un cazo de capacidadsemejante pero que tenga lados paralelos gradua-dos en cinco secciones iguales para facilitar latoma de muestras, proporcionalmente, de más deun recipiente.

0(a).4.5. Varilla.- Redonda, de un metro de lon-gitud y 35 mm de diámetro aproximadamente.

0(a).4.6. Recipiente.- Para el submuestreo, concinco litros de capacidad y boca ancha.

0(a).4.7. Cuchara o espátula de rama larga.- Dehoja ancha.

0(a).4.8. Recipientes para muestra.- Serán pre-ferentemente opacos. En caso de que fuerantransparentes, el recipiente con su contenidodeberá colocarse en lugar oscuro. Ver 0(a).4.1,0(a).7.1, 0(a).7.3 y 0(a).7.4.

0(a).5. Procedimiento.0(a).5.1. Toma de muestras de leche concen-

trada y evaporada.- La muestra se homogeneiza-rá convenientemente utilizando los procedimien-tos manuales o mecánicos adecuados. Tomar lamuestra inmediatamente después de la homoge-neización utilizando un cazo, siendo su peso deno menos de 200 g. En este caso, en la etiqueta

de la muestra y en un informe se anotará esta cir-cunstancia.

0(a).5.1.1. Toma de muestras de productosenvasados en recipientes pequeños para la ventaal por menor.- La muestra será constituida por elrecipiente intacto y sin abrir.

Se tomará uno o más recipientes del mismolote o número de código para formar una muestrade no menos de 200 g.

0(a).5.2. Toma de muestras de leche conden-sada.

0(a).5.2.1. Generalidades.- La toma de mues-tras de recipientes a granel de leche condensadapuede ser de gran dificultad, especialmente cuan-do el producto es muy viscoso y no está homo-geneizado. Pueden surgir problemas por la pre-sencia de grandes cristales de sacarosa o de lac-tosa, o por la precipitación de algunas sales quepueden aparecer en toda la masa del producto oadherirse a las paredes, o por la presencia de gru-mos. Estas condiciones pueden apreciarse si seintroduce una varilla de muestreo en el recipientedel producto y se retira después de explorar unasuperficie del recipiente tan amplia como seaposible. Si el tamaño de los cristales de azúcar noes mayor de 6 mm, no deberán encontrarse difi-cultades en la toma de muestras por esta causa.

Si el producto no es homogéneo, hay que ano-tarlo en la etiqueta de la muestra y en el informe.Como la leche condensada se almacena con fre-cuencia a temperatura ambiente, se recomiendaque para obtener una muestra representativa semantenga el contenido a una temperatura no infe-rior a 20ºC.

0(a).5.2.2. Recipientes abiertos (barriles).- Seseparará la tapa del recipiente previamente limpiay seca para evitar que caiga materia extrañadurante el proceso de apertura. El contenido sehomogeneizará utilizando un agitador (ver figura3). Se pasará la hoja por los lados y el fondo delrecipiente para eliminar cualquier producto queestuviera adherido. Se homogeneizará totalmenteel contenido mediante una combinación de movi-mientos de rotación y verticales, con el agitadorinclinado en diagonal, teniendo cuidado para evi-tar la incorporación de aire a la muestra. Se extra-erá el agitador y la leche condensada adherida aél pasará a un recipiente de cinco litros (0(a).4.6.)utilizando una espátula o una cuchara. Se repeti-rá el proceso de homogeneización y extracciónhasta que reúnan dos-tres litros. Estos se agitaránhasta homogeneidad y se tomará una muestra deno menos de 200 gramos.

0(a).5.2.3. Bidones cerrados con tapones en elextremo o en el lado.- Por las razones descritasen 0(a).5.2.1. la toma de muestras a través delagujero del tapón sólo es adecuada con lechecondensada que fluye fácilmente y que sea deconsistencia uniforme. El contenido se mezclará

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M

Figura 3Agitador adecuado para homo-geneizar leche condensada en

barriles.

Figura 4Cazo adecuado para líquidos

introduciendo una varilla a través del agujero y,después de moverlo y agitarlo en la medida de loposible en todas las direcciones, se extraerá lavarilla y se preparará una muestra según se des-cribe en 0(a).5.2.2. También puede efectuarsedejando que el contenido pase a un recipienteadecuado, teniendo cuidado de que pase lamayor cantidad posible del bidón. Después deagitar con un agitador se formará la muestrasegún se describe en 0(a).5.2.2.

0(a).5.2.4. Toma de muestras de productosenvasados en recipientes pequeños para la ventaal por menor.- La muestra estará constituida por elrecipiente intacto y sin abrir. Tomar uno o másrecipientes del mismo lote o número de códigopara formar una muestra de no menos de 200gramos.

0(a).6. Exigencias cuantitativas.El acceso a la partida debe ser tal que permita

tomar muestras de todas las partes que la com-ponen.

Todos los envases deberán ser de la mismapartida y tomados en distintos puntos de ella.

0(a).6.1. Tomas elementales.- El muestreo debeser representativo de la partida examinada, por lo

que el número mínimo de tomas elementalesserán las indicadas en el cuadro.

0(a).6.2. Muestra global.- La totalidad de lamasa o volumen de las tomas elementales desti-nadas a construir la muestra global no puede serinferior a:

Cuatro kilos en los graneles y productos enva-sados en envases con un contenido superior a 1kilo.

Seiscientos gramos en productos envasadoscon un contenido inferior a 1 kilo.

0(a).7. Instrucciones referentes a las tomas, pre-paración y el acondicionamiento de las muestras.

0(a).7.1. Generalidades.- Tomar y preparar lasmuestras lo más rápidamente posible, teniendoen cuenta las precauciones necesarias para evitarque el producto se altere o contamine.

Los aparatos y utensilios, así como las superfi-cies y recipientes destinados a recibir las mues-tras deben estar limpios y secos.

0(a).7.2. Preparación de las muestras globa-les.- Reunir las tomas elementales para constituiruna sola muestra global.

0(a).7.3. Preparación de las muestras para suanálisis.- Tomar las precauciones necesarias para

10

0(a).6.1.1 Graneles:Partidas que no excedan de 2,5 toneladasPartidas de más de 2,5 toneladas..................

0(a).6.1.2 Productos envasados:0(a).6.1.2.1 Envases con un contenido supe-

rior a 1 kilogramo.Partidas compuestas de 1 a 4 envases..........Partidas compuestas de 5 a 16 envases........Partidas compuestas de más de 16 envases..

0(a).6.1.2.2 Envases con un contenido igual oinferior a 1 kilogramo:

Partidas hasta 100 envases...........................Partidas de 101 a 1.000 envases...................Partidas de 1.001 a 10.000 envases..............Partidas de más de 10.000 envases..............

Número de tomas elementales

720 veces el número de toneladas de queconste la partida, limitado a un máximode 40 tomas elementales.

Todos los envases4

Del número de envases que componganla partida, limitado a un máximo de 20envases.

36

1212+3 más por cada fracción de 2.500envases (que exceda de 10.000).

Ö

ÖCuando la cifra obtenida sea un número fraccionario, se redondeará éste hasta el número entero

inmediatamente superior.

evitar cualquier modificación de la composición delos ejemplares de la muestra, contaminación oalteración que pueda sobrevenir en el transcursode la toma, del transporte o del almacenamiento.

0(a).7.3.1. Productos a granel o envasadospara venta al por mayor superiores a 1 kilogramo.-Mezclar con cuidado cada muestra global paraobtener una muestra homogénea. Si es necesa-rio, reducir la muestra global hasta dos kilos(muestra reducida).

Preparar a continuación tres ejemplares de lamuestra final que tengan la misma masa o elmismo volumen, aproximadamente. Introducircada ejemplar en un recipiente apropiado.

0(a).7.3.2. Productos envasados para la ventaal detalle: La muestra final estará formada por latotalidad de las tomas elementales, las cuales serepartirán en tres bloques iguales, cada uno de loscuales constituirá un ejemplar de la muestra final.

0(a).7.4. Acondicionamiento de las muestraspara análisis.- Etiquetar y precintar o sellar losrecipientes o los envases que las contenga (la eti-queta debe estar incorporada en el sello o precin-to) de manera que le sea imposible abrirlos sindeteriorar el precinto o sello, manteniendo la tem-peratura adecuada en cada caso.

0(a).8. Personal autorizado.Las tomas de muestras destinadas a controles

oficiales se llevarán a cabo por personal autoriza-do y acreditado por los Organismos competentes.

0(a).9. Acta de la toma de muestra.Cada muestra deberá estar identificada por un

acta que permita determinar sin ambigüedad lapartida controlada.

0(b). METODO DE TOMA DE MUESTRASDE LECHES EN POLVO

0(b).1. Objeto.Obtener de una partida determinada una

muestra representativa, con carácter oficial, parapoder comprobar a partir de ella sus característi-cas físico-químicas.

0(b).2. Ambito de aplicación.Este método de toma de muestras se aplicará a:Leche entera en polvo.Leche descremada en polvo.Leche en polvo parcialmente descremada.Leche en polvo con alto contenido en grasa.

0(b).3. DefinicionesPartida: La cantidad de producto que constitu-

ye una unidad de características presuntamenteuniformes.

Cuando la cantidad de producto a muestrear

sea superior a 100 toneladas, se fraccionará, teó-ricamente y a efectos de muestreo, en tantas par-tidas de hasta 100 toneladas como sea necesario.

Toma elemental: Cantidad tomada en un puntode la partida.

Muestra global: Conjunto constituido por lastomas elementales efectuadas en la misma parti-da, homogeneizada o no según se indica másadelante.

Muestra reducida: Parte representativa de lamuestra global obtenida por reducción de ésta.

Muestra final: Parte de la muestra reducida o dela muestra global, previamente homogeneizada.

0(b).4. Material y aparatos.0(b).4.1. Condiciones generales.- Los aparatos

y utensilios destinados a la toma de muestras deleche en polvo deberán ser de acero inoxidable uotro material idóneo, no absorbente, de resistenciaadecuada, que no provoque alteración alguna quepudiera afectar a los resultados de los análisis.

El equipo será de construcción lo suficiente-mente fuerte para evitar que se deforme durantesu utilización. Todas las superficies deberán estarpulidas y exentas de grietas y todos los ángulosdeberán ser redondeados.

0(b).4.2. Sondas: Larga (tipo A) y corta (tipo B)(ver figura 1).- Las dimensiones de las sondas, yasean de hendidura larga o dividida en comparti-mentos, corta o de cualquier otro tipo, deberánadaptarse a las características de la partida (pro-fundidad del recipiente, dimensiones del saco,etc.) y al tamaño de las partículas que compongala leche en polvo.

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M

Figura 1. Sondas para leche en polvo(todas las dimensiones se expresan en mm)

La hoja y el cierre deberán ser de metal pulido,preferentemente de acero inoxidable. El mango detipo largo también deberá ser preferentemente deacero inoxidable. La sonda de tipo corto tendrá unmango desmontable de madera o plástico, fijadoa la hoja por una unión o bayoneta. La forma, elmaterial y el acabado deberán ser tales que lasonda pueda limpiarse fácilmente.

El borde sobresaliente de la hoja del tipo Adeberá ser lo bastante agudo como para quepueda servir de raspador.

La punta de la hoja deberá ser bastante agudapara facilitar la toma de muestras.

Las sondas deberán presentar las dimensionesque se indican (con una tolerancia del 10 por 100)(dimensiones en milímetros):

Tipo A Tipo Blarga corta––––– –––––

Longitud de la hoja ................. 800 400Espesor del metal de la hoja ... 1 a 2 1 a 2Diámetro interno de la hojaen la punta ............................. 18 32Diámetro interno de la hoja en el mango o en el eje................ 22 28Anchura de la ranura en la punta 4 20Anchura de la ranura en elmango o en el eje ................... 14 14

Advertencias sobre el uso de las sondas:En el caso de la leche en polvo, más o menos

adherentes, las sondas pueden introducirse verti-calmente. Las sondas del tipo A se llenan com-pletamente girando y se extraen verticalmente.Las sondas del tipo B se llenan completamentedurante la introducción pero deben extraerse enposición oblicua para evitar pérdidas en el extre-mo inferior.

En el caso de leche en polvo, más o menos flui-da, se inclinarán los recipientes, se introducirán lassondas casi horizontalmente con la ranura haciaabajo y se extraerán con la ranura hacia arriba.

0(b).4.3. Cuchara o espátula de mango largo.0(b).4.4. Recipiente de muestreo en cintas

transportadoras.- Su forma y dimensiones seajustarán aproximadamente a las que se indicanen la figura nº 2.

En su defecto se utilizará cualquier otro reci-piente que, alcanzando la misma finalidad, cumplalas condiciones generales señaladas en 4.1.

0(b).4.5. Bolsa portaporciones.- Ha de ser deutilización única, preferentemente de materialplástico flexible y de dimensión aproximada de 30por 40 centímetros.

Se utilizará acoplada a la boca posterior de lassondas o para almacenamiento de cualquier otratoma elemental de alimentos no líquidos (figura 3).

0(b).4.6. Fraccionador.- Para las tomas elemen-tales, así como para la preparación de las mues-

tras reducidas y de las muestras finales, se podránutilizar aparatos o utensilios destinados a dividir lasmuestras en partes aproximadamente iguales.

0(b).5. Procedimiento.0(b).5.1. Generalidades.- Se pondrá cuidado

en evitar la absorción de humedad atmosféricapor el producto contenido en el recipiente duran-

12

Figura 2Dimensiones aproximadas en mm

Figura 3Dimensiones aproximadas en cm

te la toma de muestras para el análisis. El reci-piente se volverá a cerrar perfectamente despuésde realizar la toma de muestras.

0(b).5.2. Toma de muestras.- Se tomará unamuestra no inferior a 200 gramos.

Se pasará la sonda limpia y seca a través delproducto; en caso necesario inclinado o poniendode lado el recipiente. Se orientará la ranura haciaabajo y se adoptará un ritmo uniforme de pene-tración. Cuando la sonda alcance el fondo delrecipiente se hará girar 180 grados, se extraerá yse descargará el contenido en el recipiente de lamuestra. Se efectuará una o varias tomas paraobtener una muestra no inferior a 200 gramos. Elrecipiente de la muestra se cerrará inmediatamen-te después de tomar la misma.

En caso de productos envasados en recipien-tes pequeños para la venta al por menor, la mues-tra estará constituida por el recipiente intacto y sin

abrir. Se tomará uno o más recipientes del mismolote o con el mismo número de código para obte-ner una muestra de no menos de 200 gramos.

Las muestras deberán tomarse siempre deesta forma cuando se necesite determinar propie-dades que puedan alterarse fácilmente.

0(b).6. Exigencias cuantitativas.El acceso a la partida debe ser tal que permita

tomar muestras de todas las partes que la com-ponen.

Todos los envases deberán ser de la mismapartida y tomados en distintos puntos de ella.

0(b).6.1. Tomas elementales.- El muestreodebe ser representativo de la partida examinada,por lo que el número mínimo de tomas elementa-les será:

0(b).6.2. Muestra global.- La totalidad de lamasa o volumen de las tomas elementales desti-

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M

0.6.1.1 Graneles:

Partidas que no excedan de 2,5 toneladas

Partidas de más de 2,5 toneladas

0.6.1.2 Productos envasados:

0.6.1.2.1 Envases con un contenido superior a 1 kilogramo:

Partidas compuestas de 1 a 4 envases .......

Partidas compuestas de 5 a 16 envases .....

Partidas compuestas de más de 16 envases

0(b).6.1.2.2 Envases con un contenido igual oinferior a 1 kilogramo:

Número de tomas elementales

7

20 veces el número de toneladas de queconste la partida, limitado a un máximode 40 tomas elementales.

Todos los envases

4

Del número de envases que componganla partida, limitado a un máximo de 20envases.

Ö

ÖPartidas hasta 100 envases ........................

Partidas de 101 a 1.000 envases ................

Partidas de 1.001 a 10.000 envases ...........

Partidas de más de 10.000 envases............

3

6

12

12+3 más por cada fracción de 2.500 enva-ses (que exceda de 10.000).

Cuando la cifra obtenida sea un número fraccionario, se redondeará éste hasta el número ente-ro inmediatamente superior.

nadas a construir la muestra global no puede serinferior a:

- Cuatro kilos en los graneles y productosenvasados en envases con un contenido superiora un kilo.

- Seiscientos gramos en productos envasadoscon un contenido inferior a un kilo.

0(b).7. Instrucciones referentes a las tomas, pre-paración y el acondicionamiento de lasmuestras.

0(b).7.1. Generalidades.- Tomar y preparar lasmuestras lo más rápidamente posible, teniendoen cuenta las precauciones necesarias para evitarque el producto se altere o contamine.

Los aparatos y utensilios, así como las superfi-cies y recipientes destinados a recibir las mues-tras deben estar limpios y secos.

0(b).7.2. Preparación de las muestras globa-les.- Reunir las tomas elementales para constituiruna sola muestra global.

0(b).7.3. Preparación de las muestras para suanálisis.- Tomar las precauciones necesarias paraevitar cualquier modificación de la composición delos ejemplares de la muestra, contaminación oalteración que pueda sobrevenir en el transcursode la toma, del transporte o del almacenamiento.

0(b).7.3.1. Productos a granel o envasadospara venta al por mayor superiores a un kilogra-mo.- Mezclar con cuidado cada muestra globalpara obtener una muestra homogénea. Si esnecesario, reducir la muestra global hasta doskilos (muestra reducida).

Preparar a continuación tres ejemplares de lamuestra final que tengan la misma masa o elmismo volumen, aproximadamente. Introducircada ejemplar en un recipiente apropiado.

0(b).7.3.2. Productos envasados para la ventaal detalle.- La muestra final estará formada por latotalidad de las tomas elementales, las cuales serepartirán en tres bloques iguales, cada uno delos cuales constituirá un ejemplar de la muestrafinal.

0(b).7.4. Acondicionamiento de las muestraspara análisis.- Etiquetar y precintar o sellar losrecipientes o los envases que las contengan (laetiqueta debe estar incorporada en el sello o pre-cinto) de manera que le sea imposible abrirlos sindeteriorar el precinto o sello, manteniendo la tem-peratura adecuada en cada caso.

0(b).8. Personal autorizado.Las tomas de muestras destinadas a controles

oficiales se llevarán a cabo por personal autoriza-do y acreditado por los Organismos competentes.

0(b).9. Acta de la toma de muestras.

Cada muestra deberá estar identificada por unacta que permita determinar sin ambigüedad lapartida controlada.

1(a). GRASA(Leches natural, certificada,higienizada y esterilizada)

1(a).1. Principio.Este método es aplicable a las leches natura-

les, certificada, higienizada y esterilizada, enteraso parcialmente desnatadas, definidas en el Regla-mento de Centrales Lecheras y otras IndustriasLácteas.

Se entiende por contenido en materia grasa delas leches natural, certificada, higienizada y esteri-lizada, el porcentaje en masa de las sustanciasdeterminadas por el procedimiento expuesto acontinuación, que corresponde al descrito en lanorma FIL-1A: 1969 de la Federación Interna-cional de Lechería.

El contenido en materia grasa se determinagravimétricamente, por extracción de la citadamateria grasa de una solución alcohólico-amonia-cal del tipo de leche de que se trate, medianteéter étilico y éter de petróleo, evaporación de losdisolventes y pesado del residuo, según el princi-pio del método de Röse-Gottlieb.

1(a).2. Material y aparatos.1(a).2.1. Balanza analítica.1(a).2.2. Probetas o matraces de extracción

adecuados, provistos de tapones de vidrio esme-rilado, de tapones de corcho y otros dispositivosde cierre inatacables por los disolventes utiliza-dos. Los tapones de corcho serán de buena cali-dad y se tratarán sometiéndolos sucesivamente aextracciones con éter etílico y con éter de petró-leo. Después se introducirán durante 20 minutos,por lo menos, en agua a una temperatura de 60ºC o superior, y se dejarán enfriar también en agua,con objeto de que estén saturados cuando se uti-licen.

1(a).2.3. Matraces de paredes delgadas ybases planas, de una capacidad de 150 a 250 ml.

1(a).2.4. Estufa de desecación, bien ventilada ycontrolada termostáticamente (ajustada para quefuncione a una temperatura de 102 ± 2º C), o unaestufa de desecación por vacío (temperatura 70-75º C, presión menor de 50 mm de Hg).

1(a).2.5. Materiales para facilitar la ebullición,exentos de materia grasa, no porosos ni delezna-bles al ser utilizados, como, por ejemplo, perlasde vidrio o trozos de carburo de silicio (el empleode estos materiales es facultativo, véase el apar-tado 1(a).4.3.

1(a).3. Reactivos Todos los reactivos deberán ser de calidad

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pura para análisis y no dejar en la evaporaciónmayor cantidad de residuos que la autorizadapara el ensayo en blanco (1(a).4.2.). En casonecesario, los reactivos podrán destilarse denuevo en presencia de 1 g aproximadamente demantequilla deshidratada por 100 ml de disolven-te. El agua que se utilice deberá ser destilada o,por lo menos, de igual pureza que el agua destila-da.

131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Dietílico estabilizado con ~ 6

ppm de BHT PA-ACS131315 Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO131542 Potasio Yoduro PA-ISO

1(a).3.1. Amoníaco 25% (en NH3) PA (densidadaproximada a 20/4 0,910) o una solución másconcentrada conociéndose dicha concentración.

1(a).3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su defecto,153973 Etanol 96º totalmente desnaturalizadoPR.

1(a).3.3. Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS, exento de Peróxidos.

Para el ensayo de los peróxidos, añadir a 10 mlde Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm de BHTPA-ACS contenidos en una pequeña probeta contapón de vidrio, previamente enjuagada con unpoco de éter, 1 ml de solución al 10% de PotasioYoduro PA-ISO, recien preparada. Agitar y dejarreposar durante 1 minuto. No debe aparecer colo-ración amarilla en ninguna de las dos capas.

El Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm deBHT PA-ACS puede mantenerse exento de peró-xidos, añadiendo una lámina de Zinc húmeda, quedeberá sumergirse completamente en una solu-ción ácida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidratoPA-ACS-ISO durante 1 minuto y después lavarsecon Agua PA-ACS. Por litro de Eter Dietílico esta-bilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, utilizar unasuperficie de 80 cm2 aproximadamente de láminade Zinc cortada en bandas lo suficientemente lar-gas para que lleguen por lo menos hasta el centrodel recipiente.

1(a).3.4. Eter de Petróleo de puntos de ebulli-ción entre 30º C y 60º C. En su defecto usar Eterde Petróleo 40-60ºC PA-ISO.

1(a).3.5. Disolvente mixto, preparado pocotiempo antes de su utilización, mezclando volú-menes iguales de Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS y Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO (se podrá sustituir la mezcla dedisolventes en aquellos casos en que su utiliza-ción esté prevista por Eter Dietílico o por Eter dePetróleo.

1(a).4. Procedimiento.1(a).4.1. Preparación de la muestra.- Poner la

muestra a una temperatura de 20ºC. Mezclarlacuidadosamente hasta obtener una distribuciónhomogénea de la materia grasa. No agitar muyenérgicamente para evitar la formación de espu-ma en la leche o el batido de la materia grasa.

Si resulta dificultoso dispersar la capa de nata,calentar lentamente hasta 35-40ºC, mezclando cui-dadosamente y teniendo la precaución de reincor-porar a la muestra la nata que pudiera haberseadherido a las paredes del recipiente. Enfriar rápida-mente la muestra hasta la temperatura ambiente. Sise desea se puede utilizar un homogeneizadorapropiado para facilitar la dispersión de la grasa.

Si se separa la materia grasa líquida o seobserva la presencia de partículas blancas deforma irregular adheridas a las paredes del reci-piente que contiene la muestra, el análisis no darálos resultados correctos.

1(a).4.2. Ensayo en blanco.- Al mismo tiempoque se determina el contenido en materia grasade la muestra, efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS en lugar de la muestra,empleando el mismo tipo de aparato de extrac-ción, los mismos reactivos en las mismas cantida-des y siguiendo el mismo procedimiento que sedescribe a continuación. Si el resultado del ensa-yo en blanco excede de 0,5 mg, habrá que com-probar los reactivos, y aquél o aquéllos que resul-ten impuros deberán sustituirse o purificarse.

1(a).4.3. Determinación.- Secar el matraz (si sedesea con algún material 1(a).2.5., que facilite unaebullición moderada durante la subsiguiente elimi-nación de los disolventes) en la estufa durante unintervalo de media a una hora. Dejar que se enfríeel matraz hasta la temperatura ambiente de labalanza y, una vez enfriado, pesarlo con una apro-ximación de 0,1 mg.

Invertir tres o cuatro veces el recipiente quecontiene la muestra preparada y pesar inmediata-mente en el aparato de extracción, directamente opor diferencia de 10 a 11 g de la muestra bienmezclada, con una aproximación de 1 mg. Añadir1,5 ml de la solución de Amoníaco 25% (en NH3)PA, o un volumen equivalente de una soluciónmás concentrada, y mezclar convenientemente.Añadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA y mezclar sua-vemente, pero de modo homogéneo, mantenien-do abierto el aparato de extracción. Añadir 25 mlde Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm de BHTPA-ACS, cerrar el aparato y agitarlo vigorosamen-te, invirtiéndolo varias veces, durante 1 minuto. Sies necesario, enfriar el aparato con agua corrien-te. Quitar el tapón cuidadosamente y añadir 25 mlde Eter de Petróleo, utilizando los primeros mlpara enjuagar el tapón y el interior del cuello delaparato, dejando que los líquidos de los enjua-gues penetren en el último. Cerrarlo, volviendo a

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M

colocar el tapón, y agitarlo e invertirlo repetida-mente durante 30 segundos. Si no está previstocentrifugar, en la operación descrita, no agitarmuy enérgicamente.

Dejar el aparato en reposo hasta que la capalíquida superior esté completamente límpida y cla-ramente separada de la fase acuosa. Podrá efec-tuarse igualmente la separación mediante el usode una centrífuga adecuada. Si se utiliza una cen-trífuga cuyo motor no sea trifásico, puede produ-cirse chispas y será preciso tomar las debidasprecauciones para evitar una explosión o unincendio debido a la presencia de vapores de éter(por ejemplo, en caso de rotura de un tubo).

Quitar el tapón y enjuagarlo, así como tambiénel interior del cuello del aparato, con algunos mlde la mezcla de disolventes, y dejar que los líqui-dos de los enjuagues penetren en el aparato.Transvasar con cuidado el matraz, lo más com-pletamente posible, la capa superior de decanta-ción o con la ayuda de un sifón. Si el transvase nose efectúa mediante sifón, tal vez sea necesarioañadir un poco de Agua PA-ACS para elevar laseparación entre las dos capas, con objeto defacilitar la decantación.

Enjuagar el exterior e interior del cuello del apa-rato, o el extremo y la parte inferior del sifón, conalgunos ml de la mezcla de disolventes. Dejar des-lizar los líquidos del enjuague del exterior del apa-rato dentro del matraz y los del interior del cuello ydel sifón, dentro del aparato de extracción.

Proceder a una segunda extracción repitiendolas operaciones descritas, desde la adición deEter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm de BHTPA-ACS y 15 ml de Eter de Petróleo. Efectuar unatercera extracción procediendo como se indicaanteriormente, pero omitiendo el enjuague final.Eliminar con cuidado por evaporación o destila-ción la mayor cantidad posible de disolvente(incluido el etanol). Si el matraz es de pequeñacapacidad, será necesario eliminar un poco dedisolvente después de cada extracción de lamanera antes indicada.

Cuando ya no subsiste el olor a disolvente,calentar el matraz, tumbado durante 1 hora en laestufa. Dejar que el matraz se enfríe hasta la tem-peratura ambiente de la balanza como se indicó ypesar con una aproximación de 0,1 mg. Repetir laoperación calentando a intervalos de 30 a 60minutos hasta obtener una masa constante. Aña-dir de 15 a 25 ml de Eter de Petróleo para com-probar si la materia extraída es totalmente soluble.Calentar ligeramente y agitar el disolvente median-te un movimiento rotatorio hasta que toda lamateria grasa se disuelva.

Si la materia extraída es totalmente soluble enel Eter de Petróleo, la masa de materia grasa serála diferencia entre las pesadas efectuadas. Encaso contrario o de duda, extraer completamente

la materia grasa contenida en el matraz, mediantelavados repetidos con Eter de Petróleo caliente,dejando que se deposite la materia no disueltaantes de cada decantación. Enjuagar tres veces elexterior del cuello del matraz. Calentar el matraztumbado durante 1 hora en la estufa y dejar quese enfríe hasta la temperatura ambiente de labalanza, como lo indicado anteriormente, y pesarcon una aproximación de 0,1 mg. La masa de lamateria grasa será la diferencia entre la masaobtenida y la obtenida en esta pesada final.

1(a).5. Cálculo.La masa, expresada en gramos, de la materia

grasa extraída es:(M1 – M2) – (B1 – B2)

y el contenido en materia grasa de la muestra,expresado en porcentaje de la masa, es:

(M1 – M2) – (B1 – B2)––––––––––––––––––––– x 100

Sen donde

M1 = masa, en gramos, del matraz M, que con-tiene la materia grasa después de desecar hastamasa constante.

M2 = masa, en gramos, del matraz M, sin mate-ria grasa, o en el caso de presencia de materiasinsolubles, después de extraer completamente lamateria grasa.

B1 = masa, en gramos, del matraz B, del ensa-yo en blanco, después de desecar hasta masaconstante.

B2 = masa, en gramos, del matraz B, o en elcaso de presencia de materias insolubles, des-pués de extraer completamente la materia grasa.

S = masa, en gramos, de la cantidad de mues-tra utilizada en la determinación.

La diferencia entre los resultados en dosdeterminaciones repetidas (resultados obtenidossimultáneamente o uno inmediatamente despuésde otro, por el mismo analista) no debe sermayor de 0,03 g de materia grasa de 100 g deproducto.

1(a).6. Referencias.1(a).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 1A: 1969.

1(b). GRASA(Leche desnatada)

1(b).1. Principio.Este método es aplicable a las leches líquidas,

no concentradas, y concretamente a la lecheesterilizada desnatada, definida en el Reglamentode Centrales Lecheras y otras Industrias Lácteas.

Se entiende por contenido en materia grasa dela leche desnatada el porcentaje en masa de lacantidad total de lípidos y sustancias lipoides,

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determinada por el procedimiento expuesto acontinuación, que corresponde al descrito en lanorma FIL-22: 1968 de la Federación Interna-cional de Lechería.

El contenido en materia grasa se determinagravimétricamente por adición de amoníaco yalcohol a una cantidad conocida de leche desna-tada, extracción por un disolvente de los lípidos yde las sustancias lipoides, evaporación del disol-vente y pesado del residuo, obtenido por aplica-ción del método Röse-Gottlieb.

1(b).2. Material y aparatos. 1(b).2.1. Balanza analítica, de sensibilidad míni-

ma 0,1 miligramos.1(b).2.2. Probetas o matraces de extracción

apropiados provistos de tapones para cierre her-mético (corcho o vidrio esmerilado).

1(b).2.3. Erlenmeyer o matraces de fondoplano, de 150 a 250 ml de capacidad, con zonaesmerilada para identificación.

1(b).2.4. Materiales que faciliten la ebullición,exentos de materia grasa; por ejemplo, perlas devidrio.

1(b).2.5. Dispositivos apropiados para la eva-poración de los disolventes.

1(b).2.6. Estufa que permita obtener una tem-peratura constante de 102º-104ºC o estufa dedesecación por vacío.

1(b).2.7. Pipetas graduadas de 10 ml.

1(b).3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS131085 Etanol 96% v/v PA131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA132770 Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACS131315 Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO

1(b).3.1. Etanol 96% v/v PA o Etanol desnatu-ralizado con metanol o con éter de petróleo.

1(b).3.2. Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS, exento de peróxidos.

1(b).3.3. Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO.1(b).3.4. Amoníaco 25% (en NH3) PA (densidad

0,91 a 20ºC) límpida e incolora.Los reactivos no deben dejar residuos después

de la evaporación.

1(b).4. Procedimiento.1(b).4.1. Preparación de la muestra.- Mezclar la

muestra cuidadosamente. En caso necesario,calentar la muestra a 35-40ºC y mezclar. Enfriar a20ºC antes del análisis.

1(b).4.2. Determinación.- Con una aproxima-ción de 10 miligramos, pesar alrededor de 10 g, ointroducir exactamente 10 mililitros (a 20º ± 2ºC)de leche desnatada en el aparato de extracción.Añadir 1 ml de la solución Amoníaco 25% (en

NH3) PA y mezclar cuidadosamente. Añadir 10 mlde Etanol 96% v/v PA y mezclar el contenido.Añadir 25 ml de Eter Dietílico estabilizado con ~ 6ppm de BHT PA-ACS y, después de cerrar el apa-rato de extracción, mezclar el contenido agitandoe invirtiendo varias veces durante 1 minuto. Aña-dir 25 ml de Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO,cerrar el aparato de extracción y mezclar el con-tenido agitando e invirtiendo repetidas veces.

Dejar reposar el aparato de extracción por lomenos 2 horas o centrifugar (por lo menos 5minutos a 500-600 revoluciones por minuto) hastaque la capa Eter Dietílico-Eter de Petróleo estétotalmente límpida y completamente separada dela fase acuosa. Transvasar lo más completamenteposible, la capa Eter Dietílico-Eter de Petróleo pordecantación o, con ayuda de un dispositivo desifón (teniendo cuidado de no traspasar la faseacuosa), a un erlenmeyer o matraz de fondoplano, que contenga un material destinado a faci-litar la ebullición, previamente desecado y pesado.

Realizar una segunda extracción utilizando 15ml de Eter Dietílico PA y 15 ml de Eter de Petróleo40-60ºC PA-ISO, siguiendo el procedimiento indi-cado. Transvasar al mismo matraz la capa de EterDietílico-Eter de Petróleo como se indica anterior-mente. Destilar con cuidado los disolventes con-tenidos en el matraz.

Después de la evaporación de los disolventes,secar la materia grasa durante 1 hora en estufa devacío a 70º-75ºC (presión inferior a 50 mm demercurio), o en una estufa de presión normal a102-104ºC, colocando al matraz en posición hori-zontal. Dejar enfriar el matraz y pesar cuando hayaalcanzado la temperatura ambiente. Continuar elproceso de desecación hasta peso constante(desecación en vacío) o hasta un ligero aumentodel peso (desecación a presión normal). En el últi-mo caso, tomar para el cálculo el último valorencontrado antes del aumento del peso. Si seconsidera necesario, la materia grasa puede vol-ver a disolverse en Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO para comprobar el resultado del análisis.

1(b).4.3. Ensayo en blanco.- Para el control delos reactivos es necesario efectuar un análisis enblanco siguiendo exactamente la forma de operarindicada y utilizando 10 ml de Agua PA-ACS enlugar de leche desnatada. El ensayo en blanco nodeberá indicar más que una cantidad inapreciable.

Para determinar la influencia de las variacionesde temperatura y humedad del aire, pesar unmatraz y tratarlo como el utilizado para el análisis,pero sin llenarlo con los disolventes.

1(b).5. Cálculo.En el cálculo de porcentaje de materia grasa se

tendrán en cuenta, si es necesario, los valoresencontrados en los ensayos en blanco. Si la can-tidad de leche tomada para el análisis se ha toma-

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do con ayuda de una pipeta, es necesario teneren cuenta la densidad de la leche.

La diferencia entre los resultados en dos deter-minaciones repetidas no debe ser mayor de 0,005g de materia grasa por 100 g de producto.

1(b).6. Referencia.1(b).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 22: 1963.

1(c). GRASA.(Leches concentrada, evaporada ycondensada)

1(c).1. Principio. Este método es aplicable a las leches concen-

trada, evaporada y condensada, enteras o desna-tadas, definidas en el Reglamento de CentralesLecheras y otras Industrias Lácteas.

Se entiende por contenido en materia grasa delas leches concentrada, evaporada y condensadael porcentaje en masa de las sustancias determi-nadas por el procedimiento expuesto a continua-ción, que corresponde al descrito en la norma FIL-13A: 1969 de la Federación Internacional deLechería.

El contenido en materia grasa se determinagravimétricamente por extracción de la citadamateria grasa en una solución alcohólico-amonia-cal del tipo de leche de que se trate, medianteéter dietílico y éter de petróleo, evaporación de losdisolventes y pesado del residuo, según el princi-pio del método de Röse-Gottlieb.

1(c).2. Material y aparatos.1(c).2.1. Balanza analítica.1(c).2.2. Probetas o matraces de extracción

adecuados provistos de tapones de vidrio esmeri-lado, de tapones de corcho u otros dispositivosde cierre inatacables por los disolventes utiliza-dos. Los tapones de corcho serán de buena cali-dad y se tratarán sometiéndolos sucesivamente aextracciones con éter dietílico y con éter de petró-leo. Después se introducirán, durante 20 minutospor lo menos, en agua a una temperatura de 60ºCo superior y se dejarán enfriar también en aguacon objeto de que estén saturados cuando se uti-licen.

1(c).2.3. Matraces de paredes delgadas ybases planas de una capacidad de 150 a 250 ml.

1(c).2.4. Estufa de desecación bien ventilada ycontrolada termostáticamente (ajustada para quefuncione a una temperatura de 102 ± 2ºC) o unaestufa de desecación por vacío (temperatura 70-75ºC, presión menor de 50 mm de Hg).

1(c).2.5. Materiales para facilitar la ebullición,exentos de materia grasa, no porosos ni delezna-bles al ser utilizados, como, por ejemplo, perlasde vidrio o trozos de carburo de silicio (el empleode estos materiales es facultativo).

1(c).3. Reactivos.Todos los reactivos deben de ser de calidad

pura para análisis y no dejar en la evaporaciónmayor cantidad de residuos que la autorizadapara el ensayo en blanco. En caso necesario, losreactivos podrán destilarse de nuevo en presenciade 1 g, aproximadamente, de mantequilla deshi-dratada por 100 ml de disolvente. El agua que seutilice deberá ser destilada o por lo menos deigual pureza que el agua destilada.

131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACS131315 Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO131542 Potasio Yoduro PA-ISO

1(c).3.1. Amoníaco 25% (en NH3) PA (densidadaproximada a 20/4 0,910) o una solución másconcentrada, conociéndose dicha concentración.

1(c).3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su defecto,153973 Etanol 96º totalmente desnaturalizadoPR.

1(c).3.3. Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS, exento de Peróxidos.

Para el ensayo de los peróxidos, añadir a 10ml de Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm deBHT PA-ACS contenidos en una pequeña probe-ta con tapón de vidrio, previamente enjuagadacon un poco de éter, 1 ml de solución al 10% dePotasio Yoduro PA-ISO, recién preparada. Agitary dejar reposar durante 1 minuto. No debe apa-recer coloración amarilla en ninguna de las doscapas.

El Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm deBHT PA-ACS puede mantenerse exento de peró-xidos, añadiendo una lámina de Zinc húmeda, quedeberá sumergirse completamente en una solu-ción ácida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidratoPA-ACS-ISO durante 1 minuto y después lavarsecon Agua PA-ACS. Por litro de Eter Dietílico esta-bilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, utilizar unasuperficie de 80 cm2 aproximadamente de láminade Zinc cortada en bandas lo suficientemente lar-gas para que lleguen por lo menos hasta el centrodel recipiente.

1(c).3.4. Eter de Petróleo de puntos de ebulli-ción entre 30ºC y 60ºC. En su defecto usar Eterde Petróleo 40-60ºC PA-ISO.

1(c).3.5. Disolvente mixto, preparado pocotiempo antes de su utilización, mezclando volú-menes iguales de Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS y Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO (se podrá sustituir la mezcla dedisolventes en aquellos casos en que su utiliza-ción esté prevista por Eter Dietílico estabilizado

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con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS o por Eter de Petró-leo).

1(c).4. Procedimiento.1(c).4.1. Preparación de la muestra.1(c).4.1.1. Leche concentrada y leche evapora-

da.- Agitar e invertir el recipiente que contiene lamuestra. Abrir y transvasar lentamente la leche aun segundo recipiente (provisto de cierre herméti-co). Mezclar mediante transvases sucesivos,teniendo cuidado de incorporar a la muestra todala materia grasa u otro constituyente adheridos alas paredes o al fondo del primer recipiente. Final-mente, transvasar la leche lo más completamenteposible al segundo recipiente y cerrar éste último.En caso necesario, templar el envase original,cerrado, en baño de María a 40º-60ºC. Sacarlo yagitar vigorosamente cada 15 minutos. Al cabo de2 horas, retirar el envase y dejarlo enfriar hastatemperatura ambiente. Quitar totalmente la tapa-dera y mezclar cuidadosamente removiendo elcontenido con una cuchara o espátula (si se sepa-ra la materia grasa no se debe efectuar el análisisde la muestra).

En el caso de envases flexibles, abrirlos ytransvasar el contenido a un vaso. Rasgar losenvases, despegar todas las materias adheridas alas paredes e introducirlas en el vaso.

1(c).4.1.2. Leche condensada.- Abrir el reci-piente que contiene la muestra y mezclar cuidado-samente la leche con una cuchara o una espátula.Imprimir a este instrumento un movimiento rotativoascendente y descendente de manera que lascapas superiores e inferiores se mezclen bien conel resto del contenido. Tener cuidado de reincor-porar a la muestra toda la masa de leche quepudiera haberse adherido a las paredes y a losfondos del recipiente. Transvasar la leche lo máscompletamente posible a un segundo recipiente(provisto de cierre hermético) y cerrar éste último.

En caso necesario, templar el bote original,cerrado, en baño de María a 30º-40ºC. Abrir elbote, desprender toda la leche adherida a lasparedes del mismo, transvasar a una cápsula losuficientemente grande para permitir un manejocuidadoso y mezclar hasta que toda la masa seahomogénea.

En el caso de tubos flexibles abrirlos y transva-sar el contenido a un vaso. Rasgar los tubos, des-pegar todas las materias adheridas a las paredese introducirlas en el vaso.

1(c).4.2. Ensayo en blanco.- Al mismo tiempoque se determina el contenido en materia grasade la muestra, efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS en lugar de la muestra,empleando el mismo tipo de aparato de extrac-ción, los mismos reactivos en las mismas cantida-des y siguiendo el mismo procedimiento que sedescribe a continuación. Si el resultado del ensa-

yo en blanco excede de 0,5 mg, habrá que com-probar los reactivos y aquél o aquéllos que resul-ten impuros deberán sustituirse o purificarse.

1(c).4.3. Determinación.- Proceder como en1(a).4.3., excepto que se pesa de 4 a 5 g de lamuestra, añadiendo a continuación 7 ml de AguaPA-ACS, agitando suavemente y calentando lige-ramente (40º-50ºC) hasta la dispersión total delproducto.

1(c).5. Cálculo. Como en 1(a).5.

1(c).6. Referencia. 1(c).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 13A:

1969.

1(d). GRASA(Leche en polvo)

1(d).1. Principio. Este método es aplicable a las leches en polvo,

entera, parcialmente desnatada y desnatada, defi-nidas en el Reglamento de Centrales Lecheras yotras Industrias Lácteas.

Se entiende por contenido en materia grasa dela leche en polvo el porcentaje en masa de lassustancias determinadas por el procedimientoexpuesto a continuación, que corresponde al des-crito en la norma FIL-9A: 1969 de la FederaciónInternacional de Lechería.

El contenido en materia grasa se determinagravimétricamente por extracción de la citadamateria grasa de una solución alcohólico-amonia-cal de leche en polvo mediante éter etílico y éterde petróleo, evaporación de los disolventes ypesado del residuo, según el principio del métodoRöse-Gottlieb.

1(d).2. Material y aparatos. 1(d).2.1., 2, 3, 4, 5 y 6, como 1(a).2.1., 2, 3, 4,

5 y 6.

1(d).3. Reactivos. 1(d).3.1., 2, 3, 4 y 5, como 1(a).3.1., 2, 3, 4

y 5.

1(d).4. Procedimiento. 1(d).4.1. Preparación de la muestra.- Transva-

sar la leche en polvo a un recipiente limpio y seco(provisto de cierre hermético) de una capacidadque corresponda, aproximadamente, a dos vecesel volumen del polvo. Cerrar en seguida el reci-piente y mezclar cuidadosamente la leche enpolvo agitándolo e invirtiéndolo repetidamente.

Durante la preparación de la muestra deberáevitarse, en la medida de lo posible, la exposiciónde la leche en polvo al aire atmosférico con obje-to de reducir al mínimo la absorción de humedad.

19

M

1(d).4.2. Ensayo en blanco.- Como en 1(a).4.2.1(d).4.3. Determinación.- Como en 1(a).4.3.,

excepto que se pesa, aproximadamente, 1 g deleche entera en polvo o 1,5 g de leche parcial-mente desnatada en polvo o de leche desnatadaen polvo añadiendo 10 ml Agua PA-ACS y agitan-do hasta la dispersión total del polvo de leche.Después de añadir la solución de Amoníaco 25%(en NH3) PA, calentar en baño María a una tempe-ratura de 60º-70ºC durante 15 minutos, agitandode cuando en cuando, y enfriar a continuacióncon agua corriente, si se desea.

1(d).5. Cálculo. Como en 1(a).5.

Referencia. 1(d).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 9A: 1969.

1(e). GRASA(Leche natural) (Método Gerber)

En el caso de leche natural se puede emplear,como alternativo, el método Gerber.

1(e).1. Principio. Liberación total de la grasa por disolución de

las sustancias proteicas, separación de la grasapor centrifugación y posterior medida volumétricade ésta.

Aplicable a leche natural, pasterizada y esterili-zada.

1(e).2. Material y aparatos. 1(e).2.1. Pipetas aforadas de 11 ml.1(e).2.2. Dosificador de émbolo de 10 ml para

el ácido sulfúrico.1(e).2.3. Baño de agua regulable a 65ºC.1(e).2.4. Centrífuga Gerber.1(e).2.5. Butirómetros original Gerber. Se pue-

den utilizar de varios tipos.1(e).2.5.1. Graduación de 0-5 por 100 divisio-

nes en 0,1. Cuello ranurado.1(e).2.5.2. Graduación de 0-5 por 100 divisio-

nes en 0,1. Cuello liso.1(e).2.5.3. Graduación de 0-7 por 100 divisio-

nes en 0,1. Cuello ranurado.1(e).2.5.4. Graduación de 0-9 por 100 divisio-

nes en 0,1. Cuello ranurado.1(e).2.6. Tapones de caucho.1(e).2.7. Empujador metálico.

1(e).3. Reactivos. 171010 Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE171865 Alcohol iso-Amílico según Gerber mez-

cla de isómeros RE

1(e).3.1. Acido Sulfúrico 90-91% según GerberRE.

1(e).3.2. Alcohol iso-Amílico según Gerbermezcla de isómeros RE

1(e).4. Procedimiento. Colocar en el butirómetro 10 ml de Acido Sul-

fúrico 90-91% según Gerber RE y agregar 11 mlde leche con cuidado y lentamente para que no semezclen, observándose claramente la separaciónde ambas capas, ácida y de leche.

Agregar a continuación 1 ml de Alcohol iso-Amílico según Gerber mezcla de isómeros RE(con dosificador) y cerrar el butirómetro. Agitarenérgicamente, envuelto en un paño para evitarposibles proyecciones hasta la total disolución dela fase proteica de la leche. Verter y dejar en repo-so algún tiempo para observar mejor si la disolu-ción ha sido completa. Llevar a la centrífugadurante 5 minutos. Sacar de la centrífuga con cui-dado para no mover la capa superior de grasa yaseparada. Colocar en el baño (65ºC) durante 5minutos. Sacar y leer rápidamente.

1(e).5. Cálculo. Se lee directamente en la escala del butiró-

metro.

1(e).6. Observaciones.1(e).6.1. A veces el volumen de líquidos en el

butirómetro no es suficiente para que la columnade grasa quede en la escala graduada; en estecaso, antes de centrifugar, añadir unas gotas deácido sulfúrico o simplemente agua si es despuésde la centrifugación, para conseguir que dichacolumna pueda ser leída.

1(e).6.2. Puede ser conveniente después de laagitación del butirómetro y antes de centrifugar,colocarlo en el baño a 65ºC de 5 a 15 minutospara que el ataque sea lo más completo posible,aunque presenta el inconveniente de hacer el gló-bulo graso más pequeño, produciéndose un ligeroaumento de volumen de grasa, obteniéndose unvalor ligeramente por exceso. A pesar de todo, sidicho tiempo de resistencia en el baño no se pro-longa más allá de esos 15 minutos, la variaciónapenas es apreciable, quedándose dentro del errorexperimental 0,05% en MG propio del método.

Sin embargo, presenta la ventaja de apreciarclaramente antes de la centrifugación si la disolu-ción ha sido total, factor fundamental en la deter-minación.

1(e).6.3. En leches conservadas mediante for-mol, la disolución de la proteína es imposible oincompleta, por lo que la separación de la capagrasa en la centrifugación no es completa ni níti-da. No es aconsejable en dicho caso el empleo deeste método.

20

2. PROTEINAS (*)

2.1. Principio.Se entiende por contenido en proteínas de la

leche el contenido en nitrógeno expresado en por-centaje en peso y multiplicado por el factor deconversión, que se determina por el métodoexpuesto a continuación, el cual corresponde aldescrito en la norma FIL-20: 1962 de la Federa-ción Internacional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches no alte-radas, natural, certificada, higienizada, esterilizaday a las reconstituidas asimismo no alteradas, pos-teriormente de las leches concentrada, evapora-da, condensada y en polvo.

La determinación del nitrógeno total se realizapor aplicación del método Kjeldahl: una determi-nada cantidad pesada de leche se trata con ácidosulfúrico en presencia de mercurio II óxido comocatalizador con objeto de transformar el nitrógenode los compuestos orgánicos en nitrógeno amo-niacal. El amoníaco se libera por adición de sodiohidróxido, se destila y se recoge a una solución deácido bórico. A continuación se valora el amo-níaco.

2.2. Material y aparatos.2.2.1. Balanza analítica de 1 mg de sensibilidad

mínima.2.2.2. Aparato de digestión que permita man-

tener el matraz Kjeldahl en una posición inclinaday provisto de un sistema de calentamiento que noafecte más que a la parte del matraz ocupada porel líquido.

2.2.3. Matraz Kjeldahl de 500 ml de capacidad.2.2.4. Refrigerante Liebig de tubo interior recti-

líneo.2.2.5. Un tubo de salida con bulbo de seguri-

dad esférico, conectado a la parte inferior del refri-gerante por unión esmerilada.

2.2.6. Una alargadera conectada al matrazKjeldahl y al refrigerante Liebig por medio degoma. Uniones esmeriladas.

2.2.7. Un matraz erlenmeyer de 500 ml decapacidad.

2.2.8. Probetas graduadas de 25, 50, 100 y150 ml.

2.2.9. Bureta de 50 ml graduados a 0,1 ml.2.2.10. Materiales para facilitar la ebullición. En

la digestión, pequeños trozos de porcelana dura operlas de vidrio, y en la destilación, pequeños tro-zos de piedra pómez recién calcinados.

2.3. Reactivos.172222 Acido Bórico solución 4% RE181023 Acido Clorhídrico 0,1 mol/1 (0,1N) SV131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS251170 Azul de Metileno (C.I. 52015) DC

172430 Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azulde Metileno) RE

141427 Mercurio II Oxido rojo PRS211835 Piedra Pómez gránulos QP131532 Potasio Sulfato PA-ACS-ISO171617 Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS131644 di-Sodio tetra -Borato 10-hidrato PA-

ACS-ISO131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO211682 Sodio Sulfuro 9-hidrato QP

2.3.1. Potasio Sulfato PA-ACS-ISO2.3.2. Mercurio II Oxido rojo PRS2.3.3. Acido Sulfúrico 96% PA-ISO2.3.4. Solución de Sodio Hidróxido: 500 g de

Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO y 12 g deSodio Sulfuro 9-hidrato QP disueltos en 1.000 mlde Agua PA-ACS.

2.3.5. Acido Bórico solución 4% RE.2.3.6. Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV2.3.7. Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azul de

Metileno) RE. En su defecto puede prepararsedisolviendo 2 g de Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS y 1 g de Azul de Metileno DC en 1.000 ml deEtanol 96% v/v PA.

2.3.8. Solución de di-Sodio tetra -Borato 10-hidrato PA-ACS-ISO para la valoración del AcidoClorhídrico.

Los reactivos y las soluciones utilizadas nodeben contener sustancias nitrogenadas.

2.4. Procedimiento.2.4.1. Preparación de la muestra.- Antes del

análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarlacuidadosamente. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentarla lenta-mente a 40ºC, mezclar suavemente y enfriarla denuevo a 20º ± 2ºC.

2.4.2. Determinación.- Introducir sucesivamen-te en el matraz Kjeldahl algunas perlas de vidrio opequeños trozos de porcelana, alrededor de 10 gde Potasio Sulfato PA-ACS-ISO, 0,5 g de Mercu-rio II Oxido rojo PRS y alrededor de 5 g de lecheexactamente pesados, con aproximación de 1mg.

Añadir 20 ml de Acido Sulfúrico 96% PA-ISO ymezclar el contenido del matraz. Calentar cuida-dosamente el matraz Kjeldhal sobre el dispositivopara la reacción hasta que no se forme espuma yel contenido se vuelva líquido. Continuar la reac-ción por calentamiento más intenso, hasta que elcontenido se vuelva líquido. Continuar la reacciónpor calentamiento más intenso, hasta que el con-tenido del matraz esté perfectamente límpido eincoloro. Durante el calentamiento, agitar decuando en cuando el contenido del matraz. Cuan-do el líquido esté perfectamente límpido, prose-guir la ebullición durante una hora y media, evi-tando todo sobrecalentamiento local.

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M

Dejar enfriar el contenido del matraz a la tem-peratura ambiente, añadir alrededor de 150 ml deAgua PA-ACS y algunos fragmentos de PiedraPómez gránulos QP, mezclar cuidadosamente ydejarlo todavía enfriar algo más. Con la ayuda deuna probeta graduada, verter 50 ml de Acido Bóri-co solución 4% RE en el matraz erlenmeyer, aña-dir cuatro gotas de indicador y mezclar. Situar elmatraz erlenmeyer bajo el refrigerante, de maneraque el extremo del tubo de salida se introduzca enla solución de Acido Bórico. Con la ayuda de unaprobeta graduada añadir al contenido del matrazKjeldahl 80 ml de la solución de Sodio Hidróxidoque contiene sulfuro. Durante esta operación,mantener el matraz inclinado, de tal manera que elSodio Hidróxido se deslice a lo largo de la pareddel recipiente y que los líquidos no se mezclen.Conectar inmediatamente el matraz Kjeldahl alrefrigerante por medio de la alargadera. Mezclar elcontenido del matraz por agitación. Calentar aebullición evitando la espuma. Proseguir la desti-lación hasta el momento en que el contenido delmatraz presente ebullición a saltos. Regular elcalentamiento de manera que la destilación durepor lo menos 20 minutos. Enfriar bien el destiladopara evitar que se caliente la solución de AcidoBórico. Poco tiempo antes de terminar la destila-ción, bajar el matraz erlenmeyer para que el tubode salida no esté introducido en la solución deAcido Bórico. Detener el calentamiento, elevar eltubo de salida y enjuagar sus paredes exteriores einteriores con un poco de Agua PA-ACS. Valorarel destilado con Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N)SV.

2.4.3. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayoen blanco, aplicando el método operatorio descri-to, pero utilizando cinco mililitros de Agua PA-ACSen lugar de leche.

2.5. Cálculo.2.5.1. Nitrógeno total.- Se calcula el contenido

en nitrógeno total mediante la fórmula.1,40N (V1 - V0)

Nitrógeno total % = –––––––––––––––P

N = normalidad del ácido clorhídrico.V1 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico

utilizado en la determinación.V0 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico

utilizado en el ensayo en blanco.P = peso en gramos de la leche empleada en el

análisis.La diferencia máxima entre dos determinacio-

nes repetidas no debe sobrepasar el 0,005% denitrógeno.

2.5.2. Proteínas.- Para expresar el contenidoen proteínas de la leche analizada es preciso mul-tiplicar la cantidad de nitrógeno total, obtenida

según el método descrito, por un factor de con-versión que se fija en 6,38. En consecuencia, elcontenido en proteínas viene dado por la fórmula

1,40N (V1 - V0)Proteínas % = ——————— x 6,38

P

2.6. Referencia.2.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 20: 1962.(*) En el Real Decreto 1679/1994, capítulo I,

artículo 5, apartado 9, publicado en BOE, nº 229,de fecha 24/9/94, se indica que la leche de vacacontiene un mínimo de 28 gramos de materia pro-teica por litro, obtenida al multiplicar el contenidoen nitrógeno total de la leche expresado porcen-tualmente por 6,38.

3. CASEINA

3.1. Principio.Se entiende por contenido en caseína de la

leche el contenido en proteínas, expresado enporcentaje en peso, obtenidas después de unaprecipitación a pH 4,6, siguiendo el procedimien-to expuesto a continuación, que corresponde a lanorma FIL-20: 1964 de la Federación Interna-cional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches no alte-radas, natural, certificada, higienizada, esterilizaday a las reconstituidas también, no alteradas pos-teriormente, de las leches concentrada, evapora-da, condensada y en polvo. Asimismo puede apli-carse a las muestras de leche conservadas poradición de formaldehído (1:2.500).

Se determina la cantidad total de nitrógeno dela leche. A continuación la caseína se precipitacon un tampón acético-acetato y se filtra. Sedetermina luego la cantidad de nitrógeno del filtra-do.

La cantidad de caseína se calcula con estasdos determinaciones de nitrógeno, que se realizanpor el método Kjeldahl, según el método 2.

3.2. Material y aparatos.3.2.1. Pipetas de 0,5, 1 y 10 ml.3.2.2. Probeta graduada de 100 ml.3.2.3. Matraz graduado de 100 ml.3.2.4. Papel filtro, lavado en ácido, velocidad

media: de 11 a 12,5 cm.3.2.5. Embudos.

3.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS131074 Agua PA-ACS171634 Sodio Acetato 1 mol/1 (1M) RE

3.3.1. Solución de Acido Acético al 10% p/v.3.3.2. 171634 Sodio Acetato 1 mol/I (1M) RE.

22

3.4. Procedimiento.3.4.1. Preparación de la muestra.- Antes del

análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarcuidadosamente. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentar la mues-tra lentamente a 40ºC; mezclar suavemente yenfriar a 20º ± 2ºC.

3.4.2. Determinación.- Determinar el contenidototal en nitrógeno (NT) de la leche utilizando elmétodo Kjeldahl, según el método 2.

Precipitar la caseína de la siguiente manera:Llevar con pipeta 10 ml de leche a un matraz

aforado de 100 ml. Añadir 75 ml de Agua PA-ACSa 40ºC; después un ml de la solución de AcidoAcético. Mezclar suavemente el contenido delmatraz y esperar 10 minutos. Añadir con pipetaun ml de la solución de Sodio Acetato 1 mol/l (1M)RE. Mezclar de nuevo. Dejar enfriar el contenidodel matraz a unos 20ºC, completar hasta 10 mlcon Agua PA-ACS y mezclar invirtiendo lentamen-te el matraz. Cuando el precipitado de caseína ymateria grasa se haya depositado, filtrar con filtroseco y recoger el filtrado en un recipiente seco.

Determinar el contenido en nitrógeno de 50 mldel filtrado límpido (nitrógeno no caseínico: NNC),utilizando el método Kjeldahl según el método 2.

3.4.3. Ensayo en blanco.- Además del ensayoen blanco previsto en el método 2, relativo a ladeterminación del contenido en nitrógeno total dela leche, conviene hacer un ensayo en blanco paracomprobar los reactivos que precipitan la caseína,utilizando 50 ml de Agua PA-ACS, 0,5 ml de lasolución de Acido Acético y 0,5 ml de la soluciónde Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE.

3.5. Cálculo.Calcular el porcentaje en peso de NT en la

leche y del NNC en el suero límpido con tres cifrassignificativas. Corregir la cifra obtenida para NNCpor el volumen del precipitado, multiplicando elvalor obtenido por 0,994. Calcular la cantidad decaseína mediante la fórmula.

Cantidad de caseína % = 6,38 (NT - NNC)La aplicación de este factor a todas las leches

enteras no entraña error sensible; sin embargo, sise aplica el método a leche desnatada, el factorde corrección utilizado deberá ser 0,998.

La diferencia entre dos determinaciones repeti-das no debe sobrepasar el 0,04% de caseína.

3.6. Referencia.3.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 29: 1964.

4. LACTOSA

4.1. Principio.Se entiende por contenido en lactosa de la

leche el contenido en lactosa monohidratadaexpresado en porcentaje en peso, determinado

por el procedimiento expuesto a continuación,que corresponde al descrito en la norma FIL-28:1964 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches no alte-radas natural, certificada, higienizada, esterilizaday a las reconstituidas, asimismo no alteradas yposteriormente; de las leches concentrada, eva-porada, condensada y en polvo. También puedeaplicarse a las muestras de leche conservadaspor adición de formaldehído (1:2.500).

El contenido en lactosa se determina indirecta-mente, una vez desproteinizada la leche, por valo-ración de la cantidad de halógeno reducido al finalde la reducción entre lactosa y yoduro potásico-cloramina T.

4.2. Material y aparatos.4.2.1. Balanza analítica.4.2.2. Matraces aforados de 100 ml.4.2.3. Pipetas de 5, 10, 20, 25 y 40 ml.4.2.4. Papel filtro (lavado en ácido, velocidad

media: 11 a 12,5 cm).4.2.5. Embudos filtrantes.4.2.6. Matraces erlenmeyer, de una capacidad

de 150 a 200 ml.4.2.7. Matraces erlenmeyer, de 150 ml con cie-

rre esmerilado.4.2.8. Bureta de 10 ml graduada a 0,02 ml.

4.3. Reactivos.182108 Acido clorhídrico 2 mol/l (2N) SV131032 Acido orto-Fosfórico 85% PA-ACS-ISO131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO180159 Acido Sulfúrico 0,5 mol/l (1N) SV131074 Agua PA-ACS171096 Almidón soluble RE142323 Cloramina T 3-hidrato PRS131542 Potasio Yoduro PA-ISO182160 Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV131724 Sodio Tungstato 2-hidrato PA

4.3.1. Reactivo del Acido Tungsténico: Disolver7 g de Sodio Tungstato 2-hidrato PA en 870 ml deAgua PA-ACS; añadir 0,1 ml de una solución deAcido orto-Fosfórico 85% PA-ACS-ISO y 70 mlde Acido Sulfúrico 0,5 mol/l (1N) SV.

4.3.2. Solución de Cloramina T, 0,040 N(5,70 gpor litro).

4.3.3. Solución Tiosulfato solución normalizadaa un poco más de 0,040N. Usese Sodio Tiosulfa-to 0,05 mol/l (0,05N) SV.

4.3.4. Solución de Potasio Yoduro PA-ISO del10%, recientemente preparada (incolora).

4.3.5. Acido Clorhídrico 2 mol/l (2N) SV.4.3.6. Solución de Almidón soluble RE al 1%.

4.4. Procedimiento.4.4.1. Preparación de la muestra.- Antes del

análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarla

23

M

con cuidado. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentar la mues-tra lentamente a 40ºC, mezclar suavemente yenfriar a 20º ± 2ºC.

4.4.2. Determinación.- Llevar con pipeta 10 mlde leche a matraz aforado de 100 ml. Añadir 25ml de Agua PA-ACS, 40 ml del reactivo de AcidoTungsténico y mezclar suavemente. Completarhasta 100 ml con Agua PA-ACS, mezclar y dejarque se deposite el precipitado. Filtrar con un filtroseco y recoger en un matraz seco. Con una pipe-ta tomar 10 ml de filtrado y ponerlo en un matrazerlenmeyer de 150 ml provisto de tapón esmerila-do. Añadir 5 ml de la solución de Potasio YoduroPA-ISO y exactamente 20 ml de la solución deCloramina T 3-hidrato PRS. Mezclar. Tapar elmatraz con su tapón, previamente humedecidocon un poco de solución de Potasio Yoduro PA-ISO y mantenerlo en la oscuridad durante unahora y media a 18º-20ºC. Quitar el tapón, enjua-garlo en el matraz con un poco de Agua PA-ACSy añadir 5 ml de la solución de Acido clorhídrico2 mol/l (2N) SV. Añadir exactamente 10 ml de lasolución de Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N)SV. Valorar con una aproximación de 0,02 ml conla solución de Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N)SV. Hacia el final de la valoración, añadir dos otres gotas de la solución de Almidón soluble RE.

4.4.3. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayoen blanco siguiendo exactamente el método ope-ratorio descrito, pero empleando 10 ml de AguaPA-ACS en lugar del filtrado.

4.5. Cálculo.Calcular la diferencia entre los valores de tio-

sulfato obtenidos para el ensayo en blanco y parael de la leche. Corregir el valor en función del volu-men del precipitado, multiplicando por 0,992.Convertir la cifra obtenida en lactosa monohidra-tada, teniendo en cuenta que 1 ml de solución detiosulfato 0,040N corresponde a 0,00720 g delactosa monohidratada. Expresar los resultadosen porcentajes de lactosa monohidratada.

La aplicación de este factor 0,992 a todas lasleches enteras no ocasiona ningún error sensible;sin embargo, si el método se aplica a la leche des-natada, debe utilizarse 0,996 como factor decorrección.

La diferencia máxima entre dos determinacio-nes repetidas no debe sobrepasar de 0,05% delactosa.

4.6. Observaciones.La solución de tiosulfato se debe normalizar

periódicamente, por ejemplo, por valoración de 10 ml de Potasio Yodato 0,04N, a los que sehabrá añadido 5 ml de solución de Potasio Yodu-ro PA-ISO y 5 ml de la solución de Acido Clorhí-drico 2 mol/l (2N) SV.

La concentración de la solución de tiosulfato hasido elegida de tal forma que la lectura en buretasea de 2 a 3,5 ml para la mayor parte de lasmuestras de leche y de 9,5 a 9,7 ml para los ensa-yos en blanco.

NOTA: Para esta normalización periódica delSodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV puedeemplearse: 182150 Potasio Yodato 0,025M SV.

Cuando se proceda a una serie de análisis se deben preparar los filtrados y los ensayos en blanco hasta la adición de potasio yoduro inclusive. Finalmente se añade rápidamente lasolución de cloramina T a cada matraz y se ano-ta la hora. Después de una hora y media (se ad-mite una tolerancia de una hora veinte minutos a una hora cuarenta minutos) se añade el áci-do clorhídrico en todos los matraces y siguien-do el mismo orden. Así se paraliza la reacción y los matraces se pueden valorar por turno.

4.7. Referencia.4.7.1. Norma Internacional FIL-IDF 28: 1967.

5(a). EXTRACTO SECO (*)(Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada)

5(a).1. Principio.Se entiende por contenido en extracto seco de

las leches natural, certificada, higienizada y esteri-lizada, el residuo, expresado en porcentaje enpeso, obtenido después de efectuada la deseca-ción de la leche de que se trate por el procedi-miento expuesto a continuación, que correspondeal descrito en la norma FIL-21: 1962 de la Fede-ración Internacional de Lechería.

Una cantidad conocida de leche se deseca atemperatura constante hasta peso constante. Elpeso obtenido después de desecar representa elde la materia seca.

5(a).2. Material y aparatos.5(a).2.1. Balanza analítica, de sensibilidad

0,1 mg como mínimo.5(a).2.2. Desecador provisto de un buen deshi-

dratante (211335 Gel de Sílice 3-6 mm con indi-cador QP).

5(a).2.3. Estufa de desecación que permitaconseguir una temperatura constante de 102º ±2ºC.

5(a).2.4. Cápsulas metálicas planas, en metalinoxidable o de vidrio de 2 cm de altura aproxima-damente y de 6 a 8 cm de diámetro, aproximada-mente, con tapas adecuadas.

5(a).2.5. Baño de agua.

5(a).3. Procedimiento.5(a).3.1. Preparación de la muestra.- Antes del

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análisis, poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarlacuidadosamente. Si no se obtiene una buenarepartición de la materia grasa, calentar lentamen-te a 40ºC, mezclarla suavemente y enfriarla, a 20º± 2ºC.

5(a).3.2. Determinación.- Secar la cápsula y latapa a 102º ± 2ºC durante 30 minutos. Colocar lacápsula tapada en un desecador, dejarla enfriar ala temperatura ambiente y pesarla. Poner aproxi-madamente 3 ml de la muestra en la cápsula,tapar la cápsula con la tapa y pesarla. Poner lacápsula destapada en baño de agua durante 30minutos. Poner la cápsula y la tapa en una estufade desecación a 102º ± 2ºC durante 2 horas. Latapa se debe poner a un lado de la cápsula.Cubrir la cápsula con la tapa y ponerla en el dese-cador; dejarla enfriar y pesarla. Ponerla 1 horamás en la estufa de desecación; dejarla enfriar ypesarla. Repetir la desecación hasta que la dife-rencia entre dos pesadas consecutivas no seamayor de 0,5 mg.

5(a).4. Cálculo.

P'Contenido en extracto seco % = ––––––– x 100

P

P' = peso en gramos de la muestra después dela desecación.

P = peso en gramos de la muestra antes de ladesecación.

Si a la muestra de la leche se le han adiciona-do como conservadores sustancias no volátiles,como, por ejemplo, potasio dicromato, se debecorregir la expresión del extracto seco comosigue:

P' – C'Contenido en extracto seco % = –––––––– x 100

P – CC' = cantidad de conservante no volátil en la

muestra analizada.P

C = porcentaje de conservante x ––––––– 100

En caso de ser potasio dicromato, el contenidoporcentual de conservante se determina según elmétodo 7.

La diferencia entre dos determinaciones repeti-das no debe ser mayor de 0,05% del extractoseco.

5(a).5. Referencia.5(a).5.1. Norma Internacional FIL-IDF 21: 1962.

(*) En el Real Decreto 1679/1994, capítulo I,artículo 5, apartado 9, publicado en BOE nº 229,de fecha 24/9/1994, se indica que la leche devaca contiene un extracto seco magro igual osuperior a 85 gramos por litro.

5(b). EXTRACTO SECO(Leches concentrada, evaporada y condensada)

5(b).1. Principio.Se entiende por contenido en extracto seco de

las leches concentrada, evaporada y condensada,el residuo, expresado en porcentaje en peso obte-nido después de efectuada la desecación de laleche de que se trate, por el procedimientoexpuesto a continuación, que corresponde al des-crito en la norma FIL-15: 1961 de la FederaciónInternacional de Lechería.

El método consiste en la dilución con agua deuna cantidad conocida de muestra y la deseca-ción con arena a temperatura constante. El pesoobtenido después de desecar representa el de lamateria seca.

5(b).2. Material y aparatos.5(b).2.1. Balanza analítica de sensibilidad: 0,1

mg como mínimo.5(b).2.2. Desecador provisto de un buen deshi-

dratante 211335 Gel de Sílice 3-6 mm con indica-dor QP.

5(b).2.3. Estufa de desecación que permitaobtener una temperatura constante de 98º-100ºC.

5(b).2.4. Cápsulas metálicas, planas, en metalinoxidable o de vidrio de 2,5 cm de altura aproxi-madamente, y de 7,5 cm de diámetro aproxima-do, con tapas adecuadas.

5(b).2.5. Arena de cuarzo o 211160 Arena deMar lavada, grano fino QP que pase a través deun tamiz de diez aberturas por cm, pero que nopase a través de un tamiz de 40 aberturas por cmy, si es necesario, lavada con 131019 Acido Clor-hídrico 35% PA-ISO, después con 131074 AguaPA-ACS y finalmente secada y calcinada.

Para comprobar si la arena es adecuada, dese-car una pequeña cantidad a 98º-100ºC hastapeso constante, añadir Agua PA-ACS, desecar denuevo y pesar. No debe haber diferencia entre lasdos pesadas.

5(b).2.6. Varillas cortas de vidrio.5(b).2.7. Baño de agua.

5(b).3. Procedimiento.5(b).3.1. Preparación de la muestra.- Si se

observa una separación parcial más o menosimportante de algunos componentes, por ejem-plo, materias proteicas, materia grasa, sales decalcio o lactosa, es necesario mezclar la muestra.

5(b).3.1.1. Leche concentrada o evaporada.-Abrir el envase al borde de la tapa, verter la lechedespacio en otro recipiente y mezclar bien porsucesivos transvases. La leche o la grasa que seadhiere a la tapa debe reincorporarse a la mues-tra. Calentar entonces la muestra tapada a una

25

M

temperatura de 40ºC y mezclar íntimamenteremoviendo. Dejar enfriar.

5(b).3.1.2. Leche condensada.- Abrir el bote alborde de la tapa. La leche o grasa adherida a latapa deberá incorporarse a la muestra. Calentar a40ºC y mezclar íntimamente removiendo de arribaabajo con una cuchara. Dejar enfriar.

5(b).3.2. Determinación.- Colocar en la cápsu-la, aproximadamente, 25 g de arena y una peque-ña varilla de vidrio. Secar la cápsula y su conteni-do, con la tapa abierta, a 98º-100ºC durante 2horas. Colocar la cápsula tapada en un deseca-dor, dejarla enfriar a la temperatura ambiente ypesar. Arrastrar la arena hacia un borde de la cáp-sula, pesar exactamente y poner en el espaciolibre, aproximadamente 1,5 g de la muestra. Aña-dir cinco ml de Agua PA-ACS, mezclar los líquidosy la arena mediante una varilla de vidrio. Dejar lavarilla en la mezcla. Colocar la cápsula en baño deagua hirviendo durante 20 minutos y remover concuidado la mezcla de cuando en cuando. Colocarla cápsula con la varilla y la tapa en una estufa dedesecación a 98º-100ºC durante 1 hora 30 minu-tos. La tapa se debe colocar al lado de la cápsu-la. Cubrir la cápsula con la tapa y ponerla en eldesecador; dejarla enfriar y pesar. Colocar 1 horamás en la estufa de desecación; dejarla enfriar ypesar como antes. Repetir la desecación hastaque la diferencia en peso entre dos pesadas suce-sivas no exceda de 0,5 mg.

5(b).4. Cálculo.

P'Contenido en extracto seco % = ––––––– x 100

PP' = peso en gramos de la muestra después de

desecar.P = peso en gramos de la muestra antes de

desecar.

La diferencia entre dos determinaciones repeti-das no debe ser mayor de 0,1% del extractoseco.

5(b).5. Referencia.5(b).5.1. Norma Internacional FIL-IDF 15: 1961.

6. CENIZAS

6.1. Principio.Se entiende por contenido en cenizas de la

leche el producto resultante de la incineración delextracto seco, expresado en porcentaje en peso,obtenido según el procedimiento descrito a conti-nuación.

El extracto seco se incinera a una temperaturadeterminada y en una lenta corriente de aire.

6.2. Material y aparatos.6.2.1. Balanza de sensibilidad: 0,1 mg como

mínimo.6.2.2. Desecador provisto de un buen deshi-

dratante (211335 Gel de Sílice 3-6 mm con indi-cador QP).

6.2.3. Estufa de desecación, regulada a 120ºC.6.2.4. Horno eléctrico con circulación de aire,

provisto de un regulador de temperatura.6.2.5. Cápsula de platino o de un material inal-

terable en las condiciones del ensayo de aproxi-madamente 55 ml de diámetro y 25 de altura.

6.2.6. Baño de agua a temperatura de ebulli-ción.

6.3. Procedimiento.Colocar la cápsula en la estufa de desecación

a 102º ± 2ºC durante 30 minutos. Pasarla luego aldesecador, dejarla enfriar a la temperaturaambiente y pesar. Pesar exactamente alrededorde 10 g de leche en la cápsula. Poner la cápsulaen baño de agua hirviendo hasta secado por eva-poración (aproximadamente siete horas). Incinerarel extracto seco, procedente de la desecaciónanterior, por calentamiento durante 2 o 3 horas enun horno regulado entre 520º y 550ºC (no debenexistir en éste último partículas carbonosas).Poner a enfriar la cápsula en un desecador. Pesarcon una aproximación de 0,5 mg.

6.4. Cálculo.El contenido en cenizas de la leche, expresado

en porcentaje en peso, es igual a:

M - mCenizas % = ––––––––– 100

P

M = peso de la cápsula y de las cenizas des-pués de la incineración y enfriamiento posterior.

m = peso de la cápsula vacía.P = peso en gramos de la leche empleada en la

determinación de las cenizas.

6.5. Observaciones.El peso de las cenizas es variable según las con-

diciones de incineración. La técnica descrita ante-riormente proporciona los resultados más constan-tes; las diferencias no pasan generalmente de un2% por término medio, y el 95% por lo menos delos cloruros se encuentran en las cenizas.

Cuando la temperatura del horno se haya ele-vado ligeramente por encima de 550ºC, determi-nar los cloruros y corregir en consecuencia elpeso de las cenizas.

Si a la muestra se le ha añadido potasio dicro-mato, es necesario efectuar dos correccionespara obtener un valor aproximado de las cenizasde la leche inicial, operando como sigue:

26

1º Determinar el potasio dicromato y restar supeso del de las cenizas.

2º Determinar los cloruros en las cenizas,expresarlos en NaCl y añadir al peso de las ceni-zas la diferencia entre los cloruros totales de laleche y los cloruros resultantes.

7. POTASIO DICROMATO

7.1. Principio.La determinación se realiza sobre las cenizas

de la leche, por reducción de los cromatosmediante una solución de sulfato ferroamónico(sal de Mohr) Fe(NH4)2 (SO4)2. 6H2O cuyo excesose valora con potasio permanganato.

7.2. Reactivos.131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131368 Amonio Hierro II Sulfato 6-hidrato PA-

ISO182114 Potasio Permanganato 0,01 mol/l

(0,05N) SV

7.2.1. Solución acuosa de Sal de Mohr de 8 gpor l, (Amonio Hierro II Sulfato 6-hidrato PA-ISO),para valorar en el momento de su empleo (estasolución se estabiliza por adición de 12 ml deAcido Sulfúrico 96% PA-ISO por litro).

7.2.2. Solución valorada de Potasio Permanga-nato 0,02N en la cual 1 ml corresponda a 0,00098g de Cr2O7K2.

NOTA: En un matraz aforado de 250 ml intro-ducir 100 ml de Potasio Permanganato 0,01 mol/l(0,05N) SV, diluir y enrasar con Agua PA-ACS.Determinar el factor de la solución 0,02N resul-tante.

7.2.3. Acido Sulfúrico 96% PA-ISO (d = 1,84).

7.3. Procedimiento.Agotar las cenizas por lavados sucesivos con

Agua PA-ACS; después, con una solución acuosade Acido Sulfúrico al 5% en volumen, obtener untotal de 25 a 30 ml de líquido. Recogerlo en unvaso para valorar. Añadir alrededor de 5 ml deAcido Sulfúrico 96% PA-ISO y 20 ml exactamentemedidos de la solución sulfúrica de Sal de Mohrcon la solución valorada de Potasio Permangana-to 0,02N hasta coloración rosa permanente.

Por otra parte, valorar en las mismas condicio-nes 20 ml de la misma solución sulfúrica de Sal deMohr mediante la solución valorada de PotasioPermanganato 0,02N.

7.4. Cálculo.El contenido de la leche en potasio dicromato,

expresado en porcentaje en peso, es igual a:

(V' - V) 0,098Potasio Dicromato % = ––––––––––––––

P

V = volumen en ml de potasio permanganatoempleados en la valoración del exceso de sal deMohr.

V' = volumen en ml de potasio permanganatoempleados en la prueba en blanco.

P = peso en gramos de la leche empleada en ladeterminación de las cenizas.

8(a). ACIDEZ(Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada)

8(a).1. Principio.Se entiende por acidez en las leches natural,

certificada, higienizada y esterilizada el contenidoaparente en ácidos, expresado en g de ácido lác-tico por 100 ml de leche, determinado por el pro-cedimiento expuesto a continuación, que corres-ponde al descrito en la norma UNE 34.100 delInstituto de Racionalización del Trabajo.

Un determinado volumen de leche se valora ensolución de sodio hidróxido, empleando soluciónalcohólica de fenolftaleína y luego se expresa elresultado en peso de ácido láctico, mediante lacorrespondiente transformación.

8(a).2. Material y aparatos.Bureta graduada cada 0,05 ml, o cada 0,1 ml

que permita apreciar la semidivisión.

8(a).3. Reactivos.171327 Fenolftaleína solución 1% RE181694 Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SV

Indicador: Fenolftaleína183154 Sodio Hidróxido 0,111 mol/l (0,111N)8(a).3.1. Solución 0,111N (N/9) o 181694

Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SV.8(a).3.2. Indicador: 0,5 ml de Fenolftaleína

solución 1% RE.

8(a).4. Procedimiento.8(a).4.1. Preparación de la muestra.- Antes del

análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarlacuidadosamente. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentar lenta-mente la muestra a 40ºC, mezclar nuevamente yenfriarla de nuevo a 20º ± 2ºC.

8(a).4.2. Determinación.- Se determina volumé-tricamente operando sobre 10 ml de leche consolución de Sodio Hidróxido 0,111N o sobre 9 mlde leche con solución de Sodio Hidróxido 0,1mol/l (0,1N) SV. Como indicador se emplean 0,5ml de Fenolftaleína solución 1% RE (dar por termi-nada la valoración cuando aparece una coloraciónrosa fácilmente perceptible por comparación con

27

M

un testigo tomado de la misma leche. Dicha colo-ración desaparece progresivamente, pero se con-sidera, obtenido el viraje cuando el tinte rosa per-siste durante unos segundos).

8(a).5. Expresión de los resultados.Los resultados se expresan en peso de ácido

láctico por 100 mililitros de leche, dividiendo por10 el número de mililitros empleados de soluciónde sosa.

Si a la muestra de leche se le ha adicionadopotasio dicromato, es preciso tener en cuenta laacidez debida a dicho conservador. En el casode leches no alteradas se puede considerar que1 g de potasio dicromato aumenta la acidez enlas mismas proporciones que 0,6 g de ácido lác-tico.

8(a).6. Referencia.8(a).6.1. Instituto Nacional de Racionalización

del Trabajo. Una norma española 34.100.

8(b). ACIDEZ(Leche en polvo)

8(b).1. Principio.Se entiende por acidez en la leche en polvo el

contenido aparente en ácidos expresado en gra-mos de ácido láctico por 100 g de leche en polvodeterminado por el procedimiento expuesto acontinuación, que corresponde al descrito en lanorma UNE 34.101 del Instituto Nacional deRacionalización del Trabajo.

El método es aplicable a las leches en polvo,entera y desnatada.

Una determinada cantidad pesada de leche enpolvo disuelta en agua se valora con una soluciónde sosa empleando fenolftaleína como indicadorhasta igualarla en color con otra cantidad igual deleche en polvo disuelta y mezclada con rosanilinaacetato.

8(b).2. Material y aparatos.8(b).2.1. Cápsulas de porcelana blanca de

aproximadamente 100 ml de capacidad.

8(b).3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS131074 Agua PA-ACS131085 Etanol 96% v/v PA131325 Fenolftaleína PA-ACS181694 Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SV

Indicador: Fenolftaleína183154 Sodio Hidróxido 0,111 mol/l (0,111N)8(b).3.1. Solución 0,111N (N/9) o Sodio Hidró-

xido 0,1 mol/l (0,1N) SV, exento de carbonato.8(b).3.2. Solución indicadora de Fenolftaleína:

Se disuelve un gramo de Fenolftaleína PA-ACS en110 ml de Etanol 96% v/v PA, se añade Sodio

Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SV, hasta que una gotadé una débil coloración rosa, y se completa hasta200 ml con Agua PA-ACS.

8(b).3.3. Solución concentrada de RosanilinaAcetato: Se disuelven 0,12 g de Rosanilina Aceta-to en 50 ml de Etanol 96% v/v PA que contenga0,5 ml de Acido Acético glacial PA-ACS y se com-pleta hasta 100 ml con Etanol 96% v/v PA.

8(b).3.4. Solución diluida de Rosanilina Aceta-to: Se diluye un mililitro de solución concentradade Rosanilina Acetato hasta 500 ml con una mez-cla, a partes iguales en volumen, de Agua PA-ACSy Etanol 96% v/v PA.

Las soluciones de Rosanilina Acetato se con-servan en la oscuridad en frascos herméticamen-te cerrados con tapones de caucho.

8(b).4. Procedimiento.Se toman dos cápsulas de porcelana blanca de

una capacidad aproximada de 100 ml, pesándoseen cada una de ellas 1 g de leche en polvo. A unay otra cápsulas se añaden 10 ml de Agua PA-ACShirviente, se agita con la extremidad aplastada deuna varilla de vidrio hasta obtener un líquido per-fectamente homogéneo y se deja enfriar durante10 minutos. A una de las cápsulas se le añade1 ml de solución diluida de Rosanilina Acetato y semezcla. A la otra cápsula se le agrega 1 ml desolución de Fenolftaleína PA-ACS y, gota a gota yagitando enérgicamente todo el tiempo, soluciónvalorada de Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SVhasta obtener una coloración igual a la primera. Eltiempo empleado en la valoración no ha de exce-der de 20 segundos y ésta se ha de efectuar conuna luz difusa.

8(b).5. Cálculo.El número de mililitros consumidos de solución

0,111N (N/9) representa la acidez, expresada en gra-mos, de ácido láctico por 100 g de leche en polvo.

Si se opera con solución 0,1N (N/10), el núme-ro de mililitros multiplicado por 0,9 da el mismoporcentaje de acidez.

8(b).6. Referencia.8(b).6.1. Instituto Nacional de Racionalización

del Trabajo. Una norma española 34.101.

9. SACAROSA(Determinación polarimétrica en la leche condensada)

9.1. Principio.Se entiende por contenido en sacarosa de la

leche condensada el contenido en sacarosa notransformada, expresado en porcentaje en peso,determinado por el procedimiento expuesto acontinuación, que corresponde al descrito en la

28

norma FIL-35: 1966 de la Federación Internacio-nal de Lechería.

Este método es aplicable a la leche condensa-da, entera o desnatada, de composición normal,preparada a partir de leche y sacarosa únicamen-te que no contenga sacarosa transformada.

El método se basa en el principio de inversiónde Clerget: Un tratamiento suave con un ácidohidroliza completamente la sacarosa. La lactosa ylos otros azúcares prácticamente no se hidrolizan.La cantidad de sacarosa se deduce del cambiodel poder rotatorio de la solución.

Se prepara un filtrado límpido de la muestra, sinmutarrotación debida a la lactosa, por tratamientode la solución con amoníaco seguido de netraliza-ción y clarificación por adiciones sucesivas desoluciones de zinc acetato y de potasio hexacia-noferrato II.

En una parte del filtrado de sacarosa se hidro-liza en las condiciones especiales que correspon-den a este tipo de operación.

Partiendo de los poderes rotatorios del filtrado,antes y después de la inversión, se calcula la can-tidad de sacarosa.

9.2. Material y aparatos.9.2.1. Balanza analítica de sensibilidad: 10 mg

como mínimo.9.2.2. Vasos de precipitados de 100 ml de

vidrio.9.2.3. Matraces graduados, de 200 y 50 ml.9.2.4. Pipetas de 40 ml.9.2.5. Probetas graduadas de 25 ml.9.2.6. Pipetas graduadas de 10 ml.9.2.7. Embudos filtrantes de diámetro entre 8 y

10 cm y filtros (plegados) de 15 cm de diámetro.9.2.8. Tubo de polarímetro de 2 cm de longi-

tud, exactamente calibrado.9.2.9. Polarímetro o sacarímetro.9.2.9.1. Polarímetro con luz de sodio o con luz

verde de mercurio (lámpara de vapor de mercuriocon prisma o pantalla Wratten número 77 A), per-mitiendo lecturas con una precisión por lo menosigual a 0,05 grados de ángulo.

9.2.9.2. Sacarímetro con escala internacionalde azúcar utilizando luz blanca que pasa a travésde un filtro de 15 ml de una solución al 6 por 100de potasio dicromato, o bien luz de sodio, y per-mitiendo la lectura con una precisión por lo menosigual a 0,1 grados de la escala sacarimétrica inter-nacional.

9.2.10. Baño de agua a 60º ± 1ºC.

9.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS182119 Acido Acético 2 mol/l (2N) SV131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA

171168 Azul de Bromotimol solución 0,04% RE131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131775 Zinc Acetato 2-hidrato PA

9.3.1. Solución de Zinc Acetato 2,0N: Disolver21,9 g de Zinc Acetato 2-hidrato PA y 3 ml deAcido Acético glacial PA-ACS en Agua PA-ACS ycompletar hasta 100 ml.

9.3.2. Solución de Potasio Hexacianoferrato II1,0N: Disolver 10,6 gramos de Potasio Hexacia-noferrato II 3-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS ycompletar hasta 100 ml.

9.3.3. Solución de Acido Clorhídrico, 6,35 ±0,20N (20-22%). Usese Acido Clorhídrico 35% PAy diluir convenientemente.

9.3.4. Solución diluida de amoníaco, 2,0 ±0,2N (3,5%). Usese Amoníaco 25% (en NH3) PA ydiluir convenientemente.

9.3.5. Solución diluida de Acido Acético 2 mol/l(2N) SV

9.4. Procedimiento.9.4.1. Preparación de la muestra.Para muestras de productos recientemente pre-

parados en los que no se puede prever separaciónalguna apreciable de los componentes. Abrir elrecipiente, introducir en él el producto adherido a latapa y mediante movimientos de arriba abajo, conayuda de una cuchara, conseguir que se mezcleníntimamente las capas superiores así como el con-tenido del fondo del recipiente. Transvasar el con-tenido de un bote a un frasco provisto de tapónbien adaptado. Para muestras de productos másantiguos y muestras en las que se pueda preveruna separación de componentes, calentar en bañode agua, aproximadamente a 40ºC, hasta que lamuestra casi haya alcanzado esta temperatura,abrir el recipiente y operar de la misma manera quearriba. En el caso de un bote, transvasar el conte-nido a un frasco, raspar el producto que se hayaadherido a las paredes, continuar la mezcla hastaque toda la masa sea homogénea. Cerrar el frascocon una tapadera que se adapte perfectamente.Dejar enfriar.

9.4.2. Comprobación del método.- Procedercomo en 9.4.3., utilizando una mezcla de 100 gde leche desnatada y de 18 g de sacarosa pura,que corresponde a 40 g de una leche concentra-da conteniendo el 45% de sacarosa. Calcular lacantidad de sacarosa como en 9.5.1., utilizandoen la fórmula D, para W, F y P, la cantidad de lechepesada y la riqueza en materia grasa y proteínasde esta leche, y en la fórmula ID, para W, la cifrade 40. La media de los valores encontrados nodebe diferir de dicho valor (45%) en más del 0,1%.

9.4.3. Determinación.- En un vaso de 100 mlpesar aproximadamente 40 g de la muestra bienmezclada con una aproximación de 10 mg, añadir

29

M

50 ml de Agua PA-ACS caliente (80º-90ºC) y mez-clar cuidadosamente. Transvasar cuantitativamen-te la mezcla a un matraz aforado de 200 ml,enjuagar el vaso con cantidades sucesivas deAgua PA-ACS a 60ºC hasta que el volumen totalsea de 120 a 150 ml. Mezclar y enfriar a tempera-tura ambiente. Añadir 5 ml de la solución de Amo-níaco diluida. Mezclar de nuevo y dejar reposardurante 15 minutos. Neutralizar el Amoníaco aña-diendo una cantidad equivalente de la solucióndiluida de Acido Acético. Determinar previamentela cantidad exacta de mililitros por valoración de lasolución de Amoníaco diluida empleando el Azulde Bromotimol solución 0,04% RE como indica-dor. Mezclar. Añadir, mezclando suavemente porrotación del matraz inclinado, 12,5 ml de soluciónde Zinc Acetato. De la misma forma que para lasolución de acetato, añadir 12,5 ml de solución dePotasio Hexacianoferrato II. Poner el contenidodel matraz a 20ºC y añadir Agua PA-ACS (a 20ºC)hasta alcanzar el enrase de 200 ml.

Hasta este momento todas las adiciones deagua o reactivos deberán haberse efectuado detal manera que se haya evitado la formación deburbujas de aire y por esa misma razón todas lasmezclas se habrán realizado por rotación dematraz y no por agitación violenta. Si se observala presencia de burbujas de aire antes de alcanzarlos 200 ml se puede eliminar aplicando al matrazuna bomba de vacío o imprimiéndole un movi-miento de rotación. Tapar el matraz con un tapónseco y mezclar íntimamente sacudiendo con ener-gía. Dejar reposar durante algunos minutos, filtrara continuación por un papel filtro seco. Despreciarlos primeros 25 ml del filtrado.

9.4.3.1. Polarización directa.- Determinar larotación óptica del filtrado a 20º ± 2ºC.

9.4.3.2. Inversión.- Introducir con la pipeta enun matraz graduado de 50 ml, 40 ml del filtradoobtenido de la manera indicada antes. Añadir 6 mlde Acido Clorhídrico 6,35 N. Poner el matraz enbaño de agua a 60ºC durante 15 minutos, sumer-giéndolo hasta el nacimiento del cuello. Mezclarpor rotación durante los 5 primeros minutos, alfinal de los cuales el contenido deberá haberalcanzado la temperatura del baño. Enfriar a 20ºCy completar hasta 50 ml con Agua PA-ACS a20ºC, mezclar y dejar reposar 1 hora a esta tem-peratura.

9.4.3.3. Polarización después de inversión.-Determinar el poder rotatorio de la solución inver-tida a 20º ± 2ºC (cuando la temperatura del líqui-do en el tubo de polarización difiera en más de0,2ºC de 20ºC durante la medida, se debe aplicarla corrección de la temperatura indicada en elapartado 9.5.2.).

9.5. Cálculo.9.5.1. Riqueza en sacarosa

WI) v = –––––––– (1,08E + 1,55 P)

100

5D ––––––– I V – v V

4II) S = ––––––––––– x –––––– x –––––– x 100

Q V L x W

S = cantidad de sacarosa.W = peso de la muestra en gramos.P = porcentaje de proteínas (N x 0,38) de la

muestra.F = porcentaje de materia grasa de la muestra.V = volumen en mililitros de la muestra diluida

antes de filtrar.D = lectura polarimétrica directa (polarización

antes de la inversión).I = lectura polarimétrica después de la inver-

sión.L = longitud en decímetros del tubo del polarí-

metro.Q = factor de inversión cuyos valores se indican

más adelante.Pesando exactamente 40 g de leche conden-

sada y utilizando un polarímetro con luz de sodioprovisto de escala en grados de ángulo y un tubode 2 cm de longitud, el contenido en sacarosa delas leches condensadas normales (C = 9) a 20º ±0,1ºC se puede calcular con ayuda de la siguien-te fórmula:

S = ((d).5/4I) (2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P)Si la medida de la polarización después de la

inversión se efectúa a una temperatura diferente a20ºC, las cifras obtenidas se deben multiplicar por:

[I + 0,0037 (T-20)]9.5.2. Calores del factor de inversión Q.- Las

fórmulas siguientes dan valores precisos de Q paradiversas clases de luz con correcciones, si esnecesario, para la concentración y la temperatura.

Luz de sodio y polarímetro con escala en gra-dos de ángulo.

Q = 0,8825 + 0,0006 ((c).9) - 0,0033 (T-20)Luz verde de mercurio y polarímetro con esca-

la en grados de ángulo:Q = 1,0392 + 0,0007 ((c).9) - 0,0039 (T-20)Luz blanca con filtro de dicromato y sacaríme-

tro con escala sacarimétrica:Q = 2,549 + 0,0017 (C-9) - 0,0095 (T-20)En las fórmulas precedentes:C = porcentaje de azúcares totales en la solu-

ción invertida, según lectura polarimétrica.T = temperatura de la solución invertida en la

lectura del polarímetro.El porcentaje de azúcares totales C en la solu-

ción invertida se puede calcular a partir de la lec-tura directa y de la variación después de la inver-

30

sión según el método habitual, utilizando los valo-res usuales de rotación específica de sacarosa, delactosa y de sacarosa invertida. La corrección0,0006 (C-9), etcétera, no es exacta más quecuando C es aproximadamente 9; para leche con-centrada normal esta corrección se puede des-preciar, por ser C próximo a 9.

Variaciones en la temperatura de 20ºC influyenescasamente en la lectura de la polarizacióndirecta. Por el contrario, diferencias de más de0,2ºC, en la lectura de polarización después de lainversión necesitan una corrección. La corrección0,003 (T-20), etc., no es exacta más que paratemperaturas comprendidas entre 18ºC y 22ºC.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o unainmediatamente después de la otra por el mismoanalista no debe ser mayor de 0,3 g de sacarosapara 100 g de leche condensada.

9.6. Referencia.9.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 35: 1966

10. HUMEDAD(Leche en polvo)

10.1. Principio.Se entiende por humedad de la leche en polvo

el contenido en agua libre, es decir, la pérdida depeso, expresado en porcentaje en peso, determi-nado por el procedimiento expuesto a continua-ción, que corresponde al descrito en la norma FIL-26: 1964 de la Federación Internacional de Le-chería.

Este método es aplicable a las leches en polvo,entera y desnatada.

El agua, contenida en la leche en polvo, se eli-mina por calentamiento de la muestra en unaestufa de desecación, a una temperatura de 102º± 2ºC, hasta peso constante.

10.2. Material y aparatos.10.2.1. Balanza analítica, de sensibilidad

0,1 mg como mínimo.10.2.2. Cápsulas apropiadas, preferentemente

en aluminio, níquel, acero inoxidable o vidrio. Lascápsulas deberán estar provistas de tapas que seadapten convenientemente, pero que se puedanquitar con facilidad. Las dimensiones más conve-nientes son: diámetro aproximado 50 mm; profun-didad aproximada, 25 mm.

10.2.3. Un desecador provisto de 211335 Gelde Sílice 3-6 mm con indicador QP de humedad.

10.2.4. Una estufa de desecación bien ventila-da, provista de termostato y regulada a 102º± 2ºC. Es importante que la temperatura sea uni-forme en toda la estufa.

10.2.5. Frascos provistos de tapones herméti-cos para el mezclado de la leche en polvo.

10.3. Procedimiento.10.3.1. Preparación de la muestra.- Transvasar

toda la muestra de la leche en polvo a un frascoseco y tapado, de un volumen igual al doble,aproximadamente, del de la muestra, mezclar ínti-mamente por rotación y agitación (en el caso deque no se pueda obtener una homogeneizacióncompleta por este procedimiento, extraer, conobjeto de realizar determinaciones paralelas, dosmuestras en dos puntos, lo más distantes posibleel uno del otro).

10.3.2. Determinación.- Colocar la cápsuladestapada y la correspondiente tapa en la estufade desecación durante 1 hora, a la temperatura de 102º ± 2ºC. Colocar la tapa sobre la cápsula ypasarla de la estufa al desecador. A continuaciónenfriar a la temperatura ambiente y pesar. Introdu-cir aproximadamente 1 g de leche en polvo en lacápsula, tapar la cápsula y pesar rápidamente conla mayor exactitud posible. Destapar la cápsula ycolocarla con su tapa en la estufa a una tempera-tura de 102º ± 2ºC durante 2 horas. Volver a colo-car la tapa, poner la cápsula en el desecador,dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar rápi-damente con la mayor exactitud posible.

Calentar la cápsula abierta y su tapa a 102º ±2ºC en la estufa durante 1 hora suplementaria,volver a tapar y dejar enfriar en el desecador atemperatura ambiente; pesar de nuevo. Repetir laoperación hasta que las pesadas sucesivas nodifieran en más de 0,0005 g. La desecación seacaba aproximadamente en 2 horas.

10.4. Cálculo.Calcular la humedad mediante la fórmula

siguiente:M1 – M2

Humedad (cantidad de agua) % = ––––––––– x 100M3

M1 = la masa inicial, en gramos, de la cápsulay su tapa más la leche en polvo utilizada para elanálisis.

M2 = la masa final, en gramos, de la cápsula ysu tapa más la leche en polvo.

M3 = la masa, en gramos, de la leche en polvoutilizada para el análisis.

La diferencia entre dos determinaciones repeti-das no debe sobrepasar el 0,06% de agua.

10.5. Referencia.10.5.1. Norma Internacional FIL-IDF 26: 1964.

11. INDICE DE SOLUBILIDAD(Leche en polvo)

11.1. Principio.Se entiende por índice de solubilidad de la

leche en polvo la cantidad de sedimento, expre-

31

M

sada en volumen, determinada por el procedi-miento expuesto a continuación, que correspondeal descrito en la norma UNE 34.101 del InstitutoNacional de Racionalización del Trabajo.

Este método es aplicable a la leche en polvo,entera o desnatada.

11.2. Material y aparatos.11.2.1. Centrífuga con soportes para la coloca-

ción de los tubos centrífugos cónicos. La veloci-dad requerida varía, como a continuación se indi-ca, con el diámetro.

El "diámetro" es la distancia entre los fondosinternos de dos soportes opuestos, medida a tra-vés del centro de rotación de la cabeza de la cen-trífuga, estando los soportes extendidos horizon-talmente.

11.2.2. Tubos de centrífuga cónicos, gradua-dos como se indica a continuación:

-De 0 a 1,0 ml en divisiones de 0,1 ml.-De 1,0 a 2,0 en divisiones de 0,2 ml.-De 2,0 a 10,0 ml en divisiones de 0,5 ml.-De 10,0 a 20,0 ml en divisiones de 1,0 ml.

y a 50 ml una marca que quede, por lo menos, a13 mm del borde del tubo.

11.2.3. Mezclador eléctrico.11.2.4. Tubo sifón de vidrio.

11.3. Procedimiento.Se añaden 10 o 13 g de la muestra, según se

trate de leche desnatada o completa, respectiva-mente, a 100 ml de Agua PA-ACS, a la tempera-tura de 24ºC, en el vaso especial del mezcladorque seguidamente se pone en éste para agitardurante 90 segundos exactos. Si hay necesidadinmediata de volver a emplear el vaso del mezcla-dor, puede verterse la solución total en un vaso deprecipitación apropiado. Se deja reposar la solu-ción hasta que la espuma se separe lo suficiente,para poder quitarla completamente con unacuchara. El periodo de reposo después de la mez-cla no ha de exceder de 15 minutos.

Después de separada la espuma se mezclacompletamente con una cuchara durante 5segundos y, seguidamente, se llena un tubo cóni-co hasta la marca de 50 ml. Se centrifuga duran-te 5 minutos a las revoluciones por minuto reque-ridas, según la tabla del apartado 11.2.1. A conti-nuación se sifona el líquido que sobrenada, hasta2 ml del nivel del sedimento, teniendo cuidado deno remover éste. Se vierten en el tubo 25 ml deAgua PA-ACS a 24ºC y se agita para dispersar elsedimento, desalojando si fuera necesario con unalambre. Se llena con Agua PA-ACS, 24ºC, hastala marca de 50 ml, se invierte y se agita para laperfecta mezcla del contenido, y se centrifuga denuevo durante 5 minutos a la velocidad requerida.Se mantiene el tubo en posición vertical, de modoque el nivel superior del sedimento quede a niveldel ojo; se refieren los mililitros de sedimento a ladivisión de la escala más próxima. La lectura seefectúa fácilmente, cuando se observa el tubo,colocado delante de una luz fuerte.

Cuando se opere con leches en polvo parcial-mente desnatadas, las cantidades que se han deañadir a los 100 ml de Agua PA-ACS son, segúnsus porcentajes grasos, las siguientes:

Hasta el 4 % ............................... 10,0 gramosDesde el 4,1 al 9% ...................... 10,5 gramosDesde el 9,1 al 13% .................... 11,0 gramosDesde el 13,1 al 17% .................. 11,5 gramosDesde el 17,1 al 21% ................. 12,0 gramosDesde el 21,1 al 24% .................. 12,5 gramosMás del 24 % ............................. 13,0 gramos

11.4. Referencia.11.4.1. Instituto Nacional de Racionalización

del Trabajo. Una norma española 34.101.

12. CALCIO

12.1. Principio.Se entiende por contenido en calcio de la leche

la cantidad total de calcio expresada en porcenta-je en peso, determinada por el procedimientoexpuesto a continuación, que corresponde a lanorma FIL-36: 1966 de la Federación Internacio-nal de Lechería.

Este método se aplica a todas las leches líqui-das normales, así como a las leches reconstitui-das por dilución o disolución de leches concen-tradas o de leches desecadas.

El calcio total se lleva a disolución por precipi-tación de las materias proteicas con ácido triclo-roacético. El calcio contenido en el filtrado es pre-cipitado bajo forma de calcio oxalato, que sesepara por centrifugación y se valora con potasiopermanganato.

32

Diámetro Revolucionespor minuto

250 milímetros .............. 1.083300 milímetros .............. 988350 milímetros .............. 916400 milímetros .............. 856450 milímetros .............. 807500 milímetros .............. 766550 milímetros .............. 730600 milímetros .............. 700

12.2. Material y aparatos.12.2.1. Balanza analítica.12.2.2. Matraz aforado de 50 ml.12.2.3. Pipeta para leche de 20 ml.12.2.4. Papel filtro sin cenizas para filtración

lenta.12.2.5. Centrífuga que pueda desarrollar una

aceleración centrífuga de 1,400 g (g = aceleraciónde la gravedad).

12.2.6. Tubos de centrífuga cilíndricos confondo redondo de 30 ml, aproximadamente, mar-cados a 20 ml.

12.2.7. Pipetas de 2 y 5 ml.12.2.8. Dispositivo de sifón por succión, pro-

visto de un tubo capilar.12.2.9. Baño de agua, a temperatura de ebulli-

ción.12.2.10. Bureta graduada.

12.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS252373 Acido Tricloroacético solución 20% p/v

DC131074 Agua PA-ACS131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA131136 Amonio Oxalato 1-hidrato PA131085 Etanol 96% v/v PA182114 Potasio Permanganato 0,01 mol/l

(0,05N) SV171617 Rojo de Metilo RE-ACS

12.3.1. Acido Tricloroacético solución 20% p/vDC.

12.3.2. Acido Tricloroacético solución acuosaal 12% p/v. Usese Acido Tricloroacético solución20% p/v DC y diluir convenientemente.

12.3.3. Amonio Oxalato 1-hidrato PA: Soluciónacuosa saturada en frío.

12.3.4. Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS:solución al 0,05% p/v en Etanol 96% v/v PA.

12.3.5. Acido Acético: solución acuosa al 20%v/v. Usese Acido Acético glacial PA-ACS y diluirconvenientemente.

12.3.6. Amonio Hidróxido: solución acuosaobtenida mezclando volúmenes iguales de Amo-níaco 25% (en NH3) PA y de Agua PA-ACS.

12.3.8. Acido Sulfúrico: solución acuosa obte-nida añadiendo 20 ml de Acido Sulfúrico 96% PA-ISO a 80 ml de Agua PA-ACS.

12.3.9. Potasio Permanganato 0,02N:NOTA: En un matraz aforado de 250 ml. intro-

ducir 100 ml. de Potasio Permanganato 0,01 mol/l(0,05N) SV, diluir y enrasar con Agua PA-ACS.Determinar el factor de la solución 0,02N resultan-te.

Todos los reactivos deben ser puros para aná-lisis.

12.4. Procedimiento.12.4.1. Preparación de la muestra.- Antes del

análisis, poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarcon cuidado. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentar lenta-mente la muestra a 40ºC, mezclar suavemente yenfriar a 20º ± 2ºC.

12.4.2. Defecación de la muestra.- En unmatraz aforado de 50 ml pesar exactamente alre-dedor de 20 g de leche, con una aproximación de10 mg. Añadir poco a poco mientras se agita unasolución acuosa de Acido Tricloroacético 20% p/vDC y completar hasta 50 ml con este reactivo.Agitar fuertemente durante algunos segundos.Dejar reposar 30 minutos. Filtrar sobre papel filtrosin cenizas. El filtrado obtenido debe ser límpido.

12.4.3. Precipitación del calcio en forma deoxalato y separación del oxalato. En un tubo decentrífuga cilíndrica de fondo redondo, introducir5 ml del filtrado límpido; después 5 ml de AcidoTricloroacético al 12%, 2 ml de una solución acuo-sa saturada de Amonio Oxalato 1 hidrato PA, dosgotas de solución alcohólica de Rojo de MetiloRE-ACS y 2 ml de Acido Acético al 20%. Mezclarmediante agitación circular y añadir poco a pocosolución de Amoníaco (12.3.6.) hasta coloraciónamarillo pálido; después, algunas gotas de AcidoAcético al 20% hasta coloración rosa. Dejar repo-sar 4 horas a la temperatura ambiente.

Diluir hasta 20 ml con Agua PA-ACS y centrifu-gar 10 minutos a 1.400 g (g = aceleración de lagravedad). Mediante un dispositivo de succión,decantar el líquido límpido que sobrenada. Lavarlas paredes del tubo de centrifugación (sin remo-ver el depósito de calcio oxalato) con 5 ml desolución de Amoníaco diluido (12.3.7.). Centrifu-gar 5 minutos a 1.400 g. Decantar el líquido quesobrenada con el dispositivo de succión. Proce-der a tres lavados sucesivos.

12.4.4. Valoración del oxalato.- Después dehaber extraído con sifón el agua del último lavado,añadir 2 ml de solución acuosa de Acido Sulfúricoy 5 ml de Agua sobre el precipitado de calcio oxa-lato. Poner el tubo en baño de agua hirviendo, ycuando el oxalato esté completamente disuelto,valorar con solución de Potasio Permanganato0,02N, hasta coloración rosa persistente. La tem-peratura debe permanecer superior a los 60ºCdurante la valoración.

12.4.5. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayoen blanco con todos los reactivos, utilizando 20ml de Agua PA-ACS en vez de leche.

12.5. Cálculo.Contenido 1.000en calcio% = 0,0004 x (V-v) x ––––––– x K =

P

33

M

K= 0,4 x (V-v) x ––––––––

P

V = volumen en ml de MnO4K (0,02N) gastadosen la valoración de la muestra.

v = volumen en ml de MnO4K (0,02N) gastadosen el ensayo blanco.

P = peso en gramos de la muestra inicial (alre-dedor de 20 g).

K = coeficiente de corrección del volumen delprecipitado resultante de la precipitación tricloroa-cética.

Para leche entera (3,5 a 4,5 por 100 de mate-ria grasa):

K = 0,972Para leche con 3 por 100 de materia grasa: K = 0,976.Para leche con 2 por 100 de materia grasa: K = 0,980.Para leche con 1 por 100 de materia grasa: K = 0,985.Para leche desnatada: K = 0,989.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o unainmediatamente después de otra por el mismoanalista, no debe ser mayor de 0,002 g calcio por100 g de leche.

12.6. Referencia.12.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 36: 1966.

13. FOSFORO

13.1. Principio.Se entiende por contenido en fósforo de la

leche la cantidad total de fósforo expresada enporcentaje en peso, determinada por el procedi-miento expuesto a continuación, que correspondea la norma FIL-42: 1967 de la Federación Interna-cional de Lechería.

Este método se aplica a todas las leches líqui-das normales, así como a las leches reconstitui-das por dilución o disolución de las leches con-centradas o de las leches desecadas.

Las materias orgánicas de la leche se destru-yen por mineralización en seco (incineración). Elfósforo se determina colorimétricamente, redu-ciendo el amonio fosfomolibdato con diamonifenol(amidol) y midiendo la densidad óptica de la solu-ción obtenida.

13.2. Material y aparatos.13.2.1. Balanza analítica.13.2.2. Cápsulas de platino o de cuarzo (de

55 mm de diámetro aproximadamente) provistade vidrio de reloj.

13.2.3. Baño de agua.13.2.4. Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.13.2.5. Matraces aforados, de 25 ml con tapo-

nes esmerilados, de 100 y de 1.000 ml.13.2.6. Horno mufla.13.2.7. Estufa a 105º ± 2ºC.13.2.8. Espectrofotocolorímetro.

13.3. Reactivos.181021 Acido Clorhídrico 1 mol/l (1N) SV132175 Acido Perclórico 70% PA-ACS-ISO131074 Agua PA-ACS131134 Amoníaco Molibdato 4-hidrato PA-

ACS-ISO131509 Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA131698 Sodio Disulfito PA-ACS

13.3.1. 181021 Acido Clorhídrico 1 mol/l (1N)SV.

13.3.2. Acido Perclórico 65% (d. 1,61). UseseAcido Perclórico 70% PA-ACS-ISO y diluir conve-nientemente.

13.3.3. Solución de Amidol: Disolver en AguaPA-ACS 1 gramo de Amidol (2,4-DiaminofenolDiclorhidrato: (NH2)2C6H3OH. 2HCl y 20 g deSodio Disulfito PA-ACS o Sodio Pirosulfito(Na2S2O5) Completar hasta 100 ml en un matrazaforado con tapón esmerilado. Preparar cada díauna solución nueva.

13.3.4. Solución de molibdato: Disolver enAgua PA-ACS 8,3 g de 131134 Amonio Molibda-to 4-hidrato PA-ACS-ISO: (NH4)6Mo7O24.4H2O.Completar hasta 100 ml.

13.3.5. Solución acuosa de Potasio di-Hidró-geno Fosfato PA (a partir de KH2PO4, desecadodurante 2 horas a 105ºC), que permite trazar unacurva de diferencia para la determinación del Fós-foro: Pesar 4,393 g de Potasio di-Hidrógeno Fos-fato PA KH2PO4, disolver en Agua PA-ACS y com-pletar hasta 1.000 ml (solución A). Diluir 10 ml desolución A hasta 1.000 ml (solución B).

Un ml de solución B = 10 microgramos de P.Todos los reactivos deben ser puros para aná-

lisis.

13.4. Procedimiento.13.4.1. Preparación de la muestra: Antes del

análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarcuidadosamente. Si no se obtiene una dispersiónhomogénea de la materia grasa, calentar lenta-mente la muestra a 40ºC, agitar suavemente yenfriar a 20º ± 2ºC.

13.4.2. Ensayo en blanco: Efectuar un ensayoen blanco con todos los reactivos, operandocomo se prescribe en 13.4.3.3., pero reemplazan-do los 5 ml de la dilución por 5 ml de Agua PA-ACS.

13.4.3. Determinación:13.4.3.1. Mineralización por vía seca: En una

34

cápsula de platino o de cuarzo pesar exactamen-te alrededor de 10 g de leche con una aproxima-ción de 10 mg. Evaporar, hasta sequedad, al bañode agua hirviendo. Después de la desecacióncompleta, calcinar en la mufla a una temperaturacomprendida entre 500ºC y 550ºC hasta la obten-ción de cenizas blancas.

13.4.3.2. Preparación de la solución de ceni-zas: Después de enfriar la cápsula, cubrirla convidrio de reloj, disolver las cenizas en 2 o 3 ml deAcido Clorhídrico 1 mol/l (1N) SV y diluir con AguaPA-ACS. Transvasar la solución de las cenizas aun matraz aforado de 100 ml, lavar el vidrio dereloj y la cápsula, recogiendo las aguas de lavadoen el matraz. Completar hasta 100 ml con AguaPA-ACS, agitar y filtrar. Tomar 10 ml del filtrado,introducirlos en un matraz de 100 ml. Completarhasta 100 ml con Agua PA-ACS y agitar.

13.4.3.3. Determinación colorimétrica del fós-foro: Tomar 5 ml de la dilución preparada en13.4.3.2. e introducirlos en un matraz aforado de25 ml. Añadir sucesivamente 2 ml de Acido Per-clórico, 2 ml de la solución de Amidol, 1 ml de lasolución de Amonio Molibdato. Completar hasta25 ml con Agua PA-ACS y mezclar. Esperar 5minutos y medir la densidad óptica utilizandocubeta de 1 cm en un espectrofotocolorímetro a750 nanómetros. Buscar en la curva patrón lacantidad de Fósforo contenida en el matraz de 25ml, expresada en microgramos y correspondientea la densidad óptica leída.

13.4.3.4. Determinación de la curva patrón: Encuatro matraces aforados de 25 ml introducir 3, 5,7, y 10 ml de la solución B. Las cantidades asíintroducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 micro-gramos de Fósforo. Proceder a continuacióncomo en 13.4.3.3. Situar sobre una gráfica lasdensidades ópticas obtenidas en función de lascantidades de Fósforo presentes en los matraces.Trazar la curva patrón (que es una recta).

13.5. Cálculo.El contenido en fósforo de la leche expresada

en g de fósforo por 100 g de leche viene dado porla fórmula siguiente:

m - m'Fósforo % = ––––––––

50M

m = masa de fósforo, expresada en microgra-mos, obtenida según 13.4.3.4. y contenida en elmatraz de 25 ml con la muestra de aproximada-mente 50 mg de leche.

m' = masa de fósforo, expresada en microgra-mos, obtenida según 13.4.3.4. y contenida en elensayo en blanco.

M = masa de leche, expresada en gramos,empleada para la mineralización.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o unainmediatamente después de otra por el mismoanalista no debe ser mayor de 0,008 g de fósforopor 100 g de leche.

13.6. Referencia.13.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 42: 1967.

14(a). HARINA DE ALFALFA(Método comparativo, B.O.E. 30-8-1979)

14(a).1. Principio.Determinación de harina de alfalfa en leche

desnaturalizada por comparación visual y micros-cópica frente a muestras patrón.

14(a).2. Material y aparatos.14(a).2.1. Tamiz de 0,25 mm de luz de malla.14(a).2.2. Lupa para 10 a 20 aumentos.14(a).2.3. Material necesario para observación

microscópica.

14(a).3. Procedimiento.14(a).3.1. Preparación de la muestra patrón de

harina de alfalfa.Mezclar íntimamente muestra de harina de

alfalfa adquiridas en el mercado finamente moli-das.

Tamizar la harina obtenida empleando el tamiz14(a).2.1.

Separar las dos fracciones y mezclarlas en lasiguiente proporción: 98 partes de la fracción másfina y 2 de la más gruesa.

Dicha mezcla se considera como muestrapatrón de harina de alfalfa.

14(a).3.2. Preparación de las muestras patrónde leche en polvo-harina de alfalfa.

Mezclar y homogeneizar leche en polvo sin des-naturalizar y la muestra patrón de harina de alfalfaobtenida, según las siguientes proporciones:

Realizar con estas muestras patrón una seriede preparaciones, colocando en el centro de unportaobjetos 0,6 g aproximadamente de cada una

35

M

Gramos Gramos Porcentajede leche de harina de harinaen polvo de alfalfa de alfalfa

99 1 1 %98,5 1,5 1,5 %98 2 2 %97,5 2,5 2,5 %97 3 3 %96,5 3,5 3,5 %96 4 4 %

de las muestras. Cubrir con otro portaobjetos yextender el polvo mediante compresión y giro delos dos vidrios, hasta lograr una lámina circular deunos 2 cm de diámetro. Sujetar los dos portaob-jetos fijando los extremos con papel adhesivotransparente.

La colección de patrones así obtenida se con-serva para ulteriores determinaciones.

14(a).3.3. Determinación de la harina de alfalfacontenida en la muestra de leche en polvo a ana-lizar.

Obtener una preparación en forma análoga a laanteriormente descrita y comparar con las mues-tras patrón de leche en polvo-harina de alfalfa,separando aquéllas que, a simple vista, sean aná-logas o muy próximas a la muestra problema.

Proceder a una comparación microscópicaentre la muestra a analizar y cada una de lasmuestras separadas, empleando lupa de 10 a 20aumentos, considerando tanto el tamaño como ladensidad de las partículas que aparecen en unaserie de campos, obteniendo valores medios yexpresando los resultados en porcentaje de hari-na de alfalfa contenida en la leche en polvo anali-zada.

14(a).4. Referencia.14(a).4.1. A. López, M. del C. Díaz-Peñalver y

J. Gutiérrez: "Leches desnaturalizadas". Compro-bación de la desnaturalización de las mismas".

14(b). HARINA DE ALFALFA(Método gravimétrico)

14(b).1. Principio.Separación de las partículas de alfalfa, por

lavado con agua y posterior determinacióngravimétrica.

14(b).2. Material y aparatos.14(b).2.1. Vaso de precipitados de 250 ml.14(b).2.2. Tamiz de 0,25 mm de luz de malla.14(b).2.3. Embudo. 14(b).2.4. Matraz erlenmeyer de 2.000 ml.14(b).2.5. Trompa de vacío 14(b).2.6. Placa filtrante de vidrio del número 1.14(b).2.7. Estufa de desecación.

14(b).3. Procedimiento.Pesar 50 g de leche desnaturalizada en un

vaso de precipitados de 250 ml y adicionar 150 mlde Agua PA-ACS. Una vez bien impregnada laleche desnaturalizada, formar una papilla fina poragitación mediante una varilla con el extremo cur-vado en forma de U.

Añadir a continuación otros 100 ml de AguaPA-ACS, agitar y pasar la papilla a través del tamiz14(b).2.2. (previamente desecado a 100ºC hastapeso constante, con precisión de 0,01 g) coloca-

do sobre un embudo y éste a su vez sobre unmatraz erlenmeyer de 2.000 ml.

Lavar el vaso y el tamiz añadiendo poco a pocoAgua PA-ACS a 40ºC en chorro fino, removiendolos pequeños grumos con ayuda de la varilla hastaque toda la leche haya sido arrastrada por elagua. Se precisan aproximadamente 1,5 litros.

Dejar escurrir el tamiz y desecarlo en estufa a100ºC, colocado sobre un papel de filtro.

Una vez desecado el tamiz hasta peso cons-tante, se pesa con aproximación de 0,01 g, reco-giéndose en él previamente las partículas quepudieran haber caído en el papel de filtro a medi-da que se producía la desecación de la harina dealfalfa. Se obtiene así un peso p1.

Las partículas de alfalfa, a causa de la hume-dad, sufren un hinchamiento, por lo que es nece-sario tamizar de nuevo después de la desecacióny de exponer el tamiz a humedad ambiente duran-te dos horas, obteniéndose así el peso p2 de lacantidad retenida por el mismo.

Filtrar a vacío la leche recogida en el erlenme-yer a través de la placa filtrante 14(b).2.6., cuyofondo y paredes se han recubierto de algodón .Antes de iniciarse la filtración, pesar con aproxi-mación de 0,01 g, la placa y el algodón previa-mente desecados a 100ºC. La filtración se realizaañadiendo la leche poco a poco sobre el centrode la placa, cuidando que el vacío no sea dema-siado intenso para evitar la formación de espuma.Lavar con abundante Agua PA-ACS a 40ºC hastaque ésta pase completamente transparente.Desecar la placa a 100ºC hasta peso constante ypesar con aproximación de 0,01 g. Se obtiene asíel peso de las partículas de alfalfa p3.

14(b).4. Cálculo.La humedad propia de la harina de alfalfa se

estima en un 8%. Los valores reales de la harinade alfalfa total contenida en 50 g de muestra (P) yde la retenida por el tamiz (p), serán:

8 (p1 + p2)% de harina de alfalfa P = p2 (p1 + p3+ ––––––––––)

100P = p2

14(b).5. Referencia.14(b).5.1. A. López, M. del C. Díaz-Peñalver y

J. Gutiérrez: "Leches desnaturalizadas". Compro-bación de la desnaturalización de las mismas".

36

15. FENOLFTALEINA EN LECHEDESNATURALIZADA(Método cualitativo)

15.1. Principio.Detección de fenolftaleína en leche desnaturali-

zada en presencia de una solución alcalina.

15.2. Material y aparatos.Tubos de ensayo 160/60.

15.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS182158 Sodio Hidróxido 2 mol/l (2N) SV

15.4. Procedimiento.Poner en un tubo de ensayo 160/60, aproxi-

madamente 0,5 g de leche en polvo, añadir 10 mlde Agua PA-ACS y agitar hasta lograr una emul-sión uniforme. Añadir 2 ml de solución de SodioHidróxido 2 mol/l (2N) SV.

La presencia de Fenolftaleína en la muestra semanifiesta por la aparición de una serie de puntosrojo-rosados que se ensanchan, intensificando sucolor hasta llegar a un máximo, para empalidecerseguidamente y llegar a desaparecer transcurridoun cierto tiempo.

Comparar con un patrón de leche en polvoconteniendo Fenolftaleína al 1/20.000.

16. FECULA(Método comparativo)

16.1. Principio.Determinación de fécula en leche desnaturali-

zada por comparación con muestras patrón.

16.2. Material y aparatos.16.2.1. Matraz aforado de 100 ml.16.2.2. Probeta de 100 ml.16.2.3. Pipeta de 10 ml.

16.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS181772 Yodo 0,05 mol/l (0,1N) SV

16.4. Procedimiento.16.4.1. Preparación del desnaturalizante pa-

trón.Mezclar íntimamente 80 g de salvado y 20 g de

fécula de la misma naturaleza que la que se pre-tende identificar.

16.4.2. Preparación de patrones de leche des-cremada en polvo y desnaturalizante patrón.

Mezclar haciendo uso del mortero, según lassiguientes proporciones:

16.4.3. Determinación de la muestra.Pesar exactamente un gramo de la muestra

con precisión de 0,01 g. Pasar a un mortero y pre-parar una papilla con 25 ml de Agua PA-ACS hir-viendo y verter en un matraz aforado de 100 ml.Lavar el mortero con Agua PA-ACS caliente repe-tidas veces vertiendo los líquidos de lavado en elmatraz hasta obtener unos 75 ml; agitar enérgica-mente y llevar a un baño de María durante diezminutos, agitando de cuando en cuando; enfriar elmatraz al chorro de agua fría y llevar el contenidoexactamente a 100 ml.

Tomar 10 ml exactamente medidos y pasar auna probeta de 100 ml. Añadir 80 ml de Agua PA-ACS, 1 ml de solución de Yodo 0,05 mol/l(0,1N)SV, completar hasta el enrase con Agua PA-ACS; agitar enérgicamente.

Verificar el mismo método con los tres patronespreparados. El color desarrollado en la muestra secompara a los cinco minutos con el de los trespatrones.

17. SALVADO

17.1. Principio.Separación por tamizado del salvado y deter-

minación gravimétrica.

17.2. Material y aparatos.17.2.1. Tamiz de 0,210 mm de luz de malla.17.2.2. Tamiz de 0,074 mm de luz de malla.17.2.3. Estufa de desecación.

17.3. Procedimiento.Pesar con precisión de 0,01 g, 20 g de leche y

tamizarla exhaustivamente a través del tamiz17.2.1. estándar. Recoger cuidadosamente lafracción de salvado retenida por el tamiz y pesar.A continuación, empastar con Agua PA-ACS laparte tamizada, deshaciendo todos los grumosque puedan formarse con ayuda de una varilla devidrio con el extremo curvado en forma de U ydiluir con Agua PA-ACS hasta completar unos 300ml.

Verter la emulsión sobre el tamiz 17.2.2., pre-viamente desecado a 100ºC hasta peso constan-te; lavar repetidamente el residuo que permaneceen el tamiz hasta que las aguas de lavado pasen

37

M

Leche descrema- Desnaturali-Patrón da en polvo zante patrón

– –(g) (g)

Núm. 1 ............ 85 15Núm. 2 ............ 80 20Núm. 3 ............ 75 25

transparentes e incoloras. Desecar el tamiz en unaestufa a 100ºC hasta peso constante.

17.4. Cálculos.El contenido en salvado en 100 g de la mues-

tra viene dado por:

Ps = 5 (a + 1,3 b)

Siendo:

b = peso, en g, de la fracción de salvado rete-nida por el tamiz de 17.2.2.

a = peso, en g, de la fracción de salvado rete-nida por el tamiz de 17.2.1.

17.5. Observaciones.17.5.1. Se estima que la pérdida que sufre el

salvado por lavado y desecación es del 30%.

18. FECULA + SALVADO

18.1. Principio.Separación por centrifugación de la fécula y del

salvado y determinación gravimétrica.

18.2. Material y aparatos.18.2.1. Centrífuga de 3.000 r.p.m.18.2.2. Estufa de desecación al vacío.

18.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS251774 Líquido de Lugol DC. En su defecto

prepararla como sigue: Mezclar 1 g de 141771Yodo resublimado PRS y 1 g de 131542 PotasioYoduro PA-ISO en Agua PA-ACS hasta 200 ml.Mantener la solución en el frasco cuentagotas.

18.4. Procedimiento.Pesar con aproximación de 0,001 g, 0,5 g de la

muestra de leche a analizar y colocarla en un tubode centrífuga previamente pesado con igual exac-titud. Añadir 10 ml de Agua PA-ACS fría y agitarcon una varilla de vidrio hasta disolución de laleche. A continuación, centrifugar a 3.000 r.p.m.

Decantar la emulsión sobrenadante y añadir10 ml de Agua PA-ACS fría al residuo insoluble;agitar de nuevo con una varilla, centrifugar otrosquince minutos a idénticas revoluciones y decan-tar. Repetir estas operaciones al menos cuatroveces.

Los líquidos obtenidos por decantación tras lacentrifugación no deben dar colocación azul conLíquido de Lugol.

Desecar a 80ºC en estufa de vacío el residuofinal contenido en el tubo de centrífuga, hastapeso constante. El peso del residuo presentará elpeso total del desnaturalizante contenido en 0,5 gde la leche desnaturalizada.

18.5. Cálculo.El salvado contiene una humedad media que

puede cifrarse en un 10%; por ello, el peso delresiduo centrifugado debe incrementarse en lahumedad correspondiente al salvado contenidoen 0,5 g de leche, que en un producto correcta-mente desnaturalizado al 20% será 0,008 g.El peso del desnaturalizado total será:

100 (Rs + h)% desnaturalizado = –––––––––––––

P

Siendo:Rs = peso, en g, del residuo.h = factor de corrección de humedad del sal-

vado = 0,008 g.P = peso, en g, de la leche desnaturalizada.

19. SUSTANCIAS PROTEICASREDUCTORAS (B.O.E. 14-10-1981)

19.1. Principio.Determinación de las sustancias proteicas

reductoras de la leche, mediante reacción conpotasio ferricianuro y posterior valoración colori-métrica. Este método es aplicable a la detecciónde leche en polvo reconstituida en leche cruda opasterizada.

19.2. Material y aparatos.19.2.1. Espectrofotómetro que permite lectu-

ras de 610 nm con cubetas de 1 cm.19.2.2. Centrífuga 1.000-1.500 r.p.m.19.2.3. Tubos de centrífuga graduados a 50 ml.19.2.4. Baño de agua de temperatura regulable

hasta 80ºC.

19.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS131067 Acido Tricloroacético PA-ACS131074 Agua PA-ACS141358 Hierro III Cloruro 6-hidrato PRS131503 Potasio Hexacianoferrato III PA-ACS131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131481 Potasio Hidrógeno Ftalato PA-ISO131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO131754 Urea PA

19.3.1. Solución de Acido Acético 5%. Diluir50 ml de Acido Acético glacial PA-ACS con AguaPA-ACS a 1 litro.

19.3.2. Solución saturada de Urea PA en AguaPA-ACS.

19.3.3. Solución tampón. Disolver 2 g de SodioHidróxido lentejas PA-ACS-ISO en Agua PA-ACSy diluir a 250 ml. Disolver 10,2 g de Potasio Hidró-

38

geno Ftalato PA-ISO en Agua PA-ACS y diluir a250 ml. Mezclar 150 ml de la solución de SodioHidróxido lentejas PA-ACS-ISO con 200 ml de lasolución de Potasio Hidrógeno Ftalato PA-ISO,diluirlo hasta 800 ml y ajustar la solución final a unpH 5,6 por adición de las soluciones de SodioHidróxido o Potasio Hidrógeno Ftalato.

19.3.4. Solución de Potasio HexacianoferratoIII PA-ACS al 1%- Disolver 10 g de Potasio Hexa-cianoferrato III PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir a1 litro. Desechar la solución si presenta colorverde o contiene precipitado azul. Esta solucióndebe utilizarse recién preparada.

19.3.5. Solución de Acido Tricloroacético 10%.Disolver 100 g de Acido Tricloroacético PA-ACSen Agua PA-ACS y diluir a 1 litro.

19.3.6. Solución de Hierro III Cloruro 6-hidrato0,1%. Disolver 0,1 g de Hierro III Cloruro 6-hidra-to PRS en Agua PA-ACS y diluir a 100 ml. Estasolución debe utilizarse recién preparada. 19.3.7.Solución de Potasio Hexacianoferrato II 0,05mg/ml. Pesar 0,1147 g de Potasio Hexacianofe-rrato II 3-hidrato PA-ACS y diluir a 1 litro con AguaPA-ACS. Diluir 50 ml de esta solución a 100 ml enmatraces aforados. Cada ml contiene 0,05 mg dePotasio Hexacianoferrato II anhidro. Debido a queeste reactivo se oxida fácilmente con el aire sedebe utilizar inmediatamente después de su pre-paración.

19.4. Procedimiento.19.4.1. Preparación de la curva de referencia.Pipetear 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5;

4,0 ml de la solución de Potasio Hexacianoferra-to (0,05 mg/ml) en tubos de ensayo. AñadirAgua PA-ACS hasta un volumen total de 5 ml. Atodos los tubos se les añade 5 ml de la "solu-ción blanco" preparada como se describe acontinuación:

Diluir 3 ml de la solución de Urea PA a 15 mlcon Agua PA-ACS en un tubo de centrífuga, aña-dir 5 ml de la solución tampón, 5 ml de la soluciónPotasio Hexacianoferrato III y 5 ml de la soluciónde Acido Tricloroacético. Mezclar bien con unavarilla de vidrio (La "solución blanco" no necesitaser calentada, ni filtrada para la curva de referen-cia. Sin embargo, cuando analizan las muestras,el blanco se calienta y se filtra igual que en lascondiciones del ensayo).

A intervalos convenientes añadir 1 ml de lasolución de Hierro III Cloruro 0,1%, para desarro-llar el color, agitar y dejar en reposo exactamentedurante 10 minutos. Ajustar el 100% de transmi-tancia con la solución control (0,0* ml de disolu-ción de Potasio Hexacianoferrato II) a 610 nm.Leer a continuación en transmitancia las distintaspreparaciones de las soluciones patrones y repre-sentar los valores obtenidos frente a concentra-ciones en mg de Potasio Hexacianoferrato II en

papel semilogarítmico. Preparar la curva de refe-rencia con cada serie de análisis.

(*) Se refiere al tubo n.º 1

19.4.2. Determinación.Mantener las muestras aproximadamente a

3ºC. Las muestras congeladas o conservadas soninadecuadas para la determinación. Pipetear 15ml de la muestra previamente homogeneizada enun tubo de centrífuga graduado de 50 ml, quecontenga 15 ml de Agua PA-ACS. Añadir 3 ml dela solución de Acido Acético 5%, agitar bien conuna varilla de vidrio y centrifugar durante 5 minu-tos. Decantar el líquido sobrenadante. (Unapequeña parte del precipitado puede quedar flo-tando en la parte superior del tubo después decentrifugar; si la mayor parte del precipitadoqueda en el fondo del tubo, se puede despreciar.Sin embargo, si la muestra contiene excesivanata, el precipitado flotará y no podrá separarse elsobrenadante. Desechar la determinación y volvera mezclar la muestra completamente. Lavar elprecipitado dos veces con porciones de 15 ml deAgua PA-ACS, mezclando cada vez el precipitadocon una varilla de vidrio, centrifugar 15 minutos ydecantar.

Al precipitado y a un tubo centrífuga limpio quese llevará paralelamente como blanco, añadir 3 mlde solución de Urea y entonces diluir a 15 ml conAgua PA-ACS. Agitar, añadir 5 ml de la solucióntampón y 5 ml de la solución de Potasio Hexacia-noferrato III 1%, y agitar de nuevo. Colocar en unbaño de agua a 70ºC, exactamente 20 minutos yenfriar en hielo.

Una vez frío, añadir 5 ml de la solución deAcido Tricloroacético 10%, agitar y filtrar a travésde un papel Whatman nº 40 de 11 cm o similar.Usar los primeros 5 ml del filtrado para lavar lasparedes y el fondo del recipiente, desechándolos.Verter el resto de la solución sobre el filtro y dejarque filtre completamente; filtrar de nuevo si el fil-trado es turbio.

Introducir 5 ml de Agua PA-ACS en un tubo deensayo, añadir 5 ml del filtrado claro. Adicionar1 ml de la solución de Hierro III Cloruro 0,1% paraque se desarrolle el color, agitar y dejar en reposoexactamente 10 minutos. Ajustar el 100% detransmitancia a 610 nm con el blanco y efectuar lalectura. Con las series de muestras, añadir lasolución de Hierro III Cloruro a intervalos conve-nientes para permitir las lecturas después delperiodo de 10 minutos.

19.5. Cálculo.A partir de la curva de referencia, determinar

la cantidad de sustancias reductoras como mgde Potasio Hexacianoferrato II por 100 ml deleche, multiplicando el valor obtenido de la curvapor 40.

39

M

19.6. Observaciones.Los análisis deben terminarse el mismo día que

se comiencen. Es importante que las muestras nopermanezcan demasiado tiempo después de enfria-miento o después de la filtración. Durante la deter-minación el laboratorio debe estar libre de vaporesoxidantes o reductores (H2S, Cl2, NHO3, etc.).

19.7. Referencia.19.7.1. "Official Methods of Analysis of The

AOAC" Ed. 1975, Nº 16.047-16.050.

20. RESIDUO INSOLUBLE DE SANGRE(B.O.E. 20-1-1982)

20.1. Principio.Mediante dilución de la sangre en suero fisioló-

gico, posterior filtración y desecación se obtieneel residuo insoluble, cuyo porcentaje se determinapor pesada.

Este método es aplicable a leches en polvo,que pueden contener harina de sangre de lasdenominadas comercialmente solubles.

20.2. Material y aparatos.20.2.1. Embudo cilíndrico esmerilado con

placa filtrante, soldada al mismo de 65 mm dediámetro y porosidad 1. Su peso debe ser inferioral límite máximo de pesada de las balanzas analí-ticas, lo que normalmente se consigue con unaaltura del cilindro igual o inferior a 4 cm.

20.2.2. Agitador electromagnético.20.2.3. Estufa de desecación.

20.3. Reactivos.131007 Acetona PA-ACS-ISO131020 Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO131074 Agua PA-ACS141076 Hidrógeno Peróxido 30% p/v (100 vol.)

PRS131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO

20.3.1. Suero Salino Fisiológico. Se obtienedisolviendo 9 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO en1.000 ml de Agua PA-ACS.

20.3.2. Acetona PA-ACS-ISO.20.3.3. Hidrógeno Peróxido 30% p/v (100 vol.)

PRS.20.3.4. Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO.

20.4. Procedimiento.20.4.1. Tomar aproximadamente un gramo de

muestra, medida con la precisión del miligramo, ydiluir en un vaso de precipitados de 250 ml con50 ml de Suero Salino Fisiológico agitando con unagitador electromagnético durante cinco minutos.

A continuación verter y filtrar el líquido poco apoco en el embudo cilíndrico con placa filtrante,

previamente desecado y pesado con la precisióndel miligramo y filtrar con ayuda de vacío.

Lavar agitador y vaso con pequeñas cantida-des de Suero Salino Fisiológico, que se viertenluego en el embudo hasta completar la filtracióncon una cantidad aproximada de 200 ml de líqui-do de lavado. Lavar a continuación embudo yplaca dos veces con Agua PA-ACS y añadir des-pués 10 ml de Acetona PA-ACS-ISO, de formaque empapen bien la placa. Someter a vacíodurante unos minutos.

A continuación pasar el embudo a una estufa ydesecar a 100-105ºC hasta peso constante (pre-cisión del miligramo).

20.4.2. Limpieza del embudo cilíndrico conplaca filtrante. Acoplar el embudo cilíndrico en unerlenmeyer y verter sobre la placa filtrante unos50 ml de Hidrógeno Peróxido 30% p/v (100 vol.)PRS y de 1 a 5 ml de Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO. Dejar reposar durante unas veinticuatrohoras y añadir, si es necesario, más HidrógenoPeróxido 30% p/v (100 vol.) PRS y Acido Clorhí-drico 37% PA-ACS-ISO para ultimar la limpieza. Acontinuación lavar repetidamente cilindro y placacon Agua Desionizada.

20.5. Cálculo.

P1 x 100R (porcentaje) = ––––––––––

P2

siendo:

R = % de residuo insoluble.P1 = peso, en gramos del residuo obtenido por

diferencia de pesadas del embudo cilíndrico.P2 = peso, en gramos, de la muestra.

21. DETECCION DE LECHE DE VACA ENMEZCLAS CON LECHE DE OVEJA YCABRA

21.1. Principio.Se puede detectar la leche de vaca en mezclas

con leche de oveja o cabra mediante extraccionesde la caseína y posterior separación por electrofo-resis en gel de poliacrilamida. La caseína aSI deleche de vaca presenta una mayor movilidad elec-troforética que las caseínas aS de leches de ovejao cabra.

21.2. Material y aparatos.21.2.1. Centrífuga.21.2.2. Equipo de electroforesis.21.2.3. Fuente de alimentación.21.2.4. Tubos para electroforesis de 11 cm de

longitud y 0,7 cm de diámetro.21.2.5. pH-metro.

40

21.2.6. Material de uso corriente en laboratoriode pipetas, tubos, micropipetas, etc.

21.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS181009 Acido Acético 1 mol/l (1N) SV181021 Acido Clorhídrico 1 mol/l (1N) SV253309 Acrilamida DC131074 Agua PA-ACS131138 Amonio Peroxodisulfato PA171165 Azul de Bromofenol RE-ACS131340 Glicina PA131091 Metanol PA-ACS-ISO252036 Negro Amido 10B DC181691 Sodio Hidróxido 1 mol/l (1N) indicador:

Azul de Bromofenol SV131940 Tris (Hidroximetil) Aminometano

PA-ACS131754 Urea PA

21.3.1. Acido Acético 1 mol/l (1N) SV o diluirAcido Acético glacial PA-ACS en Agua PA-ACShasta la concentración indicada.

21.3.2. Sodio Hidróxido 1 mol/l (1N) indicador:Azul de Bromofenol SV.

21.3.3. Solución de urea 7M. Disolver Urea PAen Agua PA-ACS y diluir hasta la concentraciónindicada.

21.3.4. Solución A. Tampón pH 8,9. Disolver48 ml de Acido Clorhídrico 1 mol/l (1N) SV, 36,3 gde Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS y 0,46ml de TEMED en Agua PA-ACS hasta 100 ml.

21.3.5. Solución B de Acrilamina. Disolver 60 gde Acrilamida DC y 1,6 g de NN' Metilenbisacrila-mida (Bis) en Agua PA-ACS hasta 200 ml.

21.3.6. Solución tampón para depósitos de loselectrodos pH 8,4. Disolver 0,60 g de Tris (Hidro-ximetil) Aminometano PA-ACS y 2,88 g de GlicinaPA en Agua PA-ACS hasta 100 ml. Se puede pre-parar un tampón concentrado 10 veces y guardaren nevera diluyéndolo en el momento de su utili-zación.

21.3.7. Solución de Amonio Peroxodisulfato.Disolver 0,56 g de Amonio Peroxodisulfato PA enAgua PA-ACS hasta 100 ml. Este reactivo debeprepararse nuevo cada semana.

21.3.8. Solución de tinción. Disolver 0,56 g deNegro Amido 10B DC en una mezcla de 250 ml deMetanol PA-ACS-ISO, 650 ml de Agua PA-ACS y100 ml de Acido Acético glacial PA-ACS.

21.3.9. Solución de lavado. Mezclar 400 ml deMetanol PA-ACS-ISO, 50 ml de Acido Acético gla-cial PA-ACS y 550 ml de Agua PA-ACS.

21.3.10. Solución de Azul de Bromofenol RE.Disolver 1 mg de 171165 Azul de Bromofenol RE-ACS en 100 ml de 131074 Agua PA-ACS.

21.4. Procedimiento.21.4.1. Preparación de la muestra: Diluir la

leche, previamente desnatada por centrifugacióna 1/5 con Agua PA-ACS. Calentar a 35ºC y llevara pH 4,6 mediante adición de Acido Acético 1mol/l (1N) SV. Separar la caseína precipitada porcentrifugación y lavar varias veces con Agua PA-ACS. Disolver la caseína en un volumen de Aguaigual a la mitad del volumen de la leche original,añadiendo solución de Sodio Hidróxido 1 mol/l(1N) (indicador: Azul de Bromofenol) SV. Inmedia-tamente antes de la electroforesis, disolver unvolumen igual de Urea 7M, preparada reciente-mente. Para la electroforesis es suficiente aplicarde 100 a 200 ug de caseína disuelta.

21.4.2. Preparación del gel: Mezclar 5 ml desolución A (21.3.4.), 10 ml de solución B (21.3.5.)y 11,5 g de Urea PA en una probeta de 50 ml.Añadir Agua PA-ACS con agitación hasta 35 ml dedisolución. Desairear mediante vacío y añadir 5 mlde la solución de Peroxodisulfato. Agitar la solu-ción e inmediatamente llenar con la misma lostubos (previamente tapados por su parte inferior)hasta 1 cm del extremo superior, evitando la for-mación de burbujas de aire.

Completar el llenado de los tubos con unapequeña cantidad de agua que asegura la super-ficie plana del gel, a la vez que evita la posible inhi-bición de la polimerización por el oxígeno atmos-férico. La polimerización tiene lugar en veinte -treinta minutos.

21.4.3. Electroforesis: Colocar los geles, unavez polimerizados y después de eliminar el agua,en los módulos del aparato de electroforesis enposición vertical y llenar las dos cámaras de loselectrodos con el tampón pH 8,4.

Aplicar con micropipeta en la superficie del geluna cantidad de la solución de caseína en ureaque contenga de 100 a 200 ug de caseína. Aña-dir una gota de Azul de Bromofenol y completar elllenado de los tubos con una pequeña cantidadde tampón.

Utilizar el depósito superior como cátodo y elinferior como ánodo. Conectar la corriente y apli-car una intensidad constante de 1 mA por tubodurante 1,5 a 2 horas (hasta que el Azul de Bro-mofenol llegue al extremo del gel).

21.4.4. Separación, teñido y desteñido de losgeles: Para desprender el gel del tubo de vidrio sepuede utilizar una jeringa con una aguja sin punta,colocándola entre el gel y el tubo. Inyectar agua apresión y rotar el tubo, con lo que entra ésta y sedesprende el gel.

Una vez desprendido, colocar cada gel en untubo con solución colorante de Negro Amido 10Bdurante una hora. Eliminar la solución de teñido yañadir solución de lavado, que debe renovar hastaque se observe las bandas de nitidez. Los gelesse pueden conservar durante meses en soluciónde Acido Acético glacial PA-ACS al 7%.

41

M

21.5. Cálculos.21.5.1. Identificación de las bandas: El diagra-

ma electroforético de las caseínas de leche deoveja contiene dos grupos de bandas de proteí-nas. El primer grupo, de dos bandas, correspon-de a las b caseínas, y el segundo, consistente entres bandas, a las aS caseínas, que se designancomo aS1, aS2 y aS3.

La leche de vaca se puede detectar en mezclascon leche de oveja o cabra, debido a la mayormigración eletroforética de la caseína aS1 de vaca,que se hace visible por encima de las bandas decaseína de oveja o cabra.

La intensidad de la banda aS1 de vaca aumen-ta cuando es mayor el porcentaje de mezcla.

21.5.2. Determinación cuantitativa: La determi-nación cuantitativa de la proporción de leche devaca añadida a la leche de oveja o cabra se puederealizar por el análisis densitométrico de las ban-das obtenidas en las electroforesis, midiendo en lamezcla el contenido de caseína aS1 de leche devaca y comparando este valor con el contenidomedio de caseína aS de leche de vaca pura. Esnecesario efectuar una curva patrón.

21.5.3. Límite de detección: La técnica descri-ta permite detectar un 2% de leche de vaca enleche de oveja o en leche de cabra.

21.6. Observaciones.21.6.1. La electroforesis en gel de acrilamida

se puede efectuar también en un equipo paraelectroforesis en gel plano.

21.6.2. Todas las soluciones se deben prepararcon agua destilada reciente o hervida, ya que eloxígeno inhibe la polimerización y se pueden for-mar burbujas en el gel.

21.6.3. Todas las soluciones se deben almace-nar en botellas oscuras en el frigorífico.

21.6.4. La acrilamida es neurotóxica, por loque se debe manejar con cuidado.

21.7. Bibliografía.21.7.1. Pierre, A., y Portmann, A., 1970. Ann

Teechnol. Ag. 19, 107-130.21.7.2. Ramos, M.: Martínez-Castro, I., y Juá-

rez, M. 1977. J. of Dairy Sci. 60, 870-877.21.7.3. Adroid, P. (1968) "Separation of milk

proteins", en Smith "Chromatographic and elec-trophoretic tecniques". Vol. II, pág. 399. WilliamHeineimann Medical Books, Ltd. London.

22. SANGRE SOLUBLE

22.1. Principio.Disolución de la hemoglobina en una mezcla

acético-agua y posterior determinación de suabsorbancia a 396 nanómetros. Este método esaplicable a muestras de leche o suero de leche enpolvo que contengan menos del 5% de grasa.

22.2. Material y aparatos.22.2.1. Espectrofotómetro y accesorios (cube-

ta para 1 cm de espesor de líquido).22.2.2. Agitador electromagnético.22.2.3. Centrífuga y tubos de 10 ml.

22.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS131074 Agua PA-ACS

22.3.1. Mezcla Acido Acético glacial PA-ACS-Agua PA-ACS.

22.4. Procedimiento.Pesar con precisión de 0,001 g, 10 g de leche

o suero de leche en polvo e introducir en un vasode precipitados de 250 ml. Añadir 150 ml de AguaPA-ACS previamente calentada a 40-50ºC y agitarhasta que se forme una emulsión; a continuación,trasvasar esta emulsión a un matraz aforado de250 ml, lavar el vaso repetidas veces con AguaPA-ACS, enfriar y enrasar a 250 ml. Tomar 20 mlde la emulsión y verter en un matraz aforado de100 ml, enrasar con la mezcla de Acido Acéticoglacial PA-ACS. Si la solución resulta turbia, cen-trifugar 10 ml durante 15 minutos a unas 5.700revoluciones; retirar a continuación con ayuda deuna espátula la película sobrenadante; filtrar elcentrifugado y repetir las operaciones si es nece-sario de forma que la solución quede finalmentetransparente. A continuación medir la absorbanciaen cubeta de 1 cm a 396 nm, usando como blan-co la solución acético-agua.

22.5. Cálculos.El porcentaje de sangre soluble se deduce por

aplicación de la siguiente fórmula:

A 1.250S = –––––––– x ––––––––

E 11 P

Siendo:S = Porcentaje de sangre soluble presente en

la muestra.A = Absorbancia leída de la muestra.P = Peso en gramos de la leche o suero de

leche en polvo.E 1

1 = Absorbancia específica de la sangre.

22.6. Observaciones.22.6.1. En el caso de disponer de la harina de

sangre utilizada como desnaturalizante, el valor deE1 se obtendrá como se indica a continuación:Pesar con precisión de 0,0001 g 100 mg de hari-na de sangre, e introducirla en un vaso de precipi-tados de 250 ml. Añadir 150 ml de Agua PA-ACS,agitar durante cinco minutos la solución, transferir

42

a un matraz aforado de 250 ml. A continuación,tomar 20 ml de esta solución, llevar a un matrazaforado de 100 ml y enrasar con la mezcla deácido acético glacial-agua. Centrifugar 10 ml deesta solución y medir su absorbancia en cubetade 1 cm a 396 nanómetros usando como blancola solución acético-agua.

AE 1

1 = 12,5 x –––––– P

Siendo: E 1

1 = Absorbancia específica.A = Absorbancia leída.P = Peso en gramos de la harina de sangre. La absorbancia específica E 1

1 no deberá serinferior a 50. En caso contrario, la harina de san-gre no debe ser utilizada como desnaturalizante.

22.6.2. Si no se ha podido determinar estevalor previamente a la adición de la harina de san-gre a la leche o suero se tomará como valor mediode referencia E 1

1 = 52,4.

23(a). DETERMINACION DE LECHE DEVACA EN LECHE DE OVEJA O DECABRA(Por electroforesis)

23(a).1. Principio.La fracción sérica de la muestra se extrae por

adición de solución tampón a pH 4,6 y posteriorcentrifugación. Las proteínas de suero son sepa-radas por electroforesis en gel de poliacrilamida apH 8,3.

Las b lactoglobulinas de leche de vaca presen-tan una mayor movilidad electroforética que las alactoalbúminas y las b lactoglobulinas de la lechede oveja y de la leche de cabra. El método es apli-cable a la leche cruda o pasterizada a una tempe-ratura máxima de 90ºC, durante treinta segundos,fresca o conservada mediante congelación o adi-ción de dicromato potásico.

23(a).2. Material y aparatos.23(a).2.1. Material de uso corriente en labora-

torio.23(a).2.2. Microjeringa.23(a).2.3. pHmetro.23(a).2.4. Centrífuga.23(a).2.5. Equipo de electroforesis.23(a).2.6. Fuente de alimentación.23(a).2.7. Densitómetro.

23(a).3. Reactivos131008 Acido Acético glacial PA-ACS131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO

132838 Acido 5-Sulfosalicílico 2-hidrato PA-ACS

182105 Acido Sulfúrico 1 mol/l (2N) SV131067 Acido Tricloroacético PA-ACS253309 Acrilamina DC131074 Agua PA-ACS131138 Amonio Peroxodisulfato PA171165 Azul de Bromofenol RE-ACS

Azul de Coomassie R-250Azul de Coomassie R-250

141339 Glicerina (USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX

131340 Glicina PA131085 Etanol 96% v/v PA

NN’ Metilenbisacrilamina131515 Potasio Hidróxido 85% lentejas PA171634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE

N,N,N’N’ Tetrametilendiamina (TE-MED).

131940 Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS

23(a).3.1. Reactivos para la obtención de lafracción sérica.

23(a).3.1.1. Solución de Acido Acético al 10%.Diluir 100 ml de Acido Acético glacial PA-ACS conAgua PA-ACS a 1 litro.

23(a).3.1.2. 171634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M)RE.

23(a).3.2. Reactivos para la electroforesis.23(a).3.2.1. Tampón de los geles pH 8,9: Pesar

46 g de Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS,medir 4 ml de Acido Clorhídrico 35% PA-ISO, ydisolver ambos en Agua PA-ACS.

23(a).3.2.2. Solución de Acrilamida Bisacrilami-da (T=9, 4%; c=4,2):

-Acrilamida DC: 9g.-NN'Metilenbisacrilamida: 0,4 g.-Tampón de los geles: 100 ml23(a).3.2.3. Tampón de los electrodos de pH

8,3:-Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS:

1,2 g.-Glicina PA: 5,8 g.-Agua PA-ACS: hasta 2.000 ml.23(a).3.2.4. -Solución de Amonio Peroxodisulfa-

to PA al 10% (este reactivo debe prepararse cadasemana): Disolver unos grs. de Amonio Peroxodi-sulfato en Agua PA-ACS hasta concentracióndada.

23(a).3.2.5. N,N,N',N'- Tetrametilendiamina(TEMED).

23(a).3.2.6. Solución de Azul de BromofenolRE-ACS al 1/1000: Disolver 0,1 g de Azul de Bro-mofenol RE-ACS en 100 ml de Agua PA-ACS.

23(a).3.2.7. Solución de Glicerina al 40%: Mez-clar Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX conAgua PA-ACS hasta la concentración indicada.

23(a).3.3. Reactivos para la tinción.

43

M

23(a).3.3.1. Tinción con Azul Coomassie R-250:23(a).3.3.1.1. Solución fijadora:-Acido 5-Sulfosalicílico 2-hidrato PA-ACS: 17,3 g.-Acido Tricloroacético PA-ACS: 57,5 g.-Agua PA-ACS: hasta 500 ml.23(a).3.3.1.2. Solución decolorante:-Etanol 96% v/v PA: 500 ml.-Acido Acético glacial PA-ACS: 160 ml.-Agua PA-ACS: hasta 2.000 ml.23(a).3.3.1.3. Solución de tinción:-Azul Coomassie Brillante R-250: 0,46 g.-Solución decolorante -23(a).3.3.1.2.-: 400 ml.23(a).3.3.2. Tinción con Azul Comassie G-250.Solución única de fijación y tinción:-Azul Coomassie G-250: 1 g.-Agua PA-ACS: 500 ml.-Acido Sulfúrico 1 mol/l (2N) SV: 500 ml.-Solución de Potasio Hidróxido 10N: Disolver

unos gramos de Potasio Hidróxido 85% lentejasPA en Agua PA-ACS hasta la concentración indi-cada. Valorar.

-Acido Tricloroacético PA-ACS.Disolver el Azul de Coomassie G-250 en

131074 Agua PA-ACS y añadir la solución AcidoSulfúrico 1 mol/l (2N) SV. Mezclar bien agitandodurante una hora y filtrar por papel Whatmannúmero 1. Medir el volumen de filtrado y añadir1/9 de este volumen de la solución de PotasioHidróxido 10N. Añadir Acido Tricloroacético PA-ACS a esta disolución hasta que la concentraciónfinal sea de 12%. Esta solución de teñido es esta-ble durante varios meses si el pH se mantiene pordebajo de 1. Se puede utilizar varias veces peroes conveniente filtrarla antes de cada uso.

23(a).4. Procedimiento.23(a).4.1. Obtención de la fracción soluble a pH

4,6. Añadir a 10 ml de leche 5 ml de solución deAcido Acético glacial PA-ACS al 10% y 5 ml desolución de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE, mezclary comprobar con pHmetro que el pH de la mezclaes exactamente 4,6. Centrifugar a 3.000 r.p.m.durante diez minutos y filtrar el sobrenadante a tra-vés de un papel de filtro de velocidad media.

23(a).4.2. Preparación de la curva patrón.Dependiendo del tipo de muestra que desee ana-lizar, preparar patrones puros de leche de oveja ode leche de cabra y de leche de vaca y mezclasde leche de vaca en leche de oveja o de leche devaca en leche de cabra en concentraciones del5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la prepa-ración de estos patrones podrá ser cruda o pas-terizada, en este último caso la leche deberá serpasterizada a una temperatura máxima de 74ºCdurante un tiempo máximo de treinta segundos.La fracción soluble de los patrones se obtienesiguiendo el procedimiento descrito en 23(a).4.1.

23(a).4.3. Inmediatamente antes de su aplica-ción en el gel mezclar:

-1 volumen de la fracción soluble obtenidasegún 23(a).4.1.

-1 volumen de la solución de Glicerina (USP,BP, F, Eur.) PRS-CODEX al 40% (23(a).3.2.7.).

-1/2 volumen de la solución Azul de Bromofe-nol RE-ACS al 1/1000. (23(a).3.2.6.).

23(a).4.4. Preparación del Gel de Poliacrilami-da. Preparar el gel laminar de espesor comprendi-do entre 0,5 mm y 1 mm. Para 50 ml de la solu-ción de acrilamida-bisacrilamida, añadir 0,5 ml desolución de Amonio Peroxodisulfato PA al 10%(23(a).3.2.4.), desairear en un kitasato mediantevacío y añadir como agente polimerizante 50 mlde TEMED (23(a)., 3.2.5.).

23(a).4.5. Electroforesis. Colocar el gel en elaparato de electroforesis y llenar las cámaras delos electrodos con el tampón pH 8,3 (23(a).3.2.4.).Aplicar con microjeringa en cada uno de los poci-llos del gel un volumen comprendido entre 10 µI y20 µI de las soluciones obtenidas según23(a).4.3., tanto de la muestra como de los patro-nes.

La electroforesis se realiza a 60 mA (220 V)dejando correr el frente hasta que la línea del azulde bromofenol esté a 0,5 mm del extremo inferiordel gel. La duración es aproximadamente de treshoras.

23(a).4.6. Métodos de tinción.23(a).4.6.1. Tinción con Azul Coomassie R-

250. Una vez completada la electroforesis, intro-ducir el gel sucesivamente en:

1º La solución fijadora 23(a).3.3.1.1.: Una hora.2º La solución decolorante 23(a).3.3.1.2.: Diez

minutos.3º La solución de tinción 23(a).3.3.1.3.: Doce

horas.4º La solución decolorante 23(a).3.3.1.2., que

se renovará con frecuencia, hasta eliminar elfondo.

23(a).4.6.2. Tinción con Azul Coomassie G-250. Una vez completada la electroforesis, intro-ducir el gel sucesivamente en:

1º La solución de fijación/tinción 23(a).3.3.2.:Doce horas.

2º Agua PA-ACS, que se renovará con frecuen-cia: Una hora.

23(a).5. Interpretación de los resultados.23(a).5.1. Identificación de las bandas. En el

diagrama se observa el orden de las bandas delas proteínas de menor a mayor movilidad electro-forética en cada una de las especies.

44

Diagrama electroforético de las proteínas desuero de 1) Leche de vaca, 2) Leche de cabra, 3)Leche de oveja.

A) Seroalbúmina (BSA).B) b Lactoglobulina de cabra.C) a Lactoalbúmina (cabra y oveja).D) a Lactoalbúmina de vaca y b Lactoglobulina

de oveja.E) b Lactoglobulina B de vaca.F) b Lactoglobulina A de vaca.23(a).5.2. Densitometría. Medir la intensidad de

las bandas con densitómetro a una longitud deonda de 560 nm si se utiliza Coomassie R-250 enla tinción y de 600 nm si se utiliza el método delCoomassie G-250.

23(a).5.3. Cuantificación. Como se puedeobservar en el diagrama, las b lactoglobulinas A yB en leche de vaca presentan una mayor movili-dad electroforética que las de las otras dos espe-cies. Al aumentar el porcentaje de leche de vacapresente en la muestra, aumenta la intensidad delas bandas correspondientes a dichas b lactoglo-bulinas y por tanto aumenta la altura de los picosobtenidos en el densitograma.

Medir las alturas, de los picos de las b lacto-globulinas A y B de leche de vaca y del pico de laseroalbúmina (BSA).

A partir de los datos obtenidos para los patro-nes, resulta la recta de regresión y = ax + b,donde

altura b 1g A + altura b 1g By = –––––––––––––––––––––––––––––––

altura BSA

x = Porcentaje de leche de vaca

El porcentaje de leche de vaca en la muestra sedetermina sustituyendo en la recta de regresióncalculada con los patrones, el valor

altura b 1g A + altura b 1g B––––––––––––––––––––––––––––––

BSA

obtenido para la muestra.

23(a).6. Expresión de los resultados.

Expresar el contenido en leche de vaca segúnlos siguientes intervalos:

-Menor del 5 por 100.-Entre el 5 y el 10 por 100.-Entre el 10 y el 20 por 100.-Mayor del 20 por 100.Siendo el límite de detección práctico del 2 por

100 de leche de vaca, en leche de oveja o enleche de cabra.

23(a).7. Observaciones.Un resultado negativo debe obligatoriamente

ser confirmado por la técnica electroforética delas caseínas (21. Detección de leche de vaca enmezclas con leche de oveja y cabra).

23(a).8. Referencias.23(a).8.1. Ramos, M.; Juárez, M. (1986):

"Chromatographie, electrophoretic and immunolo-gical methods for detecting mixtures of milks fromdifferent species". Bulletin of International DairyFederation número 202, páginas 175-187.

23(a).8.2. Amigo, L.: Santamaría, G.; Gonzálezdel Llano, D.; Ramos, M. (1986): "Polyacrilamidegel electrophoresis of whey proteins in cheesesmade from milk of different species. Milk the vitalforce", XII Internat Dairy Congress, The Hague,152.

23(a).8.3. Amigo, L.; Calvo, M. (1987): "Quanti-tative determination cow's milk in goat's andewe's milk by PAGE using a internal standard". IICongreso Mundial de Tecnología de Alimentos,Barcelona, 151.

23(a).8.4. Calvo, M.; Amigo, L.; Olano Martín,P.J.: Ramos, M. (1989): "Effect of thermal treat-ments on the determination of bovine milk addedto ovine or caprine milk". Food Chemistry 32 (99-108).

23(b).DETERMINACION DE LECHE DEVACA EN LECHE DE OVEJA O DECABRA (Metodo inmunólogico)

23(b).1. Principio.El método está basado en la precipitación de

las inmunoglobulinas de la leche de vaca por laacción de un antisuero específico. La muestra esdepositada en los pocillos practicados en unacapa de agar que contiene el antisuero específicode la leche de vaca.

Cuando la muestra contiene leche de vaca seproduce una reacción que se observa en forma dehalo alrededor del pocillo donde se había deposi-tado dicha muestra. El diámetro de este halo esproporcional a la concentración.

El método es aplicable a la leche cruda o pas-terizada a una temperatura máxima de 74ºCdurante un tiempo máximo de treinta segundos,

45

M

+

1

FEDCB

A2 3

fresca o conservada mediante congelación o adi-ción de dicromato potásico.

23(b).2. Material y aparatos.23(b).2.1. Material de uso corriente en labora-

torio.23(b).2.2. Centrífuga.23(b).2.3. Microjeringa. 23(b).2.4. Placas Petri preparadas con agar

conteniendo el antisuero específico de leche devaca. En la capa de agar se han practicado 10pocillos cilíndricos.

23(b).2.5. Estufa regulada a 37ºC.23(b).2.6. Agitador magnético o equivalente.23(b).2.7. Dispositivo de lectura: Lupa equipa-

da con micrómetro o un retroproyector. En sudefecto se puede utilizar un doble decímetro gra-duado al medio milímetro.

23(b).3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS131074 Agua PA-ACSCuajo de titulo 1/10.000141339 Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-

CODEX252036 Negro Amido 10B DC131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO

23(b).3.1. Cuajo de título 1/10.000.23(b).3.2. Solución de Sodio Cloruro al

9/1.000: Disolver 9 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro.

23(b).3.3. Solución acuosa de Glicerina al 5%(v/v): Mezclar 50 ml de Glicerina (USP, BP, F, Eur.)PRS-CODEX con Agua PA-ACS y completar conAgua hasta 1 litro.

23(b).3.4. Solución acuosa de Acido Acéticoglacial PA-ACS al 2% (V/V): Mezclar 20 ml deAcido Acético glacial PA-ACS con la cantidadnecesaria de Agua PA-ACS hasta completar 1 litro.

23(b).3.5. Solución de tinción:-Negro Amido 10B DC: 1g.-Solución acuosa de Acido Acético glacial al

2% (V/V): 1.000 ml.23(b).3.6. Solución acética de Glicerina:-Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX 5 ml.-Acido Acético glacial PA-ACS: 2 ml.-Agua PA-ACS: Hasta completar 100 ml.

23(b).4. Procedimiento.23(b).4.1. Obtención de la fracción sérica. Aña-

dir a 10 ml de leche una gota de cuajo de título1/10.000 (23(b).3.1.), mezclar, incubar a 37ºCdurante cinco a diez minutos y centrifugar a 3.000r.p.m. durante diez minutos. Tomar con cuidado ellactosuero evitando arrastrar materia grasa.

23(b).4.2. Preparación de la curva patrón. Pre-parar mezclas de leche de vaca en leche de ovejao en leche de cabra a concentraciones del 2%,

5%, 10% y 20%. La fracción sérica de los patro-nes se obtiene siguiendo el procedimiento descri-to en 23(b).4.1.

23(b).4.3. Inmunodifusión. Depositar con laayuda de una microjeringa, 10 ml de la fracciónsérica preparada según 23(b).4.1. de cada uno delos patrones y de la muestra a analizar en los poci-llos de una misma placa. Dejar difundir de doce aveinticuatro horas a 37ºC en una cámara húmeda(estufa hermética regulada a 37ºC en cuyo fondose coloca un pliego de papel de filtro humedecidocon agua). Para una valoración rápida, transcurri-do este tiempo, se puede proceder a la lecturasegún 23(b).4.5.

23(b).4.4 Tratamiento de la placa. Lavar laplaca dentro de la solución de Sodio Cloruro al9/1000 (23(b).3.2.) bajo agitación durante ocho adoce horas.

Llenar la placa con la solución acuosa de Glice-rina al 5% (V/V) (23(b).3.3.) y mantenerla llena diezminutos. Depositar en la superficie de la soluciónun disco de papel de filtro del mismo diámetro queel de la placa, dejándolo deslizar hasta el fondo.Mantener el disco de papel de filtro contra el agarmientras se elimina la solución de Glicerina. Verifi-car que no haya presencia de burbujas de aire.

Dejar secar veinticuatro horas o acelerar el pro-ceso con la ayuda de un secador de aire, mante-niendo la distancia que permita no sobrepasar los45ºC a 50ºC al nivel de la placa.

Cuando la placa esté perfectamente seca,recubrirla con agua durante algunos minutos parapermitir que el papel de filtro se despegue progre-sivamente. Una vez despegado, retirarlo con unaspinzas. Teñir durante quince minutos, con la solu-ción de tinción 23(b).3.5. Lavar, durante unosminutos cada vez, tres o cuatro veces, con lasolución de Acido Acético glacial al 2%(23(b).3.4.) para eliminar el fondo. Enjuagar duran-te cinco minutos en la solución acética de Gliceri-na (23(b).3.6.). Vaciar y dejar secar.

23(b).4.5. Lectura de los resultados. Medir losdiámetros de los halos con la ayuda de un dobledecímetro graduado al medio milímetro o mejorcon una lupa equipada con micrómetro o con unretroproyector.

23(b).5. Interpretación de los resultados.23(b).5.1. Curva de calibrado. En un papel mili-

metrado trazar la curva, llevando en ordenadas losdiámetros de los halos obtenidos con las mezclaspreparadas para la curva patrón y en abcisas lasraíces cuadradas de las concentraciones en lechede vaca.

23(b).5.2. Determinación del porcentaje deleche de vaca en la muestra. Llevar sobre la curvade calibrado el diámetro medido para la muestra.Elevar al cuadrado el dato obtenido para expresarel resultado en porcentaje de leche de vaca.

46

23(b).5.3. Límite de detección. La técnica des-crita permite detectar un 1% de leche de vaca enleche de oveja o en leche de cabra.

23(b).6. Observaciones.23(b).6.1. Una reacción negativa debe obliga-

toriamente ser confirmada por la técnica electro-forética de las caseínas (21. Detección de lechede vaca en mezclas con leche de oveja y cabra).23(b).6.2. En el caso de una reacción positiva, setendrá en cuenta que el resultado obtenido puedeser inferior al valor real, dado el efecto de un tra-tamiento térmico efectuado en condiciones detemperatura y/o de tiempo superiores a los fijadosen 23(b).1.

23(b).7. Referencia.23(b).7.1. Journal Officiel de la Republique

Française (1 de junio de 1978).

24(a). DETERMINACION DE LECHE DECABRA EN LECHE DE OVEJA (Por electroforesis)

24(a).1. Principio.La fracción sérica de la muestra se extrae por

adición de solución tampón a pH 4,6 y posteriorcentrifugación.

Las proteínas de suero son separadas porelectroforesis en gel de poliacrilamina a pH 8,3. Lab lactoglobulina de leche de cabra presenta unamenor movilidad electroforética que la a lactoal-búmina y la b lactoglobulina de la leche de oveja.

24(a).2. Material y aparatos.24(a).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7, como 23(a).2.1., 2,

3, 4, 5, 6 y 7.

24(a).3. Reactivos.24(a).3.1., 2 y 3, como 23(a).3.1., 2 y 3.

24(a).4. Procedimiento24(a).4.1. como 23 (a).4.1.24(a).4.2. Preparación de la curva patrón. Pre-

parar patrones puros de leche de oveja y de lechede cabra y mezclas de leche de cabra en leche deoveja en concentraciones del 5%, 10% y 20%. Laleche utilizada para la preparación de estos patro-nes podrá ser cruda o pasterizada, en este últimocaso la leche deberá ser pasterizada a una tem-peratura máxima de 74ºC durante un tiempomáximo de 30 segundos. La fracción soluble delos patrones se obtiene siguiendo el procedimien-to descrito en 24(a).4.1.

24(a).4.3., 4, 5 y 6 como 23(a).4.3., 4, 5 y 6.

24(a).5. Interpretación de los resultados24(a).5.1. Identificación de las bandas. En el dia-

grama se observa el orden de las bandas de lasproteínas de menor a mayor movilidad electroforé-tica en la leche de cabra y en la leche de oveja.

Diagrama electroforético de las proteínas desuero. 1) Leche de cabra. 2) Leche de oveja.

A) Seroalbúmina (BSA).B) b Lactoglobulina de cabra.C) a Lactoalbúmina (cabra y oveja).D) b Lactoglobulina de oveja.24(a).5.2. Densitometría. Medir la intensidad de

las bandas con densitómetro a una longitud deonda de 560 nm si se utiliza Coomassie R-250 enla tinción y de 600 nm si se utiliza el método deCoomassie G-250.

24(a).5.3. Cuantificación. Como se puedeobservar en el diagrama, la b lactoglobulina deleche de cabra presenta una menor movilidadelectroforética que la a lactoalbúmina y la b lacto-globulina de oveja. Al aumentar el porcentaje deleche de cabra presente en la muestra, aumentala intensidad de la banda correspondiente a la blactoglobulina de la leche de cabra y, por tanto,aumenta la altura del pico obtenido en el densito-grama. Medir la altura del pico de la b lactoglobu-lina de leche de cabra y del pico de la seroalbú-mina (BSA). A partir de los datos obtenidos paralos patrones, resulta la recta de regresión y = ax +b, donde

altura b 1 g cabray = ––––––––––––––––––––––––––

altura BSA

x = Porcentaje de leche de cabra.

El porcentaje de leche de cabra en la muestrase determina sustituyendo en la recta de regresióncalculada con los patrones, el valor

altura b 1 g cabra–––––––––––––––––––

BSA

obtenido por la muestra.

24(a).6. Expresión de los resultados.Expresar el contenido en leche de cabra según

los siguientes intervalos:-Menor del 5 por 100.-Entre el 5 y el 10 por 100.

47

M

+

– 1

DCBA

2

-Entre el 10 y el 20 por 100.-Mayor del 20 por 100.Siendo el límite de detección práctico del 2 por

100 de leche de cabra en leche de oveja.

24(a).7. Referencias24(a).7.1., 2, 3 y 4, como 23(a).8.1., 2, 3 y 4.

24(b). DETERMINACION DE LECHE DECABRA EN LECHE DE OVEJA (Método inmunológico)

24(b).1. PrincipioEl método está basado en la precipitación de

las inmunoglobulinas de la leche de cabra poracción de un antisuero específico. La muestra esdepositada en los pocillos practicados en unacapa de agar que contiene el antisuero específicode la leche de cabra.

Cuando la muestra contiene leche de cabra seproduce una reacción que se observa en forma dehalo alrededor del pocillo donde se había deposita-do dicha muestra. El diámetro de este halo es pro-porcional a la concentración de leche de cabra.

El método es aplicable a la leche cruda o pas-terizada a una temperatura máxima de 74ºCdurante un tiempo máximo de treinta segundos,fresca o conservado mediante congelación o adi-ción de dicromato potásico.

24(b).2. Material y aparatos.24(b).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7, como 23(b).2.1., 2,

3, 4, 5, 6 y 7.

23(b).3. Reactivos.24(b).3.1., 2, 3, 4, 5 y 6, como 23(b).3.1., 2, 3,

4, 5 y 6.

24(b).4. Procedimiento.24(b).4.1. como 23(b).4.1.24(b).4.2. Preparación de la curva patrón. Pre-

parar mezclas de leche de cabra en leche deoveja en concentraciones de 2%, 5%, 10% y20%. La fracción sérica de los patrones se obtie-ne siguiendo el procedimiento descrito en24(b).4.1.

24(b).4.3., 4 y 5 como 23(b).4.3., 4 y 5.

24(b).5. Interpretación de los resultados.24(b).5.1. Curva de calibrado. En un papel mili-

metrado trazar la curva, llevando en ordenadas losdiámetros de los halos obtenidos con las mezclaspreparadas para la curva patrón y en abcisas lasraíces cuadradas de las concentraciones en lechede cabra.

24(b).5.2. Determinación del porcentaje deleche de cabra en la muestra. Llevar sobre lacurva de calibrado el diámetro medido para lamuestra. Elevar al cuadrado el dato obtenido para

expresar el resultado en porcentaje de leche decabra.

24(b).5.3. Límite de detección. La técnica des-crita permite detectar un 1% de leche de cabra enleche de oveja.

24(b).6. Observaciones.24(b).6.1. Una reacción negativa debe obliga-

toriamente ser confirmada por la técnica electro-forética de las proteínas del suero (24(a). Determi-nación de leche de cabra en leche de oveja(Método Electroforético)).

24(b).6.2. En el caso de una reacción positiva,se tendrá en cuenta que el resultado obtenidopuede ser inferior al valor real, dado el efecto deun tratamiento térmico efectuado en condicionesde temperatura y/o de tiempo superiores a los fija-dos en 24(b).1.

24(b).7. ReferenciaJournal Officiel de la Republique Française (1

de junio de 1978).

25. DETERMINACION DE SUERO DE QUE-SERIA EN LECHE MEDIANTE ANALISISDE LOS GLICOMACROPEPTIDOS PORCROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTAEFICACIA

25.1. Principio.El método permite poner de manifiesto la pre-

sencia de suero de quesería mediante la determi-nación de glicomacropéptidos por CLAE, previaeliminación de grasas y proteínas con ácido triclo-roacético.

El método es aplicable a leches líquidas UHT yesterilizadas en el plazo de siete días a partir de lafecha de envasado y a leches pasterizadas y enpolvo dentro del plazo de vida comercial del pro-ducto establecido de acuerdo con las disposicio-nes vigentes en la materia.

25.2. Material y aparatos25.2.1. Material de uso corriente en laboratorio.25.2.2. Equipo de cromatografía líquida de alta

eficacia, que comprende:25.2.2. a) Dos columnas en serie de permea-

ción de gel TSK 2000 SW (30 cm de longitud, diá-metro interior de 0,75 cm) o de eficacia equivalen-te. Alternativamente puede utilizarse una de estascolumnas con precolumna previa (3 cm x 0,3 cm)rellena de I 125 o material de eficacia equivalente.

25.2.2. b) Horno de columna con termostatoregulado a 35ºC ± 1ºC. Se puede trabajar concolumnas, mantenidas a temperatura ambiente,pero su poder de resolución es ligeramentemenor. En este caso, las variaciones de tempera-tura durante una misma serie de análisis deberánser inferiores a ± 5ºC.

48

25.2.2. c) Detector ultravioleta que permitaefectuar lecturas a 205 nm.

25.2.2. d) Integrador que pueda integrar devalle a valle.

25.3. Reactivos131881 Acetonitrilo PA131032 Acido orto-Fosfórico PA-ACS-ISO131067 Acido Tricloroacético PA-ACS131074 Agua PA-ACS131512 di-Potasio Hidrógeno Fosfato anhidro

PA131509 Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA131515 Potasio Hidróxido lentejas PA131716 Sodio Sulfato PA

25.3.1. Solución de Acido Tricloroacético.Disolver 240 g de Acido Tricloroacético PA-

ACS en agua PA-ACS hasta 1.000 ml.25.3.2. Solución eluyente pH 6,0.Disolver 1,74 g de di-Potasio Hidrógeno Fosfa-

to anhidro PA, 12,37 de Potasio di-HidrógenoFosfato PA y 21,41 g de Sodio Sulfato anhidro PAen 700 ml de agua aproximadamente.

Ajustar, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda deuna solución de ácido fosfórico o de hidróxidopotásico. Completar hasta 1.000 ml con agua yhomogeneizar.

En caso de utilizar una columna diferente a laTSK 2000 SW emplear una solución eluyente ade-cuada.

Esta solución se debe filtrar antes de su utiliza-ción a través de una membrana filtrante de0,45 mm de diámetro de poro.

25.3.3. Solución de lavado y de conservaciónde columnas.

Mezclar un volumen de acetonitrilo en nuevevolúmenes de agua.

Filtrar la mezcla, antes de su utilización, a tra-vés de una membrana filtrante de 0,45 mm de diá-metro de poro.

Puede utilizarse cualquier otra solución de lava-do que tenga efecto bactericida y que no altere laeficacia de resolución de las columnas.

25.3.4. Muestras patrón.25.3.4. a) Leche desnatada en polvo que res-

ponda a las exigencias del Reglamento CEEnúmero 625/78, exenta de suero de quesería.

25.3.4. b) La misma leche anterior adicionadacon un 5 por 100 m/m de suero de quesería decomposición media.

25.4. Procedimiento.25.4.1. Preparación de la muestra.25.4.1. a) Leche en polvo.Trasvasar la leche en polvo a un recipiente de

capacidad aproximadamente doble del volumende ésta, provisto de cierre hermético. Cerrar elrecipiente inmediatamente y mezclar bien.

Pesar 2.000 g ± 0,001 g y añadir 20,0 g deagua a 50ºC. Disolver agitando durante cincominutos con ayuda de un agitador. Llevar a tem-peratura de 25ºC. Añadir en dos minutos 10,0 mlde la solución de ácido tricloroacético (3.1) bajoagitación magnética.

Mantener a 25ºC durante sesenta minutos.Centrifugar a 2.200 ges durante diez minutos o fil-trar sobre papel desechando los cinco primerosml de filtrado.

25.4.1. b) Leche líquida.Tomar 20 ml de leche y continuar el proceso de

igual forma a la que figura a partir del segundopunto y seguido del párrafo segundo del aparta-do a).

25.4.1. c) Patrones.Aplicar exactamente a la leche en polvo (3.4.a)

y a la leche en polvo adicionada con el 5 por 100de suero de quesería (3.4.b) el procedimiento des-crito en el apartado 4.1.a.

25.4.2. Análisis cromatográfico.25.4.2. a) Inyectar de 15 a 30 ml medidos exac-

tamente de sobrenadante o de filtrado obtenidosegún el apartado 4.1. en el aparato de cromato-grafía líquida de alta eficacia con un flujo de 1,0ml/min de la solución eluyente (3.2.).

En cada interrupción lavar las columnas conagua y en toda interrupción superior a veinticuatrohoras, después del lavado con agua, se les debepasar solución de lavado (3.3.) por lo menos treshoras a un flujo de 0,2 ml por minuto o seguir lasinstrucciones del fabricante.

25.4.2. b) Antes de proceder al análisis croma-tográfico de las muestras, inyectar el patrón deleche en polvo adicionada con el 5 por 100 desuero de quesería (3.4.b) preparado según elapartado 4.1.c) las veces que sean necesariashasta que la superficie y el tiempo de retención delpico correspondiente a los GMP sea constante.

25.5. Cálculos25.5.1. En las figuras 1 y 2 (ver pág. 51) se

representan los cromatogramas de una leche enpolvo exenta de suero de quesería (3.4.a) y de lamisma leche en polvo adicionada con el 5 por 100(m/m) de suero de quesería (3.4.b), respectiva-mente. El pico III es el correspondiente a los GMP.

Con el fin de detectar cualquier anomalía, yasea debida al mal funcionamiento del cromatógra-fo o de las columnas, ya sea debido a la muestraa analizar, es necesario observar el aspecto decada cromatograma antes de efectuar cualquierinterpretación cuantitativa.

25.5.2. Cálculo del coeficiente de respuesta:

PR= –––––––––––––

A(5) - A(0)

49

M

donde:R: es el coeficiente de respuesta.A(5): es el área del pico III obtenido en el análi-

sis cromatográfico del patrón de leche en polvoadicionada con 5 por 100 (m/m) de suero de que-sería 25.3.4.b.

A(0): es el área del pico III, obtenido en el aná-lisis cromatográfico del patrón de leche en polvoexenta de suero de quesería 25.3.4.a.

P: es el porcentaje de suero de quesería pre-sente en el patrón 25.3.4.b, en este caso 5.

25.5.3. Cálculo del área relativa del pico III obte-nido en el análisis cromatográfico de la muestra (E).

S(E) = R x A(E)donde:

S(E): área relativa del pico III en la muestra (E).A(E): área correspondiente al pico III obtenida

en el análisis cromatográfico de la muestra.R: Coeficiente de respuesta calculado según

(25.5.2.).25.5.4. Cálculo del área relativa del pico III

obtenido en el análisis cromatográfico del patrónde leche en polvo exento de suero de quesería(25.3.4.a).

S(O) = R x A(O)donde:

S(O): área relativa del pico III en el patrón deleche en polvo exenta de suero de quesería(25.3.4.a).

A(O): área correspondiente al pico III obtenidoen el análisis cromatográfico del patrón de lecheen polvo exenta de suero de quesería (25.3.4.a).

R: coeficiente de respuesta calculado según(25.5.2.).

25.5.5. Cálculo del tiempo de retención relativodel pico III en la muestra (E).

TR(E)TRR(E) = ––––––––––

TR(5)donde:

TRR(E): tiempo de retención relativo del pico IIIde la muestra (E).

TR(E): tiempo de retención del pico III obtenidoen el análisis cromatográfico de la muestra (E).

TR(5): tiempo de retención del pico III obtenidoen el análisis cromatográfico del patrón de lecheen polvo adicionada con 5 por 100 (m/m) de suerode quesería (25.3.4.b).

25.5.6. Por la experimentación, está demostra-do que existe una relación lineal entre el tiemporelativo del pico III en la muestra y el porcentaje desuero de quesería en polvo añadido hasta el 10por 100:

-Con un contenido < 5 por 100, el TRR(E) es> 1,000.

-Con un contenido ³ 5 por 100, el TRR(E) es² 1,000.

-La incertidumbre admitida para los valores delTRR(E) es de ± 0,002.

25.5.7. Cálculo de porcentaje de suero de que-sería en polvo presente en la muestra.

W = S(E) - [1,3 + (S(O) - 0,9)]

donde:W: porcentaje m/m de suero de quesería pre-

sente en la muestra (E).S(E): área relativa del pico III para la muestra

obtenida según (25.5.3.).1,3 +: media experimental del área relativa del

pico III expresada en gramos de suero de quese-ría en 100 g de leche en polvo no adulterada.

S(O): área relativa del pico III para el patrón deleche en polvo exenta de suero de quesería(25.3.4.a) obtenida según (25.5.4.).

(S(O) - 0,9): corrección que hay que efectuar enel área relativa media 1,3 cuando el valor S(O) noes igual a 0,9.

25.5.8. Repetibilidad.La diferencia entre los resultados de dos deter-

minaciones efectuadas simultáneamente o en uncorto intervalo de tiempo por el mismo analistaque utilice los mismos aparatos, con la mismatoma de muestra, no debe sobrepasar el 0,2 por100 m/m.

25.5.9. Reproducibilidad.La diferencia entre dos resultados individuales

e independientes obtenidos en dos laboratoriosdiferentes, con la misma toma de muestras nodebe sobrepasar el 0,4 por 100 m/m.

25.5.10. Límite de detección.Se considerará que una muestra contiene

suero de quesería añadido cuando el porcentajecuantificado sea superior a cinco en el caso deleches UHT y superior a tres en leches pasteriza-das, esterilizadas y en polvo.

25.6. Referencias.25.6.1. “Olieman (et al) 1983. A sensitive HPLC

method of detecting and stimating rennet wheytotal soolids in skim milk powder; Neth Milk DairyJ. 37 27-36)”.

25.6.2. Reglamento CEE número 3711/1986,de la Comisión, de 4 de diciembre de 1986.

50

M

51FIGURA 1 FIGURA 2

INY

EC

CIO

N

INY

EC

CIO

N

II. Leches evaporadarica en grasa, enteracondensada, en polvorica en grasa o extra-grasa, concentrada.

METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 4-2-1989)

0. PREPARACION DE LA MUESTRAPARA EL ANALISIS QUIMICO YCONSIDERACIONES GENERALES

0.1. Preparación de la muestra:0.1.1. Leche evaporada rica en grasa.Leche evaporada entera o leche evaporada.Leche evaporada semidesnatada o parcial-

mente desnatada.Leche evaporada desnatada.Agitar el bote cerrado dándole la vuelta. Abrir el

bote y transvasar la leche lentamente a un segun-do recipiente que pueda cerrarse herméticamen-te, mezclándola mediante sucesivos transvases;asegúrese de que todos los restos de grasa y deleche adheridos al casco y al fondo del bote sehan mezclado con la muestra. Cierre el recipiente.Si el contenido no apareciera homogéneo, pónga-lo a calentar al baño María a 40ºC. Agitar vigoro-samente cada 15 minutos. Dos horas más tarde,saque el recipiente del baño María y deje que seenfríe a temperatura ambiente. Levante la tapa ymezcle cuidadosamente el contenido con laayuda de una cuchara o de una espátula (si lagrasa se ha desemulsionado no es convenienteproceder al análisis de la muestra). Consérvese enlugar fresco.

0.1.2. Leche condensada o leche entera con-densada.

Leche condensada semidesnatada.Leche condensada desnatada.Botes:Calentar el bote cerrado al baño María de 30 a

40ºC durante unos treinta minutos. Abrir el bote ymezclar cuidadosamente su contenido con unaespátula o con una cuchara, efectuando movi-mientos ascendentes, descendentes y circulares,con el fin de obtener una íntima mezcla de lascapas superiores e inferiores con el conjunto delcontenido. Asegurarse de que los restos de lecheadheridos al casco y al fondo del bote se hanmezclado con la muestra. Siempre que sea posi-ble, transvasar el contenido a un segundo reci-piente dotado de un sistema de cierre estanco.Cerrar el recipiente y conservar en lugar fresco.

Tubos:Cortar el fondo y transvasar el contenido a un

recipiente dotado de cierre estanco. Después cor-tar el tubo en el sentido de su longitud, despegartodas las materias adheridas al interior del tubo ymezclarlas cuidadosamente con el resto del con-tenido. Conservar el recipiente en lugar fresco.

0.1.3. Leche en polvo rica en grasa o extra-grasa.

Leche en polvo entera o leche entera en polvo.Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.

Leche en polvo desnatada o leche desnatadaen polvo.

Transvasar la leche en polvo a un recipientelimpio y seco (con cierre estanco) con una capaci-dad equivalente al doble del volumen del polvo.Cerrar inmediatamente el cierre y mezclar íntima-mente la leche en polvo agitándolo y dándolevueltas sucesivamente. Durante la preparación dela muestra se ha de evitar, siempre que sea posi-ble, exponer la leche en polvo al aire atmosféricopara reducir al mínimo la absorción de agua.

0.2. Reactivos:131074 Agua PA-ACS

Agua:Cuando se utilice el agua para soluciones,

disoluciones o lavados, se ha de utilizar AguaDestilada, Agua Desmineralizada o agua de unapureza al menos equivalente.

Cuando utilicemos el término "solución" o"disolución" sin otra indicación, nos referimos asolución en el agua o disolución en el agua.

Productos químicos:Todos los productos químicos utilizados han de

ser de calidad analítica reconocida, salvo especi-ficaciones especiales.

0.3. Equipo.Lista de aparatos:Las listas de aparatos sólo contienen los artí-

culos de uso especializado y los artículos deespecificación especial.

Balanza analítica:El término "balanza analítica" hace referencia a

una balanza capaz de pesar con precisión mínimade 0,1 mg.

0.4. Expresión de resultados.Cálculo del porcentaje:Salvo especificación en contra, el resultado se

calculará en porcentaje de la masa de la pruebaanalizada en el laboratorio.

Número de cifras significativas:Los resultados no contendrán un número de

cifras significativas superior al justificado por laprecisión del método de análisis utilizado.

0.5. Redacción del acta de la prueba.En el acta de la prueba se indicará el método de

análisis utilizado, así como los resultados. Ade-más, ha de mencionar todos los detalles del pro-cedimiento no especificados en el método de aná-lisis o facultativos, así como las condiciones sus-ceptibles de haber influido el resultado obtenido.

El acta de la prueba deberá suministrar todaslas informaciones necesarias para la identificacióncompleta de la muestra.

53

M

METODO 1: EXTRACTO SECO(Estufa)

1.1. Principio.Se entiende por extracto seco de la leche eva-

porada, de la leche concentrada, o de la lechecondensada, el extracto seco determinado por elmétodo descrito a continuación.

Una cantidad conocida de la muestra se diluyecon agua, luego se mezcla con arena y se desecaa una temperatura de 99 ± 1ºC. La masa obteni-da tras desecación constituye la masa de extrac-to seco. El extracto seco se expresa en porcenta-je de la masa de la muestra.

Este método permite determinar el contenidoen extracto seco de los siguientes tipos de leche:

Leche evaporada rica en grasa.Leche evaporada entera o leche evaporada.Leche evaporada semidesnatada o parcial-

mente desnatada.Leche evaporada desnatada.Leche concentrada rica en materia grasa (no existe).Leche concentrada entera o leche concentrada.Leche concentrada semidesnatada.Leche concentrada desnatada.Leche condensada.Leche condensada semidesnatada.Leche condensada desnatada.

1.2. Material y aparatos.1.2.1. Balanza analítica.1.2.2. Cápsulas metálicas preferentemente de

níquel, de aluminio o de acero inoxidable. Lascápsulas han de estar dotadas de tapas que seadapten perfectamente pero que puedan ser fácil-mente levantadas. Las dimensiones más idóneasson: Diámetro, de 60 a 80 mm; profundidad, deunos 25 mm.

1.2.3. Estufas de desecación a presión atmos-férica, bien ventiladas y controladas por termosta-to, con la temperatura regulada a 99 ± 1ºC, esmuy importante que la temperatura del conjuntode la estufa sea uniforme.

1.2.4. Desecador, lleno de gel de sílice activa-do recientemente o de un desecante equivalente.

1.2.5. Varillas de vidrio, una de cuyas extremi-dades será plana y de una longitud similar a lasdimensiones interiores de las cápsulas metálicas(1.2.2.).

1.2.6. Baño de agua hirviendo.

1.3. Reactivos.131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO131074 Agua PA-ACS211160 Arena de Mar lavada, grano fino QP

Arena de cuarzo o Arena de Mar lavada gr. finoQP (tamaño de los granos: 0,18-0,5 mm, tratadacon Acido Clorhídrico 35% PA-ISO, pasada a tra-

vés de un tamiz de 500 micras y retenida por untamiz de 180 micras). Ha de corresponder al testde control que se indica a continuación:

Calentar unos 25 g de arena durante dos horasen la estufa (punto 1.2.3.), tal como se indica enlos puntos 1.4.1. a 1.4.3. Añadir 5 ml de Agua PA-ACS, calentar de nuevo en la estufa durante doshoras, enfriar y volver a pesarlos. La diferenciaentre las dos pesadas consecutivas no ha de sersuperior a 0,5 mg.

Llegado el caso, tratar la arena durante tres díascon Acido Clorhídrico 35% PA-ISO; mezclar de vezen cuando. Lavarla con agua hasta que desapa-rezca la reacción ácida o hasta que el agua dellavado esté exenta del cloruro. Secarla a 160ºC yrepetir el test tal como se indica anteriormente.

1.4. Procedimiento.1.4.1. Colocar en la cápsula (punto 1.2.2.) unos

25 gramos de arena (punto 1.3.) y una varilla devidrio (punto 1.2.5.).

1.4.2. Calentar la cápsula, la tapa y el conteni-do –con la tapa levantada–, durante dos horas enla estufa (punto 1.2.3.).

1.4.3. Colocar de nuevo la tapa en la cápsula ypasar ésta al desecador (punto 1.2.4.). Dejarenfriar a temperatura ambiente y pesar con unaprecisión mínima de 0,1 mg (Mo).

1.4.4. Inclinar la tapa, amontonando la arenaen un lado de la cápsula. Introducir en el espaciolibre que queda, aproximadamente, 1,5 g de lamuestra si se trata de leche condensada y 3 g sise trata de leche evaporada y leche concentrada.Volver a colocar la tapa y pesar con una precisiónmínima de 0,1 mg (M1).

1.4.5. Retirar la tapa. Añadir 5 ml de agua ymezclar los líquidos con la varilla de vidrio (punto1.2.5.), luego la arena y la parte líquida. Dejar lavarilla en la mezcla.

1.4.6. Colocar la cápsula en el baño de agua(punto 1.2.6.) hasta que el agua se evapore (gene-ralmente unos veinte minutos). Remover la mezclade vez en cuando con la varilla para que la masase airee bien y no se aglutine tras la desecación.Colocar la varilla en el interior de la cápsula

1.4.7. Colocar la cápsula y la tapa durante unahora y treinta minutos en la estufa.

1.4.8. Volver a poner la tapa. Transferir la cáp-sula al desecador y dejarla enfriar hasta tempera-tura ambiente. Pesar con una precisión mínima de0,1 mg.

1.4.9. Destapar la cápsula y calentarla, juntocon su tapa, durante una hora en la estufa.

1.4.10. Repetir la operación del punto 1.4.8.1.4.11. Repetir las operaciones descritas en los

puntos 1.4.9. y 1.4.8., hasta que dos pesadassucesivas no difieran en más de 0,5 mg o queaumente la masa. En el punto 1.5. utilizar la pesa-da más baja (M2).

54

1.5. Cálculos.El contenido en extracto seco, expresado en

porcentaje de la masa de muestra, se indicasegún la fórmula:

M2 - M0––––––––––––– x 100

M1 - M0

en donde:M0 = masa, en gramos, de la cápsula, de su

tapa, de la arena y de la varilla tras la operacióndel punto 1.4.3.

M1 = masa, en gramos, de la tapa, de la cáp-sula, de la arena, de la varilla y de la muestra trasla operación del punto 1.4.4.

M2 = masa, en gramos, de la tapa, de la cáp-sula, de la arena, de la varilla y de la muestradesecada, tras la operación del punto 1.4.11.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones paralelas, efectuadas simultánea oinmediatamente una después de otra por elmismo analista de la misma muestra y en las mis-mas condiciones, no ha de exceder 0,2 gramosde extracto seco por 100 gramos de producto.

1.5.1. Cálculo del contenido en extracto secototal y del contenido en extracto seco no graso enla leche.

El contenido en extracto seco lácteo de los dis-tintos tipos de leche condensada viene dado pora - b, siendo:

a = el contenido en extracto seco total (obteni-do según el método 1).

b = el contenido en sacarosa (obtenido segúnel método 5).

El contenido en extracto seco lácteo no graso,de los distintos tipos de leche condensada vienedado por a-b-c, siendo:

a = el contenido en extracto seco total (obteni-do según el método 1).

b = el contenido en sacarosa (obtenido segúnel método 5).

c = el contenido en materia grasa (obtenidosegún el método 3).

El contenido en extracto seco no graso de losdistintos tipos de leche evaporada y concentradaviene dado por a - c, siendo:

a = el contenido en extracto seco total (obteni-do según el método 1).

c = el contenido en materia grasa (obtenidosegún el método 3).

1.6. Referencias.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficialde las Comunidades Europeas" número L 327/29,de 24 de Diciembre.

METODO 2: HUMEDAD(Estufa)

2.1. Principio.Se entiende por humedad la pérdida de masa

durante el proceso de desecación determinadopor el método descrito a continuación.

La masa residual de la muestra se determinatras desecación a presión atmosférica en unaestufa a 102 ± 1ºC hasta obtención de una masaconstante. La pérdida de masa se calcula en por-centaje de la masa de muestra.

Este método permite determinar la pérdida demasa durante el proceso de desecado de lostipos de leche citados a continuación:

Leche en polvo rica en grasas o extragrasa.Leche en polvo entera o leche entera en polvo.Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.Leche en polvo desnatada o leche desnatada

en polvo.

2.2. Material y aparatos.2.2.1. Balanza analítica.2.2.2. Cápsulas, preferentemente de vidrio, de

níquel, de aluminio o de acero inoxidable. Las cápsulas han de estar dotadas de tapas

que se adapten perfectamente pero que puedanser fácilmente levantadas.

Las dimensiones más idóneas son: Diámetro,de 60 a 80 ml; profundidad, de unos 25 cm.

2.2.3. Estufa a presión atmosférica, bien venti-lada y controlada por termostato, con la tempera-tura regulada a 102 ± 1ºC. Es muy importante quela temperatura del conjunto de la estufa sea uni-forme.

2.2.4. Desecador, lleno con gel de sílice activa-do recientemente o de un desecante equivalente.

2.2.5. Frascos provistos de tapones herméti-cos para el mezclado de la leche en polvo.

2.3. Procedimiento2.3.1. Quitar la tapa de la cápsula (punto

2.2.2.) y colocar tapa y cápsula en la estufa (punto2.2.3.) durante una hora.

2.3.2. Volver a poner la tapa, transferir la cáp-sula al desecador (punto 2.2.4.) y dejar enfriarhasta alcanzar la temperatura ambiente; pesarcon una precisión de 0,1 mg (M0).

2.3.3. Colocar en la cápsula unos dos gramosde muestra de leche en polvo, poner la tapa sobrela cápsula y proceder rápidamente a pesar la cáp-sula equipada de su tapa con una precisión de 0,1 mg (M1).

2.3.4. Retirar la tapa y colocar cápsula y tapadurante dos horas en la estufa.

2.3.5. Poner de nuevo la tapa, transferir la cáp-sula tapada al desecador y dejar enfriar hasta

55

M

alcanzar la temperatura ambiente; pesar rápida-mente con una precisión de 0,1 mg.

2.3.6. Destapar la cápsula y calentar, junto consu tapa, durante una hora en la estufa.

2.3.7. Repita la operación del punto 2.3.5.2.3.8. Repetir las operaciones de los puntos

2.3.6. y 2.3.5. hasta que dos pesadas no difieranen más de 0,5 mg o aumente la masa. En el punto2.4. utilizar la pesada más baja (M2).

2.4. CálculosCalcular la pérdida de masa de la muestra

durante el proceso de desecación, expresada enporcentaje de la masa, utilizando la fórmula:

M1 - M2––––––––––––– x 100

M1 - M0

en dondeM0 = masa, en gramos, de la cápsula y de su

tapa, tras la operación del punto 2.3.2.M1 = masa, en gramos, de la cápsula, de su

tapa y de la muestra, tras la operación del punto2.3.3.

M2 = masa, en gramos, de la cápsula, de latapa y de la muestra final, tras la operación delpunto 2.3.5.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones paralelas, efectuadas simultáneamen-te o inmediatamente una después de la otra por elmismo analista de la misma muestra y en las mis-mas condiciones, no ha de exceder 0,1 g de aguapor 100 g de producto.

2.5. Referencias.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficialde las Comunidades Europeas" número L 327/29,de 24 de Diciembre).

METODO 3: MATERIA GRASA(Método Rose-Gottlieb)

3.1. Principio.Se entiende por contenido en materia grasa de

los distintos tipos de leche evaporada, leche con-centrada o de leche condensada, al contenido enmateria grasa determinado por el método descri-to a continuación.

El contenido en materia grasa se determina porextracción de la materia grasa de una soluciónamoniacal-alcohólica de la muestra con ayuda deEter Etílico y de Eter de Petróleo, evaporación delos disolventes, pesada de los residuos y cálculoen porcentaje de la muestra, según el métodoRose-Gottlieb.

Este método permite determinar el contenidoen materia grasa de los siguientes tipos de leche:

Leche evaporada rica en grasa.Leche evaporada entera o leche evaporada.Leche evaporada semidesnatada o parcial-

mente desnatada.Leche evaporada desnatada.Leche concentrada rica en materia grasa (no

existe).Leche concentrada entera o leche concentrada.Leche concentrada semidesnatada.Leche concentrada desnatada.Leche condensada.Leche condensada semidesnatada.Leche condensada desnatada.

3.2. Material y aparatos3.2.1. Balanza analítica.3.2.2. Tubos de extracción apropiados, dota-

dos de tapones de vidrio esmerilado o de otro tipode cierre, insensible a la acción de los disolventesempleados.

3.2.3. Matraces de fondo plano y pared delga-da, de 150 a 250 mililitros de capacidad.

3.2.4. Estufa de desecación a presión atmosfé-rica, bien ventilada, controlada por termostato(temperatura a 102 ± 1ºC).

3.2.5. Gránulos destinados a facilitar la ebulli-ción, exentos de materia grasa, no porosos, nodesmenuzables, como por ejemplo perlas devidrio trocitos de carburo de silicio (el empleo deestos gránulos es facultativo; ver al respecto elpunto 3.4.2.1.).

3.2.6. Sifón correspondiente a los tubos deextracción.

3.2.7. Centrífuga.

3.3. ReactivosTodos los reactivos han de conformarse con las

condiciones requeridas en la prueba en blanco(punto 3.4.1.). Llegado el caso, podrán destilarsede nuevo los reactivos en presencia de 1 g degrasa de mantequilla por 100 ml de disolvente.

131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Diétílico estabilizado con 6 ppm

de BHT PA-ACS131315 Eter Petróleo 40-60ºC PA-ISO131542 Potasio Yoduro PA-ISO

3.3.1. Solución de Amoníaco 25% (en NH3) PA(densidad a 20ºC, unos 0,91 grs. por ml).

3.3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su ausencia,153973 Etanol 96º totalmente desnaturalizado PR.

3.3.3. Eter Diétílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS, exento de peróxidos.

Nota 1: Para asegurarse de que el Eter Dietílicoestá exento de peróxidos, añadir a 10 ml de Eter

56

Dietílico contenidos en una pequeña probeta contapón, de vidrio, enjuagada previamente con unpoco de Eter Dietílico, 1 ml de una solución conun 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recientemen-te preparada. Agitar y dejar reposar durante unminuto. No ha de aparecer coloración amarillaalguna en ninguna de las dos capas.

Nota 2: Eter Diétílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS puede ser mantenido exento deperóxidos adicionando una hoja de cinc húmedapreviamente sumergida durante un minuto en unasolución ácida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidra-to PA-ACS-ISO y posteriormente lavada con AguaPA-ACS. Para un litro de Eter Dietílico, utilizarunos 8.000 mm cuadrados de hoja de cinc, cor-tada en bandas suficientemente largas para llegara la mitad del recipiente, como mínimo.

3.3.4. Eter de Petróleo, de punto de ebulliciónentre 30 y 60ºC. En su defecto usar Eter Petróleo40-60ºC PA-ISO.

3.3.5. Mezcla de disolventes, preparada inme-diatamente antes de su empleo y mediante lamezcla de igual volumen de Eter Dietílico (punto3.3.3.) y de Eter de Petróleo (punto 3.3.4.). (Sepuede sustituir la mezcla de disolventes, siempreque sea indicado, por el Eter Dietílico o por el Eterde Petróleo).

3.4. Procedimiento.3.4.1. Prueba en blanco:Al tiempo que se efectúa la determinación de la

materia grasa de la muestra, efectuar una pruebaen blanco con 10 ml de Agua PA-ACS utilizandoel mismo tipo de aparato de extracción, los mis-mos reactivos en las mismas proporciones y elmismo procedimiento que el descrito a continua-ción, salvo el punto 3.4.2.2. Si el valor de la prue-ba en blanco es superior a 0,5 mg, habrá quecomprobar la pureza de los reactivos y en el casode que sean impuros habrán de ser purificados osustituidos.

3.4.2. Determinación:3.4.2.1. Secar el matraz (punto 3.2.3.) después

de haber depositado los gránulos (punto 3.2.5.),para facilitar una ebullición moderada durante laevaporación de los disolventes en la estufa (punto3.2.4.) durante una media hora a una hora. Dejarenfriar el matraz hasta que adquiera la temperatu-ra ambiente y pesar el matraz ya enfriado, con unaprecisión de 0,1 mg.

3.4.2.2. Agitar la muestra preparada de 5 grs.y pesar inmediatamente después con una preci-sión de 1 mg, directamente o por diferencia, 4 grs.de leche evaporada o de leche concentrada o 2 a2,5 g de leche condensada en el tubo de extrac-ción (punto 3.2.2.). Añadir agua hasta un volumende 10,5 ml y agitar suavemente calentando almismo tiempo ligeramente (40 a 50ºC), hasta latotal dispersión del producto. La muestra ha de

estar totalmente dispersa, ya que en caso contra-rio habrá de repetir la determinación.

3.4.2.3. Añadir 1,5 ml de la solución de Amo-níaco 25% (en NH3) PA (punto 3.3.1.) o un volu-men correspondiente de una solución más con-centrada y mezclar convenientemente.

3.4.2.4. Añadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA(punto 3.3.2.) y mezclar los líquidos, suave perototalmente, en el tubo de extracción. Enfriar con-venientemente, si es necesario, el tubo bajo elagua corriente.

3.4.2.5. Añadir 25 ml de Eter Dietílico (punto3.3.3.). Cerrar el tubo, agitar enérgicamente,moviendo varias veces, durante un minuto.

3.4.2.6. Retirar el tapón con precaución y aña-dir 25 ml de Eter de Petróleo (punto 3.3.4.) utili-zando los primeros mililitros para enjuagar eltapón y el interior del cuello del tubo y dejandoque se deslicen los líquidos de enjuague al interiordel aparato. Cerrar el tubo volviendo a colocar eltapón agitar e invertir varias veces durante treintasegundos. Si no se prevé centrifugado durante laoperación indicada en el punto 3.4.2.7., no agitardemasiado enérgicamente.

3.4.2.7. Dejar reposar el tubo hasta que la capalíquida superior quede transparente y se separenítidamente de la fase acuosa. Se puede realizartambién la separación con ayuda de una centrífu-ga adecuada (punto 3.2.7.).

Nota: Si se utiliza una centrífuga cuyo motor noes trifásico, pueden producirse chispas y por ellohabrá que estar atento para evitar una explosión oun incendio como consecuencia de la presenciade vapores de éter (en caso de ruptura de untubo, por ejemplo).

3.4.2.8. Retirar el tapón y enjuagarlo, así comoel interior del cuello del tubo, con unos ml de mez-cla de solventes (punto 3.3.5.) y dejar que loslíquidos del enjuague se deslicen al interior delaparato. Trasvasar con mucho cuidado, lo máscompletamente posible, la capa superior al matraz(punto 3.4.2.1.) mediante decantación o conayuda de un sifón (punto 3.2.6.).

Nota: Si el trasvase no se realiza con ayuda deun sifón, puede ser necesario añadir un poco deagua para elevar el nivel de separación de las doscapas con el fin de facilitar la decantación.

3.4.2.9. Enjuagar el interior y el exterior delcuello del tubo o la punta y la parte inferior delsifón con unos ml de la mezcla de disolventes.Dejar que los líquidos del enjuague del exterior deltubo se deslicen al interior del matraz y que los delinterior del cuello y del sifón se deslicen al interiordel tubo de extracción.

3.4.2.10. Proceder a una segunda extracciónrepitiendo las operaciones descritas en los puntos3.4.2.5. a 3.4.2.9., incluido, pero utilizando única-mente 15 ml de Eter Dietílico y 15 ml de Eter dePetróleo.

57

M

3.4.2.11. Efectuar una tercera extracción pro-cediendo tal como se indica en el punto 2.4.2.10,pero sin realizar el enjuague final (punto 3.4.2.9.).

Nota: En el caso de la leche desnatada evapo-rada, de la leche desnatada concentrada y de laleche desnatada condensada, no es necesarioefectuar esta tercera extracción.

3.4.2.12. Eliminar con cuidado por evaporacióno destilación el máximo de disolvente (incluido elEtanol). Si el matraz fuera de pequeña capacidad,habrá que eliminar un poco de disolvente de lamanera anteriormente indicada tras cada extrac-ción.

3.4.2.13. Cuando ya no exista olor alguno dedisolvente, calentar el matraz inclinado, duranteuna hora, en la estufa.

3.4.2.14. Retirar el matraz de la estufa, dejarenfriar hasta que adquiera la temperatura ambien-te y pesar con precisión de 0,1 mg.

3.4.2.15. Repetir las operaciones de los puntos3.4.2.13. y 3.4.2.14. calentando a intervalos detreinta a sesenta minutos hasta que dos pesadasconsecutivas no difieran en más de 0,5 mg o queaumente la masa. En el punto 3.5. utilizar la pesa-da tomando el valor más bajo (M1).

3.4.2.16. Añadir de 15 a 25 ml de Eter dePetróleo para verificar si la materia extraída estotalmente soluble. Calentar ligeramente y agitarel disolvente mediante un movimiento circularhasta que se disuelva toda la materia grasa.

3.4.2.16.1. Si la materia extraída es totalmentesoluble en Eter de Petróleo, la masa de materiagrasa es la diferencia entre la pesada del punto3.4.2.1. y la pesada del punto 3.4.2.15.

3.4.2.16.2. Si aparecieran materias insolubleso siempre en caso de duda, extraer completa-mente la materia grasa contenida en los matracesmediante repetidos lavados con Eter de Petróleocaliente, dejando que la materia no disuelta sedeposite antes de cada decantación. Enjuagartres veces el exterior del cuello del matraz. Calen-tar el matraz inclinado, durante una hora, en laestufa y dejar enfriar tal como se indicó anterior-mente (punto 3.4.2.1.) hasta que adquiera la tem-peratura ambiente; pesar con una precisión de0,1 mg. La masa de la materia grasa es la dife-rencia entre la pesada del punto 3.4.2.15. y estapesada final.

3.5. Cálculos.La masa expresada en gramos de la materia

grasa extraída viene dada por la siguiente fórmu-la:

(M1 - M2) - (B1 - B2)

y el contenido en materia grasa de la muestra,expresado en porcentaje, por la fórmula:

(M1 - M2) - (B1 - B2)––––––––––––––––––––––––– x 100

S

en donde:M1 = masa, en gramos, del matraz M conte-

niendo la materia grasa tras la operación delpunto 3.4.2.15.

M2 = masa, en gramos, del matraz M tras laoperación del punto 3.4.2.1. o, en caso de queaparezcan materias insolubles o en caso de duda,tras la operación del punto 3.4.2.16.2.

B1 = masa, en gramos, del matraz B de laprueba en blanco tras la operación del punto3.4.2.15.

B2 = masa, en gramos, del matraz B, tras laoperación del punto 3.4.2.1. o, en el caso de queaparezcan materias insolubles o en caso de duda,tras la operación del punto 3.4.2.16.2.

S = masa, en gramos, de la muestra utilizada.La diferencia entre los resultados de dos deter-

minaciones efectuadas simultáneamente o inme-diatamente una después de la otra por el mismoanalista sobre la misma muestra y en las mismascondiciones, no ha de exceder 0,05 grs. de mate-ria grasa por 100 g de producto.

3.6. ReferenciasPrimera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficialde las Comunidades Europeas" número L 327/29,de 24 de Diciembre de 1979.

METODO 4: MATERIA GRASA(Método Rose-Gottlieb)

4.1. Principio.Se entiende por contenido en materia grasa de

los distintos tipos de leche en polvo al contenidoen materia grasa determinado por el método des-crito a continuación.

El contenido en materia grasa se determina porextracción de la materia grasa de una soluciónamoniacal-alcohólica de la muestra con ayuda deEter Etílico y de Eter de Petróleo, evaporación delos disolventes, pesada de los residuos y cálculoen porcentaje de la muestra, según el métodoRose-Gottlieb.

Este método permite determinar el contenidoen materia grasa de las siguientes leches:

Leche en polvo rica en grasa o extragrasa.Leche en polvo entera o leche entera en polvo.Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.Leche en polvo desnatada o leche desnatada

en polvo.

4.2. Material y aparatos.4.2.1. Balanza analítica.

58

4.2.2. Tubos de extracción apropiados, dota-dos de tapones de vidrio esmerilado o de otro tipode cierre insensible a la acción de los disolventesempleados.

4.2.3. Matraces de fondo plano y pared delga-da, de 150 a 250 ml de capacidad.

4.2.4. Estufa de desecación a presión atmosfé-rica, bien ventilada, controlada por termostato(temperatura a 102 ± 1ºC).

4.2.5. Gránulos destinados a facilitar la ebulli-ción, exentos de materia grasa, no porosos, nodesmenuzables, como por ejemplo perlas devidrio trocitos de carburo de silicio (el empleo deestos gránulos es facultativo; ver al respecto elpunto 4.4.2.1.).

4.2.6. Baño de agua a 60-70ºC.4.2.7. Sifón correspondiente a los tubos de

extracción.4.2.8. Centrífuga.

4.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Diétílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACS131315 Eter Petróleo 40-60ºC PA-ISO131542 Potasio Yoduro PA-ISO

Todos los reactivos han de conformarse con lascondiciones requeridas en la prueba en blanco(punto 4.4.1.). Llegado el caso, podrán destilarsede nuevo los reactivos en presencia de 1 g degrasa de mantequilla por 100 ml de disolvente.

4.3.1. Solución de Amoníaco 25% (en NH3) PA(densidad a 20ºC, unos 0,91 g/ml) una soluciónmás concentrada de una concentración conocida.

4.3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su ausencia,153973 Etanol 96º totalmente desnaturalizadoPR.

4.3.3. Eter Diétílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS, exento de peróxidos.

Nota 1: Para asegurarse de que el Eter Dietílicoestá exento de peróxidos, añadir a 10 ml de EterDietílico contenidos en una pequeña probeta contapón de vidrio, enjuagada previamente con unpoco de Eter Dietílico, 1 ml de una solución conun 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recientemen-te preparada. Agitar y dejar reposar durante unminuto. No ha de aparecer coloración amarillaalguna en ninguna de las dos capas.

Nota 2: El Eter Diétílico estabilizado con ~ 6ppm de BHT PA-ACS puede ser mantenido exen-to de peróxidos adicionando una hoja de cinchúmeda previamente sumergida durante un minu-to en una solución ácida diluida de Cobre II Sulfa-to 5-hidrato PA-ACS-ISO y posteriormente lavadacon Agua PA-ACS. Para 1 litro de Eter Dietílico,utilizar unos 8.000 mm2 de hoja de cinc, cortada

en bandas suficientemente largas para llegar a lamitad del recipiente, como mínimo.

4.3.4. Eter de Petróleo, de punto de ebulliciónentre 30 y 60ºC. En su defecto usar Eter Petróleo40-60ºC PA-ISO.

4.3.5. Mezcla de disolventes, preparada inme-diatamente antes de su empleo, mediante la mez-cla de igual volumen de Eter Dietílico (punto4.3.3.) y de Eter de Petróleo (punto 4.3.4.), (sepuede sustituir la mezcla de disolventes, siempreque sea indicado, por el Eter Dietílico o por el Eterde Petróleo).

4.4. Procedimiento.4.4.1. Prueba en blanco.Al tiempo que se efectúa la determinación de la

materia grasa de la muestra, efectuar una pruebaen blanco con 10 ml de agua utilizando el mismotipo de tubo de extracción, los mismos reactivosen las mismas proporciones y el mismo procedi-miento que el descrito a continuación, salvo elpunto 4.4.2.2. Si el valor de la prueba en blancoes superior a 0,5 mg, habrá que comprobar lapureza de los reactivos, en caso de que seanimpuros habrán de ser purificados o sustituidos.

4.4.2. Determinación.4.4.2.1. Secar el tubo (punto 4.2.3.) después

de haber depositado los gránulos (punto 4.2.5.)para facilitar una ebullición moderada durante laevaporación de los disolventes en la estufa (punto4.2.4.) durante una media hora a una hora. Dejarenfriar el matraz hasta que adquiera la temperatu-ra ambiente y pesar el matraz ya enfriado, con unaprecisión de 0,1 mg.

4.4.2.2. En el tubo de extracción (punto 4.2.2.)pesar con una precisión de 1 mg, bien directa-mente bien por diferencia, aproximadamente 1 gde leche en polvo o 1,5 g de leche semidesnata-da en polvo o de leche desnatada en polvo. Aña-dir 10 ml de agua y agitar hasta la total dispersiónde la leche (en algunas muestras habrá que pro-ceder a calentarlas).

4.4.2.3. Añadir 1,5 ml de la solución de Amo-níaco 25% (en NH3) PA (punto 4.3.1.) o un volu-men correspondiente de una solución más con-centrada y calentar al baño de agua (4.2.6.)durante quince minutos, de 60 a 70ºC, agitandode vez en cuando. Posteriormente enfriarlo, porejemplo mediante agua corriente.

4.4.2.4. Añadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA(punto 4.3.2.) y mezclar los líquidos suave, perototalmente, en el tubo de extracción. Enfriar, con-venientemente, si es necesario, el tubo bajo elagua corriente.

4.4.2.5. Añadir 25 ml de Eter Dietílico (punto4.3.3.). Cerrar el tubo, agitar enérgicamente invir-tiendo varias veces durante un minuto.

4.4.2.6. Retirar el tapón con precaución y aña-dir 25 ml de Eter de Petróleo (punto 4.3.4.) utili-

59

M

zando los primeros ml para enjuagar el tapón y elinterior del cuello del tubo y dejando que se desli-cen los líquidos de enjuague al interior del apara-to. Cerrar el tubo volviendo a colocar el tapón,agitar e invertir varias veces durante treintasegundos. Si no se prevé centrifugado durante laoperación indicada en el punto 4.4.2.7., no agitardemasiado enérgicamente.

4.4.2.7. Dejar reposar el tubo hasta que la capalíquida superior quede transparente y se separenítidamente de la fase acuosa. Se puede realizartambién la separación con ayuda de una centrífu-ga adecuada (punto 4.2.7.).

Nota.- Si se utiliza una centrífuga cuyo motorno es trifásico pueden producirse chispas y porello habrá que estar atento para evitar una explo-sión o un incendio como consecuencia de la pre-sencia de vapores de éter (en caso de ruptura deun tubo, por ejemplo).

4.4.2.8. Retirar el tapón y enjuagarlo, así comoel interior del cuello del tubo con unos ml de mez-cla de solventes (punto 4.3.5.) y dejar que loslíquidos del enjuague se deslicen al interior deltubo. Trasvasar con mucho cuidado, lo más com-pletamente posible, la capa superior al matraz(punto 4.4.2.1.) mediante decantación o conayuda de un sifón (punto 4.2.6.).

Nota.- Si el trasvase no se realiza con ayuda deun sifón, puede ser que necesitemos añadir unpoco de agua para elevar el nivel de separaciónde las dos capas con el fin de facilitar la decanta-ción.

4.4.2.9. Enjuagar el interior y el exterior delcuello del tubo o la punta y la parte inferior delsifón con unos ml de la mezcla de disolventes.Dejar que los líquidos del enjuague del exterior deltubo se deslicen al interior del matraz y que los delinterior del cuello y del sifón se deslicen al interiordel tubo de extracción.

4.4.2.10. Proceder a una segunda extracciónrepitiendo las operaciones descritas en los puntos4.4.2.5. a 4.4.2.9. incluido, pero utilizando única-mente 15 ml de Eter Dietílico y 15 ml de Eter dePetróleo.

4.4.2.11. Efectuar una tercera extracción pro-cediendo tal como se indica en el punto 4.4.2.10,pero sin realizar el enjuague final (punto 4.4.2.9.).

Nota.- En el caso de la leche desnatada enpolvo no es necesario realizar la tercera extracción.

4.4.2.12. Eliminar con cuidado por evaporacióno destilación el máximo de disolvente (incluido elEtanol). Si el frasco fuera de pequeña capacidadhabrá que eliminar un poco de disolvente de lamanera anteriormente indicada tras cada extrac-ción.

4.4.2.13. Cuando ya no exista olor alguno dedisolvente, calentar el matraz, inclinado, duranteuna hora, en la estufa.

4.4.2.14. Retirar el matraz de la estufa, dejar

enfriar hasta que adquiera la temperatura ambien-te y pesar con precisión de 0,1 mg.

4.4.2.15. Repetir las operaciones de los puntos4.4.2.13. y 4.4.2.14. calentando a intervalos detreinta a sesenta minutos hasta que dos pesadasno difieran en más de 0,5 mg o que aumente lamasa. En el punto 4.5. utilizar la pesada tomandoel valor más bajo (M1).

4.4.2.16. Añadir de 15 a 25 ml de Eter dePetróleo para verificar si la materia extraída estotalmente soluble. Calentar ligeramente y agitarel disolvente mediante un movimiento circularhasta que se disuelva toda la materia grasa.

4.4.2.16.1. Si la materia extraída es totalmentesoluble en Eter de Petróleo, la masa de materiagrasa es la diferencia entre la pesada del punto4.4.2.1. y la pesada del punto 4.4.2.15.

4.4.2.16.2. Si aparecieran materias insolubles osiempre en caso de duda, extraer completamentela materia grasa contenida en los matracesmediante repetidos lavados con Eter de Petróleocaliente, dejando que la materia no disuelta sedeposite antes de cada decantación. Enjuagar tresveces el exterior del cuello del matraz. Calentar elmatraz, inclinado, durante una hora en la estufa ydejar enfriar tal como se indicó anteriormente(punto 4.4.2.1.) hasta que adquiera la temperaturaambiente; pesar con una precisión de 0,1 mg. Lamasa de la materia grasa es la diferencia entre lapesada del punto 4.4.2.15. y esta pesada final.

4.5. CálculosLa masa expresada en gramos de la materia

grasa extraída viene dada por la siguiente fórmu-la:

(M1-M2) - (B1 - B2)

y el contenido en materia grasa de la muestra,expresado en porcentaje, por la fórmula:

(M1 - M2) - (B1 - B2)––––––––––––––––––––– x 100

Sen donde:

M1 = masa, en gramos, del matraz M conteniendola materia grasa tras la operación del punto 4.4.2.15.

M2 = masa, en gramos, del matraz M tras laoperación del punto 4.4.2.1. o, en caso de queaparezcan materias insolubles o en caso de duda,tras la operación del punto 4.4.2.16.2.

B1 = masa, en gramos, del matraz B de laprueba en blanco tras la operación del punto4.4.2.15.

B2 = masa, en gramos, del matraz B, tras laoperación del punto 4.4.2.1. o, en el caso de queaparezcan materias insolubles o en caso de duda,tras la operación del punto 4.4.2.16.2.

S = masa, en gramos, de la muestra utilizada.

60

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o inme-diatamente una después de la otra por el mismoanalista sobre la misma muestra y en las mismascondiciones, no ha de exceder 0,2 g de materiagrasa por 100 g de producto, salvo en el caso dela leche desnatada en polvo, en donde la diferen-cia no ha de exceder 0,1 g de materia grasa por100 g de producto.

3.6. ReferenciasPrimera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficialde las Comunidades Europeas" número L 327/29,de 24 de Diciembre de 1979.

METODO 5: SACAROSA(Método polarimétrico)

5.1. Principio.El contenido en sacarosa de los distintos tipos

de leche condensada es el determinado por elmétodo que se describe a continuación.

El método se basa en el principio de inversiónde Clerget: un tratamiento suave con un ácidohidroliza completamente la sacarosa. La lactosa ylos restantes azúcares no son prácticamentehidrolizados. El contenido en sacarosa se deducedel cambio de poder rotatorio de la solución.

Para ellos se prepara un filtrado límpido desolución de muestra, sin mutarrotación debida a lalactosa, por tratamiento con amoníaco seguido deneutralización y posterior clarificación medianteadiciones consecutivas de soluciones de acetatode cinc y Potasio Hexacianoferrato II.

En una parte del líquido filtrado la sacarosa sehidroliza en condiciones determinadas.

Partiendo de los poderes rotatorios del líquidofiltrado antes y después de la inversión, se calcu-la el contenido en sacarosa aplicando las fórmulasque se indican.

Este método permite determinar el contenidoen sacarosa de los siguientes tipos de leche:

-Leche condensada o leche entera conden-sada.

-Leche condensada semidesnatada.-Leche condensada desnatada.Las muestras no han de contener azúcar invertido.

5.2. Material y aparatos.5.2.1. Balanza analítica, sensibilidad 10 mg.5.2.2. Tubo de polarímetro de 2 dm de longi-

tud, calibrado exactamente.5.2.3. Polarímetro o sacarímetro.5.2.3.1. Polarímetro con luz de sodio o luz

verde mercurio (lámpara de vapor de mercuriocon prisma o pantalla Wraten especial, número 77A), que permita lecturas con una precisión, comomínimo, igual a 0,05 grados de ángulo.

5.2.3.2. Sacarímetro con escala internacional,que utilice luz blanca que pase a través de un fil-tro de 15 mm de solución al 6% de Potasio Dicro-mato o bien luz de sodio, y que permita la lecturade una precisión, como mínimo, igual a 0,1 gra-dos de la escala sacarimétrica internacional.

5.2.4. Baño de agua a una temperatura de 60± 1ºC.

5.3. Reactivos.131008 Acido Acético glacial PA-ACS182119 Acido Acético 2 mol/l (2N) SV131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131120 Amoníaco 25% (en NH3) PA171167 Azul de Bromotimol RE131085 Etanol 96% v/v PA131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131775 Zinc Acetato 2-hidrato PA

5.3.1. Solución de Zinc Acetato 1M:Disolver 21,9 g de Zinc Acetato 2-hidrato PA,

[Zn(C2H3O2)2·2H2O] y 3 ml de Acido Acético gla-cial PA-ACS en Agua PA-ACS y completar hasta100 ml.

5.3.2. Solución de Potasio Hexacianoferrato II3-hidrato 0,25M: Disolver 10,6 g de Potasio Hexa-cianoferrato II 3-hidrato PA-ACS

[K4(Fe(CN)6)·3H2O] en Agua PA-ACS y comple-tar hasta 100 ml.

5.3.3. Solución de Acido Clorhídrico 6,35± 0,20M (20 a 22%) o 5,0 ± 0,2M (16 a 18%).Usese Acido Clorhídrico 35% PA-ISO y diluir con-venientemente.

5.3.4. Solución diluida de Amonio Hidróxido2,0 ± 0,2M (3,5%). Usese Amoníaco 25% (enNH3) PA y diluir convenientemente.

5.3.5. Solución de Acido Acético 2 mol/l (2N)SV 2,0 ± 0,2M (12%).

5.3.6. Indicador Azul de Bromotimol RE, solu-ción al 1% (m/v) en 131085 Etanol 96% v/v PA.

5.4. Procedimiento.5.4.1. Comprobación del método:Para comprobar el método, los reactivos y los

aparatos, realizar dos determinaciones aplicandoel método descrito en 5.4.2. a mezclas de 100 gde leche y 18 g de sacarosa pura, o bien de 110 gde leche descremada y 18 g de sacarosa pura,equivalentes a 40 g de leche condensada conte-niendo 45% de sacarosa. Calcular el contenido desacarosa como se indica en el apartado 5.5. utili-zando, en la fórmula 1, para M, F y P la cantidadde leche pesada y los porcentajes respectivos demateria grasa y proteínas de esta leche, y, en lafórmula 2, para M, la cifra de 40 g. La media delos dos resultados obtenidos no debe diferir delvalor citado (45%) en más de 0,2%.

61

M

5.4.2. Determinación.En un vaso de vidrio, pesar exactamente, con

aproximación de 10 mg, unos 40 g de la muestraconvenientemente mezclada.

Añadir 50 ml de agua caliente (80 a 90°C) ymezclar cuidadosamente.

Trasvasar cuantitativamente la mezcla a unmatraz aforado de 200 ml, enjuagar el vaso consucesivas cantidades de agua a 60ºC hasta que elvolumen total sea de 120 a 150 ml. Mezclar ydejar enfriar a temperatura ambiente.

Añadir 5 ml de la solución de Amoníaco diluida(5.3.4.). Mezclar de nuevo y dejar reposar durantequince minutos.

Neutralizar el amoníaco añadiendo una canti-dad equivalente de la solución diluida de AcidoAcético (5.3.5.). Determinar previamente el volu-men exacto necesario mediante valoración desolución de Amoníaco diluida utilizando Azul deBromotimol como indicador (5.3.6.). Mezclar acontinuación.

Añadir, mezclando suavemente por rotación delmatraz inclinado, 12,5 ml de solución de ZincAcetato (5.3.1.).

De la misma manera que para la solución deAcetato, añadir 12,5 ml de solución de PotasioHexacianoferrato II (5.3.2.).

Llevar el contenido del matraz a 20ºC y añadiragua (a 20ºC) hasta el enrase.

Hasta este momento, todas las adiciones deagua o de reactivos deberán haberse realizadoevitando que se formen burbujas y, por estarazón, todas las mezclas se habrán efectuadomediante rotación del matraz en vez de por agita-ción violenta. Si se observa la presencia de bur-bujas antes de enrasar a 200 ml, pueden ser eli-minadas conectando el matraz con una bomba devacío e imprimiéndole un movimiento de rotación.

Tapar el matraz con un tapón seco y mezclaríntimamente por agitación intensa.

Dejar reposar durante unos minutos, y a conti-nuación filtrar a través del papel de filtro seco.Desechar los 25 primeros mililitros del líquido fil-trado.

5.4.2.1. Polarización directa: Determinar larotación óptica del líquido filtrado a 20 ± 1ºC.

5.4.2.2. Inversión: Pipetear en un matraz afora-do de 50 ml, 40 ml del líquido filtrado obtenido dela manera indicada anteriormente. Añadir 6,0 mlde Acido Clorhídrico 6,35 M o 7,6 ml de AcidoClorhídrico 5,00M. Colocar el matraz en un bañode agua a 60ºC durante quince minutos, estandosumergido el matraz hasta el nacimiento del cue-llo. Mezclar por rotación durante los cinco prime-ros minutos, durante los cuales el contenidodeberá haber alcanzado la temperatura del baño.Enfriar hasta 20ºC y enrasar con agua a 20ºC;mezclar y dejar reposar durante una hora a estatemperatura.

5.4.2.3. Polarización tras la inversión.Determinar el poder rotatorio de la solución

invertida a 20 ± 0,2ºC (cuando la temperatura Tdel líquido contenido en el tubo de polarizacióndifiera de 20ºC en más de 0,2ºC durante la medi-ción, se ha de aplicar la corrección de temperatu-ra indicada en los puntos 5.5.1. y 5.5.2.

5.5. Cálculos.5.5.1. Contenido en sacarosa:Calcular el contenido en sacarosa con ayuda

de las siguientes fórmulas:

MI-V= ––––––––– (1,08 F+1,55 P)

100

D-1, 25 I V-v V2-S= ––––––––– X ––––––– X –––––– por 100

Q V LxM

Siendo:S = Contenido en sacarosa.M = Masa de la muestra expresada en gramos.F = Porcentaje de materia grasa de la muestra. P = Porcentaje de proteínas (Nx6,38) de la

muestra.V = Volumen en mililitros de la solución de la

muestra antes de la filtración.v = Corrección expresada en ml para el volu-

men del precipitado formado durante el procesode clasificación.

D = Lectura polarimétrica directa (polarizaciónantes de inversión).

I = Lectura polarimétrica tras la inversión.L = Longitud en decímetros del tubo del polarí-

metro.Q = Factor de inversión cuyos valores se indi-

can a continuación.

Si se pesan exactamente 40 grs. de leche con-densada y se utiliza un polarímetro de luz desodio, con escala en grados de ángulo y un tubode polarímetro de 2 dm de longitud a 20,0 ± 0,1ºC, se puede calcular el contenido en saca-rosa de las leches condensadas normales (C=9)mediante la siguiente fórmula:

S = (D-1,25 I) (2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P)

Si se efectúa la medición de la polarización trasinversión a temperatura diferente de 20ºC, losvalores que se obtengan habrán de multiplicarsepor:

[1+0,0037 (T - 20)]

5.5.2. Valores del factor de inversión Q:Las fórmulas siguientes dan valores precisos

62

de Q para diversas fuentes de luz con correccio-nes, dado el caso, para la concentración y la tem-peratura:

Luz de sodio y polarímetro con escala en gra-dos de ángulo:

Q = 0,8825 + 0,0006 (C-9)-0,0033(T-20)Luz verde de mercurio y polarímetro con esca-

la en grados de ángulo:Q = 1,0392 + 0,0007 (C-9)-0,0039 (T-20)Luz blanca con filtro de dicromato y sacaríme-

tro con escala sacarimétrica internacional:Q = 2,549 + 0,0017 (C-9)-0,0095 (T-20)En las fórmulas anteriores:C = Porcentaje de azúcares totales en la solu-

ción invertida según la lectura polarimétrica.T = Temperatura de la solución invertida duran-

te la lectura en el polarímetro.El porcentaje de azúcares totales C en la solu-

ción invertida puede calcularse a partir de la lec-tura directa y de la variación posterior a la inver-sión según el método habitual, utilizando los valo-res usuales de rotación específica de la sacarosa,de la lactosa y del azúcar invertido.

La corrección 0,006 (C-9) etc., sólo es exacta siC es aproximadamente igual a 9; dado que el casode la leche condensada normal C es aproximada-mente 9, se puede despreciar esta corrección.

Variaciones de temperatura de 1ºC respecto a20ºC influencian sólo ligeramente la lectura direc-ta. En cambio, en caso de existir variaciones demás de 0,2ºC durante la lectura tras inversión,será necesario proceder a una corrección, Lacorrección -0,0033 (T-20), etc., sólo es exactapara temperaturas comprendidas entre 18 y 22ºC.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultánea o inmediata-mente una después de la otra por el mismo ana-lista, sobre la misma muestra y en las mismascondiciones, no debe ser superior a 0,3 grs. desacarosa por 100 grs. de leche condensada.

5.6. Referencia.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1067/CEE), "Diario Oficialde las Comunidades Europeas" número 327/29,de 24 de Diciembre de 1979.

METODO 6: ACIDO LACTICO YLACTATOS

6.1. Principio.Se define como contenido en ácido láctico y

lactatos de los distintos tipos de leche en polvo, elcontenido en ácido láctico y lactatos determinadopor el método especificado.

El método se basa en que previa eliminación dela materia grasa, las proteínas y la lactosa, elácido láctico y los lactatos se transforman en ace-

taldehído que se determina colorimétricamente a570 nm por reacción con p-hidroxidifenilo.

Aplicable a la determinación de ácido láctico ylactatos en los siguientes tipos de leche:

-Leche en polvo rica en grasa o extragrasa.-Leche en polvo entera o leche entera en polvo.-Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.-Leche en polvo desnatada o leche desnatada

en polvo.

6.2. Material y aparatos.6.2.1. Espectrofotómetro que permita la lectu-

ra a 570 nm.6.2.2. Material de uso normal en laboratorios.

6.3. Reactivos131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS142400 Calcio Hidróxido, polvo (USP) PRS-

CODEX131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO

p-HidroxidifeniloLitio LactatoSodio Hidróxido sol. 5%

6.3.1. Solución de Cobre Sulfato.Disolver 250 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-

ACS-ISO (CuSO4.5H2O) en Agua PA-ACS y diluira 1.000 ml.

6.3.2. Suspensión de Calcio Hidróxido.Triturar 300 g de Calcio Hidróxido, polvo (USP)

PRS-CODEX en un mortero con Agua PA-ACS uti-lizando un total de 900 ml. La suspensión se debepreparar poco antes de su utilización.

6.3.3. Solución de Acido Sulfúrico-Cobre Sulfato.Añadir 0,5 ml de solución (6.3.1.) a 300 ml de

Acido Sulfúrico de concentración 95,5-97%.En su defecto usar Acido Sulfúrico 96% PA-ISO.6.3.4. Solución de p-Hidroxidifenilo.Disolver agitando y calentando ligeramente

0,75 g de p-Hidroxidifenilo (C6H5C6H4OH) en 5 mlde una solución acuosa de Sodio Hidróxido al 5%.Diluir con Agua PA-ACS hasta 50 ml en un matrazaforado. Conservar la solución en un frasco devidrio topacio, al abrigo de la luz y en lugar fresco.No utilizar la solución si cambia el color o se entur-bia. El periodo máximo de conservación es desetenta y dos horas.

6.3.5. Solución patrón.Disolver poco antes de su empleo 0,1067 g de

Litio Lactato (CH3CHOHCOOLi) en Agua PA-ACSy diluir hasta 1.000 ml 1 ml de esta solucióncorresponde a 0,1 mg de Acido Láctico.

6.3.6. Leche reconstruida patrón. Analizar pre-viamente varias muestras de leche en polvo de altacalidad. Para la preparación de la curva de calibra-do tomar la muestra que tenga menor contenido en

63

M

Acido Láctico (menos de 30 mg de Acido Lácticopor 100 g de materia seca desgrasada en cualquiercaso). Seguir el procedimiento descrito en 6.4.2.

6.4. Procedimiento.6.4.1. Prueba en blanco.Efectuar una prueba en blanco con 30 ml de

Agua PA-ACS como muestra y siguiendo el pro-cedimiento descrito en 6.4.2. Si el resultado de laprueba en blanco frente a agua sobrepasa el equi-valente de 20 mg de Acido Láctico por 100 g demateria seca desgrasada, será necesario compro-bar los reactivos y sustituir los que se encuentrenalterados. Llevar a cabo la prueba en blanco almismo tiempo que el análisis de las muestras.

6.4.2. Determinación.6.4.2.1. Determinar el porcentaje de materia

seca desgrasada de la muestra (a) y pesar 1.000g/a-10 con precisión de 0,1 g. Añadir esta canti-dad de muestra a 100 ml de Agua PA-ACS y mez-clar cuidadosamente.

6.4.2.2. Pipetear 5 ml de la solución obtenida aun matraz aforado de 50 ml y diluir con aguahasta 30 ml aproximadamente. Añadir lentamentey agitando 5 ml de la solución de Cobre Sulfato(6.3.1.) y dejar reposar diez minutos. Añadir lenta-mente y agitando 5 ml de la suspensión de CalcioHidróxido (6.3.2.) y diluir a 50 ml con Agua PA-ACS. Agitar vigorosamente, dejar reposar diezminutos y filtrar, desechando las primeras gotasdel filtrado.

6.4.2.3. Pipetear 1 ml del filtrado a un tubo deensayo. Añadir 6 ml de la solución de Acido Sulfú-rico-Cobre Sulfato (6.3.3.) y mezclar. Calentar enbaño de agua hirviendo durante cinco minutos yenfriar hasta temperatura ambiente bajo corrientede agua. Añadir dos gotas de reactivo de p-hidro-xidifenilo (6.3.4.) y agitar vigorosamente. Sumergirel tubo en baño de agua a 30 ± 2ºC y mantenerlodurante quince minutos agitando de vez en cuan-do. Sumergir el tubo en baño de agua hirviendodurante noventa segundos y enfriar hasta tempe-ratura ambiente bajo corriente de agua.

6.4.2.4. Medir la absorbancia a 570 nm conrelación a la prueba en blanco durante las treshoras siguientes. Si la absorbancia es superior ala del punto más alto de la curva de calibrado,repetir la prueba utilizando una dilución adecuadadel filtrado obtenido en (6.4.2.2.).

6.4.3. Curva de calibrado.6.4.3.1. Pipetear 5 ml de leche constituida

(6.3.6.) en cinco matraces aforados de 50 ml.Añadir a cada uno de los matraces 0, 1, 2, 3 y 4 ml de la solución patrón de lactato (6.3.5.)correspondientes a 0, 20, 40, 60 y 80 mg deAcido Láctico añadido por 100 g de materia secadesgrasada de leche en polvo. Diluir con aguahasta unos 30 ml y proceder según lo establecidoen los apartados 6.4.2.2. y 6.4.2.4.

6.4.3.2. Medir la absorbancia a 570 nm conrelación a la prueba en blanco.

6.4.3.3. Llevar las absorbancias a un diagramaen función de las cantidades añadidas de AcidoLáctico, es decir, 0, 20, 40, 60 y 80 mg por 100 gde materia seca desgrasada. Ajustar la recta másadecuada y preparar la curva de calibrado des-plazando dicha recta paralela a sí misma demanera que pase por el origen.

6.5. Cálculos.A partir de la curva de calibrado, de la absor-

bancia medida en 6.4.2.4. y de la dilución efec-tuada en 6.4.2.4., calcular la concentración deAcido Láctico expresada en mg de Acido Lácticopor 100 g de materia seca desgrasada.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o inme-diatamente una después de la otra por el mismoanalista sobre la misma muestra, no podrá sersuperior a 8 mg de Acido Láctico por 100 g demateria seca desgrasada, en muestras con uncontenido en Acido Láctico de hasta 80 mg. Paravalores superiores dicha diferencia no podrá sersuperior al 10% del valor más bajo.

6.6. Referencia.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Ofi-cial de las Comunidades Europeas" número L327/29, de 24 de Diciembre.

METODO 7: ACTIVIDAD DE LAFOSFATASA(Método de Sanders y Sager, modificado)

7.1. Principio.La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo

viene dada por la cantidad de fosfatasa alcalinapresente. Se expresa por la cantidad de fenol libe-rado en microgramos por ml de leche reconstitui-da, determinada por el procedimiento que se indi-ca a continuación.

La actividad de la fosfatasa de la leche en polvose determina por el poder de la fosfatasa de libe-rar el fenol de fenilfosfato disódico. Se mide lacantidad de fenol liberado en las condicionesprescritas, por la medida espectrofotométrica dela coloración, desarrollada con el reactivo deGibbs.

El método permite determinar la actividad de lafosfatasa en los siguientes tipos de leche:

-Leche en polvo rica en grasa o extragrasa.-Leche en polvo entera o leche entera en polvo.-Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.-Leche en polvo desnatada o leche desnatada

en polvo.

64

7.2. Material y aparatos7.2.1. Balanza analítica.7.2.2. Baño de agua con termostato a 37ºC

± 1ºC.7.2.3. Espectrofotómetro que permita la lectu-

ra a longitud de onda de 610 nm.7.2.4. Papel de filtro (Shcleicher y Schull 597,

Whatman 42 o similar).7.2.5. Baño de agua hirviendo.7.2.6. Hoja de aluminio.

7.3. Reactivos.131015 Acido Bórico PA-ACS-ISO131074 Agua PA-ACS131188 Bario Hidróxido 8-hidrato PA131082 1-Butanol PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO

Dibromo-2, 6 Quinona Cloro-1,4 Imida131085 Etanol 96% v/v PA141322 Fenol (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX

Sodio meta-Borato131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO171674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA

7.3.1. Solución ATampón de Borato y de Bario Hidróxido:

pH 10,6 ± 0,1 a 20ºC.Disolver 25 g de Bario Hidróxido 8-hidrato PA

(Ba (OH)2.8H2O) en Agua PA-ACS y diluir hasta500 ml.

Disolver 11 g de Acido Bórico PA-ACS-ISO(H3BO3) en Agua PA-ACS y diluir hasta 500 ml.

Calentar las dos soluciones a una temperaturade 50ºC y mezclar.

Agitar y enfriar la mezcla a temperaturaambiente. Ajustar el pH a 10,6 ± 0,1 con la solu-ción de Bario Hidróxido y filtrar.

Conservar la solución en recipiente bien cerra-do. Antes de su uso, diluir la solución tampón conla misma cantidad de agua.

7.3.2. Solución B.Tampón para el desarrollo del color.Disolver 6 g de Socio meta-Borato (NaBO2) (o 12,6 g

de NaBO2.4H2O) y 20 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO (NaCl) en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml.

7.3.3. Solución C.Sustrato tamponado.7.3.3.1. Disolver 0,5 g de di-Sodio Fenilfosfato

2-hidrato RE (Na2C6H3PO4.2H2O) en 4,5 ml desolución B (7.3.2.). Añadir dos gotas de soluciónE (7.3.5.) y dejar reposar durante 30 minutos. Ex-traer el color formado con 2,5 ml de 1-Butanol PA(7.3.10.) Si fuese necesario, repetir la extraccióndel color. Tras separación, tirar el 1-Butanol. Estasolución puede conservarse algunos días en refri-gerador. Desarrollar y extraer el color, una vez másantes de su empleo.

7.3.3.2. Pipetear 1 ml de esta solución en unmatraz aforado de 100 ml y añadir la solución A(7.3.1.) hasta el enrase. Preparar el sustrato tam-ponado inmediatamente antes de su uso.

7.3.4. Solución D.Precipitarse.Disolver 3 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA

(ZnSO4.7H2O) y 0,6 g de Cobre II Sulfato 5-hidra-to PA-ACS-ISO (CuSO5.5H2O) en Agua PA-ACS yllevar a 100 ml.

7.3.5. Solución E.Reactivo de Gibbs.Disolver 0,040 g de Dibromo 2,6 Quinona Cloro

1,4 Imida (C6H2Br2C1NO) en 10 ml de Etanol 96%v/v PA. Conservar la solución en frasco de topacioen refrigerador. Desechar el reactivo cuando cam-bie de color.

7.3.6. Tampón de dilución de la coloración.Diluir 10 ml de solución tampón B para desa-

rrollo del color (7.3.2.) con Agua PA-ACS y com-pletar hasta 100 ml.

7.3.7. Solución de Cobre SulfatoDisolver 0,05 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato

PA-ACS-ISO (CuSO4.5H2O) en Agua PA-ACS ycompletar a 100 ml.

7.3.8. Solución patrón de Fenol.Disolver 0,200 ± 0,001 g de Fenol (USP, BP,

Ph. Eur.) PRS-CODEX en Agua PA-ACS y llevar a100 ml en matraz aforado. Esta solución puedeconservarse durante algunos meses en refrigera-dor. Diluir 10 ml de esta solución hasta 100 ml conagua. Esta solución diluida contiene 200 mg deFenol (USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX por ml ypuede utilizarse para preparar soluciones másdiluidas.

7.3.9. Agua PA-ACS, hervida.7.3.10. 1-Butanol PA.

7.4. Procedimiento.7.4.1. Precauciones a tomar.7.4.1.1. Evitar la exposición directa a la luz del sol.7.4.1.2. Limpiar perfectamente todo el material

de vidrio, tapones y material de trasvase. Se reco-mienda enjuagarlos y hervirlos con agua o tratar-los por vapor.

7.4.1.3. Evitar el empleo de material plástico(tapones por ejemplo que pudieran contenerFenol).

7.4.1.4. Evitar cuidadosamente todo indicio desaliva, puesto que ésta contiene fosfatasa.

7.4.2. Preparación de la muestra.7.4.2.1. Disolver 10 g de la muestra, pesados

con precisión de 0,1 g en 90 ml de Agua PA-ACS.La temperatura de disolución del polvo no debesobrepasar los 35ºC.

7.4.3. Determinación.7.4.3.1. Introducir en cada uno de los dos

tubos de ensayo 1 ml de leche reconstituida pre-parada según se indica en 7.4.2.1.

65

M

7.4.3.2. Calentar uno de los tubos en agua hir-viendo durante dos minutos. Cubrir el tubo y elbaño de agua (7.2.5.) o, por ejemplo, un vaso deprecipitados, con una hoja de aluminio (7.2.6.)para que se caliente todo el tubo. Enfriar en aguafría a temperatura ambiente. Este tuvo servirápara la prueba en blanco. A partir de este punto,tratar los dos tubos de idéntica manera.

7.4.3.3. Añadir 10 ml de la solución C (7.3.3.)Mezclar y colocar los tubos en el baño de agua(7.2.2.) a 37ºC.

7.4.3.4. Incubar durante sesenta minutos en elbaño de agua, agitando de vez en cuando.

7.4.3.5. Inmediatamente después introducir losdos tubos en el baño de agua hirviendo y calentardurante dos minutos, y enfriar a temperaturaambiente con agua fría.

7.4.3.6. Añadir 1 ml de la solución D (7.3.4.)mezclar y filtrar con papel de filtro seco; tirar lasprimeras porciones del filtrado hasta obtener unlíquido nítido.

7.4.3.7. Introducir 5 ml de cada filtrado entubos de ensayo, agregar 5 ml de solución B(7.3.2.) y 0,1 ml de solución E (7.3.5.). Mezclar.

7.4.3.8. Dejar que se desarrolle el color a tem-peratura ambiente y al abrigo de la luz solardurante treinta minutos.

7.4.3.9. Medir la absorbancia de la solución dela muestra por referencia a la prueba en blanco a610 nm.

7.4.3.10. Repetir la determinación si la absor-bancia de la solución es superior a la de la solu-ción patrón de 20 microgramos de Fenol prepara-da según el punto (7.5.).

Si dicho límite es sobrepasado, diluir un volu-men conveniente de leche reconstituida, según7.4.2.1., con un volumen apropiado de esta mismaleche cuidadosamente hervida, como se indica en7.4.3.2., para inactivar la fosfatosa presente.

7.5. Preparación de la curva patrón.7.5.1. Pipetear en cuatro matraces de 100 ml,

1, 3, 5 y 10 ml de la solución patrón diluida según7.3.8. y completar hasta enrase con agua; estassoluciones contienen respectivamente 2, 6, 10 y20 microgramos de fenol por ml.

7.5.2. Pipetear 1 ml de cada solución testigo(7.5.1.) en tubos de ensayo para obtener una seriede muestras conteniendo 0 (valor cero), 2, 6, 10 y20 microgramos de Fenol. El blanco se obtienepipeteando 1 ml de agua.

7.5.3. Pipetear sucesivamente en cada tubo deensayo 1 ml de la solución de Cobre II Sulfato(7.3.7.) 5 ml de solución tampón coloreada(7.3.6.), 3 ml de agua, 0,1 ml de la solución E(7.3.5.); mezclar.

7.5.4. Dejar reposar los tubos de ensayo atemperatura ambiente y al abrigo de la luz solardirecta durante treinta minutos.

7.5.5. Medir la absorbancia del contenido delos tubos por referencia al valor cero, a 610 nm.

7.5.6. Establecer la curva patrón anotando losvalores de las absorbancias en función de las can-tidades de Fenol en microgramos, tal como se haindicado en 7.5.2.

7.6. Cálculos.Convertir la cifra obtenida en 7.4.3.9. en micro-

gramos de Fenol con referencia a la curva patrón(P).

Calcular la actividad de la fosfatasa expresadaen microgramos de Fenol por ml de leche recons-tituida, según la fórmula siguiente:

Actividad de la fosfatasa = 2,4 x P

Si hubiera sido necesario diluir según 7.4.3.10.,multiplicar el resultado obtenido por el factor dedilución.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones efectuadas simultáneamente o inme-diatamente una después de la otra, por el mismoanalista y sobre la misma muestra, y en las mismascondiciones, no debe exceder de 2 microgramosde Fenol liberado por ml de leche reconstituida.

7.7. Referencias.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Ofi-cial de las Comunidades Europeas" número L327/29, de 24 de Diciembre.

METODO 8: ACTIVIDAD DE LAFOSFATASA(Método Aschaffenburg y Mullen)

8.1. Principio.La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo

se mide por la cantidad de fosfatasa alcalina acti-va presente en el producto. Se expresa por lacantidad de p-nitrofenol liberado en microgramospor ml de leche reconstituida, determinada por elprocedimiento que se explica a continuación.

La muestra de leche reconstituida se diluye ensubstrato en solución tampón (pH 10,2) y se incu-ba durante dos horas a una temperatura de 37ºC.Toda cantidad de fosfatasa alcalina presente en lamuestra libera, en semejantes condiciones, p-nitrofenol derivado del p-nitrofenilfosfato disódi-co. El p-nitrofenol liberado se mide mediantecomparación directa con cristales de color patro-nes en un colorímetro simple de luz reflejada.

El presente método permite determinar la activi-dad de la fosfatasa en los siguientes tipos de leche:

-Leche en polvo rica en grasa o extragrasa.-Leche en polvo entera o leche entera en polvo.-Leche en polvo parcialmente desnatada o

semidesnatada.

66

-Leche en polvo desnatada o leche desnatadaen polvo.

8.2. Material y aparatos.8.2.1. Balanza analítica.8.2.2. Baño de agua a 37ºC ± 1ºC, controlado

por termostato.8.2.3. Comparador colorimétrico, con disco

especial conteniendo cristales de color patronescalibrados en microgramos de p-nitrofenol por mlde leche y dos células de 25 mm cada una.

7.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131648 Sodio Carbonato anhidro PA

Sodio Nitrofenilfosfato131638 Sodio Hidrógeno Carbonato PA131788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA

8.3.1. Solución tampón de Sodio Carbonato ySodio Hidrógeno Carbonato.

Disolver 3,5 g de Sodio Carbonato anhidro PAy 1,5 g de Sodio Hidrógeno Carbonato PA enAgua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml en un matrazaforado.

8.3.2. Substrato en solución tampón.Disolver 1,5 g de p-Nitrofenilfosfato disódico en

la solución tampón de Sodio Carbonato anhidroPA y de Sodio Hidrógeno Carbonato PA (8.3.1.) ydiluir hasta 1.000 ml en un matraz aforado. Estasolución se mantiene estable durante un mes enel refrigerador (<4ºC) pero habrá que efectuarantes un test de control de color en las solucionesconservadas de esta forma (8.4.1.3.).

8.3.3. Precipitantes.8.3.3.1. Zinc Sulfato.Disolver 30 g de Zinc Sulfato PA (ZnSO4) en

Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml en unmatraz aforado.

8.3.3.2. Potasio Ferrocianuro en solución.Disolver 17,2 g de Potasio Hexacianoferrato II

3-hidrato PA-ACS (K4Fe(CN)6.3H2O) en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml en un matraz afo-rado.

8.4. Procedimiento.8.4.1. Precauciones a observar.8.4.1.1. Tras su utilización, vaciar los tubos,

enjuagarlos con agua, lavarlos con agua calientecon un detergente alcalino, enjuagarlos cuidado-samente luego con agua del grifo caliente y clara.Finalmente, enjuagarlos con agua; secarlos antesde su empleo.

8.4.1.2. Los tapones de los tubos de análisishan de ser enjuagados cuidadosamente con aguadel grifo caliente inmediatamente después de su

utilización; posteriormente hay que hervirlos enagua durante dos minutos.

8.4.1.3. El substrato en solución tampón(8.4.2.) se puede conservar estable durante unmes, como mínimo, en el refrigerador a una tem-peratura de ²4ºC. Toda inestabilidad se traducepor formación de un color amarillo. Dado que laprueba siempre se lee con respecto a un controldel producto hervido que contiene el mismo subs-trato en solución tampón, se recomienda no utili-zar este substrato cuando el color indique unexceso de 10 microgramos, efectuándose la lectu-ra en una célula de 25 mm en el colorímetro y uti-lizando Agua PA-ACS en la otra célula de 25 mm.

8.4.1.4. Utilizar una pipeta para cada muestra yevitar la contaminación por la saliva.

8.4.1.5. Evitar en todo momento la exposicióndirecta de la luz solar.

8.4.2. Preparación de la muestra.Disolver 10 g de polvo en 90 ml de agua. La

temperatura de disolución no ha de exceder los35ºC.

8.4.3. Determinación.8.4.3.1. Pipetear 15 ml de substrato en solu-

ción tampón (8.3.2.) en un tubo de análisis limpioy seco, luego 2 ml de la muestra de leche recons-tituida (8.4.2.) a analizar. Cerrar el tubo con untapón, mezclar dando vueltas al tubo y colocarloen baño de agua a 37ºC (8.2.2.).

8.4.3.2. Colocar simultáneamente en el bañode agua un tubo de control conteniendo 15 ml desubstrato en solución tampón y 2 ml de muestrade leche reconstituida hervida del mismo tipo quela del análisis.

8.4.3.3. Sacar los dos tubos del baño de aguaal cabo de dos horas, añadir 0,5 ml de precipitan-te de Zinc Sulfato (8.3.3.1.) poner de nuevo eltapón, agitar vigorosamente y dejar reposardurante tres minutos. Añadir 0,5 ml de precipitan-te de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS (8.3.3.2.); mezclar por completo y filtrar enpapel plegado (8.4.2.); recoger el líquido filtradonítido en el tubo de análisis limpio.

8.4.3.4. Transvasar el líquido filtrado a unacélula de 25 mm y comparar con respecto al líqui-do filtrado de la muestra de control hervida en elcolorímetro, utilizando el disco especial (8.3.2.).

8.5. Cálculos.La lectura directa obtenida según el punto

(8.4.3.4.) se expresa en microgramos de p-Nitro-fenol por ml de muestra o por ml de muestra deleche reconstituida.

La diferencia entre los resultados de dosdeterminaciones efectuadas simultáneamente oinmediatamente una después de la otra, por elmismo analista sobre la misma muestra y en lasmismas condiciones, ha de ser inferior a 2 micro-

67

M

gramos de p-Nitrofenol liberado por ml de lechereconstituida.

8.6. Referencias.Primera Directiva de la Comisión de 13 de

Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Ofi-cial de las Comunidades Europeas" número L327/29 de 24 de Diciembre.

68

Mantequilla

M

METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 21-7-1977,22-7-1977, 30-8-1979, 30-10-1991)

0. TOMA DE MUESTRA(B.O.E. 5-1-1975, Anejo único apartado 1)

Obtención a partir de una unidad (recipiente opaquete) de una parte (submuestra) que sea lomás representativa posible de dicha unidad.

0.1. MATERIALES

Podrán utilizarse los siguientes materiales:Sondas de acero inoxidable, con longitud sufi-

ciente para alcanzar diagonalmente la base delrecipiente y con un diámetro igual o superior a30 mm.

Espátulas o cuchillos de acero inoxidable, pararetirar parte de la muestra tomada con la sonda.

Recipientes cilíndricos de boca ancha, de vidrioo de acero inoxidable, esterilizables, de capacidadadecuada al tamaño de la muestra a tomar y quecerrarán herméticamente.

Todos los materiales utilizados deberán estarsecos y limpios, y no deberán comunicar otrosolores ni sabores extraños. Si la muestra se desti-na a análisis microbiológicos, el material se esteri-lizará por tratamiento con alcohol, seguido de fla-meado, o por inmersión en agua a + 100ºC, por lomenos treinta segundos, y se enfriarán a tempe-ratura ambiente antes de su uso.

0.2. TECNICA

Se tomará un número suficiente de muestrasparciales para que el peso de la muestra sea, porlo menos, de 200 g. El número de muestras toma-das será el que determina la legislación vigente.

Según la forma y peso de la mantequilla, seaplicará una de las técnicas siguientes:

a) Mantequilla en bloques o recipientes autori-zados de peso unitario superior a un kilogramo:

Se harán dos sondajes de la mantequilla. Unode éstos, se obtendrá introduciendo una sonda endiagonal a través del bloque de mantequilla,desde una esquina de la extremidad abierta delrecipiente. El segundo sondaje se obtendrá intro-duciendo la sonda verticalmente desde un puntoarbitrario de la superficie, hasta la base del reci-piente. La muestra comprenderá porciones toma-das de diferentes puntos de los dos sondajes,para dar un peso total mínimo de 200 g. Los reci-pientes para las muestras no se llenarán menosde dos tercios ni más de nueve décimas de lacapacidad.

Inmediatamente después de cerrados los reci-pientes que contienen la mantequilla, seránenvueltos en papel y almacenados en sitio oscu-

ro. La mantequilla no estará en contacto ni con elpapel ni con ninguna superficie absorbente deagua o grasa.

b) Mantequilla en recipientes autorizados depeso unitario comprendido entre 0,25 kilogramosy un kilogramo:

Dividir en cuatro partes aproximadamente igua-les las unidades, y elegir como muestra dos par-tes opuestas o la fracción correspondiente de dospartes opuestas para dar un peso mínimo de200 g. Los recipientes para las muestras no se lle-narán menos de dos tercios ni más de nueve déci-mas de su capacidad. Inmediatamente despuésde cerrados serán envueltos en papel y almace-nados en sitio oscuro.

c) Mantequilla en recipientes autorizados depeso unitario inferior a 0,25 kilogramos:

Se tomará como muestra el número de unida-des enteras necesarias para conseguir un pesomínimo de la muestra de 200 g. El número de uni-dades enteras se tomarán con su envase y, eneste caso, aparte de los recipientes autorizados,se podrán emplear bolsas de plástico protegidaspor una bolsa de papel. Estas bolsas no se llena-rán menos de dos tercios ni más de nueve déci-mas de su capacidad útil.

0.3. CONSERVACION DE LAS MUESTRAS

No se adicionarán conservadores de ningúntipo a las distintas muestras de mantequilla, quese almacenarán en cámara fría.

Para análisis microbiológicos o examen orga-noléptico, se conservarán las muestras a tempe-raturas comprendidas entre 0ºC y 5ºC.

0.4. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Las muestras serán transportadas al laborato-rio lo más rápidamente posible después de latoma de muestras, a temperaturas inferiores a +10ºC. Para análisis microbiológicos, las tempera-turas no deben sobrepasar los + 5ºC.

0.5. PREPARACION DE LA MUESTRAPARA LAS DISTINTASDETERMINACIONES

En los apartados a) y b) del punto 0.2., se colo-cará el recipiente con la muestra al baño María,sin sobrepasar la temperatura de + 39ºC, hastaobtener una consistencia óptima y fluidez homo-génea. La emulsión queda intacta, pero fluida,notándose claramente el nivel. Sacar del bañoMaría y dejar reposar hasta enfriamiento.

70

1. INDICE DE ACIDEZ DE LA GRASA

1.1. Principio.El índice de acidez de la materia grasa en la

mantequilla es el número de mg de potasio hidró-xido que se necesita para neutralizar 1 g de mate-ria grasa.

La materia grasa, después de separarla porfusión de la mantequilla, se disuelve en una mez-cla de alcohol-éter, y luego se titula con una solu-ción alcalina valorada.

1.2. Material y aparatos.1.2.1. Balanza analítica.1.2.2. Matraces erlenmeyer de 300 ml.1.2.3. Bureta graduada contrastada en divisio-

nes de 0,1 ml.

1.3. Reactivos.Los reactivos que se utilicen deben ser de cali-

dad pura para análisis.

131086 Etanol absoluto PA131085 Etanol 96% v/v PA 131091 Metanol PA-ACS-ISO131313 Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACS131325 Fenolftaleína PA-ACS182146 Potasio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) eta-

nólica SV

1.3.1. Potasio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) etanó-lica SV.

1.3.2. Mezcla de volúmenes iguales de Etanol96% v/v PA y de Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS.

1.3.3. Solución neutra de Fenolftaleína PA-ACSal 1% (m/v) en Etanol 96% v/v PA desnaturalizadocon Metanol PA-ACS-ISO.

NOTA: Alcohol desnaturalizado con MetanolPA-ACS-ISO: 100 partes Etanol absoluto PA y5 Metanol PA-ACS-ISO.

1.4. Procedimiento.Para separar la materia grasa, fundir la mues-

tra, dejarla reposar a 50º-60º 2 o 3 horas, decan-tar y filtrar con papel de filtro seco. Filtrar nueva-mente si el primer filtro no está claro. Utilizar lamateria grasa fundida, clarificada, bien mezclada.

En un matraz erlenmeyer pesar con precisiónde 1 miligramo 5-10 g de materia grasa. Añadir50-100 ml de la mezcla de Etanol 96% v/v PA yEter Dietílico est. con ~ 6 ppm de BHT y disolveren esta mezcla la materia grasa. Añadir 0,1 ml dela solución de Fenolftaleína PA-ACS. Valorar conla solución alcalina hasta que aparezca una colo-ración rosa pálido que persista al menos 10 se-gundos.

1.5. Cálculo.

V · t · 56,1Indice de acidez = ––––––––––––––

A

V = volumen, en ml, de la solución alcalinaempleada.

t = normalidad de la solución alcalina.A = masa, en gramos, de la porción ensayada.

La diferencia entre los resultados de dos deter-minaciones paralelas no debe ser mayor de 0,1 mgde potasio hidróxido por 1 g de materia grasa.

1.6. Referencia.1.6.1. Norma FIL-IDF - G A - 1969.

2. INDICE DE REFRACCION DE LA GRASA

2.1. Principio.El índice de refracción de la materia grasa en la

mantequilla es la razón entre la velocidad de unaluz de longitud de onda determinada (luz de sodio)en el aire y la velocidad de esta misma luz en lamateria grasa de la mantequilla a 40ºC.

Mediante un refractómetro apropiado se deter-mina el índice de refracción de la materia grasaobtenida por fusión de la mantequilla.

2.2. Material y aparatos.2.2.1. Refractómetro provisto de escala gra-

duada en índices de refracción, que permita efec-tuar lecturas hasta la tercera cifra decimal y cuyosprismas pueden calentarse mediante un líquidocirculante, regulándose la temperatura termostáti-camente con una aproximación de ± 0,1ºC.

2.2.2. Luz de sodio. Se puede utilizar tambiénla luz blanca si el refractómetro tiene un dispositi-vo de compensación cromática.

2.3. Procedimiento.Para separar la materia grasa, fundir la muestra

y dejarla reposar 2 o 3 horas a 50º-60ºC; decantary filtrar con papel de filtro seco. Filtrar nuevamentesi el primer filtrado no está claro. Utilizar la materiagrasa fundida, clarificada, bien mezclada sin agua.

Preparar y regular el refractómetro según elmodo de empleo del aparato. Ajustar la tempera-tura del líquido circulante a 40º ± 0,1ºC.

Colocar algunas gotas de materia grasa, pre-parada en la forma anteriormente descrita, entrelos prismas del refractómetro, de manera que sellene por completo el espacio comprendido entreellos. Dejar transcurrir algunos minutos para quela materia grasa alcance la temperatura de losprismas. Efectuar la lectura con cuatro cifras deci-males. Corregir el índice de refracción obtenido

71

M

añadiendo 0,000045 unidad de índice de acidez siéste último (determinado según 1) es igual o supe-rior a dos. Redondear la cuarta cifra decimal.

2.4. Cálculo.La diferencia entre los resultados de determi-

naciones paralelas no debe ser mayor de 0,0002de la unidad de índice de refracción.

2.5. Referencia.2.5.1. F.A.O. - B-5 - 1967.

3. SODIO CLORURO

3.1. Principio.Se entiende por contenido de sal (sodio cloru-

ro) de la mantequilla el porcentaje en masa de lasal (sodio cloruro) determinado por el procedi-miento que se describe a continuación.

Después de fundir la mantequilla añadiendoagua hirviendo, los cloruros de las mezclas sevaloran con una solución de plata nitrato, em-pleando potasio cromato como indicador, segúnel procedimiento de Mohr, y se calcula el conteni-do de sal.

3.2. Material y aparatos.3.2.1. Balanza analítica.3.2.2. Matraces erlenmeyer de 250 ml de capa-

cidad.3.2.3. Bureta graduada y contrastada en divi-

siones de 0,1 mililitros.

3.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS181464 Plata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV171498 Potasio Cromato solución 5% p/v RE

3.3.1. Plata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV.3.3.2. Potasio Cromato solución 5% p/v RE.

3.4. Procedimiento.Ablandar la muestra en un recipiente cerrado,

calentándola en baño de agua a la temperaturamás baja posible, con objeto de no romper laemulsión. Frecuentemente es adecuada una tem-peratura comprendida entre 23º y 28ºC y en nin-gún caso la temperatura podrá exceder de 39ºC.Agitar el recipiente que contiene la muestra aintervalos frecuentes durante el proceso de ablan-damiento con objeto de que la muestra se mezclehomogéneamente. Sacar el recipiente del baño deagua y agitarlo vigorosamente a intervalos fre-cuentes hasta que la muestra se haya enfriadoadquiriendo una consistencia espesa y cremosa.Esta operación puede realizarse con un agitadormecánico.

Efectuar una determinación en blanco, em-pleando los mismos reactivos, en las mismas can-

tidades y siguiendo el mismo procedimiento quese describe a continuación.

Pesar con una precisión de 10 mg, 5 mg demuestra e introducirla en un matraz erlenmeyer.

Añadir cuidadosamente 100 ml de Agua PA-ACS hirviendo. Dejar en reposo durante 5-10minutos, agitando por rotación de (temperaturade valoración). Añadir 2 ml de solución de PotasioCromato. Mezclar agitando por rotación. Mientrasse agita continuamente, valorar con la solución dePlata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV hasta que el cam-bio de color anaranjado pardo persista durante 30segundos.

3.5. Cálculo.El contenido de sal (expresado en porcentaje

por masa de NaCI) es:

5,85 t (v1 - ve)–––––––––––––––––

a

t = normalidad de la solución de plata nitrato.v1 = volumen, en ml, de solución de plata nitra-

to, utilizados en la valoración.ve = volumen, en ml, de solución de plata nitra-

to en el ensayo en blanco.a = masa, en gramos, de la muestra utilizada.La diferencia entre los resultados de dos deter-

minaciones paralelas no deberá ser mayor de 0,02g de sodio cloruro por 100 g de producto.

3.6. Referencia.3.6.1. Norma FIL-12A - 1969.

4. AGUA, EXTRACTO SECO MAGRO Y GRASA EN UNA SOLA MUESTRA

4.1. Principio.Se define el contenido de agua en la mantequi-

lla como la pérdida de masa, expresado comoporcentaje, en masa, según se determina por elprocedimiento descrito.

Se define el contenido de extracto seco magroen la mantequilla como el porcentaje, en masa, desustancias, según se determina.

Se define el contenido de materia grasa en lamantequilla como el porcentaje, en masa, que seobtiene restando de 100 el contenido de agua y eldel extracto seco magro.

El contenido de agua se determina gravimétri-camente secando una cantidad conocida de man-tequilla a 102º ± 2ºC.

El contenido de extracto seco magro se deter-mina gravimétricamente después de extraer conéter de petróleo la grasa de la mantequilla secada.

4.2. Material y aparatos.4.2.1. Balanza analítica con una tolerancia de

0,1 mg.

72

4.2.2. Estufa de desecación bien ventilada ycontrolada con termostato, ajustada para que fun-cione a una temperatura de 102º ± 2ºC.

4.2.3. Cápsulas metálicas, de porcelana o devidrio, resistentes a la corrosión, que tengan por lomenos 25 mm de altura y 50 mm de diámetro.

4.2.4. Crisoles filtrantes de vidrio sintetizado(porosidad número 3) con matraces de filtración ala trompa.

4.2.5. Varilla con pieza final de material adecuado.

4.3. Reactivos.Eter de Petróleo con límites de ebullición entre

30 y 60ºC. En su defecto usar 131315 Eter dePetróleo 40-60ºC PA-ISO.

Este reactivo no debe dejar ningún residuo porevaporación.

4.4. Procedimiento.4.4.1. Preparación de la muestra.- Excepto

cuando el mezclado no se considere necesario, lamuestra debe mezclarse agitando con una varillao con un agitador mecánico, lo más rápidamenteposible, sin exceder de 1 minuto. La temperaturadel mezclado deberá estar comprendida normal-mente entre 23ºC y 28ºC, pero en ningún casodeberá exceder de 35ºC. Antes de pesar, lamuestra deberá ponerse siempre a la temperatu-ra ambiente.

4.4.2. Determinación de agua.- Secar la cápsu-la en la estufa hasta masa constante. Dejar enfriarla cápsula en desecador hasta la temperaturaambiente (30-35 min.) y pesar. Pesar en la cápsu-la, de 5 a 10 g de la muestra de mantequilla. Man-tener la cápsula en la estufa durante una hora, porlo menos. Dejar que se enfríe la cápsula en dese-cador a la temperatura ambiente (de 30-35 min.) ypesar. Repetir el secado a intervalos de mediahora hasta masa constante (variación igual o infe-rior a 0,5 miligramos). Todas las pesadas se haráncon una precisión de 0,1 miligramo. En el caso deque aumente la masa, se toma la masa mínimapara el cálculo. No deben emplearse en estadeterminación materiales absorbentes.

4.4.3. Determinación del extracto seco magro.-Secar el crisol de vidrio filtrante en la estufa hastamasa constante. Dejar enfriar el crisol a tempera-tura ambiente (30-35 min.) y pesar. Añadir de 10 a15 ml de Eter de Petróleo caliente a la cápsula,que contiene el extracto seco procedente de ladeterminación de agua, de manera que se disuel-va la grasa.

Separar la mayor cantidad posible del sedi-mento adherido a la cápsula utilizando una varillay pasar cuantitativamente la solución sobre lapunta de la varilla al crisol. Repetir las operacionescinco veces. Lavar el sedimento que queda en elcrisol con 25 ml de Eter de Petróleo caliente.Secar la cápsula y el crisol en la estufa durante 2

horas. Dejar que la cápsula y el crisol se enfríen ala temperatura ambiente (30-35 min.) y pesar.Repetir las operaciones durante periodos de 30minutos a la temperatura de secado hasta que lamasa no disminuya más. Todas las pesadas seharán con una precisión de 0,1 mg.

4.5. Cálculo.4.5.1. Método de cálculo de contenido de

agua.- Emplear la fórmula:

M - nagua % = –––––––– x 100

M

Siendo:M = masa, en gramos, de la muestra.n = masa, en gramos, de la muestra después

de secar.

4.5.2. Método de cálculo del extracto secomagro.- Emplear la fórmula:

(A2 - A1) + (B2 - B1) x 100Extracto seco magro = ––––––––––––––––––––––––––

M

Siendo:A1 = masa, en gramos, del crisol vacío.A2 = masa, en gramos, del crisol conteniendo

sedimento.B1 = masa, en gramos, de la cápsula vacía.B2 = masa, en gramos, de la cápsula con sedi-

mento residual.M = masa, en gramos, de la muestra.

4.5.3. Método de cálculo del contenido degrasa.

Grasa % = 100 - (E + S)

E = porcentaje, en masa, de agua (calculada en4.5.1.).

S = porcentaje, en masa, de extracto secomagro (calculado en 4.5.2.).

Para la determinación del contenido de agua, ladiferencia entre el resultado de determinacionesparalelas no deberá exceder de 0,1 g de aguapara 100 g de mantequilla.

Para la determinación del contenido de extrac-to seco magro, diferencia entre resultados dedeterminaciones paralelas no deberá exceder de0,05 g de extracto seco magro para 100 g demantequilla.

73

M

5. DETECCION DE GRASA VEGETAL ENGRASA DE LECHE POR CROMATO-GRAFIA DE GASES DE ESTEROLES

5.1. Principio.Los digitónidos de esterol se disuelven en una

mezcla de formamida y N,N-dimetilformamida, ylos esteroles liberados se extraen con n-pentano,y se separan por cromatografía de gases. Si seobtiene en el cromatograma un pico con el tiem-po de retención del beta-sitosterol, se concluye lapresencia de grasa vegetal en la muestra de grasaexaminada.

5.2. Material y aparatos.5.2.1. Cromatógrafo de gases, equipado de un

detector de ionización de llama, con un inyectorde plata o de vidrio con un sistema de inyeccióndirecta en la columna y con un registrador.

5.2.2. Columna de cromatografía de gases, devidrio o de acero inoxidable, en forma de U o enespiral, de 1 o 2 m de longitud, diámetro interiorde 3-4 mm. Se recomienda el vidrio, pues algunostipos de acero inoxidable dan resultados erróneospor alteración de los esteroles.

5.2.3. Microjeringa, capaz de proporcionardosis de 5 o 10 microlitros.

5.3. Reactivos.131074 Agua PA-ACS251274 Colesterol DC

Digitonina solución alcohólica 1%131785 N, N-Dimetilformamida PA131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACSFitosterol de Aceite de ColzaFitosterol de Aceite de Soja

141956 Formamida PRS132006 n-Pentano PA131515 Potasio Hidróxido 85% lentejas PA

5.3.1. Mezcla de volúmenes iguales de Forma-mida PRS y N,N-Dimetilformamida PA.

5.3.2. n-Pentano PA.5.3.3. Relleno de la columna: fase estacionaria

de goma de silicona (tipo metílico), estable hastapor lo menos 300ºC que impregna en m2 a 4%,una tierra de diatomeas calcinada, lavada al ácidoy silanizada, de granulometría 80/100 o 100/120de malla.

5.3.4. Solución para el ensayo de sensibilidad:1 mg de Colesterol DC de 1 ml de n-Pentano PA,recientemente preparado a partir de la grasa deleche, como se describe en 5.4.2.

5.3.5. Solución para el ensayo de resolución delos picos: 0,9 mg de Fitosterol de Aceite de Colzay 0,1 mg de Colesterol DC en 1 ml de n-PentanoPA. Los esteroles deben estar recientemente

preparados según el procedimiento descrito en5.4.2.

5.3.6. Solución para el ensayo de referencia:1 mg de Fitosterol de Aceite de Soja en 1 ml de n-Pentano PA recientemente preparado, según sedescribe en 5.4.2.

5.3.7. Gas portador, nitrógeno.5.3.8. Hidrógeno.5.3.9. Oxígeno o aire.

5.4. Procedimiento.5.4.1. Preparación de la muestra.- Fundir apro-

ximadamente 50 g de la muestra de mantequillaen una estufa corriente a temperatura inferior a50ºC hasta separación de las fases acuosa ygrasa. Separar la capa grasa por decantación yclarificar la grasa en una estufa a una temperatu-ra de aproximadamente 40ºC filtrando sobre unpapel de filtro seco y evitando que pase la faseacuosa sobre el filtro.

5.4.2. Preparación de esteroles.- Pesar en unmatraz erlenmeyer de 500 ml, aproximadamente15 g de materia grasa con una precisión de 0,1 g.Añadir 10 ml de solución de Potasio Hidróxido y20 ml de Etanol 96% v/v PA. Colocar sobre elmatraz erlenmeyer el refrigerante de aire, calentaren baño de agua hirviendo, agitando por rotación,hasta que la solución se haga clara, y continuar laebullición media hora más.

Añadir 60 ml de Agua PA-ACS y luego 180 mlde Etanol 96% v/v PA y llevar la temperatura aaproximadamente 40ºC. Añadir 30 ml de la solu-ción alcohólica de Digitonina (1%), agitar y dejarenfriar. Colocar el matraz en un refrigerante regu-lado a 5ºC, aproximadamente, durante 12 horas ouna noche.

Recoger el precipitado del digitónido de esterolpor filtración sobre un papel de filtro de velocidadmedia en un embudo Buchner (8 cm de diámetro).Lavar el precipitado con Agua PA-ACS aproxima-damente a 5ºC hasta que el filtrado no formeespuma, luego lavar una vez con 25-50 ml deEtanol 96% v/v PA y después una vez con 25-50ml de Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm deBHT PA-ACS.

Desecar el papel de filtro con el precipitado en unvidrio de reloj en estufa a 102º ± 2ºC, durante 10 a15 minutos. Separar el precipitado en forma de pelí-cula, plegando en dos partes el papel de filtro.

Disolver en un pequeño tubo de ensayo, apro-ximadamente, 10 mg de digitónido de esterol en0,5 ml de una mezcla de volúmenes iguales deFormamida PRS y N,N-Dimetilformamida PA.Calentar ligeramente, si es necesario. Despuésenfriar, añadir 2,5 ml de n-Pentano PA y agitar.Dejar reposar hasta que la separación entre lascapas sea neta y usar la capa superior, que con-tiene los esteroles liberados para el análisis cro-matográfico.

74

5.4.3. Condiciones de la cromatografía degases.- Temperatura de la columna 220-250ºC.Temperatura del sistema de inyección, si puedecalentarse por separado, 20-40ºC por encima de latemperatura de la columna. Gasto de nitrógeno30/60 ml/min. Desconectar el detector y equilibrarlas columnas nuevas en estas condiciones durante16-24 horas. Conectar el detector, encender la llamay regular el gasto de hidrógeno y oxígeno o aire paraobtener una altura de llama y una sensibilidad ade-cuada. Poner en marcha el registrador y dejar que elpapel se desenrolle a una velocidad adecuada, ajus-tar el cero y el atenuador. Si la línea de base es esta-ble, el aparato está listo para usarse.

5.4.4. Ensayo de sensibilidad.- Inyectar 3 a 5 µlde la solución para el ensayo de sensibilidad(5.3.4.). Sólo aparecerá un pico de colesterol en elcromatograma (fig. 5.I.). Ajustar el atenuador demodo que se utilice aproximadamente toda laescala del registrador.

5.4.5. Ensayo de resolución de los picos.- Inyec-tar 3 a 5 µl de la solución para el ensayo de resolu-ción de los picos (5.3.5.). Aparecerán en el croma-tograma los picos de colesterol, brasicosterol,camposterol) (fig. 5.II.). Medir las distancias deretención (distancia desde el punto de inyecciónhasta el punto de altura máxima del pico) de lospicos, dch para el colesterol, db para el brasicoste-rol, dc para el camposterol y el ds para el beta-sitos-terol y las anchuras de la base de los picos (dimen-sión de retención entre las intersecciones con lalínea de base de las tangentes en los puntos deinflexión situados en la parte anterior y posterior delpico) Wch para el colesterol y Wb para el brasicos-terol. La resolución de los picos, expresada por lafórmula.

PR = 2(db - dch) (Wb + Wch)debe ser por lo menos igual a 1.

Calcular los tiempos de retención relativos(colesterol 1,00) para el brasicosterol, el campos-terol y el beta-sitosterol.

5.4.6. Ensayo de referencia.- Inyectar 3 a 5 µlde la solución para el ensayo de referencia(5.3.6.). Los picos de camposterol, estigmasteroly de beta-sitosterol deben aparecer sobre el cro-matograma (fig. 5.III.). Medir las distancias deretención de los picos, dc para el camposterol, dstpara el estigmasterol y ds para el beta-sitosterol.

Calcular los tiempos de retención relativos, queson, aproximadamente:

Colesterol ....... 1,00 (aproximadamente 15 min.)Brasicosterol... 1,13-1,15Camposterol ... 1,32-1,34Estigmasterol .. 1,44-1,46Beta-sitosterol 1,66-1,68

5.4.7. Análisis.- Inyectar 3 a 5 µl de la solucióna analizar y dar al botón del atenuador hasta obte-ner un factor de atenuación cuatro veces inferior

(se obtiene generalmente en dos pases delbotón). Registrar el cromatograma.

5.5. Cálculo.Si en el cromatograma un pico tiene un tiempo

de retención relativo igual al de beta-sitosterol yuna altura que corresponde al menos a un 2% dela escala, se concluye la presencia de beta-sitos-terol y la muestra de grasa examinada, a partir dela cual se han aislado los esteroles, se consideraque contiene grasa vegetal. La presencia en el

75

M

Fig. 5.IIEsteroles del aceite de colza adicionados de colesterol

Fig. 5.IEsteroles de la materia grasa de la leche

cromatograma de picos de otros fitosterolescomo el camposterol o el estigmasterol, refuerzaesta conclusión.

Por este método se puede demostrar la presenciade al menos un 0,5% de beta-sitosterol en la mezclade esteroles. El límite de detección de la grasa vege-tal en la grasa de leche no se puede indicar porquedepende del contenido en beta-sitosterol de la grasaañadida, es decir, de la naturaleza de esta grasa o dela mezcla de grasas añadidas a la grasa de leche.

5.6. Referencia.5.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 54: 1970.

6. FOSFATASA RESIDUAL ENMANTEQUILLA

6.1. Principio.El ensayo se basa en la acción del enzima fos-

fatasa sobre el substrato sodio fenilfosfato di-bási-co, con liberación del fenol y fosfato. La cantidadde fenol liberada se determina por adición de unreactivo que da color azul en presencia de fenol.

Cantidades superiores a dos equivalentes defenol en 0,5 g de mantequilla indican una pasteri-zación insuficiente.

6.2. Material y aparatos.6.2.1. Cuchillo o espátula de acero inoxidable.6.2.2. Baño de agua a 37º-38ºC.6.2.3. Termómetro.6.2.4. Pipetas de 1 ml.6.2.5. Embudo de 5 cm de diámetro.6.2.6. Papel Whatman núm. 42 o núm. 2.6.2.7. Tubos graduados a 5 y 10 ml.

6.2.8. Fotómetro con filtro de transmitanciamáxima a 610 nm.

6.2.9. Centrífuga. 6.2.10. Pera de goma para pipetar.

6.3. Reactivos.131015 Acido Bórico PA-ACS-ISO131074 Agua PA-ACS131082 1-Butanol PA131188 Bario Hidróxido 8-hidrato PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-

ISO2, 6-Dibromoquinona Clorimida (BQC)

131086 Etanol absoluto PA131322 Fenol PA-ACS

Sodio meta-Borato131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO171674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE131788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA

6.3.1. Tampón Bario Hidróxido-Borato: Disolver18 g de Bario Hidróxido 8-hidrato PA y 8 g deAcido Bórico PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS ydiluir a 1 litro con Agua PA-ACS.

6.3.2. Tampón de desarrollo de color: pH 9,8± 0,15 a 25ºC. Disolver 6,0 g de Sodio meta-Bora-to (NaBO2) y 20 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO enAgua PA-ACS y diluir a 1 litro con Agua PA-ACS.

6.3.3. Tampón de dilución de color. Diluir100 ml de tampón de desarrollo de color a 1 litrocon Agua PA-ACS.

6.3.4. Sustrato tampón: Disolver 0,10 g de di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE cristalino libre deFenol en 100 ml de tampón Bario Hidróxido-Bora-to (6.3.1.) (los cristales de di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE, deben guardarse en congelador o endesecador). Si di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE,no está libre de Fenol, purificarlo como sigue:Disolver 0,5 g con 4,5 ml de Agua PA-ACS, añadir0,5 ml de tampón Bario Hidróxido-Borato (6.3.1.) ydos gotas del reactivo BQC (6.3.5.) y dejar reposar30 minutos. Extraer el color con 2,5 ml de 1-Buta-nol PA (6.3.7.) y dejar reposar hasta que el alcoholse separe. Retirar el alcohol con un cuentagotas ydesecharlo. Diluir 1,0 ml de la solución acuosa a100 ml de tampón Bario-Hidróxido Borato (6.3.1.).Calentar la solución a 85ºC 2 minutos, tapar inme-diatamente y conservar en refrigerador. La soluciónes estable un año si las porciones son recogidascon mínima exposición a la atmósfera.

6.3.5. Solución de 2,6-Dibromoquinona Clori-mida (BQC) o reactivo de Gibbs: Disolver 40 mgBQC en polvo en 100 ml de Etanol absoluto PA oMetanol PA-ACS-ISO y pasarlo a un frasco cuen-tagotas oscuro. El reactivo permanece estable porlo menos un mes, si se guarda en congelador; nousarlo después de que empiece a ponerse pardo.Guardar BQC en polvo en congelador o en dese-cador (nota: ha habido explosiones del reactivo

76

Fig. 5.IIIEsteroles del aceite de soja

BQC guardado en botella en la estantería de reac-tivos). Comprobar los nuevos lotes de BQC antesde usarlo, preparando una curva patrón con Fenoly comparando la curva obtenida con la de BQCque se sabe es satisfactorio. Repetir la prueba almenos semestralmente.

6.3.6. Solución Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO para los patrones: Disolver 0,05 g CobreII Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACSy diluir a 100 ml.

6.3.7. 1-Butanol PA: Usar 1-Butanol PA, puntode ebullición 116-118ºC. Para ajustar el pH, mez-clar 1 litro con 50 ml de tampón de desarrollo decolor. Guardar en recipiente con tapón de vidrio.

6.3.8. Solución patrón de Fenol:6.3.8.1. Solución madre: Pesar exactamente

1,000 g de Fenol PA-ACS puro, llevarlo a unmatraz aforado de 1 litro, diluirlo con Agua PA-ACShasta 1 litro y mezclar (1 ml = 1 mg de Fenol). Lasolución es estable varios meses en refrigerador.

6.3.8.2. Patrones de trabajo: Diluir 10,0 ml de lasolución madre con Agua PA-ACS hasta 1 litro ymezclar (1 ml = 10/µg, 0,00001 g o 10 unidades deFenol). Usar esta solución patrón para prepararsoluciones patrón más diluidas: p. e., diluir 5, 10,30, 50 ml con Agua PA-ACS hasta 100 ml para pre-parar soluciones patrón, que contenga 0,5; 1,0; 3,0y 5,0 µg o unidades de Fenol/ml, respectivamente.Guardar estas soluciones patrón en refrigerador nomás de una semana. Análogamente preparar, a par-tir de la solución madre (6.3.8.1.), soluciones patrónque contengan 20, 30 y 40 unidades/ml.

Medir las cantidades adecuadas de las solucio-nes patrón de trabajo en una serie de tubos (pre-feriblemente graduados a 5,0 y 10,0 ml) para con-seguir un intervalo adecuado de patrones, segúnse necesite, que contengan 0 (control o prueba enblanco), 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0unidades. Para aumentar el brillo de las solucio-nes azules y mejorar la estabilidad de los patro-nes, añadir 1,0 ml de solución de Cobre II Sulfato(6.3.6.) a cada tubo. Luego añadir 5,0 ml de tam-pón de solución de color (6.3.3.) y diluir con131074 Agua PA-ACS hasta 10,0 ml, añadir 4gotas (0,08 ml) de la solución BQC (6.3.5.), mez-clar y dejar desarrollar el color azul 30 minutos atemperatura ambiente.

Leer las intensidades de color en el fotómetrocon filtro de 610 nm, restar el valor de la pruebaen blanco del color de cada patrón de Fenol y pre-parar la curva patrón (debe ser una línea recta).

Si los patrones han de usarse para compara-ción visual, guardar en refrigerador. Prepararsemanalmente una serie nueva.

6.4. Procedimiento.Tomar la muestra por debajo de la superficie

con cuchillo y espátula limpios y proceder comosigue:

Pesar 1,0 g de muestra (preferiblemente porduplicado) sobre un pedazo de papel encerado deaproximadamente 1 pulgada cuadrada e introdu-cir el papel con la muestra dentro del tubo. Análo-gamente, pesar otra muestra y colocarla en untubo como control o patrón.

Calentar el patrón aproximadamente 1 minutoa 85-90º en vaso de agua hirviendo (cubierto asíel tubo entero se calienta a 85-90º) y se enfría atemperatura ambiente. A partir de este momento,tratar en la misma forma el patrón y el problema.

Añadir 10,0 ml de sustrato patrón (6.3.4.).Tapar el tubo y mezclar. Inmediatamente despuésde añadir el sustrato, incubar 1 hora en baño deagua a 37-38º, mezclando o agitando el conteni-do de cuando en cuando.

Calentar en vaso de agua hirviendo casi 1minuto, calentando hasta 85-90º (utilizar termó-metro en otro tubo del mismo tamaño y forma quecontenga el mismo volumen de líquido) y enfriar atemperatura ambiente en recipiente de agua fría.

Pipetar en 1 ml de solución de Zinc Sulfato de6,0 g/100 ml y mezclar por completo (el pH de lamezcla debe ser de 9,0-9,1).

Filtrar (se recomienda embudo de 5 cm y papelWhatman número 42 o núm. 2) y recoger 5,0 mlde filtrado en el tubo, preferentemente graduado a5,0 y 10,0 ml.

Añadir 5,0 ml de tampón de desarrollo de color(6.3.2.). El pH de la mezcla ha de ser 9,3-9,4.

Añadir 4 gotas de la solución BQC (6.3.5.) ydejar 30 minutos a temperatura ambiente paradesarrollo de color (para detectar únicamente lapasterización, añadir solamente 2 gotas de solu-ción BQC).

Determinar la intensidad del color azul por unode los siguientes métodos:

a) Con fotómetro.- Leer intensidades de colorde soluciones en blanco y problema (utilizando fil-tro con transmitancia máxima a aproximadamente610 nm, restar la lectura de la prueba en blancode la del problema, y expresar el resultado enequivalentes Fenol mediante referencias a la curvapatrón obtenida con las correspondientes solucio-nes (6.3.8.2.). Generalmente es innecesaria laextracción con 1-Butanol PA cuando se utiliza elfotómetro; si se hace la extracción con 1-ButanolPA como en (b), centrifugar la muestra 5 minutospara romper la emulsión y separar el agua sus-pendida en la capa de alcohol (para esta finalidadpuede adaptarse una centrífuga Babcock hacien-do adaptadores especiales para tubos en la formasiguiente. Cortar una sección de 1/4" de gruesode un tapón de goma de diámetro adecuado, queajuste en el fondo del vaso de centrifugación.Pegar dos tapones de corcho de diámetro ade-cuado, perforar en el centro un orificio de dimen-siones adecuadas para alojar un tubo ajustada-mente e introducir la sección doble de corcho en

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M

el vaso. Después de centrifugar, quitar casi todo el1-Butanol PA con pipeta provista de pera degoma en el extremo superior. Filtrar dentro de lacubeta del fotómetro y leer con filtro cuyo máximode transmitancias es aproximadamente de650 nm).

b) Con patrones visuales.- Con muestras queproducen más de 5 unidades, comparar coloresen tubos con los de patrones de Fenol en soluciónacuosa (6.3.8.2.). Para cuantificar resultados enlos casos dudosos (p. ej., problemas que produ-cen 0,5-5 unidades de color) extraer con 1-Buta-nol PA (6.3.7.). Añadir 5,0 ml de Alcohol (6.3.7.) einvertir el tubo lentamente varias veces; centrifu-gar como en (a) si es necesario incrementar latransparencia de la capa de alcohol, y comparar elcolor azul con los colores de los patrones deFenol (6.3.8.2.), análogamente tratados.

En los problemas que se consideren muy posi-tivos durante el desarrollo de color (p. ej., 20 uni-dades), en los que 4 gotas de solución BQC(6.3.5.) pueden ser insuficientes para combinarcon todo el Fenol, pipetar proporción adecuadade contenidos dentro de otro tubo, diluir hasta10,0 ml con tampón de dilución de color (6.3.3.),y añadir 2 gotas adicionales de solución BQC(6.3.5.). Con cada problema diluir y tratar la prue-ba en blanco análogamente. Si la prueba sobre lamuestra diluida es todavía muy fuertemente posi-tiva, diluir de nuevo en la misma forma hasta queel color final esté dentro del intervalo de los patro-nes visuales o de la curva patrón del fotómetro.Dejar 30 minutos para el desarrollo de color des-pués de la última adición de la solución BQC(6.3.5.) antes de hacer la lectura final. Para corre-gir lecturas por dilución, multiplicar por 2 paradilución 5 + 5, por 10 para dilución 1 + 9 y por 50dilución 1 + 9 seguida de dilución 2 + 8, etc.

6.5. Cálculo.Cuando se utilice 1,0 g de mantequilla y se

añadan 11,0 ml de líquido, multiplicar el valor dela lectura por 1,1 para convertir el resultado enequivalentes de fenol/0,5 g de mantequilla (valo-res mayores de 2 equivalentes/0,5 g de mantequi-lla indican pasterización insuficiente).

6.6. Referencia.6.6.1. A.O.A.C. Official Methods of Analysis, lla.

Ed. (1970).

7. INDICES DE ACIDOS GRASOSVOLATILES SOLUBLES EINSOLUBLES

7.1. Principio.El índice de ácidos grasos volátiles solubles

(índice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny) es el

número de ml de una solución acuosa de álcali0,1N, requerido para neutralizar los ácidos grasosvolátiles solubles en agua de 5 g de grasa en lascondiciones que se especifican.

El índice de ácidos grasos volátiles insolubles(índice de Polenske) es el número de ml de solu-ción acuosa de álcali 0,1N, requerido para neutra-lizar los ácidos grasos volátiles insolubles enagua, obtenidos en 5 g de grasa, en las condicio-nes especificadas en el método.

Después de saponificar la grasa con una solu-ción de sodio hidróxido en glicerina, la soluciónjabonosa se diluye con agua y se acidifica conácido sulfúrico. Los ácidos grasos volátiles sedestilan y los ácidos grasos insolubles se separande los solubles por filtración. La solución acuosade ácidos solubles y la solución etanólica de áci-dos insolubles se valoran separadamente con unasolución de álcali normalizada.

El método es empírico porque sólo determinauna parte de estos ácidos. Por tanto, las especifi-caciones referentes al procedimiento y aparatosse deben seguir rigurosamente para obtenerresultados exactos y reproducibles.

78

APARATO DE DESTILACION

Figura 7.IDeterminación de los índices de Reichert y de Polenske

7.2. Material y aparatos (figura 7.I). 7.2.1. Matraz de fondo plano de vidrio al boro-

silicato de 300 ml de capacidad (A).7.2.2. Cabeza de destilación (E).7.2.3. Refrigerante (C).7.2.4. Receptor, que consiste en un matraz

aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y110 ml (D).

7.2.5. Lámina de asbesto de 120 mm de diá-metro, 6 mm de espesor con una abertura centralcircular de 40 a 50 mm de diámetro, para soste-ner el matraz durante el calentamiento (E).

7.2.6. Piedra pómez triturada que pasa a tra-vés de un tamiz de malla circular de 1,44 mm.

En la figura se representan las dimensiones enmm y el montaje del aparato de destilación; paralas conexiones se puede utilizar tapones de cau-cho, neopreno o silicona, o juntas de vidrio esme-rilado "estándar" 24/40.

7.3. Reactivos.181059 Acido Sulfúrico 0,5 mol/l (1N) SV131074 Agua PA-ACS131085 Etanol 96% v/v PA171327 Fenolftaleína solución 1% RE141339 Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-

CODEX211456 Piedra Pomez gránulos QP131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO181694 Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) SV

7.3.1. Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX(d = 1,26; 98% p/p).

7.3.2. Solución acuosa de Sodio Hidróxido(44% p/p). Usese Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO y disolver convenientemente con AguaPA-ACS. Conservar en botella protegida del dióxi-do de carbono. Usar la porción limpia libre de pre-cipitado de carbonatos.

7.3.3. Agua PA-ACS, hervida durante 15 minu-tos, para eliminar el dióxido de carbono.

7.3.4. Solución de Acido Sulfúrico 0,5 mol/l(1N) SV.

7.3.5. Solución acuosa de Sodio Hidróxido 0,1mol/l (0,1N) SV (o Potasio Hidróxido 0,1N), exac-tamente normalizada.

7.3.6. Solución indicadora de Fenolftaleínasolución 1% RE.

7.3.7. Etanol 96% v/v PA neutro a la Fenolfta-leína. El agua usada debe ser destilada o de unapureza por lo menos equivalente.

7.4. Procedimiento.7.4.1. Preparación de la muestra. Como en

5.4.1.7.4.2. Determinación del índice de ácidos gra-

sos volátiles solubles: Pesar 5 g con aproximaciónde 0,01 g de grasa en el matraz A. Añadir 20 g (16ml) de Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX y 2

ml de solución de Sodio Hidróxido (44%). Paraañadir la solución de Sodio Hidróxido, usar unabureta protegida de la entrada de dióxido de car-bono y limpiar la punta de la bureta desechandolas primeras gotas. Calentar el matraz a fuegodirecto, evitando sobrecalentar y agitando conti-nuamente hasta que el líquido no forme espuma yse vuelva límpido. Dejar enfriar el matraz hasta90ºC. Añadir 90 ml de Agua PA-ACS reciente-mente hervida a la misma temperatura aproxima-damente y mezclar. El líquido debe quedar límpi-do. Añadir de 0,6 a 0,7 g de Piedra Pómez QP ydespués 50 ml de solución de Acido Sulfúrico 0,5mol/l (1N) SV. Conectar inmediatamente el matrazal aparato de destilación y calentarlo ligeramentehasta que los ácidos grasos libres formen unacapa superficial limpia. Empezar a calentar y regu-lar la llama de modo que se recojan en el matrazaforado 110 ml de destilado en 19-21 minutos,tomando como principio del periodo de destila-ción el momento en que se forma la primera gotaen el refrigerante. Regular el flujo de agua del refri-gerante de modo que se mantenga la temperatu-ra del agua que sale del refrigerante a 20º ± 1ºC.

Cuando se hayan recogido exactamente 110ml de destilado, quitar el mechero inmediatamen-te y sustituir el matraz aforado por un pequeñovaso. Mezclar el contenido del matraz aforadoagitando suavemente y sumergir el matraz en unbaño de agua a 20º ± 1ºC durante 10-15 minutos,estando la señal de 110 ml del matraz aforado pordebajo del nivel del agua del baño. Agitar elmatraz de cuando en cuando. Tapar el matraz ymezclar invirtiéndolo 4 o 5 veces sin agitar. Filtrarlos 110 ml de destilado por un papel filtro seco develocidad media (diámetro 80-90 mm), que seajusta cómodamente en un embudo. El filtradodebe ser límpido (el filtro debe ser de tales dimen-siones, que un volumen de 15 ml lo llene comple-tamente). Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos aun matraz Erlenmeyer de 300 ml, añadir 0,5 ml dela solución indicadora de Fenolftaleína solución1% RE y valorar con la solución acuosa de álcali"estándar" 0,1N hasta un color rosa persistentedurante 0,5-1 minuto.

7.4.3. Ensayo en blanco: Hacer un ensayo enblanco sin grasa y en lugar de saponificar a fuegodirecto calentar en baño de agua hirviendo duran-te 15 minutos.

No se requerirán para la valoración más de0,5 ml de la solución de álcali normalizada. Enotro caso, se deben preparar nuevas solucionesdel reactivo.

7.4.4. Determinación del índice de ácidos gra-sos volátiles insolubles (Polenske): Lavar el filtrocon tres porciones sucesivas de 15 ml de AguaPA-ACS a la temperatura de 20º ± 1ºC, habiendopasado previamente cada una a través del refrige-rante del vaso pequeño y del matraz aforado.

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M

Poner el embudo y el filtro en el cuello de unmatraz cónico, limpio y seco, de 200 ml de capa-cidad. Disolver los ácidos grasos insolubles repi-tiendo los lavados, usando ahora porciones de15 ml de Etanol 96% v/v PA. Valorar con la solu-ción acuosa de álcali normalizada (0,1N) el con-junto de los lavados con Etanol 96% v/v PA usan-do 0,5 ml de solución indicadora de Fenolftaleínasolución 1% RE, hasta un color rosa persistentedurante 0,5-1 minuto.

7.5. Cálculo.7.5.1. Indice de ácidos grasos volátiles solu-

bles (índice de Reichert).

Indice de Reichert = 11 . t . (V1 - b)

Siendo:V1 = volumen en mililitros de la solución norma-

lizada (0,1N) de álcali, utilizados en la valoraciónde la muestra.

b = volumen en mililitros de la solución norma-lizada (0,1N) de álcali, utilizados en el ensayo enblanco.

t = normalidad exacta de la solución normaliza-da (0,1N) de álcali.

Redondear el resultado a la primera cifra deci-mal.

7.5.2. Indice de ácidos grasos volátiles insolu-bles (índice de Polenske).

Indice de Polenske = 10 . t . V2

Siendo:V2 = volumen en militros de la solución norma-

lizada (0,1N) de álcali utilizada en la valoración dela muestra.

t = normalidad exacta de la solución normaliza-da (0,1N) de álcali.

Redondear el resultado a la primera cifra deci-mal.

7.5.3. Reproducción de resultados: La diferen-cia entre los resultados de dos determinacionesduplicadas (resultados obtenidos simultáneamen-te o inmediatamente uno detrás de otro por elmismo analista) no debe exceder de 0,5 para elíndice de Reichert o de 0,3 para el índice dePolenske.

7.6. Referencia.7.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 37: 1966.

8. INDICE DE KIRSCHNER

Reactivos.131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131188 Bario Hidróxido 8-hidrato PA171327 Fenolftaleína solución 1% RE

141801 Plata Sulfato PRS182415 Sodio Hidróxido 1 mol/l (1N) indicador:

Fenolftaleína SV

8.1. Método operatorio.1º Neutralizar 100 ml del destilado Reichert-

Meissl con solución de Bario Hidróxido 0,1N, (pre-parada a partir de Bario Hidróxido 8-hidrato PA),con toda precisión hasta lograr un débil colorrosado empleando 0,5 ml del indicador. Realizar latitulación en un matraz cerrado para evitar laabsorción de CO2.

2º Añadir 0,3 g de Plata Sulfato PRS en formade polvo fino. Dejar reposar la mezcla una hora,agitando con frecuencia y filtrándola después.

3º Recoger 100 ml del filtrado, colocarlo en unfrasco de destilación de 300 ml, añadir 35 ml deAgua PA-ACS y 10 ml de Acido Sulfúrico diluido.Añadir un trozo de alambre de aluminio o variostrozos de Piedra Pómez para evitar que el líquidorebose. Unase al destilador y comiéncese la des-tilación a la velocidad de 110 ml en unos 20 mi-nutos.

4º Después de recoger 110 ml del destilado, fil-trar esta cantidad total y titular 100 ml con SodioHidróxido 1 mol/l (1N) indicador: Fenolftaleína SV,empleando 0,5 ml de Fenolftaleína solución 1%RE hasta lograr un tono rosado que persistadurante 2-3 minutos.

5º Preparar y realizar una prueba en blancosemejante a la anterior en todos sus aspectos.

8.2. Cálculo.

A · 121 · (100 + B)Valor de Kirschner = ––––––––––––––––––––––

10.000

A = titulación de la muestra - titulación en blan-co.

B = volumen, en ml, de bario hidróxido 0,1N,requeridos para neutralizar los 100 ml originalesdel destilado de Reichert-Meissl.

8.3. Referencia.8.3.1. Norma Internacional AOCS 5-40.

9. ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA

9.1. Principio.Obtención de los ésteres metílicos de los áci-

dos grasos mediante reacción con una soluciónde potasio hidróxido en alcohol metílico y subsi-guiente inyección directamente de la disolución deésteres metílicos en el cromatógrafo.

El método es aplicable a las grasas de mante-quillas u otras que contengan ácidos grasos de

80

longitud de cadena inferior al C14 y siempre que elcontenido de ácidos libres no exceda de 1%expresados en ácido oleico.

9.2. Material y aparatos9.2.1. Matraces con boca esmerilada y fondo

redondo de 50 y 100 ml de capacidad.9.2.2. Pipetas aforadas de 1,2 y 10 ml.9.2.3. Matraces aforados de 50 y 100 ml de

capacidad. 9.2.4. Probeta graduada de 10 ml. 9.2.5. Jeringa de características adecuadas

para la inyección de la muestra, graduada en déci-mas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.

9.2.6. Cromatógrafo apto para trabajar en fasegaseosa, provisto de horno capaz de ser calenta-do hasta 250-300ºC y sistema de regulación quepermita controlar la temperatura con un error de±1,0ºC. Equipado con programador de tempera-tura capaz de llevar la temperatura del horno de60ºC a 180ºC a una velocidad de 4ºC/min. Pro-visto de regulación independiente de la tempera-tura del inyector, que podrá ser calentado a unatemperatura superior por lo menos en 50º a lamáxima alcanzable por el horno provisto de unsistema de detección sensible, de ionización dellama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a latemperatura de la columna, a unos 50ºC por enci-ma de la del horno.

9.2.7. Registrador con una tensión de entradaadecuada a la salida del amplificador del croma-tógrafo, con una velocidad de respuesta mínimacapaz de producir la deflexión completa de laescala en un segundo; y una velocidad de despla-zamiento del papel de 5 mm/min, que permita laposibilidad de variar esta velocidad, acelerando oretardando el desplazamiento.

9.2.8. Tubo de nitrógeno a presión, utilizablecomo gas portador, debiendo tener una riquezamínima del 99,8%.

9.2.9. Tubos de hidrógeno y aire a presiónnecesarios para el caso en que se utilice detectorde llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá teneruna riqueza mínima del 99,8%, debiendo estarseco. Como medida de seguridad, es muy conve-niente colocar a la entrada de los gases en el cro-matógrafo, sendos tubos de desecación, provis-tos de tamiz molecular 13X.

9.2.10. Columna cromatográfica.9.2.10.1. Columna que satisfaga las condicio-

nes que se indican en 9.6.1.9.2.10.2. Columna de vidrio con diámetro inte-

rior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm.Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100mallas), conteniendo de 2,5 a 5 por 100 de unpoliéster, recomendándose cualquiera de los tressiguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS); etilen-glicolsuccinato o adipato (EGS o EGA); polietilen-glicoladipato (PEGA).

Antes de emplear una columna nueva en laresolución de problemas analíticos, debe seracondicionada, eliminando todos aquellos pro-ductos volátiles que perturbarían la marcha de lacromatografía. Para ello, se monta en el croma-tógrafo, sin conectarla al detector, y se calientael horno a unos 10ºC por encima de la tempera-tura máxima a que vaya a ser utilizada la colum-na en trabajos posteriores; haciendo pasar almismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30a 40 ml/minuto, que se mantiene durante veinti-cuatro horas como mínimo. La columna seráapta para su utilización si, una vez conectada aldetector y en funcionamiento normal, la líneabase dibujada por el registrador acusa la estabi-lidad del sistema.

9.3. Reactivos.131091 Metanol PA-ACS-ISO131315 Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO132062 n-Heptano PA131515 Potasio Hidróxido 85% lentejas PA

9.3.1. Metanol PA-ACS-ISO.9.3.2. Potasio Hidróxido 85% lentejas PA.9.3.3. Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO o

n-Hexano PA. Eter de Petróleo (p. ej: 40-60ºC),cuyo contenido en Benceno no sea superior a0,1%. n-Hexano, que cumpla las mismas especi-ficaciones del Eter de Petróleo.

9.3.4. n-Heptano PA, con una riqueza mínimadel 99%.

9.3.5. Disolución de Potasio Hidróxido 2N enMetanol. Disolver 11,2 g de Potasio Hidróxido85% lentejas PA en 100 ml de Metanol PA-ACS-ISO.

9.3.6. Esteres metílicos de pureza adecuadapara su utilización como patrones en cromatogra-fía gaseosa.- Se dispondrá de los ésteres metíli-cos de los ácidos mencionados a continuación,debiendo tener una pureza mínima de 99%, deter-minada por cromatografía gaseosa:

Acido butanoico (butírico).Acido pentanoico (valeriánico).Acido hexanoico (caproico).Acido octanoico (caprílico).Acido decanoico (cáprico).Acido dodecanoico (láurico).Acido tetradecanoico (mirístico).Acido hexadecanoico (palmítico).Acido octadecanoico (esteárico).Acido 9-octadecanoico (oleico).Acido 9,12-octadecadienoico (linoleico).Acido sicosanoico (aráquico).9.3.7. Solución de referencia I.- En un matraz

aforado de 50 ml se pesa, con exactitud de ± 0,1mg, 1 g de Metilo Pentanoato, disolviéndolo en n-Heptano PA y completando hasta el enrase.

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M

9.3.8. Solución de referencia II.- En un matrazaforado de 100 ml se pesa, con exactitud de ± 0,1mg, 200 g de Metilo Pentanoato, disolviéndolo enn-Heptano PA y completando hasta el enrase.

9.4. Procedimiento.9.4.1. Preparación de los ésteres metílicos.En un matraz de fondo redondo de 50 ml,

pesar con exactitud de ± 0,1 mg, 1 g de grasa.Añadir 10 ml de Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISOo n-Hexano PA y agitar suavemente hasta disolu-ción de la grasa.

En el caso de que se quiera efectuar una deter-minación cuantitativa de los Acidos Butírico yCaproico en la muestra, agregar a la disolución enEter de Petróleo de la grasa 1 ml, exactamentemedido, de la solución de referencia más adecua-da; para muestras conteniendo de 1-4% de AcidoButírico se utilizará la solución de referencia I; paramuestras conteniendo menos de 1% de AcidoButírico se utilizará la solución de referencia II.

Si se desea efectuar solamente un análisiscompleto de la fracción de ácidos grasos, para loque se aplica el método de normalización interna,no será necesario el empleo de solución de refe-rencia.

A la solución de Eter de Petróleo de la muestra,adicionada o no de solución de referencia, agre-gar 0,5 ml de disolución de Potasio Hidróxido 2N.Agitar suavemente la mezcla hasta que se pongatransparente, para lo cual son suficientes unosveinte a treinta segundos. Casi inmediatamentedespués de observar la clarificación de la soluciónsuele apreciarse un enturbiamiento debido a laseparación de glicerol, que se sedimenta rápida-mente.

Inmediatamente después de terminada la reac-ción y observada la sedimentación, tomar la can-tidad necesaria con la jeringa e inyectar en el cro-matógrafo; una demora en la inyección de losésteres metílicos daría lugar a la formación dejabones, con error en la determinación.

9.4.2. Determinación cromatográfica.9.4.2.1. Condiciones de trabajo.Temperatura de la columna: Temperatura pro-

gramada de 60ºC a 160ºC, con una velocidad de4ºC/minuto.

Temperatura de inyector: 200ºC.Temperatura del detector: 200ºC.Gas portador: Nitrógeno (o helio) con un flujo

de 60 ml/min.Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación

del detector: Los flujos dependerán del tipo dedetector utilizado, debiendo determinarse previa-mente para optimizar la respuesta.

El registro obtenido del cromatograma debesatisfacer las condiciones que se indican a conti-nuación; caso contrario, se repite la inyecciónmodificando la cantidad inyectada o la sensibili-

dad de trabajo hasta obtener un cromatogramasatisfactorio.

Los requisitos exigibles son los siguientes:a) El área total descrita en el registro, referida a

la sensibilidad máxima utilizada en el curso de laoperación, debe ser de un orden aproximado de2.000 mm2 con una velocidad del papel en elregistrador de 5 mm/min. De esta forma, los com-ponentes presentes en una cuantía del 0,1%deben dar un pico, como mínimo, de 2 mm2, sien-do, por tanto, perfectamente reconocibles.

b) Con el fin de conseguir que todos los picoscaigan dentro del papel registrador, se utilizará, encada caso, la atenuación de sensibilidad que seanecesaria, cuidando que el pico de mayor intensi-dad no sea atenuado más de ocho veces.

Una vez conseguido un registro satisfactorio, yhabiendo alcanzado nuevamente la pluma la líneabase, se interrumpe el funcionamiento del regis-trador y se retira el papel con el registro para laidentificación de los picos y/o cálculos cuantitati-vos.

9.4.2.2. Identificación de los picos.- Se segui-rán los criterios establecidos en el apartado 9.6.2.

9.4.2.3. Determinaciones cuantitativas.- Ladeterminación cuantitativa se basa en el principiode que los pesos de cada uno de los componentesseparados en la mezcla son proporcionales a lasáreas comprendidas dentro de los triángulos dibu-jados debajo de cada pico. El área de cada trián-gulo se obtiene trazando rectas tangentes a laslíneas dibujadas en el registro, prolongándolashasta su intersección con la línea base y multipli-cando la altura del triángulo por la mitad de la base.En el caso de haber trabajado con atenuacionesdiferentes para cada pico, se referirán todas lasmedidas a una misma sensibilidad del registrador,multiplicando la altura por el factor de atenuacióncorrespondiente en cada caso, y el valor de la altu-ra así corregida por la mitad de la base.

9.4.3. Determinación del contenido de los Aci-dos Butírico y Caproico en la materia grasa.- Estadeterminación se realiza por el método del patróninterno, siendo el patrón elegido el metilo penta-noato.

9.4.3.1. Preparación de la mezcla de calibra-ción. Con una exactitud de ± 0,1 mg y en unmatraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg decada uno de los siguientes patrones: metilo buta-noato, metilo pentanoato y metilo caproato. Sedisuelve la mezcla de n-Heptano y se diluye com-pletando hasta el enrase.

Inyectar la cantidad necesaria de la soluciónanterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, traba-jando a la sensibilidad media del aparato, se con-siga situar los máximos de los picos en una posi-ción del 70-80% del recorrido total de la pluma delregistrador. Los tres picos deberán registrarse a lamisma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá

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la solución anterior con n-Heptano en la relaciónnecesaria para poder ajustarse a las prescripcio-nes fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determi-naciones consecutivas, que no deben discreparentre sí más del 1%.

9.4.4. Análisis cuantitativo de la totalidad de loscomponentes de la fracción de ácidos grasos,comprendiendo del C4 al C20 y C18:3.

9.4.4.1. Preparación de la mezcla de calibra-ción.- Determinar previamente el factor de correc-ción para cada ácido componente de la mezcla,referido a uno cualquiera de ellos que se tomacomo patrón, eligiéndose normalmente para estefin el Acido Palmítico, y, debiendo tener la mezclade calibración una composición análoga a la de lamezcla problema.

Para ello, si no se conoce previamente el ordende composición del problema, se realizará unadeterminación cromatográfica de orientación, rea-lizándose en el registro la cuantificación de loscomponentes suponiendo el mismo factor de res-puesta para todos ellos, efectuando un repartoproporcional entre las áreas medias.

En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con unaexactitud de ± 0,1 mg, cantidades de los ésteresmetílicos patrones que se indican a continuaciónproporcionales a las cifras de composición encon-tradas en el análisis de orientación anteriormentealudido, o previstas con anterioridad para lamuestra. Los patrones que deben pesarse son lossiguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato,metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dode-canoato, metilo tetradecanoato; metilo hexadeca-noato, metilo octadecanoato, metilo oleato, meti-lo linoleato y metilo eicosanoato. Se disuelve lamezcla de n-Heptano agregando la cantidad ade-cuada de disolvente en relación al peso total deésteres metílicos que se hayan pesado; para unos500 mg en total, se deben emplear, como orienta-ción, unos 50 ml de n-Heptano PA. A continua-ción, inyectar 0,2-0,4 µl para que, trabajando a lasensibilidad media del aparato, se consiga situarel máximo del pico correspondiente al componen-te mayoritario, en una posición del 70-80% delrecorrido total de la pluma del registrador. Todoslos picos deben registrarse a la misma sensibili-dad, lo cual suele ser perfectamente factible en lagrasa de leche; en aquellos casos en que la rela-ción entre el pico mayoritario y el pico minoritariono permita registrar éste último con las dimensio-nes adecuadas para efectuar una cuantificacióncorrecta de su área, se podrá efectuar el cambionecesario en la atenuación del registro, procuran-do que ésta no sobrepase la relación de 4:1. Sifuese necesario, se diluirá la solución con n-Hep-tano en la relación necesaria para poder ajustarsea las prescripciones fijadas. Efectuar, cuandomenos, tres determinaciones consecutivas, queno deben discrepar entre sí más del 1%.

9.5. Cálculo.9.5.1. Cálculo de los factores de corrección

para los ácidos butírico y caproico. Se determinanlas áreas de los tres picos, siguiendo las normasque se contienen en el apartado 5.4., y se calcu-lan los dos factores correspondientes al C4 y C6,con la fórmula siguiente:

x · Apfx = ––––––––––

P · Ax

Siendo:f = factor de corrección del ácido x.x = cantidad pesada del ácido x.Ap = área medida en el registro para el patrón

de pentanoato.Ax = área medida en el registro para el ácido x.P = peso del patrón pentanoato.

9.5.2. Cálculo del contenido de ácidos.- Loscontenidos de ácido butírico y ácido caproico enla muestra de grasa se calculan por la fórmulasiguiente:

fx · Ax · PPorcentaje de ácido = –––––––––––– · 100

Ap · M

fx = factor de corrección determinado paracada ácido, según se indica en el párrafo anterior.

Ax = área medida en el registro para el ácido.P = peso del patrón interno (pentanoato).Ap = área medida en registro para el patrón

interno.M = peso de la muestra de grasa.9.5.3. Cálculo de los factores de corrección.-

Una vez determinadas las áreas de todos lospicos, siguiendo las normas que se contienen enel apartado 9.4.2.2., se calcula el factor de cadaácido, referido al ácido palmítico tomado comounidad, utilizando la fórmula que se incluye en elapartado 9.5.1., sustituyendo el área Ap y el pasoP del compuesto patrón por los valores corres-pondientes al metilo palmitato.

9.5.4. Cálculo de composición de la fracciónde ácidos grasos.- Se calcularán las áreas corre-gidas de cada uno de los componentes de la frac-ción multiplicando el área medida en el registropor el factor de corrección determinado según seindica en el apartado anterior. El contenido decada componente vendrá dado por la expresión:

fx · AxPorcentaje X = ––––––––––––– · 100

S (fx · Ax)

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M

Siendo:fx = factor de corrección del componente x.Ax = área medida en el registro para el compo-

nente x.S (fx · Ax) = suma de todas las áreas corregidas

correspondientes a los componentes de la frac-ción.

9.6. Observaciones.9.6.1. La puesta a punto de la columna se

determina obteniendo la resolución de dos pro-ductos críticos como son el metilo oleato y el es-tearato. La resolución viene determinada por laexpresión:

2DResolución = ––––––––

O + E

Siendo:D = distancia entre los dos máximos de los

picos del oleato y el estearato.O = ancho de la base del pico correspondiente

al oleato.E = ancho de la base del pico correspondiente

al estearato.Estos valores se determinan sobre el cromato-

grama obtenido con una muestra conteniendocantidades aproximadamente iguales de metiloestearato y oleato, inyectando una cantidad talque la altura de estos picos alcance al 25-50% delancho del papel de registro. Si la resolución cal-culada es igual o mayor que 1,0 la columna y elinstrumento se encuentran en condiciones satis-factorias. Todas las columnas en el transcurso desu utilización sufren una pérdida gradual en laresolución de los picos; cuando el valor llegue aser inferior a 1,0, deberá instalarse una nuevacolumna.

9.6.2. Para la identificación de los picos sepueden seguir dos criterios:

9.6.2.1. Criterio basado en los tiempos deretención.- Refiriéndose exclusivamente a los áci-dos que entran normalmente en la composiciónde las grasas naturales, sus ésteres aparecen enel cromatograma en orden creciente de sus áto-mos de carbono y a su insaturación. Esto es, elpalmítico (C16) aparece delante del estéarico (C18),y los ésteres en C18 aparecen en el orden estea-rato, oleato, linoleato y linolenato. El éster delácido aráquico (C20:0), usualmente, aparece antesdel linolénico (C18:3), pero puede ocurrir lo contra-rio en algunos casos, dependiendo del tipo decolumna y de las condiciones de su utilización, oincluso superponerse el uno al otro.

Operando en condiciones constantes, los tiem-pos de retención son reproductibles en cadaespecie química, siendo el criterio más frecuenteempleado para su identificación.

El tiempo de retención viene dado por la dis-tancia, medida en el cromatograma, entre el máxi-mo del pico del aire y la posición del máximo de labanda. Trabajando con detector de llama dehidrógeno, la salida del aire no se detecta, pudién-dose tomar, en este caso, el momento en que seinicia la salida del disolvente, acusada por unafuerte deflexión de la pluma del registrador.

9.6.2.2. Criterio basado en los tiempos deretención relativos. Los tiempos de retención rela-tivos son más reproductibles. Las retencionesrelativas vienen determinadas por el cociente dedividir el tiempo de retención de cada pico por eltiempo registrado para el pico del metilo palmita-do, o bien por otro éster que se tome como com-paración, determinados todos ellos según el crite-rio expuesto en el párrafo anterior.

9.7. Referencia.9.7.1. Instituto de Racionalización y Normaliza-

ción del Trabajo. Una Norma Española 55.118.

10. EXTRACCION DE LA GRASA ENMANTEQUILLA

10.1. Principio.Separación de las fases acuosa y grasa

mediante fusión, decantación y filtración.

10.2. Material y aparatos.10.2.1. Estufa de desecación.

10.3. Procedimiento.Tomar aproximadamente 50 g de la muestra de

mantequilla en una cápsula de porcelana e intro-ducirla en una estufa de desecación a una tempe-ratura entre 45ºC y 50ºC hasta separación de lasfases acuosa y grasa. Separar la capa grasa pordecantación y filtrar a través de papel de filtroseco, evitando que pase la fase acuosa, mante-niendo una temperatura de unos 40ºC.

10.4. Referencias.1. Norma Internacional FIL-IDF 32: 1965.

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Queso

M

I ORDEN DE 29 DE NOVIEMBRE DE1985 POR LA QUE SE APRUEBAN LASNORMAS DE CALIDAD PARA QUESOS YQUESOS FUNDIDOS DESTINADOS ALMERCADO INTERIOR (B.O.E. 6-12-1985).

Excelentísimos señores:De conformidad con lo establecido en el Decre-

to 1043/1973, de 17 de mayo por la que se regu-la la normalización de productos ganaderos en elmercado interior, y teniendo en cuenta los Decre-tos de Presidencia del Gobierno 2481/1967, de21 de septiembre, por el que se aprueba el textodel Código Alimentario Español y el 2519/1974,de 9 de agosto, sobre su entrada en vigor, aplica-ción y desarrollo, parece oportuno dictar las pre-sentes Normas Generales de Calidad para Que-sos y Quesos Fundidos.

En su virtud, previo informe de la ComisiónInterministerial para la Ordenación Alimentaria, deconformidad con los acuerdos del FORPPA y apropuesta de los Ministros de Economía y Hacien-da, de Agricultura, Pesca y Alimentación y deSanidad y Consumo, esta Presidencia del Gobier-no dispone:

Artículo único: Se aprueban las Normas Gene-rales de Calidad para Quesos y Quesos Fundidoscon destino al mercado interior, que se recogen,respectivamente, en los anejos 1 y 2 de estaOrden.

Disposición final.La presente Orden entrará en vigor en todo el

territorio del Estado español el 1 de enero de1986.

Disposiciones adicionalesPrimera.- Las determinaciones analíticas se

realizarán de acuerdo con los métodos oficialesvigentes.

Segunda.- Los Departamentos competentesvelarán por el cumplimiento de lo dispuesto en lapresente Orden a través de sus órganos adminis-trativos encargados, que coordinarán sus actua-ciones; en todo caso, sin perjuicio de las compe-tencias que correspondan a las ComunidadesAutónomas y a las Corporaciones Locales.

Disposición derogatoriaA la entrada en vigor de la presente Orden que-

dan derogadas cuantas disposiciones de igual oinferior rango se opongan a los aspectos que lamisma regula y, de forma específica, los incluidosen las siguientes disposiciones:

Ordenes del Ministerio de Agricultura, de 27 dejulio de 1970 ("Boletín Oficial del Estado" de 5 deagosto); de 9 de abril de 1975 ("Boletín Oficial delEstado" del 18); de 24 de noviembre de 1975("Boletín Oficial del Estado" de 2 de diciembre); de

22 de julio de 1977 ("Boletín Oficial del Estado"del 30); de 17 de abril de 1978 ("Boletín Oficial delEstado" del 27), y Resolución de la DirecciónGeneral de Industrias Agrarias de 26 de octubrede 1977 ("Boletín Oficial del Estado" de 8 denoviembre).

Lo que comunico a VV. EE. para su conoci-miento y efectos. Madrid, 29 de noviembre de1985.

MOSCOSO DEL PRADO Y MUÑOZ

Excmos. Sres. Ministros de Economía yHacienda; de Agricultura, Pesca y Alimentación, yde Sanidad y Consumo.

ANEJO INorma general de calidad para quesoscon destino al mercado interior

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma General de Calidad para Quesos.

2. OBJETO DE LA NORMA

La presente norma tiene por objeto definiraquellas condiciones y características que debenreunir los quesos para su comercialización y con-sumo en el mercado interior.

3. AMBITO DE APLICACION

La presente norma general abarca a todos losquesos destinados a su comercialización en elmercado interior.

Podrán estipularse requisitos más específicosen normas individuales o de grupo de quesos, encuyo caso se aplicarán dichos requisitos a lavariedad particular o grupo de quesos en cues-tión, con independencia a lo establecido concarácter general por la presente disposición.

4. DEFINICION

Se entiende por queso el producto fresco omaduro, sólido o semisólido, obtenido por sepa-ración del suero después de la coagulación de laleche natural, de la desnatada total o parcialmen-te, de la nata, del suero de mantequilla o de unamezcla de algunos o de todos estos productospor la acción del cuajo u otros coagulantes apro-piados, con o sin hidrólisis previa de la lactosa.

Asimismo, se entiende por queso el consegui-do mediante técnicas de elaboración que com-prendan la coagulación de la leche y/o de mate-

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rias obtenidas de la leche y que den un productofinal que posea las mismas características del pro-ducto definido en el párrafo anterior y siempre quela relación entre la caseína y las proteinas séricassea igual o superior a la de la leche.

5. DENOMINACIONES

5.1. Todos los productos denominados"queso" o que utilicen el nombre de alguna varie-dad de queso deberán ajustarse a las disposicio-nes de esta norma general.

Los quesos que no tengan una denominaciónconcreta o aquéllos que aun teniéndola no esténprotegidos por una norma individual de composi-ción y características específicas, que se fabri-quen con leche de oveja, leche de cabra o conmezclas de ambas entre sí y con la de vaca,deberán incluir en su denominación, después dela palabra "queso" o del nombre de la variedad deque se trate, la indicación de la especie o espe-cies animales de las que proceda la leche emple-ada por orden descendente de proporciones, encaracteres claros y legibles, de las mismas dimen-siones que las utilizadas en el resto de la denomi-nación.

Para que un queso pueda ostentar una deno-minación distinta habrá de hacerlo al amparo de lacorrespondiente norma individual de calidad; trassu aprobación y publicación en el "Boletín Oficialdel Estado".

5.2. Atendiendo a su maduración, los quesosse denominarán de la siguiente forma:

5.2.1. Queso curado o madurado: Es el que,tras el proceso de fabricación, requiere mantener-se durante cierto tiempo a una temperatura y encondiciones tales que se produzcan los cambiosfísicos y/o químicos necesarios y característicosdel mismo.

5.2.2. Queso curado o madurado con mohos:Es aquél en el que el curado se ha producido prin-cipalmente como consecuencia del desarrollocaracterístico de mohos en su interior y/o sobre lasuperficie del mismo.

5.2.3. Queso fresco: Es el que está dispuestopara el consumo al finalizar el proceso de fabrica-ción.

5.2.4. Queso blanco pasterizado: Es aquelqueso fresco en el que el coágulo obtenido sesomete a un proceso de pasterización de "72ºC"durante dieciséis segundos u otras combinacio-nes de temperatura y tiempo de efecto equivalen-te, quedando dispuesto para el consumo al finali-zar su proceso de fabricación.

5.3. De acuerdo con su contenido en grasa lác-tea, expresado en porcentaje masa/masa sobre elextracto seco lácteo, los quesos se denominarán:

-Extragraso: El que contenga un mínimo de60%.

-Graso: El que contenga un mínimo del 25 ymenos del 60%.

-Semigraso: El que contenga un mínimo del 25y menos del 45%.

-Semidesnatado: El que contenga un mínimodel 10 y menos del 25%.

-Desnatado: El que contenga menos del 10%.

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. Ingredientes esenciales.6.1.1. Leche, leche desnatada total o parcial-

mente, nata, suero de mantequilla o una mezclade algunos o de todos estos productos.

6.1.2. Otras materias obtenidas de la leche yque sean propias de su composición.

6.1.3. Cuajo animal o vegetal.

6.2. Ingredientes facultativos.6.2.1. Sodio cloruro, en dosis limitadas por la

buena práctica de su fabricación.6.2.2. Sustancias aromáticas naturales e idén-

ticas naturales, especias, aderezos vegetales yotros ingredientes naturales que no procedan dela leche y se hallen autorizados en proporción sufi-ciente para caracterizar el producto, pero inferioral 30% en masa/masa expresado sobre el pro-ducto terminado, y que en la denominación delproducto se declare la presencia de la sustanciaañadida, "queso con..." (aquí el nombre de dichasustancia).

6.2.3. Sacarosa, dextrosa y glucosa, solas o encombinación, exclusivamente en quesos frescos yquesos blancos pasterizados en dosis no superioral 17% masa/masa, quedando incluido este por-centaje en el indicado en el apartado 6.2.2.

6.2.4. Leche en polvo para el ajuste del extrac-to seco lácteo en porcentaje máximo del 5%masa/masa, sobre dicho extracto.

6.2.5. Gelatina, en cantidad máxima de 5 g/kgde queso y solamente en quesos frescos y que-sos blancos pasterizados.

Cuando además de la gelatina se utilicen esta-bilizantes de los contenidos en el apartado 7.3.3.,la cantidad máxima total será de 5 g/kg de queso,sin que los estabilizantes sobrepasen las dosisfijadas en dicho apartado.

6.3. Características físico-químicas.Las características físico-químicas de la grasa

estarán comprendidas entre los siguientes valo-res:

a) Para queso de vaca:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4540 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 1 a 4.Indice de Kirchner: De 19 a 27.

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b) Para queso de cabra:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4520 a

1,4545.Indice de Reichert: De 21 a 28.Indice de Polenske: De 5 a 9.Indice de Kirchner: De 14 a 21.c) Para queso de oveja:Indice de refracción de 40ºC: De 1,4530 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 5 a 8.Indice de Kirchner: De 19 a 27.En el caso de los quesos curados o maduros

con mohos, estos índices serán de aplicaciónsolamente durante las setenta y dos horassiguientes a la coagulación.

Para los quesos elaborados con leche de vaca,cabra y oveja, el límite mínimo de colesterol, den-tro de los esteroles, será de un 98% sobre la frac-ción esterólica del insaponificable determinadospor cromatografía gaseosa.

En todo caso la presencia de fitosteroles nodeberá considerarse aisladamente del conjuntode los índices físico-químicos anteriormente ex-puestos.

8. NORMA MICROBIOLOGICA YCONTAMINANTES

8.1. Norma microbiológica para quesos frescosy blancos pasterizados.

8.1.1. Toma, transporte y conservación demuestras.

La toma de muestras de los quesos frescos yquesos blancos pasterizados se hará por triplica-do, según la legislación vigente y de acuerdo conlos siguientes métodos:

a) Como norma general, se tomarán cinco uni-dades del mismo lote, para cada uno de los tresejemplares de la muestra. Cada unidad estaráconstituida por un envase original e íntegro cuan-do su contenido neto sea inferior a un kilogramo,y por porciones de 300 gramos aproximadamen-te, recogidas con utensilios estériles en recipien-tes asimismo estériles para piezas con contenidoneto igual o superior a un kilogramo.

b) Excepcionalmente, en los supuestos en queno fuese posible tomar el número de muestrasindicado en el apartado a), por falta de cantidadsuficiente de un mismo lote, se tomará una unidadpara cada ejemplar de muestra.

En ambos casos, en el acta de toma de mues-tras, deberán reflejarse las condiciones de con-servación y temperatura de la muestra, así comola fecha de caducidad o la de consumo preferen-te, debiendo reflejarse asimismo si la muestra hasido tomada de un envase íntegro o de envases abiertos.

El transporte de muestras y su conservaciónhasta el momento del análisis se realizará a unatemperatura no superior a 8ºC para que la mues-tra mantenga, en todo momento, las característi-cas adecuadas al objeto de no desvirtuar la finali-dad de aquél.

El análisis de los tres ejemplares deberá estariniciado antes de la fecha de caducidad del pro-ducto o, en su caso, de la de consumo preferen-te del mismo.

La porción de la muestra que se tome para lapráctica del análisis deberá ser representativa delconjunto de su respectiva unidad.

8.1.2. Tolerancias microbiológicas.Las tolerancias serán las indicadas en el cua-

dro siguiente:

n = número de unidades de muestra de un loteque se analizan según el programa de muestreoestablecido.

c = número de muestras que pueden rebasar ellímite m sin ser superior al límite M.

m = límite microbiológico que únicamente c delas n muestras pueden sobrepasar. Se admitepara este nivel una variabilidad:

² 3 m para medio sólido.² 10 m para medio líquido.

M = nivel límite de aceptabilidad. Los valoressuperiores a M no son aceptables.

Los valores de M se fijan en:

M = 10 m para medios sólidos.M = 30 m para medios líquidos.Para las muestras tomadas según el procedi-

miento b) del apartado 8.1.1. las tolerancias seránlas indicadas a continuación:

Enterobacteriáceas totales/g............ 1x104

E. coli/g........................................... 1x103

Staph. aureus enterotoxigénico/g..... 1x103

Salmonella o Shigella/25 g............... Ausencia

88

n c m M

Enterobacteriáceastotales/g .................. 5 2 1x103 1x104

E. coli/g ..................... 5 2 1x102 1x103

Staph. aureus enterotoxigénico/g ... 5 1 1x102 1x103

Salmonella oShigella/25 g ........... 5 0 0 —

8.2. Contaminantes.Las tolerancias de productos contaminantes y

sustancias tóxicas no deberán sobrepasar loslímites contenidos en la legislación vigente y, en sudefecto, en las normas internacionales aceptadaspor el Estado español, que velará por su cumpli-miento como garante de las mismas, con la deter-minación y exigencia de responsabilidades eneste punto por el órgano del Estado correspon-diente. El contenido máximo en nisina procedenteexclusivamente de cepas nisinógenas será de 100mg/kg de queso.

ANEJO 2

Norma General de Calidad para losQuesos Fundidos con destino almercado interior

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma General de Calidad para los QuesosFundidos.

2. OBJETO DE LA NORMA

La presente norma tiene por objeto definiraquellas condiciones y características que debenreunir los quesos fundidos para su comercializa-ción y consumo en el mercado interior.

3. AMBITO DE APLICACION

La presente norma abarca a todos los quesosfundidos destinados a su comercialización en elmercado interior.

4. DEFINICION

Se entiende por queso fundido el productoobtenido por molturación y/o mezcla, fusión yemulsión con tratamiento térmico de una o másvariedades de queso con o sin adición de agentesemulgentes, de leche y productos lácteos y deotros productos alimenticios.

5. DENOMINACIONES

En las denominaciones utilizadas para designarlos distintos quesos fundidos se cumplirán lascondiciones que se fijan a continuación, en el bienentendido que en todos los apartados de estepunto la expresión "extracto seco total" se refiereal producto terminado, descontando los ingre-dientes contemplados en 6.2.3.

5.1. De acuerdo con su contenido en grasa lác-tica, expresado en porcentaje en masa/masasobre el extracto seco total, los quesos fundidosse denominarán como sigue:

-Extragraso: El que contenga un mínimo del60%.

-Graso: El que contenga un mínimo del 45 ymenos del 60%.

-Semigraso: El que contenga un mínimo del 25y menos del 45%.

-Semidesnatado: El que contenga un mínimodel 10 y menos del 25%.

-Desnatado: El que contenga menos del 10%.

5.2. Cuando el producto contenga el mínimodel 50% masa/masa de extracto seco total, ladenominación será "queso fundido..." seguido delcalificativo que le corresponda, según la clasifica-ción del apartado 5.1.

5.3. Si dichas denominaciones se contemplancon la expresión "para untar" o "para extender", elextracto seco total será como mínimo del 40%masa/masa e inferior al 50% masa/masa sobre elproducto terminado en origen.

El mínimo del extracto seco total será del 25%masa/masa e inferior al 40% masa/masa en ori-gen, si en la denominación se incluye la expresión"queso blanco fundido... para untar" o "quesoblando fundido... para extender".

5.4. El queso fundido, cuya denominaciónincluya el nombre de una o más variedades dequeso, se designará de una de las siguientes for-mas: "queso(s)... y ... fundido(s)" o "queso(s) fun-dido(s) de... y..." y en su elaboración no podránemplearse otra u otras variedades de queso másque las especificadas, debiendo contener un míni-mo del 50% masa/masa de extracto seco total.

En el caso que en la denominación figurennombres de variedades de quesos, se indicarántodas ellas por orden decreciente de proporcio-nes, y la menor no deberá ser inferior a un 10%masa/masa del queso utilizado como materiaprima.

Si dichas denominaciones se contemplan conlas expresiones "para untar" o "para extender", elextracto seco total deberá ser, como mínimo, del40% masa/masa e inferior al 50% masa/masa.

En el caso que se completen con las de "blan-do fundido... para untar" o "blando fundido... paraextender", el extracto seco total deberá ser, comomínimo, del 25% masa/masa e inferior al 40%masa/masa.

En todos los casos, la materia grasa se ajusta-rá a las exigencias del apartado 5.1. de estanorma.

89

M

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. Ingredientes esenciales: Queso.6.2. Ingredientes facultativos:6.2.1. Nata, mantequilla y grasa de mantequilla

deshidratada, así como leche en polvo y, en gene-ral, sólidos lácteos. En cualquier caso la adiciónen todas estas materias primas viene limitada porel porcentaje de lactosa, que no excederá del 6%expresado en masa/masa sobre el producto ter-minado, descontando los ingredientes contempla-dos en 6.2.3.

6.2.2. Sodio cloruro en cantidades limitadaspor la práctica normal de fabricación.

6.2.3. Sustancias aromáticas naturales e idén-ticas naturales, especias, aderezos vegetales yotros ingredientes naturales no lácteos, autoriza-dos, con incidencia organoléptica apreciable,siempre que el extracto seco incorporado noexceda del 30% en masa del extracto seco totalexpresado sobre el producto terminado.

En la denominación del producto se declararála presencia de la sustancia o sustancias añadi-das, agregando las palabras "con..." (aquí, elnombre de dichas sustancias).

6.3. Características físico-químicas.6.3.1. Exclusivas para quesos fundidos sin adi-

ciones de las contempladas en el apartado 6.2.3.a) Para queso de vaca:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4540 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 1 a 4.Indice de Kirchner: De 19 a 27.b) Para queso de oveja:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4520 a

1,4545.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 5 a 8.Indice de Kirchner: De 19 a 27.c) Para queso de cabra:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4530 a

1,4547.Indice de Reichert: De 21 a 28.Indice de Polenske: de 5 a 9.Indice de Kirchner: De 14 a 21.Estos índices no son aplicables a los quesos

fundidos en cuya elaboración se hayan utilizadoquesos madurados por mohos. Para todos estosquesos, el límite mínimo de colesterol dentro delos esteroles será del 98% de la fracción esteróli-ca del insaponificable determinados por cromato-grafía gaseosa.

En todo caso, la presencia de fitosteroles nodeberá considerarse aisladamente del conjuntode los índices físico-químicos anteriormente ex-puestos.

6.3.2. Para quesos fundidos con adiciones delas contempladas en el apartado 6.2.3. se con-templará la posible modificación de los anterioresíndices en función de las transferencias que hayanpodido tener lugar y, en especial, de la grasa.

8. NORMA MICROBIOLOGICA YCONTAMINANTES

8.1. Norma microbiológica aplicable a los que-sos fundidos.

8.1.1. Toma, transporte y conservación demuestras.

La toma de muestras de los quesos fundidosse hará por triplicado, según la legislación vigentey de acuerdo con los siguientes métodos:

a) Como norma general, se tomarán cinco uni-dades del mismo lote para cada uno de los tresejemplares de la muestra. Cada unidad estaráconstituida por un envase original e íntegro.

b) Excepcionalmente, en los supuestos en queno fuera posible tomar el número de muestrasindicado en el apartado a) por falta de cantidadsuficiente de un mismo lote, se tomará una unidadpara cada ejemplar de la muestra.

En ambos casos, en el acta de toma de mues-tras deberán reflejarse las condiciones de conser-vación de la muestra y la fecha de consumo pre-ferente.

El análisis de los tres ejemplares deberá estariniciado antes de su fecha de consumo preferen-te.

La porción de la muestra que se tome para lapráctica del análisis deberá ser representativa delconjunto de su respectiva unidad.

8.1.2. Tolerancias microbiológicas. 8.1.2.1. Para quesos fundidos:

8.1.2.2. Para quesos fundidos rallados, quesosfundidos en polvo y quesos fundidos con losingredientes facultativos indicados en el epígrafe6.2.3. de esta norma.

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n c m M

Enterobacteriáceastotales/g .................. 5 2 1x102 1x103

E. coli/g................. 5 1 1 1x101

Staph. aureus enterotoxigénico/g ... 5 2 1 1x101

Salmonella oShigella/25 g ........... 5 0 0 —

n = número de unidades de muestra de un loteque se analizan según el programa de muestreoestablecido.

c = número de muestras que pueden rebasar ellímite m sin ser superior al límite M.

m = límite microbiológico que únicamente c delas n muestras pueden sobrepasar. Se admitepara este nivel una variabilidad:

² 3 m para medio sólido.² 10 m para medio líquido.M = nivel límite de aceptabilidad. Los valores

superiores a M no son aceptables.Los valores de M se fijan en:M = 10 m para medios sólidos.M = 30 m para medios líquidos.Para las muestras tomadas según el apartado

b) del apartado 8.1.1. las tolerancias serán lasindicadas a continuación:

Quesos fundidos:Enterobacteriáceas totales/g............ 1x103

E. coli/g........................................... 1x101

Staph. aureus enterotoxigénico/g..... 1x101

Salmonella o Shigella/25 g............... AusenciaQuesos fundidos rallados, quesos fundidos en

polvo y quesos fundidos con los ingredientesfacultativos indicados en el epígrafe 6.2.3. de lanorma:Enterobacteriáceas totales/g............ 1x103

E. coli/g........................................... 1x102

Staph. aureus enterotoxigénico/g..... 1x103

Salmonella o Shigella/25 g............... Ausencia

8.2. Contaminantes.Las tolerancias de productos contaminantes y

sustancias tóxicas no deberán sobrepasar los lími-tes contenidos en la legislación vigente y, en sudefecto, en las Normas Internacionales aceptadaspor el Estado español, que velará por su cumpli-miento como garante de las mismas con la deter-minación y exigencia de responsabilidades en estepunto por el órgano del Estado correspondiente.

NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados,9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12.Etiquetado y rotulación, 13. Especificaciones y 14.

Responsabilidades, publicados en este mismoB.O.E., no se han incluido en esta recopilaciónpor carecer de interés analítico.

II METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 30-8-1979 Y 30-10-1991)

0. TECNICA DE TOMA DE MUESTRA(B.O.E. 5-8-1970)

0.1. Ambito de aplicación.Las técnicas que se indican en este título, son

aplicables exclusivamente a los productos defini-dos como quesos y quesos fundidos.

Podrán estipularse técnicas específicas en nor-mas individuales o de grupos de quesos, en cuyocaso se aplicarán dichas técnicas a la variedadparticular o grupos de quesos en cuestión.

0.2. Toma de muestras.0.2.1. Materiales.Todos los materiales utilizados deberán estar

secos y limpios y no deberán comunicar olores nisabores extraños.

Podrán utilizarse los siguientes materiales:Sondas de forma y dimensiones apropiadas

para la clase de queso de la que ha de tomarse lamuestra.

Cuchillo de acero inoxidable con hoja puntia-guda.

Recipientes cilíndricos, de boca ancha, devidrio, metal inoxidable, materia plástica apropia-da o de otro material autorizado que satisfaga losrequisitos que posteriormente se señalan, concapacidad adecuada para el tamaño de la mues-tra. Podrán también utilizarse sacos de plásticoadecuados.

Los recipientes se cerrarán herméticamente,por medio de tapones de caucho o plástico, omediante cápsulas de metal o de materia plásticaque cierren a rosca y que estén provistos interior-mente, si fuera necesario, de un revestimientoplástico, impermeable a los líquidos, insoluble, noabsorbente e inatacable por las grasas y que nopueda transmitir olor ni sabor.

0.2.2. Técnica.Se tomará un número suficiente de muestras

parciales para que el peso de la muestra total seapor lo menos de 50 g.

Según la forma, peso, clase y madurez delqueso, se aplicará una de las técnicas siguientes:

Mediante cuchillo.Mediante sonda.Utilización de una pieza entera.Toma de muestra de queso en salmuera.El primer método es preferible respecto al

segundo, pero éste es aceptable especialmentecuando se trata de quesos de pasta dura de grantamaño.

91

M

n c m M

Enterobacteriáceastotales/g .................. 5 2 1x102 1x103

E. coli/g ................... 5 2 1x101 1x102

Staph. aureus enterotoxigénico/g ... 5 1 1x102 1x103

Salmonella oShigella/25 g ........... 5 0 0 —

Para los quesos fundidos en porciones o lon-chas, en tubos o vasos, en polvo o rallados, asícomo para los quesos preenvasados y los depequeño tamaño, se utilizará el tercer procedi-miento.

a) Toma de muestra mediante cuchillo.Con ayuda de un cuchillo de hoja puntiaguda,

se darán dos cortes radiales desde el centro delqueso, si éste tiene base circular, o paralelo a loslados, si la base del queso o del queso fundido esrectangular o cuadrangular.

El tamaño del trozo así obtenido deberá ser tal,que después de haber retirado la capa superficialno comestible, la parte restante no tenga un pesoinferior a 50 gramos.

b) Toma de muestras mediante sonda.Según el tamaño, peso y clase del queso, se

empleará una de las técnicas siguientes:La sonda podrá introducirse oblicuamente en

dirección al centro del queso una o varias vecesen una de las caras planas, en un punto situado auna distancia mínima de 10 a 20 centímetros delborde.

La sonda podrá introducirse horizontalmenteen la pared vertical del queso, a igual distanciaentre las dos superficies planas hasta el centro delqueso.

La sonda podrá introducirse perpendicular-mente por una de las caras del queso, para alcan-zar la zona opuesta pasando por el centro.

Cuando se trate de quesos transportados enbarriles, cajas u otros recipientes a granel, o dequesos que formen grandes bloques compactos,la toma de muestras, podrá realizarse haciendopasar la sonda oblicuamente de arriba a abajo,atravesando todo el contenido del recipiente.

En los quesos grandes la parte externa delcilindro, por lo menos 2 centímetros, tomados demuestra por la sonda y comprendiendo la corteza,podrá utilizarse para tapar el agujero hecho en elqueso. Los agujeros dejados por la sonda, debe-rán taparse con gran cuidado, y si es posible, serecubrirán con un producto obturador aprobado.El resto de cilindro o cilindros, constituirá la mu-estra.

c) Toma de muestras utilizando una pieza en-tera.

Este método deberá reservarse normalmentepara los quesos de tamaño pequeño preenvasadoo no, y para los quesos y quesos fundidos pre-sentados en cajitas conteniendo porciones enva-sadas o lonchas, en polvo o rallados y quesosfundidos en tubos o vasos.

Deberá tomarse un número suficiente de por-ciones, de lonchas o de piezas en general paraobtener una muestra cuyo peso sea de 50 gramoscomo mínimo.

d) Toma de muestras de quesos en salmuera.

Las muestras de quesos en salmuera, seobtendrán retirando fragmentos de 200 gramoscada uno por lo menos y, al mismo tiempo, unacantidad de salmuera suficiente para recubrir elqueso en el recipiente de la muestra.

Antes de efectuar los análisis, la muestra secolocará sobre un papel de filtro durante una odos horas.

0.2.3. Tratamiento y conservación.Inmediatamente después de la toma de mues-

tras, éstas deberán colocarse en el recipienteadecuado, a no ser que se trate de porciones,lonchas, trozos o piezas enteras envasadas enrecipientes pequeños para la venta al por menor,en cuyo caso dichos recipientes servirán al efec-to. En el primer supuesto, las muestras podráncortarse en trozos para introducirlas en los reci-pientes, pero no deberán ser comprimidas ni des-menuzadas. A las muestras podrá añadírseles unasustancia conservadora adecuada, siempre queno afecte al análisis subsiguiente, indicándose enla etiqueta y en los informes su naturaleza y canti-dad utilizada.

Los recipientes que contengan las muestrasdeberán enviarse inmediatamente al laboratorio,en donde se iniciarán los análisis con la mayorrapidez posible.

Las muestras de queso deberán conservarseen forma tal que se evite la separación de la mate-ria grasa o del agua, y si se trata de quesos depasta blanda, se mantendrán a una temperaturacomprendida entre 0 y 5ºC.

Al preparar la muestra, sea cual fuere el méto-do de toma de muestra que se haya empleado,deberá tenerse cuidado para no eliminar más quela capa superficial no comestible del queso, comoson las partes mohosas y la corteza, salvo indica-ción en contrario.

1. EXTRACCION DE LA GRASA DELQUESO

1.1. Principio.Extracción de la grasa del queso mediante

pentano o éter de petróleo.

1.2. Material y aparatos1.2.1. Mortero.1.2.2. Aparato de extracción continuo.1.2.3. Baño de agua.

1.3. Reactivos.132006 n-Pentano PA 131315 Eter de Petróleo 40-60ºC PA-ISO131716 Sodio Sulfato anhidro PA

1.3.1. Sodio Sulfato anhidro PA.1.3.2. n-Pentano PA o Eter de Petróleo 40-

60ºC PA-ISO.

92

1.4. Procedimiento.Moler la muestra en un mortero con Sodio Sul-

fato anhidro PA hasta obtener una masa granulo-sa. Extraer la masa con n-Pentano PA o Eter dePetróleo 40-60ºC PA-ISO (se puede usar un apa-rato de extracción continuo) y evaporar el disol-vente al baño de agua o a presión reducida.

1.5. Referencia.1.5.1. Norma internacional FIL-IDF 32: 1965.

2. DETERMINACION DEL CONTENIDOEN MATERIA GRASA

2.1. Principio.El contenido de grasa se determina gravimétri-

camente por digestión del queso con ácido clorhí-drico y subsiguientemente extracción de la grasade una solución ácido-alcohólica con la ayuda deéter etílico y éter de petróleo, evaporación de losdisolventes y posterior pesada de los residuos.

La precisión del método es de 0,2 g. de grasapor 100 g. del producto.

2.2. Material y aparato.2.2.1. Balanza analítica.2.2.2. Probetas o matraces de extracción ade-

cuados provistos de tapones de vidrio esmeriladoo corcho; dispositivos del cierre que no puedanser atacados por los disolventes utilizados. Si seusan tapones de corcho deberán ser de buenacalidad, sometiéndolos a extracción sucesiva-mente con éter etílico y éter de petróleo. Despuésse introducirán, al menos durante veinte minutos,en agua a una temperatura de 60ºC o superior,dejándose enfriar en agua de forma que esténsaturados cuando se utilicen.

2.2.3. Matraces de paredes delgadas y basesplanas de 150 a 250 ml de capacidad.

2.2.4. Estufa de desecación regulable que per-mita trabajar a 102º ± 2ºC, o una estufa de dese-cación por vacío (temperatura de 70º a 75ºC, pre-sión menor de 50 mm de Hg).

2.2.5. Perlas de vidrio o trozos de carburo desilicio, exento de grasa.

2.2.6. Baño de agua.2.2.7. Hojas de película de celulosa, sin barni-

zar, solubles en ácido clorhídrico, de 0,03-0,05mm de espesor y de 50 x 75 mm de superficie,aproximadamente. Las películas de celulosa nodeben afectar al resultado del análisis.

2.2.8. Aparato adecuado para la trituración dela muestra.

2.3. Reactivos.131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO

131085 Etanol 96% v/v PA132770 Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm

de BHT PA-ACSEter de Petróleo 30-60ºC. En sudefecto, usar

131315 Eter de Petróleo 40-60ºC. PA-ISO131542 Potasio Yoduro PA-ISO

2.3.1. Acido Clorhídrico 25% p/p (d20 = 1,125).Usar Acido Clorhídrico 35% PA-ISO y diluir conve-nientemente.

2.3.2. Etanol 96% v/v PA (2.6.1.).2.3.3. Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm

de BHT PA-ACS, exento de peróxidos (2.6.2.).2.3.4. Eter de Petróleo que destile a una tem-

peratura que oscile entre 30º y 60ºC.2.3.5. La mezcla de disolventes se prepara

poco antes de utilizarla, mezclando volúmenesiguales de 2.3.3. y 2.3.4. (2.6.3.).

2.4. Procedimiento.2.4.1. Preparación de la muestra.- Antes de

efectuar el análisis, eliminar la corteza, capa osuperficie mohosa que recubre el queso, conobjeto de obtener una muestra representativa delqueso tal como se consume normalmente. Triturarla muestra con 2.2.8., mezclar la masa trituradarápidamente, y si es posible triturarla por segundavez y mezclarla de nuevo concienzudamente(2.6.4.). Pasar la muestra preparada a un recipien-te cerrado herméticamente hasta el momento delanálisis, que se efectuará en el mismo día (2.6.5.).

2.4.2. Determinación.- Secar el matraz 2.2.3.con 2.2.5. en la estufa durante un intervalo demedia hora. Dejar que se enfríe el matraz a la tem-peratura ambiente de la balanza y pesar el matrazenfriado con aproximación de 0,1 mg.

Pesar, con aproximación de 1 mg en el apara-to de extracción 2.2.2. o en un vaso o matraz de100 ml, de 1 a 3 g de la muestra de queso prepa-rada. La muestra del ensayo podrá tambiénpesarse utilizando una lámina de celulosa 2.2.7.,que posteriormente se plegará e introducirá en eltipo de vasija seleccionada.

Añadir de 8 a 10 ml de Acido Clorhídrico(según la forma del aparato de extracción) y agitarla vasija ligeramente en un baño de agua hirvien-do o sobre una llama hasta que el queso estécompletamente disuelto. Dejar la vasija en reposodurante veinte minutos en el baño de agua hir-viendo y después enfriar, por ejemplo, en aguacorriente.

Si la digestión del queso se ha hecho en el apa-rato de extracción, añadir 10 ml de Etanol 96%v/v PA y mezclar el contenido, removiéndolo lige-ramente, pero de un modo homogéneo en el apa-rato sin cerrar.

Si la digestión del queso se ha hecho en unavasija distinta del matraz de extracción, verter el

93

M

contenido de la vasija en este matraz. Enjuagarlosucesivamente con 10 ml de Etanol 96% v/v PA,25 ml. de Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppmde BHT PA-ACS y 25 ml de Eter de Petróleo, ver-tiendo cada vez el disolvente en el matraz deextracción. Después de cada adición mezclar yagitar el matraz de extracción, según se indica acontinuación.

Añadir 25 ml de Eter Dietílico estabilizado con~6 ppm de BHT PA-ACS, cerrar el aparato y agi-tar vigorosamente, invirtiéndolo repetidamentedurante un minuto. Enfriarlo, si es necesario, enagua corriente. Quitar el tapón cuidadosamente yañadir 25 ml de Eter de Petróleo, empleando losprimeros ml para enjuagar el tapón y la superficieinterna del cuello del aparato, dejando que el líqui-do de los enjuagues penetre en el mismo. Cerrar-lo, volviendo a colocar el tapón, agitar e invertirlorepetidamente durante treinta segundos; no debeagitarse demasiado enérgicamente. Dejar el apa-rato en reposo hasta que la capa líquida superioresté completamente límpida y claramente separa-da de la capa acuosa. La separación podrá tam-bién efectuarse mediante el uso de una centrífugaadecuada (2.6.6.), quitar el tapón y enjuagarlo, asícomo también el interior del aparato con algunosml de la mezcla de los disolventes y dejar que loslíquidos de los enjuagues penetren en el aparato.Transvasar cuidadosamente el matraz 2.2.3., lomás completamente posible la capa superior pordecantación o con ayuda de un sifón (2.6.7.).Enjuagar el exterior y el interior del cuello del apa-rato o el extremo de la parte interior del sifón conunos cuantos mililitros de la mezcla de disolven-tes. Dejar que los líquidos de los enjuagues de laparte exterior del aparato penetren en el matraz yque los líquidos de los enjuagues de la parte inte-rior del cuello y del sifón penetren en el aparato deextracción. Hacer una segunda extracción repi-tiendo el procedimiento descrito anteriormente(desde la adición de 25 ml de Eter de Petróleo),utilizando solamente 15 ml de Eter Dietílico esta-bilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS y 15 ml deEter de Petróleo. Hacer una tercera extracción,pero omitiendo el enjuague final.

Evaporar o destilar cuidadosamente la mayorcantidad posible de disolvente (incluido el Etanol).Si el matraz es de poca capacidad, parte deldisolvente tendrá que eliminarse en la forma cita-da anteriormente, después de cada extracción.Cuando haya desaparecido el olor a disolvente,calentar el matraz, apoyándolo sobre un ladodurante una hora en la estufa. Dejar que el matrazse enfríe a la temperatura ambiente de la balanzay pesar con aproximación de 0,1 mg. Repetir lasoperaciones de calentar el matraz en estufa ypesar calentando a intervalos de treinta a sesentaminutos, hasta que se obtenga una masa cons-tante.

Añadir de 15 a 25 ml de Eter de Petróleo, conobjeto de verificar si la materia extraída es total-mente soluble. Calentar ligeramente y agitar eldisolvente mediante un movimiento rotatorio,hasta que se haya disuelto toda la grasa. Cuandola materia extraída sea totalmente soluble en elEter de Petróleo, la masa de grasa será la diferen-cia entre las pesadas del matraz 2.2.3. y de lamasa constante. En caso contrario extraer com-pletamente la grasa del matraz mediante lavadosrepetidos con Eter de Petróleo caliente, dejandoque se deposite la materia no disuelta antes decada decantación. Enjuagar tres veces la parteexterior del cuello del matraz. Calentar el matraz,apoyándolo sobre un lado durante una hora en laestufa y dejar que se enfríe a la temperaturaambiente de la balanza y pesar con aproximaciónde 0,1 mg. La masa de la grasa será la diferenciaentre la masa obtenida anteriormente y esta masafinal.

2.4.3. Ensayo en blanco.Al mismo tiempo que se determina el conteni-

do de grasa de la muestra, efectuar una determi-nación en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS,empleando el mismo tipo de aparato de extrac-ción, los mismos reactivos en las mismas cantida-des y el mismo procedimiento. Si el resultado delensayo en blanco excede de 0,5 mg deberáncomprobarse los reactivos, y el reactivo o reacti-vos impuros deberán purificarse o sustituirse.

2.5. Cálculos.La masa, expresada en gramos, de la muestra

extraída es:

(M1 - M2) - (B1 - B2)

y el contenido de grasa en la muestra, expresadoen porcentaje, de la masa es:

(M1 - M2) - (B1 - B2)–––––––––––––––––––––––– x 100

S

Siendo:M1 = masa, en g, del matraz con la materia

grasa extraída.M2 = masa, en g, del matraz sin grasa.B1 = masa, en g, del matraz del ensayo en

blanco después de eliminar los disolventes.B2 = masa, en g, del matraz del ensayo en

blanco.S = masa, en g, de la porción ensayada.

2.6. Observaciones.2.6.1. Si no se dispone de Etanol 96% v/v PA

se puede utilizar etanol desnaturalizado con alco-hol metílico, metiletilcetona, benceno o éter depetróleo.

94

2.6.2. Para el ensayo de los peróxidos verter10 ml de Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppmde BHT PA-ACS en una pequeña probeta tapadacon tapón de vidrio, previamente enjuagada conEter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm de BHTPA-ACS, añadir 1 ml de solución al 10% de Pota-sio Yoduro PA-ISO, recién preparada. Agitar ydejar reposar durante un minuto. No debe apare-cer ningún color amarillo en ninguna de las capas.El Eter Dietílico estabilizado con ~ 6 ppm de BHTPA-ACS podrá mantenerse exento de peróxidos,añadiendo una lámina de zinc húmeda, que debe-rá sumergirse completamente en una soluciónácida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO durante un minuto y después lavar conagua. Utilizar por litro una superficie de 80 cm2

aproximadamente de lámina de zinc, cortarla enbandas suficientemente largas para que lleguenpor lo menos hasta la mitad del recipiente.

2.6.3. La mezcla de disolventes podrá sustituir-se en aquellos casos en que su utilización se hayaprevisto por Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppmde BHT PA-ACS o Eter de Petróleo.

2.6.4. Si la muestra no se pudiera triturar mez-clarla cuidadosamente mediante un amasadointenso.

2.6.5. En caso de que haya que retrasar inevi-tablemente esta operación, tomar las precaucio-nes necesarias para asegurar la conservaciónadecuada de la muestra e impedir la condensa-ción de la humedad en la superficie interior.

2.6.6. Cuando se utilice una centrífuga que noesté provista de un motor trifásico pueden produ-cirse chispas y entonces habrá que tomar lasdebidas precauciones para evitar explosiones oincendios debido a la presencia de los vapores deéter, por ejemplo, en el caso de una rotura de untubo.

2.6.7. Si el trasvase no se efectúa mediante unsifón, quizá sea necesario tener que añadir unpoco de agua para elevar el plano intermedioentre las dos capas, con objeto de facilitar ladecantación.

2.7.. Referencia.2.7.1. Código de Principios referente a la leche

y a los Productos Lácteos. Norma B-3. FIL-IDF5A: 1969.

3. DETERMINACION DEL CONTENIDODE EXTRACTO SECO

3.1. Principio.El extracto seco del queso y de los quesos

fundidos es la masa, expresada en porcentajeponderal, que queda después del proceso dedesecación.

La precisión del método es de ± 0,1%.

3.2. Material y aparatos3.2.1. Balanza analítica, sensibilidad 0,1 mg.3.2.2. Desecador provisto de un buen deshi-

dratante (211335 Gel de Sílice con indicador QP o141219 Calcio Cloruro anhidro 95% escoriformePRS).

3.2.3. Estufa de desecación que permita obte-ner una temperatura constante hasta 110ºC.

3.2.4. Cápsulas de níquel o de aluminio de2 cm de altura, aproximadamente, y de 6 a 8 cm.de diámetro.

3.2.5. Arena de cuarzo de granos gruesos o211161 Arena de Mar lavada, grano grueso QPpurificada con 131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO, lavada y calcinada.

3.2.6. Agitadores de vidrio con una extremidadplana.

3.3. Procedimiento.Colocar 20 g de Arena de Mar QP, aproxima-

damente, y un agitador de vidrio en la cápsula deníquel o de aluminio. Secar la cápsula con la arenay el agitador en la estufa a 105ºC, hasta pesoconstante. Dejar enfriar la cápsula en el deseca-dor y pesar.

Colocar rápidamente en la cápsula, aproxima-damente, 3 g de la muestra de queso preparada ypesar de nuevo.

Triturar cuidadosamente la masa de queso conla arena con ayuda del agitador (3.4.1.). Secar lacápsula en la estufa durante cuatro horas a105ºC. Dejar enfriar en el desecador y pesar.

Proseguir el secado hasta peso constanteseparando cada pesada por una permanencia enla estufa de media hora.

3.4. Observaciones.3.4.1. Para los quesos que fundan a la tempe-

ratura de 105ºC en una masa córnea, se reco-mienda guardar primero la cápsula con la masadel queso triturado en el desecador durante dieci-séis horas, a la presión atmosférica normal y a latemperatura del laboratorio. Se removerá de vezen cuando el contenido de la cápsula con el agi-tador, para evitar la formación de costras.

3.5. Referencias.3.5.1. Federación Internacional de Lechería.

Norma FIL-IDF 4: 1958.

4. DETERMINACION DEL CONTENIDOEN FOSFORO

4.1. Principio.Mineralización de determinada cantidad de

muestra con ayuda de ácido sulfúrico en presen-cia de hidrógeno peróxido. El fosfato se trata consodio molibdato e hidracina sulfato como agentereductor. El azul de molibdeno así formado se

95

M

mide por fotometría, calculándose el contenido enfósforo.

La presión del método es de 0,04 g de fósforopor 100 de producto.

4.2. Material y aparatos4.2.1. Balanza analítica.4.2.2. Colorímetro fotoeléctrico que permita

lecturas a una longitud de onda de 700 nm.4.2.3. Aparato apropiado para triturar la mues-

tra.4.2.4. Matraces erlenmeyer de 25 ml.4.2.5. Aparato de mineralización que mantenga

los matraces erlenmeyer en una posición inclinaday provisto de un sistema de calentamiento que nocaliente la parte del matraz situada por encima dela superficie del líquido.

4.2.6. Cuerpos que faciliten la ebullición para lamineralización: trozos de porcelana o perlas devidrio.

4.2.7. Matraces aforados de 50, 100, 200, 500y 1.000 ml.

4.2.8. Pipetas y/o buretas de 1, 2, 5, 10, 20 y25 ml.

4.3. Reactivos.131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131350 Hidracinio Sulfato PA141076 Hidrógeno Peróxido 30% p/v (100 vol.)

PRS131509 Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA131701 Sodio Molibdato 2-hidrato PA4.3.1. Acido Sulfúrico 96% PA-ISO.4.3.2. Hidrógeno Peróxido 30% p/v (100 vol.)

PRS.4.3.3. Reactivo de Molibdato y de Hidracina

Sulfato.4.3.3.1. Solución 2,5% de Sodio Molibdato.-

Disolver 12,5 g de Sodio Molibdato 2-hidrato PAen Acido Sulfúrico 10N (usar Acido Sulfúrico 96%PA-ISO y diluir convenientemente con Agua PA-ACS), completando hasta 500 ml.

4.3.3.2. Solución 0,15% de Hidracinio Sulfato.-Disolver 0,30 g de Hidracinio Sulfato PA, en AguaPA-ACS, completando hasta 200 ml.

4.3.3.3. Inmediatamente antes de su empleo,mezclar 25 ml. de 4.3.3.1. con 10 ml de 4.3.3.2.y diluir la mezcla hasta 100 ml con Agua PA-ACSpara preparar el reactivo de Molibdato y de Hidra-cinio Sulfato. Esta solución no puede conservarse.

4.3.3.4. Solución normalizada de fosfato.-Disolver 0,4390 g. de Potasio di-Hidrógeno Fosfa-to PA en Agua PA-ACS hasta obtener una solu-ción de 1.000 ml. Esta solución contiene 100 µg.de fósforo en 1 ml. El Potasio di-Hidrógeno Fosfa-to PA debe haber sido secado durante cuarenta yocho horas en presencia de un agente de dese-cación eficaz, por ejemplo, el Acido Sulfúrico 96%

PA-ISO. Todos los reactivos deben ser de calidadanalítica.

4.4. Procedimiento.4.4.1. Preparación de la muestra.Antes del análisis se quitará la corteza o la cara

superficial mohosa del queso de modo que seobtenga una muestra representativa del queso talcomo se consume habitualmente. La muestraserá triturada a continuación en un triturador uotro aparato apropiado y mezclada íntimamente,evitando las pérdidas por evaporación.

La muestra así preparada será conservada enun recipiente al abrigo del aire hasta su análisis,que deberá efectuarse el mismo día.

4.4.2. Determinación.Introducir sucesivamente en el matraz erlenme-

yer 0,5 g de la muestra, pesados con exactitud de1 mg, algunas perlas de vidrio o pequeños trozosde porcelana y 4 ml de Acido Sulfúrico 96% PA-ISO. Calentar con precaución el matraz erlenme-yer sobre el aparato de mineralización. Al cesar laformación de espuma, enfriar a la temperaturaambiente; añadir con precaución algunas gotasde Hidrógeno Peróxido 30% p/v PRS, calentar denuevo y repetir estas operaciones hasta que elcontenido del matraz se encuentre límpido e inco-loro. Durante el calentamiento, mezclar el conteni-do del matraz de tiempo en tiempo por agitación.Evitar los recalentamientos locales.

Enjuagar el cuello del matraz con unos 2 ml deAgua PA-ACS y calentar de nuevo hasta que elagua se haya evaporado. Dejar hervir el líquidodurante una media hora después de la decolora-ción, con el fin de eliminar todo indicio de hidróge-no peróxido. Evitar los recalentamientos locales.

Después del enfriamiento a la temperaturaambiente, traspasar el contenido del matraz a unmatraz aforado de 100 ml, completar hasta elaforo con Agua PA-ACS y mezclar.

Llevar con la pipeta 1 ml de la solución a unmatraz aforado de 50 ml y diluir con unos 25 ml.de Agua PA-ACS. Añadir 20 ml del reactivo deMolibdato y de Hidracinio Sulfato, llenar el matrazhasta el aforo con Agua PA-ACS y mezclar. Colo-car el matraz en agua hirviendo y dejar que seforme el color durante quince minutos.

Enfriar a la temperatura ambiente en agua fríay, antes de una hora, medir la densidad óptica conrelación al ensayo en blanco (4.4.4.) a una longi-tud de onda de 700 nm.

4.4.3. Preparación de la curva patrón.Diluir en un matraz aforado 10 ml de la solución

normalizada 4.3.4. con Agua PA-ACS y completarhasta 100 ml.

Introducir en cinco matraces aforados de50 ml, 0, 1, 2, 5 y 10 ml de la solución normaliza-da diluida con el fin de obtener una serie de solu-ciones testigos que contengan 0 (valor cero), 10,20, 50 y 100 µg de fósforo.

96

Añadir Agua PA-ACS a los matraces para obte-ner un volumen aproximado de 25 ml, añadir20 ml del reactivo de Molibdato y de HidracinioSulfato, llenar hasta el aforo con Agua PA-ACS,mezclar, colocar el matraz con agua hirviendo ydejar que se forme el color durante quince minu-tos.

Enfriar a la temperatura ambiente en agua fría ymedir la densidad óptica de los testigos con res-pecto al de valor cero, a una longitud de onda de700 nm.

Determinar la curva patrón señalando las dife-rencias de densidad óptica con respecto a lascantidades de microgramos de fósforo.

4.4.4. Ensayo en blanco.Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el pro-

cedimiento expresado en 4.4.2., pero sin queso.

4.5. Cálculo.Calcular el contenido en fósforo de la muestra

por medio de la fórmula:

PContenido en fósforo (%) = –––––––

100 W

Siendo:P = peso, en mg, de fósforo obtenido al con-

vertir la medida obtenida en el colorímetro utilizan-do la curva patrón.

W = peso, en g, de la muestra tomada para elanálisis.

4.6. Referencia.4.6.1. Federación Internacional de Lechería.

Norma FIL-IDF 33A: 1971.

5. DETERMINACION DEL CONTENIDOEN ACIDO CITRICO

5.1. Principio.Obtención de un filtrado claro por dispersión de

la muestra en agua y clarificación por la adición deácido tricloroacético. El filtrado se trata con piridi-na y anhídrido acético y se forma con el ácidocítrico un compuesto de color amarillo. El colorobtenido se mide por fotometría.

La precisión del método es de 0,1 g de ácidocítrico anhidro por 100 g de producto.

5.2. Material y aparatos.5.2.1. Balanza analítica, con precisión que per-

mita de 0,001 g.5.2.2. Colorímetro fotoeléctrico que permita

lecturas a una longitud de onda de 428 nm.5.2.3. Baño de agua con control termostático

que permita una regulación a 32º ±1ºC.5.2.4. Aparato apropiado para triturar la mues-

tra.

5.2.5. Tubos de ensayo con tapones de vidrioo de plástico de 16 o 18 por 150 nm.

5.2.6. Mortero y mano de porcelana de unos50 ml

5.2.7. Matraces aforados de 50, 100 y 1.000ml.

5.2.8. Pipetas y buretas de 1; 1,3; 4; 5,7; 8; 12;16 y 20 ml

5.2.9. Embudos de vidrio de dimensiones apro-piadas, por ejemplo, de 5 cm de diámetro.

5.2.10. Papel de filtro duro. Whatman número540, S y S 5893 o equivalente.

5.3. Reactivos.131067 Acido Tricloroacético PA-ACS131074 Agua PA-ACS131147 Anhídrido Acético PA131457 Piridina PA-ACS131655 tri-Sodio Citrato 2-hidrato PA-ACS

5.3.1. Acido Tricloroacético 30% (p/v).- Disol-ver 300 g. de Acido Tricloroacético PA-ACS enAgua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml.

5.3.2. Piridina PA-ACS.5.3.3. Anhídrido Acético PA.5.3.4. Solución normalizada de citrato.- Disol-

ver 0,9565 g de tri-Sodio Citrato 2-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml.

Todos los reactivos deben ser de calidad analí-tica.

5.4. Procedimiento.5.4.1. Preparación de la muestra.Antes del análisis se quitará la corteza o la

capa superficial mohosa del queso de modo quese obtenga una muestra representativa del quesotal como se consume habitualmente. La muestraserá triturada a continuación con un triturador uotro aparato apropiado y/o mezclada íntimamenteevitando las pérdidas por evaporación. La mues-tra así preparada será conservada en un recipien-te al abrigo del aire hasta su análisis, que deberáefectuarse el mismo día.

5.4.2. Determinación.Colocar 0,5 g de la muestra, pesada con preci-

sión de 0,001 g en un mortero de porcelana. Dis-persar la muestra machacándola con la mano delmortero y añadiendo pequeñas cantidades deagua caliente (60º-70ºC).

Traspasar el contenido del mortero a un matrazaforado de 100 ml., empleando unos 50 ml. deAgua PA-ACS. Enfriar a la temperatura ambiente.

Añadir 40 ml de la solución de Acido Tricloroa-cético, mezclar por agitación, llenar con Agua PA-ACS hasta el aforo y mezclar de nuevo.

Dejar reposar a la temperatura ambiente duran-te treinta minutos y filtrar sobre un papel de filtroseco. Desechar la primera porción del filtrado

97

M

hasta que se obtenga un líquido límpido; se dese-chará al menos 10 ml.

Introducir con ayuda de una pipeta 1 ml de fil-trado claro en un tubo de ensayo provisto detapón.

Añadir al tubo 1,3 ml de Piridina PA-ACS. Mez-clar y añadir inmediatamente 5,7 ml de AnhídridoAcético PA. Tapar el tubo y mezclar íntimamentesu contenido, colocándolo inmediatamente en unbaño de agua a 32ºC, dejándolo durante treintaminutos.

Retirar el tubo del baño de María, secarlo ymedir la densidad óptica con relación al ensayo enblanco (5.4.4.) a una longitud de onda de 428 nmantes de treinta minutos.

5.4.3. Preparación de la curva patrón.Introducir en seis matraces de 50 ml 0, 4, 8,

12, 16 y 20 ml de la solución normalizada de citra-to (5.3.4.); añadir a cada matraz Agua PA-ACShasta obtener un volumen aproximado de 25 ml.Añadir 20 ml. de la solución de Acido Tricloroacé-tico (5.3.1.); mezclar por agitación, llenar hasta elaforo con Agua PA-ACS y mezclar de nuevo.

Introducir con una pipeta 1 ml de cada soluciónpatrón diluida en tubos de ensayo provistos detapón, con el fin de obtener una serie de testigosque contengan 0 (valor cero), 50, 100, 150, 200 y250 µg de ácido cítrico anhidro; añadir a cadatubo 1,3 ml de Piridina PA-ACS. Mezclar y añadirinmediatamente 5,7 ml de Anhídrido Acético PA.Tapar el tubo y mezclar íntimamente su contenido.Colocar los tubos sin demora en un baño de aguaa 32ºC y dejarlos durante treinta minutos.

Retirar los tubos del baño de agua, enfriar atemperatura ambiente, secarlos y medir la densi-dad óptica de los testigos con relación al valorcero, a una longitud de onda de 428 nm antes detreinta minutos.

Determinar la curva patrón señalando la dife-rencia de densidad óptica con relación a la canti-dad de ácido cítrico anhidro en µg.

5.4.4. Ensayo en blanco.Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el proce-

dimiento expresado anteriormente, pero sin muestra.

5.5. Cálculos.Calcular el contenido en ácido cítrico anhidro

por medio de la fórmula:

CContenido en ácido cítrico anhidro % ––––––––

100 x W

Siendo:C = peso, en µg., de ácido cítrico obtenido al

convertir la medida obtenida en el colorímetro uti-lizando la curva patrón.

W = peso, en g., de la muestra tomada para elanálisis.

5.6. Referencia.5.6.1. Federación Internacional de Lechería.

Norma FIL-IDF 34B: 1971.

6. DETERMINACION DEL CONTENIDOEN LACTOSA

6.1. Principio.Preparación de un filtrado claro del queso por

dispersión de la muestra en agua y defecación porzinc ferrocianuro. A una parte del filtrado se leañade una solución que contiene un complejocúprico. Se determina gravimétricamente el preci-pitado de cobre I óxido, formado por la acciónreductora de la lactosa y los resultados obtenidosse convierten, con la ayuda de tablas, en lactosaanhidra o hidratada.

La precisión del método es de 0,15 g de lacto-sa anhidra por 100 g de producto.

6.2. Material y aparatos.6.2.1. Balanza analítica. Sensibilidad 0,1 mg.6.2.2. Estufa regulable a 103ºC ± 2ºC. 6.2.3. Mortero de porcelana de un contenido

aproximado de 300 ml, de un diámetro interior deunos 110 nm, con una mano apropiada.

6.2.4. Vaso de precipitados de 400 ml6.2.5. Crisol filtrante de porcelana de un conte-

nido aproximado de 35 ml y de una porosidadmedia de 3-15 micras, cuyo peso no debe variarmás de 1,0 mg cuando se le aplica el métodooperatorio descrito más adelante, sin utilizar elqueso.

6.2.6. Desecador provisto de un agente dedesecación eficaz, como el Gel de Sílice con indi-cador QP.

6.2.7. Matraz aforado de 500 ml.6.2.8. Matraz erlenmeyer de 500 ml.6.2.9. Pipetas de 25 y 100 ml.6.2.10. Probeta graduada de 20 o 25 ml.6.2.11. Embudo de vidrio de unos 150 mm de

diámetro.6.2.12. Vidrio de reloj destinado a cubrir el vaso

de precipitados de 400 ml.6.2.13. Varilla de vidrio con protección de

goma en la punta.6.2.14. Dispositivo de aspiración de una sec-

ción media. 6.2.15. Matraz de vacío con portacrisol.6.2.16. Filtro plegado o filtro plano de porosi-

dad media, de dimensión correspondiente alembudo 6.2.11.

6.3. Reactivos.131036 Acido Nítrico 60% PA-ISO131074 Agua PA-ACS131085 Etanol 96% v/v PA131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO211335 Gel de Sílice 3-6 mm con indicador QP

98

211456 Piedra Pómez gránulos QP131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131729 Potasio Sodio Tartrato 4-hidrato PA-

ACS-ISO131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA

6.3.1. Solución de Zinc Sulfato.Disolver 30 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA en

Agua PA-ACS, completando hasta 100 ml.6.3.2. Solución de Potasio Hexacianoferrato II.Disolver 15 g de Potasio Hexacianoferrato II

3-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS completandohasta 100 ml

6.3.3. Solución de Cobre II Sulfato.Disolver 70 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-

ACS-ISO en Agua PA-ACS, completando hasta1.000 ml y filtrando si es necesario.

6.3.4. Solución de Tartrato Alcalino.Disolver 350 g de Potasio Sodio Tartrato

4-hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS, comple-tando hasta 1.000 ml Dejar reposar dos días enun frasco tapado y filtrar. La solución se deteriora-rá al cabo de un cierto tiempo, lo que puede fal-sear el ensayo en blanco (resultados más eleva-dos).

6.3.5. Acido Nítrico diluido: Acido Nítrico 60%PA-ISO diluyendo a 15-20% en peso.

6.3.6. Etanol 96% v/v PA. Puede ser desnatu-ralizado con un desnaturalizante apropiado queno deje residuos después de la evaporación.

Los reactivos deben ser de calidad analítica.

6.4. Procedimiento.6.4.1. Preparación de la muestra para el ensayo.Antes del análisis se quitará la corteza o capa

superficial mohosa del queso, a fin de obtener unamuestra representativa del queso tal como habi-tualmente se consume. La muestra será trituradaa continuación en un triturador u otro aparatoapropiado y mezclada íntimamente, evitando laspérdidas por evaporación. La muestra así prepa-rada será conservada en un recipiente cerradohasta su análisis, que deberá efectuarse el mismodía.

6.4.2. Determinación.Lavar el crisol filtrante con Acido Nítrico diluido,

enjuagarlo perfectamente con Agua PA-ACScaliente y después con 10 ml de Etanol 96% v/vPA. Secar el crisol a 103ºC. ± 2ºC durante treintaminutos, enfriar en un desecador y pesar.

Colocar, aproximadamente, 10 g de la muestra,pesados exactamente, en un mortero de por-celana. Dispersar la muestra machacándola con lamano del mortero, añadiendo pequeñas cantida-des de Agua PA-ACS caliente (60º - 70ºC) Trasva-sar el contenido del mortero a un matraz aforadode 500 ml Diluir en 400 ml, aproximadamente.

Añadir 5 ml de la solución de Zinc Sulfato, mez-clando suavemente por rotación del matraz alre-dedor de su eje, manteniéndolo inclinado. Añadirdel mismo modo 5 ml de la solución de PotasioHexacianoferrato II.

Enfriar el contenido del matraz a 20ºC. y com-pletar con Agua PA-ACS (a 20ºC.) hasta el aforo.Cerrar el matraz con un tapón seco y mezclar ínti-mamente su contenido mediante una agitaciónenérgica. Filtrar con un papel de filtro seco, dese-chando los primeros ml filtrados.

Tomar con una pipeta 25 ml de la solución deCobre II Sulfato (6.3.3.) y 25 ml de la solución de Tartrato Alcalino (6.3.4.) y llevarlo a un vaso de precipitado de 400 ml Mezclar por mo-vimiento de rotación. Calentar la muestra hastaebullición. Añadir 100 ml del filtrado de la muestracon ayuda de una pipeta. Cubrir el vaso con un vidrio de reloj y calentar de nuevo. Detener el calentamiento exactamente seis minutos des-pués de alcanzar nuevamente el punto de ebulli-ción.

Para asegurar una ebullición más regular y paraevitar las proyecciones del líquido, se podrán aña-dir pequeños trozos de Piedra Pómez 4 a 8 mmQP tratados previamente de la misma manera queel crisol y pesados con éste último.

Enjuagar el vidrio de reloj con un poco de AguaPA-ACS caliente encima del vaso. Trasvasar todoel contenido del vaso a un crisol filtrante prepara-do previamente (según se indica con anteriori-dad). Para efectuar este trasvase ayudarse dechorros de Agua PA-ACS caliente y de una varillade vidrio con protección de goma en la punta. Elfiltrado debe ser de color azul. Si es incoloro,repetir el análisis utilizando una cantidad máspequeña de filtrado diluida en 100 ml.

Enjuagar cuidadosamente el crisol filtrante conAgua PA-ACS caliente y después con 10 ml deEtanol 96% v/v PA. Secar el crisol durante treintaminutos a 103ºC ± 2ºC, enfriar en un desecador ypesar.

6.4.3. Ensayo en blanco.Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el pro-

cedimiento descrito pero utilizando 10 ml de aguadestilada en lugar de 10 g de queso.

6.5. Cálculos.Corregir la masa de cobre I óxido encontra-

da en el análisis de la muestra restándole el resul-tado del ensayo en blanco. Buscar en las tablas la cantidad de lactosa anhidra o hidratada co-rrespondiente a la masa corregida de cobre Ióxido.

Calcular el contenido en lactosa anhidra ohidratada de la muestra con ayuda de la fórmulasiguiente:

99

M

Contenido en lactosa anhidra o hidratada (%) =

50.000 x A 500 x A= –––––––––––– x 0,99 = –––––––––––– · 99

V x E V x ESiendo:A = masa, en g., de lactosa anhidra o hidrata-

da encontrada en la tabla.E = masa, en g, de la muestra de ensayo.V = volumen, en ml, del filtrado utilizado.

0,99 = factor de corrección para compensar elerror de volumen que resulta de la presencia demateria grasa y proteínas en la muestra.

6.6. Referencia.6.6.1. Federación Internacional de Lechería.

Norma FIL-IDF 43: 1967.

100

10 5,1 4,811 5,8 5,512 6,4 6,113 7,1 6,714 7,7 7,315 8,4 8,016 9,0 8,617 9,7 9,218 10,3 9,819 11,0 10,520 11,6 11,021 12,3 11,722 12,9 12,323 13,6 12,924 14,2 13,525 14,8 14,126 15,5 14,727 16,2 15,428 16,8 16,029 17,5 16,630 18,1 17,231 18,7 17,832 19,4 18,433 20,0 19,034 20,7 19,735 21,3 20,236 22,0 20,937 22,6 21,538 23,3 22,139 23,9 22,740 24,6 23,441 25,2 23,942 25,9 24,643 26,5 25,244 27,2 25,845 27,8 26,446 28,5 27,147 29,1 27,648 29,8 28,349 30,4 28,950 31,4 29,551 31,7 30,152 32,4 30,853 33,0 31,454 33,7 32,055 34,3 32,656 34,9 33,257 35,3 33,858 36,2 34,459 36,9 35,160 37,5 35,6

61 38,2 36,362 38,8 36,963 39,4 37,464 40,1 38,165 40,8 38,866 41,4 39,367 42,0 39,968 42,7 40,669 43,3 41,170 44,0 41,871 44,6 42,472 45,3 43,073 45,9 43,674 46,6 44,375 47,2 44,876 47,9 45,577 48,5 46,178 49,2 46,779 49,8 47,380 50,4 47,981 51,1 48,582 51,8 49,283 52,4 49,884 53,1 50,485 53,7 51,086 54,4 51,787 55,0 52,388 55,7 52,989 56,3 53,590 57,0 54,291 57,6 54,792 58,2 55,393 58,9 56,094 59,5 56,595 60,2 57,296 60,8 57,897 61,4 58,398 62,1 59,099 62,8 59,7

100 63,4 60,2101 64,0 60,8 102 64,6 61,4103 65,3 62,0104 66,0 62,7105 66,6 63,3106 67,2 63,8107 67,9 64,5108 68,6 65,2109 69,2 65,7110 69,9 66,4111 70,5 67,0

101

M

TABLA PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE LACTOSA (MONOHIDRATADA Y ANHIDRA) ENMILIGRAMOS, SEGUN LA CANTIDAD DE COBRE I OXIDO EN MILIGRAMOS

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

112 71,2 67,6113 71,9 68,3114 72,5 68,9115 73,2 69,5116 73,8 70,1117 74,5 70,8118 75,1 71,3119 75,8 72,0120 76,5 72,7121 77,1 73,2122 77,7 73,8123 78,4 74,5124 79,1 75,1125 79,8 75,8126 80,4 76,4127 81,0 77,0128 81,7 77,6129 82,3 78,2130 83,0 78,9131 83,7 79,5132 84,4 80,2133 85,0 80,8134 85,6 81,3135 86,3 82,0136 87,0 82,7137 87,7 83,3138 88,3 83,9139 89,0 84,6140 89,6 85,1141 90,3 85,8142 91,0 86,5143 91,6 87,0144 92,2 87,6145 92,9 88,3146 93,6 88,9147 94,3 89,6148 94,9 90,2149 95,6 90,8150 96,2 91,4151 96,9 92,1152 97,6 92,7153 98,2 93,3154 98,8 93,9155 99,5 94,5156 100,2 95,2157 100,8 95,8158 101,5 96,4159 102,2 97,1160 102,8 97,7161 103,5 98,3162 104,2 99,0163 104,9 99,7164 105,6 100,3

165 106,2 100,9166 106,9 101,6167 107,6 102,2168 108,2 102,8169 108,9 103,5170 109,6 104,4171 110,2 104,7172 110,9 105,4173 111,6 106,0174 112,3 106,7175 113,0 107,4176 113,6 107,9177 114,3 108,6178 115,0 109,3179 115,6 109,8180 116,3 110,5181 117,0 111,2182 117,6 111,7183 118,3 112,4184 119,0 113,1185 119,7 113,7186 120,3 114,3187 121,0 115,0188 121,7 115,6189 122,4 116,3190 123,0 116,9191 123,7 117,5192 124,3 118,1193 125,0 118,8194 125,6 119,3195 126,3 120,0196 127,0 120,7197 127,7 121,3198 128,4 122,0199 129,1 122,6200 129,7 123,2201 130,4 123,9202 131,1 124,5203 131,8 125,2204 132,4 125,8205 133,1 126,4206 133,8 127,1207 134,5 127,8208 135,2 128,4209 135,8 129,0210 136,5 129,7211 137,2 130,3212 137,9 131,0213 138,6 131,7214 139,3 132,3215 140,0 133,0216 140,6 133,6217 141,3 134,2

102

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

218 142,0 134,9219 142,6 135,5220 143,3 136,1221 144,0 136,8222 144,7 137,5223 145,4 138,1224 146,1 138,7225 146,8 139,5226 147,5 140,1227 148,1 140,7228 148,8 141,4229 149,4 141,9230 150,1 142,6231 150,8 143,3232 151,4 143,8233 152,1 144,5234 152,8 145,2235 153,4 145,7236 154,1 146,4237 154,8 147,1238 155,4 147,6239 156,1 148,3240 156,9 149,1241 157,4 149,5242 158,1 150,2243 158,7 150,8244 159,4 151,4245 160,1 152,1246 160,7 152,7247 161,4 153,3248 162,0 153,9249 162,7 154,6250 163,4 155,2251 164,0 155,8252 164,7 156,5253 165,4 157,4254 166,0 157,7255 166,7 158,4256 167,3 158,9257 168,0 159,6258 168,7 160,3259 169,4 160,9260 170,0 161,5261 170,7 162,2262 171,3 162,7263 172,0 163,4264 172,6 164,0265 173,3 164,6266 174,0 165,3267 174,7 166,0268 175,4 166,6269 176,1 167,3270 176,8 168,0

271 177,5 168,6272 178,2 169,3273 178,8 169,9274 179,5 170,5275 180,2 171,2276 180,9 171,9277 181,6 172,5278 182,3 173,2279 183,0 173,9280 183,6 174,4281 184,3 175,1282 185,0 175,8283 185,7 176,4284 186,4 177,1285 187,1 177,7286 187,8 178,4287 188,5 179,1288 189,1 179,6289 189,8 180,3290 190,5 181,0291 191,2 181,6292 191,9 182,3293 192,6 183,0294 193,3 183,6295 194,0 184,3296 194,7 185,0297 195,4 185,6298 196,0 186,2299 196,7 186,9300 197,4 187,5301 198,1 188,2302 198,8 188,9303 199,5 189,5304 200,2 190,2305 200,9 190,9306 201,6 191,5307 202,3 192,2308 203,0 192,9309 203,7 193,5310 204,4 194,2311 205,2 194,9312 205,9 195,6313 206,6 196,3314 207,3 196,9315 208,0 197,6316 208,7 198,3317 209,5 199,0318 210,2 199,7319 210,9 200,4320 211,6 201,0321 212,3 201,7322 213,0 202,4323 213,7 203,0

103

M

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

324 214,4 203,7325 215,2 204,4326 215,9 205,1327 216,6 205,8328 217,3 206,4329 218,0 207,1330 218,8 207,9331 219,5 208,5332 220,2 209,2333 220,9 209,9334 221,6 210,5335 222,4 211,3336 223,1 211,9337 223,8 212,6338 224,5 213,3339 225,2 213,9340 225,9 214,6341 226,6 215,3342 227,2 215,8343 227,9 216,5344 228,6 217,2345 229,3 217,8346 230,0 218,5347 230,7 219,2348 231,4 219,8349 232,1 220,5350 232,8 221,2351 233,5 221,8352 234,2 222,5353 234,9 223,2354 235,6 223,8355 236,2 224,4356 237,0 225,2357 237,7 225,8358 238,4 226,5359 239,1 227,1360 239,8 227,8361 240,5 228,5362 241,2 229,1363 241,8 229,7364 242,5 230,4365 243,2 231,0366 243,9 231,7367 244,6 232,4368 245,2 232,9369 245,9 233,6370 246,6 234,3371 247,3 234,9372 248,0 235,6373 248,7 236,3374 249,4 236,9375 250,1 237,6376 250,8 238,3377 251,6 239,0

378 252,3 239,7379 253,0 240,4380 253,7 241,0381 254,4 241,7382 255,1 242,3383 255,8 243,0384 256,6 243,8385 257,3 244,4386 258,0 245,1387 258,7 245,8388 259,5 246,5389 260,2 247,2390 260,9 247,9391 261,6 248,5392 262,3 249,2393 263,1 249,9394 263,8 250,6395 264,5 251,3396 265,2 251,9397 265,9 252,6398 266,7 253,4399 267,4 254,0400 268,1 254,7401 268,8 255,4402 269,6 256,1403 270,3 256,8404 271,0 257,5405 271,8 258,2406 272,5 258,9407 273,2 259,5408 274,0 260,3409 274,7 261,0410 275,5 261,7411 276,2 262,4412 276,9 263,1413 277,7 263,8414 278,4 264,5415 279,1 265,1416 279,9 265,9417 280,6 266,6418 281,4 267,3419 282,2 268,1420 283,0 268,9421 283,7 269,5422 284,5 270,3423 285,2 270,9424 286,0 271,7425 286,8 272,5426 287,6 273,2427 288,3 273,9428 289,1 274,6429 289,9 275,4430 290,7 276,2431 291,4 276,8

104

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

432 292,2 277,6433 293,0 278,4434 293,8 279,1435 294,5 279,8436 295,3 280,5437 296,0 281,2438 296,8 282,0439 297,6 282,7440 298,4 283,5441 299,2 284,2442 299,9 284,9443 300,7 285,7444 301,4 286,3445 302,2 287,1446 303,0 287,9447 303,7 288,5448 304,5 289,3449 305,2 289,9450 306,0 290,7

7. NITRATOS Y NITRITOS

7.1. Principio.Tratamiento de la muestra con agua caliente,

precipitación de la grasa y proteína y filtración.Reducción en una porción del filtrado del nitra-

to a nitrito, por medio de una columna de cadmio.Desarrollo de una reacción coloreada en alícuotasdel filtrado no reducida, por adición de sulfanilami-da y cloruro de N-1-Naftiletilendiamina. Mediciónde la absorbancia de la solución obtenida a538 nm

7.2. Material y aparatos.7.2.1. Aparato apropiado para triturar la mues-

tra.7.2.2. Mezclador-homogeneizador con reci-

piente de vidrio de 250 y 400 ml.7.2.3. Papel de filtro de poro medio, de 15 cm

de diámetro, exento de nitratos y nitritos.7.2.4. Columna de reducción similar a la de la

figura (ver página siguiente).7.2.5. Colorímetro fotoeléctrico o espectrofotó-

metro que permita lecturas a una longitud deonda de 538 nm.

7.3. Reactivos.131020 Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO182108 Acido Clorhídrico 2 mol/l (2N) SV181023 Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV131669 Acido Etilendiaminotetraacético Sal

Disódica 2-hidrato PA-ACS-ISOSal Disódica 2-hidrato

131074 Agua PA-ACS131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA

Cadmio metal, gránulos ø ~ 0,3-0,8 mm131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO132751 N-(1-Naftil) Etilendiamina Diclorhidrato

PA131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato

PA-ACS131524 Potasio Nitrato PA-ISO131703 Sodio Nitrito PA132823 Sulfanilamida PA131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA

7.3.1. Gránulos de cadmio de diámetro aproxi-mado 0,3 a 0,8 mm.

7.3.2. Solución de Cobre II Sulfato 5-hidratoPA-ACS-ISO: Disolver 20 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a1.000 ml

7.3.3. Solución Tampón pH 9,6 a 9,7. Diluir 50 ml de Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO con600 ml de Agua PA-ACS. Después de mezclarañadir 140 ml de Amoníaco 25% (en NH3) PA.Diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS y mezclar.Ajustar el pH a 9,6-9,7, si es necesario.

7.3.4. Acido Clorhídrico 2 mol/l (2N) SV o diluir

105

M

Cobre I Lactosa LactosaOxido 1-hidrato anhidra (Cu2O) (C12H22O11.H2O) (C12H22O11)en mg en mg en mg

FiguraColumna de reducción de nitrato

Pinza deHoffman

Conectorlana devidrio

Dimensiones en milímetros

160 ml de Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO a1.000 ml con Agua PA-ACS.

7.3.5. Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV odiluir 50 ml de la solución 7.3.4. a 1.000 ml conAgua PA-ACS.

7.3.6. Solución de Zinc Sulfato 7-hidrato PA:Disolver 53,5 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA conAgua PA-ACS y diluir a 100 ml.

7.3.7. Solución de Potasio Hexacianoferrato II3-hidrato PA-ACS: Disolver 17,2 g de PotasioHexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS en AguaPA-ACS y diluir a 100 ml.

7.3.8. Solución de Acido Etilendiaminotetraa-cético Sal Disódica 2-hidrato PA-ACS-ISO: Disol-ver 33,5 g de Acido Etilendiaminotetraacético SalDisódica 2-hidrato PA-ACS-ISO (Na2C10H14N2O8 ·2H2O) en Agua PA-ACS y diluir a 1.000 ml.

7.3.9. Solución de Acido Clorhídrico (Sol.I):Diluir 540 ml de Acido Clorhídrico 37% PA-ACS-ISO a 1.000 ml con Agua PA-ACS.

7.3.10. Solución de Sulfanilamida (Sol. II):Disolver, calentando en baño de agua, 0,5 g deSulfanilamida PA (NH2C6H4SO2NH2) en una mez-cla de 75 ml de Agua PA-ACS y 5 ml de AcidoClorhídrico 37% PA-ACS-ISO. Enfriar a tempera-tura ambiente y diluir a 100 ml con Agua PA-ACS.Filtrar si es necesario.

7.3.11. Solución de N-(1-Naftil) EtilendiaminaPA (Sol. III): Disolver 0,1 g de N-1-(Naftil) Etilen-diamina Diclorhidrato PA en Agua PA-ACS. Diluir a100 ml con Agua PA-ACS. Filtrar si es necesario.Esta solución se puede conservar hasta unasemana en refrigerador en un recipiente oscurobien cerrado.

7.3.12. Solución patrón de Sodio Nitrito PA.Disolver en Agua PA-ACS 0,150 g de Sodio Nitri-to PA desecado a peso constante a 110-120ºC,diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS y mezclar. Enel momento de su empleo diluir 10 ml de estasolución con 20 ml de solución tampón (7.3.3.) ydiluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 1 ml de estasolución final contiene 1,00 g de NO2

-.7.3.13. Solución patrón de Potasio Nitrato PA-

ISO. Disolver en Agua PA-ACS 1,468 g de Pota-sio Nitrato PA-ISO desecado a peso constante a110-120ºC y diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS.En el momento de su empleo diluir 5 ml de la solu-ción tampón (7.3.3.) y diluir a 1.000 ml con AguaPA-ACS. 1 ml de esta solución final contiene 4,5 gde NO3

-.

7.4. Procedimiento.7.4.1. Preparación de la columna de cadmio.7.4.1.1. Llevar los gránulos de cadmio (aproxi-

madamente 40-60 g para cada columna) a unerlenmeyer de 250 ml. Añadir suficiente soluciónde Acido Clorhídrico 2 mol/l (2N) SV (7.3.4.) paracubrir el cadmio. Agitar durante unos minutos.Decantar la solución y lavar el cadmio en el matraz

con Agua PA-ACS, hasta que esté libre de cloru-ros.

Añadir la solución de Cobre II Sulfato 5-hidratoPA-ACS-ISO (aproximadamente 2,5 ml por g decadmio) y agitar durante un minuto Decantar lasolución y lavar el cadmio cuprizado inmediata-mente con Agua PA-ACS, teniendo cuidado deque el cadmio esté cubierto con Agua PA-ACS, entodo momento. Terminar el lavado cuando el AguaPA-ACS esté exenta de cobre precipitado.

7.4.1.2. Llenar la columna con Agua PA-ACS yllevar el cadmio cuprizado a la misma, con la míni-ma exposición al aire. La altura del cadmio debeser de 15 a 20 centímetros. Se debe evitar quequeden atrapadas burbujas de aire entre los grá-nulos de cadmio y que el nivel del líquido quedepor debajo de la parte superior del cadmio.

7.4.1.3. Acondicionar la columna haciendopasar una mezcla de 750 ml de Agua PA-ACS,225 ml de solución patrón de Potasio Nitrato PA-ISO (7.3.1.2.), 20 ml de solución tampón (7.3.3.) y20 ml de solución EDTA (7.3.8.) a un flujo nosuperior a 6 ml/min.

Lavar la columna con 50 ml de Agua PA-ACS.7.4.2. Comprobación de la capacidad de

reducción de la columna.7.4.2.1. Pipetear 20 ml de solución patrón de

Potasio Nitrato PA-ISO (7.3.1.2.) y llevarlos aldepósito superior de la columna. Añadir inmedia-tamente 5 ml de solución tampón (7.3.3.). Eluir aun flujo no superior a 6 ml/min. y recoger el eluidoen un matraz aforado de 100 ml. Cuando el depó-sito se ha vaciado casi completamente, lavar lasparedes del mismo con 15 ml de Agua PA-ACS yrepetir esta operación con otros 15 ml de AguaPA-ACS. Cuando esta segunda porción de Aguaha pasado a la columna, llenar completamente eldepósito con Agua PA-ACS y eluir con la máximavelocidad de flujo posible. Cuando se hayan reco-gido casi 100 ml retirar el matraz, completar hastael aforo y mezclar bien.

7.4.2.2. Pipetear 10 ml del eluido a un matrazaforado de 100 ml. Añadir Agua PA-ACS hasta unvolumen aproximado de 60 ml y proceder de laforma especificada en (7.4.8.). Si la concentraciónde nitrito en el eluido determinada a partir de lacurva de calibración (7.4.9.) está por debajo de0,63 g de NO2

- por ml (95% del valor teórico), sedebe regenerar la columna, 100% del rendimientocorresponde a 0,66 g de nitritos por ml.

7.4.3. Regeneración de la columna: La colum-na se debe regenerar cada día después de suempleo, o más frecuentemente si se observa unapérdida de eficacia, de la siguiente manera: Aña-dir 5 ml de la solución EDTA (7.3.8.) y 2 ml deAcido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV (7.3.5.) a100 ml de Agua PA-ACS. Pasar la mezcla a travésde la columna a un flujo aproximado de 10 ml/min.Cuando el depósito se ha vaciado, lavar la colum-

106

na con Agua PA-ACS, solución de Acido Clorhí-drico 0,1 mol/l (0,1N) SV y Agua PA-ACS sucesi-vamente.

Si la columna no muestra todavía una eficaciasatisfactoria, repetir el procedimiento especificadoen 7.4.1.3.

7.4.4. Preparación de la muestra: Antes delanálisis quitar la corteza o la capa superficial, demodo que se obtenga una muestra representativadel queso tal y como se consume habitualmente.Triturar la muestra con un triturador u otro apara-to apropiado y mezclar cuidadosamente, evitandolas pérdidas por evaporación.

La muestra así preparada se conservará en unrecipiente cerrado hasta el momento del análisis,que se realizará tan pronto como sea posible. Si elretraso es inevitable se deben tomar todas lasprecauciones para asegurar la conservación de lamuestra y para prevenir la condensación dehumedad en la superficie interior del recipiente.

7.4.5. Extracción y desproteinización.Pesar con precisión de 1 mg, 10 g de muestra

y llevarlos al recipiente de vidrio del mezclador-homogeneizador. Añadir gradualmente 164 ml deAgua PA-ACS a 50-55ºC. Mezclar hasta que elqueso esté bien suspendido. Añadir en el siguien-te orden: 6 ml de solución de Zinc Sulfato 7-hidra-to PA (7.3.6.), 6 ml de solución de Potasio Hexa-cianoferrato II 3-hidrato PA-ACS (7.3.7.) y 20 mlde solución tampón (7.3.3.) a la suspensión dequeso, agitando cuidadosamente después decada adición. Después de tres minutos filtrar a tra-vés del papel de filtro, recogiendo el filtrado en unErlenmeyer de 250 ml.

Es necesario obtener un filtrado transparente.Por esta razón, en algunos quesos puede ser nece-sario añadir una cantidad mayor de reactivos deprecipitación, disminuyendo en este caso la canti-dad de Agua PA-ACS en la misma proporción.

7.4.6. Reducción de nitrato a nitrito.Pipetear 20 ml del filtrado obtenido en el apar-

tado anterior y operar de la misma forma que enel apartado (7.4.2.1.)

7.4.7. Preparación de la solución para la deter-minación de nitrito en la muestra.

Pipetear 20 ml de filtrado del apartado 7.4.5.en un matraz aforado de 100 ml y completar conAgua PA-ACS. Mezclar bien.

7.4.8. Determinación colorimétrica.Pipetear alícuotas iguales dependiendo del

contenido probable en nitritos, de la solución7.4.7. y del eluido del apartado 7.4.6. en matracesaforados de 100 ml. Añadir Agua PA-ACS hastaun volumen aproximado de 60 ml. Añadir 5 ml desolución I (7.4.9.) y 5 ml de solución II (7.3.10.).Mezclar cuidadosamente y dejar reposar la solu-ción durante cinco minutos a temperatura am-biente protegiéndola de la luz solar directa.

Añadir 2 ml de solución III. Mezclar cuidadosa-mente y dejar reposar cinco minutos a temperatu-ra ambiente al abrigo de la luz solar directa. Com-pletar hasta 100 ml con Agua PA-ACS y mezclarbien. Medir en el plazo de quince minutosla absorbancia de la solución frente al ensayoen blanco (7.4.10.) a una longitud de onda de538 nm.

7.4.9. Curva de calibración.Pipetear 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 20 ml de la

solución patrón de Sodio Nitrito PA (7.3.12.) enmatraces aforados de 100 ml. Añadir Agua PA-ACS hasta un volumen aproximado de 60 ml. Lle-var a cabo el procedimiento descrito en (7.4.8.).Representar las absorbancias obtenidas frente alas concentraciones de nitrito, en microgramospor mililitro.

7.4.10. Ensayo en blanco.Llevar a cabo un ensayo en blanco usando

todos los reactivos, pero sustituyendo los 10 g demuestra por 4 ml de Agua PA-ACS.

7.5. Cálculo.7.5.1. Contenido en nitritos:

100.000 x c1Contenido en NO2

- (mg/kg) = ––––––––––––m x V

Siendo:m = Peso en gramos de la muestra.c1 = Concentración en microgramos de NO2

-

por ml, obtenidos a partir de la curva de calibra-ción, correspondiente a la absorbancia de la solu-ción obtenida usando el filtrado diluido (7.4.7.).

V = Volumen en ml de la alícuota tomada en(7.4.8.) sobre el filtrado diluido (7.4.7.).

7.5.2. Contenido en nitrato:

Contenido en NO3- (mg/kg) =

100.000 x c2 x r= 1,35 (––––––––––––––––– – NO2

-)m x V

Siendo:m = Peso en gramos de la muestra.c2 = Concentración en microgramos de NO2

-

por ml, obtenidos a partir de la curva de calibra-ción, correspondiente a la absorbancia de la solu-ción obtenida del eluido de la columna.

V = Volumen en ml de la alícuota tomada deleluido.

r = 100/rendimiento de la columna.

7.6. Referencias.7.6.1. Norma Internacional L FIL-IDF 84 A:

1984.

107

M

8. DETERMINACION DE LECHE DE VACAEN QUESO DE OVEJA O DE CABRA(Por electroforesis)

8.1. Principio.La fracción sérica de la muestra se extrae por

adición de solución tampón a pH 4,6 y posteriorcentrifugación. Las proteínas de suero son sepa-radas por electroforesis en gel de poliacrilamida apH 8,3.

Las b lactoglobulinas de leche de vaca pre-sentan una mayor movilidad electroforética de lasa lactoalbúminas y las b lactoglobulinas de laleche de oveja y de la leche de cabra. El métodoes aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura máxima de 90ºC durante treintasegundos, fresca o conservada mediante conge-lación o adición de dicromato potásico.

8.2. Material y aparatos.8.2.1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 coinciden con los apar-

tados 23(a)- 2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de los Métodosde Análisis de la Leche (ver página 43).

8.3. Reactivos.8.3.1., 2 y 3, coinciden con los apartados

23(a)- 3.1., 2 y 3 de los Métodos de Análisis de laLeche (ver página 43).

8.4. Procedimiento.8.4.1 Obtención de la fracción soluble a pH

4,6. Pesar 15 g de queso previamente triturado,añadir 5 ml de solución de Acido Acético glacialPA-ACS al 10% (8.3.1.) y 5 ml de solución deSodio Acetato 1 mol/l (1M) RE, homogeneizar ycomprobar con pH metro que el pH de la mezclaes exactamente 4,6. Centrifugar a 3.000 r.p.m.durante diez minutos y filtrar el sobrenadante através de un papel de filtro de velocidad media.

8.4.2. Preparación de la curva patrón.Dependiendo del tipo de muestra que se desea

analizar, partir de patrones de quesos puros deoveja o de cabra y de vaca, así como patrones dequesos de mezcla de vaca en oveja o de vaca encabra, en concentraciones del 5 por 100, 10 por100 y 20 por 100. La leche utilizada para la fabri-cación de estos quesos patrón podrá ser cruda opasterizada, en este último caso la leche deberáser pasterizada a una temperatura máxima de74ºC durante un tiempo máximo de treinta segun-dos. La fracción soluble de los patrones se obtie-ne siguiendo el procedimiento descrito en 8.4.1.

8.4.3. Inmediatamente antes de su aplicaciónen gel mezclar:

-Un volumen de la fracción soluble obtenidasegún 8.4.1.

-Un volumen de la solución de Glicerina (USP,BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX al 40% (8.3.2.7.).

-Medio volumen de la solución de Azul de Bro-mofenol RE-ACS al 1/1000 (8.3.2.6.).

8.4.4 Preparación del gel de poliacrilamida.Parar el gel laminar de espesor comprendido entre0,5 mm y 1 mm. Para 50 ml de la solución de Acri-lamida-Bisacrilamida, añadir 0,5 ml de solución deAmonio Peroxodisulfato PA al 10% (8.3.2.4.),desairear en un kitasato mediante vacío y añadircomo agente polimerizante 50 ml de TEMED(8.3.2.5.).

8.4.5. Electroforesis.Colocar el gel en el aparato de electroforesis y

llenar las cámaras de los electrodos con el tam-pón pH 8,3 (8.3.2.3.). Aplicar con microjeringa encada uno de los pocillos del gel un volumen com-prendido entre 10 ml y 20 ml de las solucionesobtenidas según 8.4.3., tanto de la muestra comode los patrones. La electroforesis se realiza a 60mA (220V) dejando correr el frente hasta que lalínea del azul de bromofenol esté a 0,5 mm delextremo inferior del gel. La duración es aproxima-damente de tres horas.

8.4.6. Métodos de tinción.8.4.6.1. Tinción con Azul Coomassie R-250.

Una vez completada la electroforesis, introducir elgel sucesivamente en:

1º La solución fijadora (8.3.3.1.1.): Una hora.2º La solución decolorante (8.3.3.1.2.): Diez

minutos.3º La solución de tinción (8.3.1.3.): Doce horas.4º La solución decolorante (8.3.3.1.2.), que se

renovará con frecuencia, hasta eliminar el fondo.8.4.6.2. Tinción con Azul de Coomassie G-

250. Una vez completada la electroforesis, intro-ducir el gel sucesivamente en:

1º La solución de fijación/tinción (8.3.3.2.1.):Doce horas.

2º Agua PA-ACS, que se renovará con frecuen-cia: Una hora.

8.5. Interpretación de los resultados.8.5.1. Identificación de las bandas.En el diagrama se observa el orden de las ban-

das de las proteínas de menor a mayor movilidadelectroforética en cada una de las especies:

Diagrama electroforético de las proteínas desuero de: 1) Leche de vaca, 2) Leche de cabra, 3)Leche de oveja.

1081

FE

DCB

A2 3

+

A) Seroalbúmina (BSA).B) b Lactoglobulina de cabra.C) a Lactoalbúmina (cabra y oveja).D) a Lactoalbúmina de vaca y b Lactoglobulina

de oveja.E) b Lactoglobulina B de vaca.F) b Lactoglobulina A de vaca.

8.5.2. y 8.5.3. coinciden con los apartados 23(a)-5.2. y 23(a)- 5.3. de los Métodos de Análisis de laLeche (ver página 45).

8.6. Expresión de los resultados.Expresar el contenido en leche de vaca según

los siguientes intervalos:-Menor del 5 por 100.-Entre el 5 y el 10 por 100.-Entre el 10 y el 20 por 100.-Mayor del 20 por 100.Siendo el límite de detección práctico del 3 por

100 en leche de vaca, en queso de oveja o enqueso de cabra.

8.7. Referencias.8.7.1., 2, 3 y 4 coinciden con los apartados 23(a)8.1., 2, 3 y 4 de los Métodos de Análisis de laLeche (ver página 45).

9. DETERMINACION DE LECHE DECABRA EN QUESO DE OVEJA(Por electroforesis)

9.1. Principio.La fracción sérica de la muestra se extrae por

adición de solución tampón a pH 4,6 y posteriorcentrifugación. Las proteínas de suero son separa-das por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH8,3.

La b lactoglobulina de leche de cabra presentauna menor movilidad electroforética que la a lac-toalbúmina y la b lactoglobulina de la leche deoveja.

9.2. Material y aparatos.9.2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 coinciden con los apar-

tados 23(a) 2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de los Métodosde Análisis de la Leche (ver página 43).

9.3. Reactivos.9.3.1., 2 y 3, coinciden con los apartados

23(a)- 3.1., 2 y 3 de los Métodos de Análisis de laLeche (ver página 43).

9.4. Procedimiento.9.4.1. como 8.4.1.9.4.2. Preparación de la curva patrón.Partir de patrones de quesos puros de oveja y

de cabra, así como de patrones de quesos demezcla de cabra en oveja, en concentraciones del5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la fabri-cación de estos quesos patrón podrá ser cruda o

pasterizada, en este último caso la leche deberáser pasterizada a una temperatura máxima de74ºC durante un tiempo máximo de treinta segun-dos. La fracción soluble de los patrones se obtie-ne siguiendo el procedimiento descrito en 9.4.1.

9.4.3., 4, 5 y 6 como 8.4.3., 4, 5 y 6.

9.5. Interpretación de los resultados.9.5.1. Identificación de las bandas.En el diagrama se observa el orden de las ban-

das de las proteínas de menor a mayor movilidadelectroforética en la leche de cabra y en la lechede oveja.

Diagrama electroforético de las proteínas desuero. 1) Leche de cabra, 2) Leche de oveja.

A) Seroalbúmina (BSA).B) b Lactoglobulina de cabra.C) a Lactoalbúmina (cabra y oveja).D) b Lactoglobulina de oveja.9.5.2. y 9.5.3. coinciden con los apartados

24(a) 5.2. y 24(a) 5.3. de los Métodos de Análisisde la Leche (pág. 47).

9.6. Expresión de los resultados.Expresar el contenido en leche de cabra según

los siguientes intervalos:-Menor del 5 por 100.-Entre el 5 y el 10 por 100.-Entre el 10 y el 20 por 100.-Mayor del 20 por 100.Siendo el límite de detección práctico del 3 por

100 de leche de cabra en queso de oveja.

9.7. Referencias.9.7.1., 2, 3 y 4 coinciden con los apartados

23(a) 8.1., 2, 3 y 4 de los Métodos de Análisis dela Leche (ver página 45).

109

M

+

– 1

DCBA

2

Yogur

I ORDEN DE 1 DE JULIO DE 1987 PORLA QUE SE APRUEBA LA NORMA DECALIDAD PARA EL YOGUR O YOGHOURTDESTINADO AL MERCADO INTERIOR.(B.O.E. 3-7-1987).

De conformidad con lo establecido en el Decre-to 1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regu-la la normalización de productos ganaderos en elmercado interior, y teniendo en cuenta los Decre-tos de Presidencia del Gobierno 2484/1967, de21 de septiembre, por el que se aprueba el textodel Código Alimentario Español y el 2519/1974,de 9 de agosto, sobre su entrada en vigor, aplica-ción y desarrollo, parece oportuno dictar la pre-sente Norma de Calidad para yogur o yoghourt.

En su virtud, previo informe de la Comisión In-terministerial para la Ordenación Alimentaria, deconformidad con los acuerdos del FORPPA y apropuesta de los Ministros de Economía y Hacien-da, de Agricultura, Pesca y Alimentación y deSanidad y Consumo,

Este Ministerio de Relaciones con las Cortes yde la Secretaría del Gobierno dispone:

Artículo único.- Se aprueba la Norma de Cali-dad para el yogur o yoghurt destinado al mercadointerior que se recoge en el anejo único de estaOrden.

DISPOSICIONES ADICIONALES

Primera.- Las determinaciones analíticas serealizarán de acuerdo con los métodos oficialesvigentes.

Cuando no existan métodos oficiales paradeterminados análisis y hasta tanto los mismos nosean propuestos por el órgano competente y pre-viamente informados por la Comisión Interministe-rial para la Ordenación Alimentaria, podrán ser uti-lizados los adoptados por los Organismos nacio-nales e internacionales de reconocida solvencia.

Segunda.- Los Departamentos competentesvelarán por el cumplimiento de lo dispuesto en lapresente Orden a través de sus órganos adminis-trativos encargados, que coordinarán sus actua-ciones, en todo caso, sin perjuicio de las compe-tencias que correspondan a las ComunidadesAutónomas y a las Corporaciones Locales.

DISPOSICION FINAL

La presente Orden entrará en vigor en todo elterritorio español a los treinta días de su publica-ción en el «Boletín Oficial del Estado».

DISPOSICION TRANSITORIA

El apartado 11 - Etiquetado y Rotulación– delanejo único no será de obligado cumplimiento,hasta transcurridos seis meses a partir de la fechade su publicación en el “Boletín Oficial del Esta-do”, teniendo hasta entonces el carácter de reco-mendado, sin perjuicio de lo dispuesto en el RealDecreto 2058/1982, de 12 de agosto.

Madrid, 1 de julio de 1987.

ZAPATERO GÓMEZ

Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pescay Alimentación, de Economía y Hacienda y deSanidad y Consumo.

ANEJO UNICONorma de Calidad para el yogur o yoghourt

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma de Calidad para el yogur o yoghourt.

2. OBJETO DE LA NORMA

La presente Norma tiene por objeto definir lascaracterísticas de calidad, envasado y presenta-ción que deben reunir los yogures para su ade-cuada comercialización en el mercado interior.

3. AMBITO DE APLICACIÓN

La presente Norma se aplicará a todos losyogures comercializados en todo el territorio es-pañol.

4. DEFINICIÓN

Se entiende por “yogur” o “yoghourt” el pro-ducto de leche coagulada obtenida por fermenta-ción láctica mediante la acción de lactobacillusbulgaricus y streptococcus thermophilus a partirde leche pasterizada, leche concentrada pasteri-zada, leche total o parcialmente desnatada paste-rizada, leche concentrada pasterizada total o par-cialmente desnatada, con o sin adición de natapasterizada, leche en polvo entera, semidesnata-da o desnatada, suero en polvo, proteínas deleche y/u otros productos procedentes del frac-cionamiento de la leche.

Los microorganismos productores de la fer-mentación láctica deben ser viables y estar pre-sentes en el producto terminado en cantidad míni-ma de 1 por 107 colonias por gramo o mililitro.

111

M

5. TIPOS DE YOGUR

Según los productos añadidos, antes o des-pués de la fermentación, los yogures pueden cla-sificarse de la siguiente forma:

5.1. Yogur natural.- Es el definido en el punto 4.5.2. Yogur azucarado.- Es el yogur definido en

el punto 4 al que se han añadido azúcar o azúca-res comestibles.

5.3. Yogur edulcorado.- Es el yogur definido enel punto 4 al que se han añadido los edulcorantesautorizados en esta Norma.

5.4. Yogur con fruta, zumos y/u otros produc-tos naturales.- Es el yogur definido en el punto 4al que se han añadido frutas, zumos y/u otros pro-ductos naturales.

5.5. Yogur aromatizado.- Es el yogur definidoen el punto 4 al que se han añadido agentes aro-máticos autorizados.

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. pH.- Todos los yogures deberán tener unpH igual o inferior a 4,6.

6.2. Materia grasa de leche.- Todos los yoguresdefinidos en el punto 5, tendrán en su parte lác-tea, un contenido mínimo de materia grasa deleche de 2 por 100 m/m. Los yogures definidos enel punto 5 que tengan en su parte láctea un con-tenido máximo de materia grasa láctea de 0,5 por100 m/m deberán llevar además la mención “des-natado”.

6.3. Extracto seco magro de leche.- Todos losyogures definidos en el punto 5 tendrán en suparte láctea, un contenido mínimo de extractoseco magro de leche de 8,5 por 100 m/m.

Asimismo, los yogures “desnatados”, cumpli-rán este requisito.

6.4. Contenido en yogur.- Para los yogures confrutas, zumos y/u otros productos naturales defi-nidos en el punto 5.4., la cantidad mínima deyogur en el producto terminado serán del 70 por100 m/m.

Para los yogures aromatizados definidos en elpunto 5.5., la cantidad mínima de yogur en el pro-ducto terminado será del 80 por 100 m/m.

9. NORMA MICROBIOLOGICA YCONTAMINANTES

9.1. Norma microbiológica para el yogur.9.1.1. Toma, transporte y conservación de

muestras.- La toma de muestras para los yoguresse hará por triplicado según la legislación vigentey de acuerdo con los siguientes métodos:

a) Como norma general, se tomarán 5 unida-des del mismo lote, para cada uno de los tres

ejemplares de la muestra. Cada unidad estaráconstituida por un envase original e íntegro.

b) Excepcionalmente, en los supuestos en queno fuese posible tomar el número de muestrasindicado en el apartado a), por falta de cantidadsuficiente de un mismo lote, se tomará una unidadpara cada ejemplar de la muestra.

c) En ambos casos, en el acta de toma demuestras deberán reflejarse las condiciones deconservación, la temperatura de la muestra y lafecha de caducidad.

El transporte de las muestras y su conserva-ción hasta el momento del análisis, se realizará atemperatura inferior a 10ºC, para que la muestramantenga, en todo momento, las característicasadecuadas al objeto de no desvirtuar la finalidadde aquél.

El análisis de los tres ejemplares deberá estariniciado antes de la fecha de caducidad.

La porción de la muestra que se tome para suanálisis, deberá ser representativa del conjunto desu respectiva unidad.

9.1.2. Tolerancias microbiológicas.- Las tole-rancias serán las indicadas en el cuadro siguiente:

Yogures definidos en:

n: Número de unidades de muestra de un loteque se analiza según el programa de muestreoestablecido.

c: Número de muestras que pueden rebasar ellímite m, sin ser superior al límite M.

m: Límite microbiológico que únicamente c delas n muestras pueden sobrepasar.

112

5.1., 5.2., 5.3. y 5.5.

n c m M

Enterobacteriáceaelactosa positivocolonias/g ................ 5 2 1.101 1.102

E. coli colonias/g ....... 5 2 1 1.101

Salmonella -Shigella/25 g............ 5 0 0 —

5.4.

n c m M

Enterobacteriáceaelactosa positivocolonias/g ................ 5 2 5.101 5.102

E. coli colonias/g ....... 5 2 5 10’ 5.101

Salmonella -Shigella/25 g............ 5 0 0 —

Se admite para este nivel una variabilidad:² 3 m para medio sólido.² 10 m para medio líquido.M: Nivel límite de aceptabilidad. Los valores

superiores a M no son satisfactorios.Los valores M se fijan en:M = 10 m para medios sólidos.M = 30 m para medios líquidos.Para las muestras tomadas según el procedi-

miento b) del apartado 9.1.1., las toleranciasserán las indicadas a continuación:

Yogures definidos en:

Estos valores son válidos para determinacionesen medios sólidos. Debido a la variabilidad de losresultados en medios líquidos, las toleranciasserán tres veces superiores.

9.2. Contaminantes.- Las tolerancias en resi-duos de plaguicidas y otros contaminantes entodos los ingredientes y en los productos termina-dos, no deberán sobrepasar los límites conteni-dos en la legislación vigente y, en su defecto, enlas Normas Internacionales aceptadas por el Esta-do español, que velará por su cumplimiento comogarante de las mismas, con la determinación yexigencia de responsabilidades en este punto porel órgano del Estado correspondiente.

Se admitirá la presencia de ácido benzoico deorigen natural y sus sales siempre que no excedala cantidad de 50 ppm.

NOTA: Los apartados 7. Materias primas y adi-ciones esenciales y facultativas, 8. Higiene, 10.Envasado, 11. Etiquetado y rotulación, 12. Prohi-biciones y 13. Responsabilidades, publicados eneste mismo B.O.E., no se han incluido en estarecopilación por carecer de interés analítico.

II METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 3-7-1987) EN TANTO NO SE ESTABLEZCANNORMAS ESPAÑOLAS PARA LA DETER-MINACION DE LAS ESPECIFICACIONESDE ESTA NORMA, SE UTILIZARAN LOSSIGUIENTES METODOS:

1. PREPARACION DE LA MUESTRA(Norma Chimie Ministerio deAgricultura francés XIV-1)

1.1. Principio.Esta operación consiste en la preparación de la

muestra de forma homogénea y a la temperaturaconveniente.

1.2. Modo operatorio.Vaciar la muestra al máximo posible, dentro de

un vaso o de un mortero seco.Homogeneizar el producto por batido y si es

fluido por transvasamientos sucesivos.Llevar a temperatura próxima a 20ºC.Efectuar rápidamente las tomas de ensayo

necesarias para las diferentes determinaciones,recogiendo el producto con la ayuda de una espá-tula antes de cada extracción.

Reducir al máximo la exposición de la muestraa la atmósfera ambiental.

Transvasar el resto de la muestra a un recipien-te herméticamente cerrado. Conservar a alrede-dor de 4ºC en previsión de otro análisis posterior.

1.3. Caso particular de los yogurs de frutas.Verter la muestra sobre un colador metálico

(abertura de mallas alrededor de 0,5 mm) con elfin de retener las frutas.

Proseguir las operaciones como se ha indicadoarriba.

2. DETERMINACION DEL CONTENIDOEN MATERIA GRASA(Método Acido-Butirométrico, Norma Chimie Ministerio de Agricultura francés XIV-3)

2.1. Objeto.Este método describe la técnica de determina-

ción del contenido en materia grasa de las lechesfermentadas. La muestra se diluirá bajo las condi-ciones que permitan expresar los resultados enporcentaje ponderal.

2.2. Principio.Separación de la materia grasa de la muestra

diluida, por centrifugación en un butirómetro,seguido de ataque con ácido sulfúrico de los ele-mentos de la leche, excepto la materia grasa. Laseparación de ésta se facilita por la adición de unapequeña cantidad de alcohol iso-amílico.

113

M

5.1., 5.2., 5.3. y 5.5. 5.4.

Entero-bacteriáceaelactosa positivocolonias/g........... 1.102 5.102

E. coli colonias/g .. 1.101 5.101

Salmonella -Shigella/25 g ...... 0 0

2.3. Reactivos.171010 Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber

RE131074 Agua PA-ACS171865 Alcohol iso-Amílico según Gerber mez-

cla de isómeros RE

2.3.1. Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE.2.3.2. Alcohol iso-Amílico según Gerber mezcla

de isómeros RE (exento de furfural d ~ 0,811).2.4. Aparatos.Material corriente de laboratorio y especial-

mente:2.4.1. Butirómetro para leche 0-4%, norma NF

B 35521 provisto de tapón apropiado.2.4.2. Pipeta para leche de 11 ml de descarga

única, norma NF B 35523.2.4.3. Medidor de ácido sulfúrico (descarga

10 ml) o pipeta de seguridad de 10 ml.2.4.4. Medidor de alcohol iso-amílico (descarga

1 ml) o pipeta de seguridad de 1 ml.2.4.5. Baño de agua a 65-70ºC para butirómetros.2.4.6. Centrífuga eléctrica para butirómetros de

leche. Esta centrífuga estando enteramente car-gada, debe alcanzar en dos minutos una veloci-dad tal que produzca una aceleración radial en elextremo exterior del tapón del butirómetro de 350± 50 veces a la aceleración debida a la gravedad.Una aceleración así, es producida, por ejemplo,por una centrífuga de diámetro 52 ± 1 cm (distan-cia entre las extremidades exteriores de los tapo-nes de los butirómetros opuestos diametralmente)operando a 1.100 ± 50 revoluciones por minuto.

La fórmula para calcular otras combinacionesentre el diámetro y la velocidad es la siguiente:

a = 11,81 x n2 x R

a es la aceleración radial, expresada en g, esdecir en múltiplos de la aceleración debida a lagravedad.

n es el número de revoluciones por minutodividido por 1.000.

R es el radio expresado en centímetros.

2.5. Modo operatorio.2.5.1. Preparación de la muestra.Dentro de un frasco aforado (2.4.7.), pesar con

precisión aproximada de 2 mg, alrededor de 50 gde muestra preparada según se indica en 10.1.Completar a 100 ml con Agua PA-ACS. Agitar yproceder a transvasamientos sucesivos paraobtener la solución lo más homogénea posible.

2.5.2. Determinación.2.5.2.1. Preparación del butirómetro:Introducir dentro del butirómetro (2.4.1.) 10 ml

de Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE(2.3.1.) evitando mojar el cuello.

Añadir con pipeta (2.4.2.) 11 ml de la soluciónobtenida en (2.5.1.) colocando la punta de la pipe-ta en contacto con la base del cuello del butiró-metro y evitando la mezcla prematura de la lechecon el ácido.

Verter sobre la superficie de la leche 1 ml deAlcohol iso-Amílico según Gerber mezcla de isó-meros RE (2.3.2.) teniendo cuidado de no mezclarlos líquidos ni de mojar el cuello del butirómetro.

Tapar el butirómetro.2.5.2.2. Agitación:Proceder a la agitación hasta que la caseína,

que coagula en el momento en que la leche semezcla con el ácido, esté enteramente disuelta.

Dejar el butirómetro en la posición que ocupa-ba antes de la agitación y esperar que la mezclarellene completamente el terminal de la ampolla;seguidamente proceder a dar la vuelta y esperar aque el terminal de la ampolla esté enteramentevacío; proceder dos veces más a estos rellenadosy vaciados alternativos de la ampolla.

Después de estos seis cambios sucesivos deposición del butirómetro, la agitación es suficientey la mezcla homogénea.

El butirómetro debe calentarse a alrededor de80ºC para facilitar la mezcla del ácido con la leche.Es necesario vigilar que no se produzca enfriamien-to importante a causa de la agitación por lo cualdebe efectuarse ésta lo más rápidamente posible.

2.5.2.3. Centrifugación:Inmediatamente después de la agitación prece-

dente y sin dejar enfriar el butirómetro, procédasea la centrifugación.

Si por cualquier circunstancia debe de aplazar-se el centrifugado, antes de proseguir es impres-cindible colocar el butirómetro, durante 5 minutoscomo mínimo, en el baño de agua (2.4.5.) y secar-lo antes de su colocación en la centrífuga (2.4.6.).

Al introducir el butirómetro en la centrífuga, ajustarel tapón de modo que antes de centrifugar, la colum-na de grasa se halle dentro de la escala graduada.

La duración efectiva del centrifugado debe serde 5 minutos.

2.5.2.4. Lectura:Una vez terminado el centrifugado, colocar el

butirómetro verticalmente, con el tapón abajo,dentro del baño de agua (2.4.5.) y dejarlo 5 minu-tos antes de proceder a la lectura. El nivel del aguadebe cubrir la ampolla terminal del butirómetro.

En el momento de introducir el butirómetro enel baño de agua, la columna de grasa debe loca-lizarse exactamente dentro de la escala graduada.Si es preciso modifíquese el ajuste del tapónhasta lograrlo.

Efectuar la lectura rápidamente (en menos de10 segundos) y bajo las siguientes condiciones:

a) Sacar el butirómetro del baño de agua,asiéndolo por su parte ancha, envolverlo con untrapo, y secando rápidamente el tubo graduado.

114

b) Estando el butirómetro en posición vertical,mover el tapón de tal forma que al examinar elplano inferior de la columna grasa, este planocoincida con una división. En principio es preferi-ble hacer descender la columna grasa que nohacerla subir. Asegurarse de que no se ha pro-yectado materia grasa dentro de la ampolla termi-nal, en el curso de esta manipulación.

c) Obtenida esta coincidencia, asegurar lainmobilidad de la columna de grasa al propio tiem-po que la del tapón.

d) Desplazar el butirómetro a la altura del ojo yleer el nivel por la parte más inferior del meniscosuperior de la columna de grasa;

e) Verificar inmediatamente el plano de separa-ción inferior de la columna grasa para asegurarque no se ha movido.

Si se ha desplazado, corregir la posiciónmoviendo adecuadamente el tapón.

f) Releer de la misma manera el nivel del menis-co superior. Si el plano inferior no se ha desplaza-do, esta segunda lectura debe coincidir con la pri-mera. Si este segundo valor difiere del primero,verificar nuevamente la posición del plano hori-zontal inferior y proceder a una tercera lectura. Esdel todo necesario llegar a este resultado: dos lec-turas consecutivas del menisco superior debendar el mismo valor. Esto prueba la constancia deposición del plano horizontal inferior.

g) Si el resultado no se obtiene en 10 segun-dos, sumergir el butirómetro en el baño de agua yrehacer la lectura al cabo de 2 o 3 minutos.

2.6. Expresion de resultados.2.6.1. Modo de cálculo.El contenido en materia grasa del producto

examinado, expresado en porcentaje en masa seobtiene aplicando la fórmula:

100(n' - n) –––––

M

donde:n' representa el valor alcanzado por el nivel

superior de la columna grasa.n representa el valor alcanzado por el nivel

inferior de la columna grasa.M la masa en g del producto pesado en la

operación (2.5.1.)

2.6.2. Precisión.La desviación máxima entre los resultados

obtenidos de determinaciones paralelas efectua-das por dos operadores debe ser de 0,05 g por100 g de producto.

3. DETERMINACION DE LA MATERIASECA(Método por secado, Norma ChimieMinisterio de Agricultura francésXIV-2)

3.1. Objeto.Este método describe la técnica de determina-

ción de materia seca en las leches fermentadas.3.2. Principio.Desecación a 103 ± 2ºC y pesado del residuo.

3.3. Reactivos.131019 Acido Clorhídrico 35% PA-ISO131074 Agua PA-ACS211160 Arena de mar lavada, grano fino QP211335 Gel de Sílice 3-6 mm con indicador QP

3.3.1. Purificar la Arena de mar lavada, granofino QP con Acido Clorhídrico diluido a 25%, lava-do con Agua PA-ACS y calcinar a alrededor de500ºC.

La arena debe atravesar el tamiz AFNOR n.º 28y ser retenida por el tamiz AFNOR n.º 23.

NOTA: Tamiz AFNOR n.º 28 equivale a 0,500mm B interior malla.

Tamiz AFNOR n.º 23 equivale a 0,160 mm Binterior malla.

3.4. Aparatos.3.4.1. Balanza analítica.3.4.2. Estufa provista de ventilación y de siste-

ma de regulación termostática que permita obte-ner una temperatura de 103 ± 2ºC en todos lospuntos de su interior.

3.4.3. Desecador provisto de deshidratante efi-caz (Gel de Sílice 3-6 mm con indicador QP).

3.4.4. Cápsulas cilíndricas de metal inoxidableo de vidrio, de alrededor 25 mm de altura.

3.4.5. Varilla de vidrio con una extremidadaplastada, cuya longitud no debe sobrepasar enmás de 1 cm el diámetro de la cápsula.

3.5. Modo operatorio.3.5.1. En la cápsula (3.4.4.) introducir 20 g de

arena lavada y una varilla de vidrio.3.5.2. Colocar en la estufa durante 1 hora.3.5.3. Dejar enfriar en el desecador y pesar.3.5.4. Introducir rápidamente dentro de la cáp-

sula alrededor de 5 g, pesados con precisión de1 mg, de muestra preparada según (1.).

3.5.5. Mezclar cuidadosa e íntimamente latoma de ensayo y la arena con la ayuda de la vari-lla de vidrio.

3.5.6. Colocar la cápsula en la estufa durante 5horas.

3.5.7. Dejar enfriar en el desecador y pesar.3.5.8. Repetir este secado a periodos de 1

hora hasta peso constante (las desviaciones nodeben sobrepasar los 2 mg).

115

M

En caso de aumento de peso, tomar para elcálculo el peso más bajo obtenido.

En la práctica, un solo secado de 15 horas enla estufa, proporciona los mismos resultados.

3.6. Expresión de resultados.3.6.1. Modo de cálculo.La materia seca expresada en porcentaje en

peso, se obtiene por la fórmula siguiente:

100(M - m) –––––

Edonde:

M representa la masa en gramos de la cápsu-la y de su contenido después de la operación(3.5.8.).

m representa la masa en gramos de la cápsu-la y de su contenido después de la operación(3.5.3.).

E representa la masa en gramos de la mues-tra.

3.6.2. Precisión.La pérdida máxima entre las determinaciones

paralelas efectuadas por dos operadores distin-tos, debe ser de 0,3 g por 100 g de muestra.

4. IDENTIFICACION DE COLORANTES,EDULCORANTES, ESPESANTES YCONSERVADORES

Métodos seleccionados y recomendados por elCentro Nacional de Alimentación y Nutrición.

5. ANALISIS MICROBIOLOGICO

- Recuento de coliformes- Escherichia coli- Estafilococos aureus- Estreptococos D. de Lancefield- Gérmenes sulfito-reductores (Cl. Perfringens)- Hongos- Examen al microscopioMétodos seleccionados y recomendados por el

Centro Nacional de Alimentación y Nutrición.

6. FENOLFTALEINA(Método cualitativo)

6.1. Principio.Extracción y concentración de la fenolftaleína

presente en el alimento e identificación por viraje acolor rojo en medio alcalino que desaparece enmedio ácido. La separación y concentración de lafenolftaleína se realiza por extracción etérea ysoluciones alcalinas.

6.2. Material y aparatos.6.2.1. Centrífuga que alcance 3.000 r.p.m.6.2.2. Aparato de destilación.

6.3. Reactivos.131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO131074 Agua PA-ACS132770 Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm

de BHT PA-ACS131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO6.3.1. Eter Dietílico estabilizado con ~6 ppm de

BHT PA-ACS.6.3.2. Sodio Hidróxido solución 1%. Disolver

Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO en AguaPA-ACS y diluir hasta 1%.

6.3.3. Acido Sulfúrico solución 1%. Diluir AcidoSulfúrico 96% PA-ISO con Agua PA-ACS hasta 5%.

6.4. Procedimiento.Pesar 50 g de la muestra, reducida a polvo, si es

necesario, y llevar a un matraz erlenmeyer de250 ml de capacidad. Añadir 50 ml de Eter Diétíli-co estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS. Agi-tar suavemente durante 3 a 5 minutos.

Centrifugar la mezcla así obtenida a 1.500-2.000 r.p.m. durante diez minutos. Recoger el líqui-do sobrenadante.

Volver a emulsionar el sedimento con nuevaaportación de Eter Diétílico estabilizado con ~6ppm de BHT PA-ACS, agitando durante dos-tresminutos.

Centrifugar en las mismas condiciones y recogerel sobrenadante añadiéndolo a la centrifugaciónanterior.

Repetir esta operación por tercera vez. Reunirtodas las porciones de extracto etéreo y destilarpara eliminar el éter, tomando las precaucioneshabituales en este tipo de destilación. Queda unresiduo graso abundante.

Añadir al residuo graso solución acuosa deSodio Hidróxido solución 1%. Agitar suavementedurante 2-3 minutos. Si es necesario, calentandosuavemente.

Centrifugar la emulsión obtenida a 2.000-3.000r.p.m. durante cinco minutos.

Eliminar la capa superior grasa y tomar la frac-ción acuosa inferior. Cuando el producto contengaFenolftaleína, la capa acuosa presenta una colora-ción rojo-rosada que desaparece al acidificar conAcido Sulfúrico solución 5% y vuelve a reaparecersi se alcaliniza el medio.

116

Cuajada

M

ORDEN DE 14 DE JUNIO DE 1983 PORLA QUE SE APRUEBA LA NORMA DECALIDAD PARA LA CUAJADA EN ELMERCADO INTERIOR.

Excelentísimos señores:De acuerdo con lo dispuesto en el Decreto

1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regula lanormalización de productos ganaderos en el mer-cado interior, y teniendo en cuenta los Decretos2484/1967, de 21 de septiembre, por el que seaprueba el texto del Código Alimentario Español, yel 2519/1974, de 9 de agosto, sobre su entrada envigor, aplicación y desarrollo, parece oportuno dic-tar la presente norma de calidad, aprobada por laComisión Especializada de Normalización de Pro-ductos Ganaderos, visto el informe de la ComisiónInterministerial para la Ordenación Alimentaria yde conformidad con los acuerdos del FORPPA.

En su virtud, a propuesta de los Ministros deAgricultura, Pesca y Alimentación, de Economía yHacienda y de Sanidad y Consumo, esta Presi-dencia del Gobierno dispone:

Primero.- Se aprueba la Norma de Calidad parala Cuajada en el mercado interior que figura en elanejo único de esta Orden.

Segundo.- La toma de muestras, así como lasdeterminaciones analíticas, se realizarán deacuerdo con los métodos oficiales vigentes.

Tercero.- La presente Orden entrará en vigor entodo el territorio nacional al año de su publicaciónen el "Boletín Oficial del Estado".

Cuarto.- Los departamentos competentesvelarán por el cumplimiento de lo dispuesto en lapresente Orden a través de sus órganos adminis-trativos encargados, que coordinarán sus actua-ciones, en todo caso, sin perjuicio de las compe-tencias que correspondan a las ComunidadesAutónomas y a las Corporaciones Locales.

Lo que comunico a VV. EE. para su conoci-miento y efectos.

Dios guarde a VV. EE. muchos años.Madrid, 14 de junio de 1983.

MOSCOSO DEL PRADO Y MUÑOZ

Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pescay Alimentación, de Economía y Hacienda y deSanidad y Consumo.

ANEJO UNICONorma de Calidad para la Cuajada

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma de Calidad para la Cuajada.

2. OBJETO DE LA NORMA

Esta Norma tiene por objeto definir las condi-ciones y características que debe reunir el pro-ducto cuajada para su adecuada comercializacióny consumo en el mercado interior.

3. AMBITO DE APLICACION

La presente Norma se aplicará a la cuajadadestinada a su comercialización en el mercadointerior.

4. DEFINICION

Se entiende por cuajada el producto semisóli-do obtenido de la leche sometida a tratamientotérmico adecuado para conseguir las característi-cas bacteriológicas que se fijan posteriormente,entera o desnatada total o parcialmente, coagula-da por la acción del cuajo u otros enzimas coagu-lantes autorizados, sin adición de fermentos lácti-cos y sin proceso de desuerado.

5. DENOMINACIONES

5.1. En la denominación, después de la palabra"cuajada" debera figurar la indicación de la especieo especies animales de las que proceda la lecheempleada por orden descendente de proporcio-nes, en caracteres perfectamente claros y legibles.

5.2. Según el contenido en materia grasa,expresado en porcentaje en masa de la materiagrasa sobre la masa del producto final, las cuaja-das se denominarán:

- Extragrasa: La que contenga más del 5,5%de materia grasa.

- Grasa: La que contenga más del 3,5% y unmáximo del 5,5% de materia grasa.

- Magra: La que contenga más del 1,5% y unmáximo del 3,5% de materia grasa.

- Desnatada: La que contenga un máximo del1,5% de materia grasa.

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. Ingredientes esenciales:Uno.- Leche pasterizada o U.H.T. entera, semi-

desnatada o desnatada concentrada o no deoveja, cabra, vaca o sus mezclas.

Dos.- Cuajo animal o coagulante vegetal.

6.2. Ingredientes facultativos:6.2.1. Leche en polvo entera, semidesnatada o

desnatada en cantidad que permita ajustar elextracto seco total.

118

6.2.2. Nata, para poder satisfacer los requisitosdel contenido en materia grasa.

6.2.3. Gelatina, en dosis máxima de 7 g porkilogramo de cuajada.

6.3. Extracto seco total mínimo: 15% expresa-do en masa/masa sobre el producto terminado.

6.4 Indices.Las características fisicoquímicas de la grasa

estarán comprendidas entre los siguientes valo-res:

6.4.1. Para la cuajada de vaca:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4540 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 1 a 4.Indice de Kirchner: De 19 a 27.6.4.2. Para la cuajada de cabra:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4520 a

1,4545.Indice de Reichert: De 21 a 28.Indice de Polenske: De 5 a 9.Indice de Kirchner: De 14 a 21.6.4.3. Para la cuajada de oveja:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4530 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 5 a 8.Indice de Kirchner: De 19 a 27.

Para la cuajada de vaca, cabra y oveja el límitemínimo de colesterol, dentro de los esteroles, seráde un 98%.

8. CONTAMINANTES

Los siguientes niveles de contaminación relati-vos a la higiene alimentaria de estos productoshan sido sancionados por la Subsecretaría para laSanidad del Ministerio de Sanidad y Consumo.

En virtud del artículo 14 del Real Decreto3302/1978, de 22 de diciembre, dicha Subsecre-taría para la Sanidad podrá modificar en cualquiermomento la presente relación de contaminantesmediante Resolución.

8.1. Normas microbiológicas aplicables a cua-jadas.

Recuento de colonias aerobias mesófilas (30º± 1ºC), máximo 1 x 105 col./g.

Enterobacteriaceae, máximo: 1 x 102 col./g.Escherichia coli, máximo: 1 x 101 col./g.Salmonella-Shigella: Ausencia col./25 g.Staphylococcus aureus enterotoxigénico,

máximo: 1 x 102 col./g.

8.2. Criterios aplicables a contaminantes y sus-tancias tóxicas.

La tolerancia de productos contaminantes ysustancias tóxicas no deberán sobrepasar loscontenidos en la legislación vigente y, en sudefecto, los contenidos en las normas internacio-nales aceptadas por el Estado español.

NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados, 9.Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12. Eti-quetado y rotulación y 13. Responsabilidades,publicados en este mismo B.O.E., no se han inclui-do en esta recopilación por carecer de interés ana-lítico.

119

M

Nata

ORDEN DE 12 DE JULIO DE 1983 PORLA QUE SE APRUEBAN LAS NORMASGENERALES DE CALIDAD PARA LANATA Y NATA EN POLVO CON DESTINOAL MERCADO INTERIOR.

Excelentísimos señores:De conformidad con lo dispuesto en el Decreto

1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regulala normalización de productos ganaderos en elmercado exterior, y teniendo en cuenta los Decre-tos de Presidencia del Gobierno 2484/1967, de21 de septiembre, por el que se aprueba el textodel Código Alimentario Español, y el 2519/1974,de 9 de agosto, sobre su aplicación, desarrollo yentrada en vigor, parece oportuno dictar las pre-sentes normas de calidad, visto el informe de laComisión Interministerial para la Ordenación ali-mentaria y de conformidad con los acuerdos delFORPPA.

En su virtud, a propuesta de los Ministros deAgricultura, Pesca y Alimentación, de Economía yHacienda y de Sanidad y Consumo, esta Presi-dencia del Gobierno dispone:

Primero.- Se aprueban las Normas Generalesde Calidad para la nata y nata en polvo con desti-no al mercado interior, recogidas, respectivamen-te, en los anejos 1 y 2 de esta Orden.

Segundo.- La toma de muestras, así como lasdeterminaciones analíticas, se realizarán deacuerdo con los métodos oficiales vigentes.

Tercero.- Los departamentos competentesvelarán por el cumplimiento de lo dispuesto en lapresente Orden a través de sus órganos adminis-trativos encargados, que coordinarán sus actua-ciones; en todo caso, sin perjuicio de las compe-tencias que correspondan a las ComunidadesAutónomas y a las Corporaciones Locales.

Cuarto.- Las presentes Normas entrarán envigor en todo el territorio del Estado español a losdoce meses de su publicación en el "Boletín Ofi-cial del Estado", excepto lo dispuesto en los apar-tados 12. "Etiquetado y rotulación" de las mismas,que lo harán en las fechas previstas para el títuloIV del Real Decreto 2058/1982, de 12 de agosto,por el que se aprueba la Norma General de Eti-quetado, Presentación y Publicidad de los Pro-ductos Alimenticios Envasados.

Quinto.- A la entrada en vigor de las presentesnormas quedan derogadas cuantas disposicionesde igual o inferior rango se opongan a la presenteOrden en los aspectos que regula.

Lo que comunico a VV. EE. para su conoci-miento y efectos.

Dios guarde a VV. EE. muchos años.Madrid, 12 de julio de 1983.

MOSCOSO DEL PRADO Y MUÑOZ

Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pescay Alimentación, de Economía y Hacienda y deSanidad y Consumo.

ANEJO 1

Norma General de Calidad para la Nata

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma General de Calidad para la Nata.

2. OBJETO DE LA NORMA

La presente Norma tiene por objeto definiraquellas condiciones y características que debereunir la nata para su comercialización y consumoen el mercado interior.

3. AMBITO DE APLICACION

La presente Norma General abarca a la natadestinada a su comercialización en el mercadointerior, con excepción de la nata en polvo.

4. DEFINICION

Se entiende por nata en general al productolácteo rico en materia grasa separado de lasleches de las especies animales a que luego sealude, que toma la forma de una emulsión del tipograsa en agua.

La nata se elaborará con leche procedente deanimales que no padezcan procesos infecciosospeligrosos para la salud pública y forzosamentehabrá de ser sometida a un tratamiento que ase-gure la destrucción de los gérmenes patógenos.

5. DENOMINACIONES

5.1. Por su origen.5.1.1. Nata o nata de vaca: cuando proceda

exclusivamente de leche de vaca.5.1.2. La nata que se fabrique con leche de

oveja, leche de cabra o mezcla de ambas entre síy con la de vaca, deberá incluir en su denomina-ción, después de la palabra "nata", la indicaciónde la especie o especies animales de las que pro-ceda la leche empleada por orden descendentede proporciones en caracteres claros y legibles.

5.2. Por su composición.Según el contenido en materia grasa, expresa-

do en porcentaje en masa de materia grasa sobremasa del producto final, las natas se denomina-rán:

121

M

5.2.1. Doble nata: La que contenga un mínimode materia grasa del 50%.

5.2.2. Nata: La que contenga un mínimo demateria grasa del 30% y menos del 50%.

5.2.3. Nata delgada o ligera: La que contenga unmínimo de materia grasa del 12% y menos del 30%.

Cuando la nata contenga productos añadidosautorizados, la determinación del porcentaje demateria grasa se efectuará sobre la parte láctea,descontando dichos añadidos.

5.3. Por su tratamiento higiénico y conserva-ción.

5.3.1. Nata pasterizada: Se entiende por natapasterizada la sometida a un tratamiento térmicoen condiciones tales de temperatura y tiempo queaseguren la total destrucción de los gérmenespatógenos y la casi totalidad de la flora banal sinmodificación sensible de su naturaleza fisicoquí-mica y cualidades nutritivas.

El tratamiento térmico para la nata delgada oligera se realizará a los mínimos de 75ºC durantequince segundos y máximo de 80ºC, y para losdemás tipos, a los mínimos de 80ºC, durantequince segundos y máximo de 85ºC.

No obstante, estas relaciones de temperatura ytiempo no excluyen otras que demuestren serigualmente eficaces para el cumplimiento delapartado 8.1. de esta norma ni otros procesos depasterización previamente autorizados por losMinisterios de Agricultura, Pesca y Alimentación yde Sanidad y Consumo.

5.3.2. Nata esterilizada. Se entiende por nataesterilizada la sometida en el mismo envase enque se suministra al consumidor a tratamientotérmico que asegure la destrucción de los gér-menes y la inactividad de sus formas de resisten-cia.

El tratamiento térmico se realizará a los míni-mos:

108ºC ................ 45 minutos114ºC ................ 25 "116ºC ................ 20 "

No obstante, estas relaciones de temperatura ytiempo no excluyen otras que demuestren serigualmente eficaces para cumplir el apartado 8.1.de esta norma ni otros procedimientos de esterili-zación previamente autorizados por los Ministe-rios de Agricultura, Pesca y Alimentación y deSanidad y Consumo.

5.3.3. Nata UHT: Se entiende por nata UHT lasometida, en circulación continua, a tratamientotérmico que asegure la destrucción de los gérme-nes y la inactivación de sus formas de resistencia,siendo posteriormente envasada en condicionesasépticas. El tratamiento térmico se realizará a losmínimos de 132ºC durante dos segundos.

No obstante, esta relación de temperatura ytiempo no excluye otras que demuestren serigualmente eficaces para el cumplimiento delapartado 8.1. de esta norma ni otros procedi-mientos previamente autorizados por los Ministe-rios de Agricultura, Pesca y Alimentación y deSanidad y Consumo.

5.3.4. Nata pasterizada envasada bajo presión:Es la nata pasterizada envasada y acondicionadabajo presión de gases inertes para su venta enrecipientes estancos.

5.3.5. Nata esterilizada envasada bajo presión:Es la nata esterilizada envasada y acondicionadabajo presión de gases inertes para su venta enrecipientes estancos.

5.3.6. Nata UHT envasada bajo presión: Es lanata UHT envasada bajo presión de gases inertespara su venta en recipientes estancos.

5.3.7. Nata congelada: Es la nata pasterizada yenvasada, azucarada o no, sometida a un proce-so rápido de congelación que permita alcanzar almenos -18ºC en el centro de su masa.

Su almacenamiento y transporte deberá hacer-se a temperatura no superior a -15ºC.

5.4. Nata homogeneizada.Cualquiera de las natas anteriores sometidas a

un proceso mecánico que subdivida los glóbulosgrasos y asegure una mejor emulsión.

5.5. Por distintas incorporaciones.Todos los tipos de nata que se relacionan a

continuación habrán de ser sometidos a algunosde los tratamientos contemplados en el apartado5.3. de esta norma, sean o no homogeneizados.

5.5.1. Batida o montada: Con adición de aire ogases inocuos.

5.5.2. Para batir o montar: La acondicionadapara tal fin.

5.5.3. Azucarada: Con adición de azúcares.5.5.4. Aromatizada: Con adición de aromas.5.5.5. Con frutas u otros alimentos naturales.5.5.6. Acida o acidificada: la acidificada por

adición de fermentos lácticos.

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. Ingredientes esenciales.Leche de vaca, oveja o cabra o sus mezclas.

6.2. Ingredientes facultativos.6.2.1. Sacarosa y/o glucosa en proporción

total no superior al 15% en masa con respecto alproducto terminado, en las natas azucaradas.

6.2.2. Sustancias aromáticas naturales o idén-ticas naturales en las natas aromatizadas.

6.2.3. Frutas y otros alimentos naturales.

122

6.3. Características fisicoquímicas.6.3.1. Organolépticas: La nata dispuesta para

su venta deberá presentar las siguientes caracte-rísticas: Consistencia líquida más o menos visco-sa, excepto la "nata batida" o "montada" que pre-sentará consistencia semisólida.

Color blanco amarillento.Sabor u olor característicos.6.3.2. Intrínsecas.Contenido mínimo en materia grasa de leche,

12%. La composición del extracto seco de la frac-ción no grasa de las distintas natas, descontandoel correspondiente al de los ingredientes facultati-vos y aditivos añadidos, será la misma que la delextracto seco magro de la leche natural de parti-da.

Acidez, expresada en peso de ácido láctico por100 de nata en volumen de la parte no grasa,0,25% como máximo, excepto para la nata acidi-ficada, que podrá ser del 0,65% como máximo.

Impurezas macroscópicas, grado 0.Las características fisicoquímicas de la grasa

estarán comprendidas entre los siguientes valo-res:

a) Para la nata de vaca:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4540 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 1 a 4.Indice de Kirchner: De 19 a 27.

b) Para la nata de oveja:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4530 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 5 a 8.Indice de Kirchner: De 19 a 27.

c) Para la nata de cabra:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4520 a

1,4545.Indice de Reichert: De 21 a 28.Indice de Polenske: De 5 a 9.Indice de Kirchner: De 14 a 21.Tanto para la nata de vaca como para las de

oveja y cabra el límite mínimo de colesterol, den-tro de los esteroles, será del 98% de la fracciónesterólica del insaponificable, determinados porcromatografía gaseosa.

8. NORMA MICROBIOLOGICA YCONTAMINANTES

8.1. Norma microbiológica.Las siguientes normas microbiológicas, relati-

vas a la higiene alimentaria de estos productos,han sido aprobadas por la Subsecretaría de Sani-dad del Ministerio de Sanidad y Consumo.

En virtud del artículo 14 del Real Decreto3302/1978, de 22 de diciembre, dicha Subsecre-taría podrá, atendiendo a motivaciones de saludpública, modificar en cualquier momento la pre-sente relación, mediante la Resolución correspon-diente.

a) Criterio microbiológico para natas pasteriza-das.

Recuento de colonias aerobias:Mesófilas (31±1ºC): Máximo 1 x 105 colonias/g.Enterobacteriaceae totales: Máximo 1 x 101

colonias/g.Escherichia coli: Ausencia/g.Salmonella-Shigella: Ausencia/25 g.St. aureus enterotoxigénico: Máximo 1 x 101/g.Otros gérmenes patógenos: Ausencia. Prueba de la fosfatasa: Negativa.Además, el producto deberá estar exento de

toxinas microbianas peligrosas.b) Criterio microbiológico para natas esteriliza-

das.No debe haber ningún crecimiento microbiano

después de ser sometido el producto a pruebasde preincubación a 31±1ºC y 55ºC durante seten-ta y dos horas.

8.2. Contaminantes.La tolerancia de productos contaminantes y

sustancias tóxicas no deberá sobrepasar los con-tenidos en la legislación vigente, y en su defecto,los contenidos en las normas internacionalesaceptadas por el Estado español.

NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados,9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12.Etiquetado y Rotulación, 13. País de origen y 14.Responsabilidades, publicados en este mismoB.O.E., no se han incluido en esta recopilaciónpor carecer de interés analítico.

ANEJO 2

NORMA GENERAL DE CALIDAD DE LANATA EN POLVO

1. NOMBRE DE LA NORMA

Norma General de Calidad de la Nata en Polvo.

2. OBJETO DE LA NORMA

La presente Norma tiene por objeto definiraquellas condiciones y características que debereunir la nata en polvo para su comercialización yconsumo en el mercado interior.

123

M

3. AMBITO DE APLICACION

La presente Norma General abarca a la nata enpolvo destinada a su comercialización en el mer-cado interior.

4. DEFINICION

Se entiende por nata en polvo el producto secoy pulverulento que se obtiene mediante la deshi-dratación de la nata, pasterizada al estado líquido,antes o durante el proceso de fabricación.

5. DENOMINACIONES

5.1. Por su origen.5.1.1. Nata en polvo o nata en polvo de vaca:

Cuando procede exclusivamente de leche devaca.

5.1.2. La nata en polvo que se fabrique conleche de oveja, leche de cabra, o mezcla deambas entre sí y con la de vaca, deberá incluir ensu denominación, después de la palabra "nata", laindicación de la especie o especies animales delas que procede la leche empleada por orden des-cendente de proporciones, en caracteres claros ylegibles.

5.2. Por su composición.Según el contenido de materia grasa, expresa-

do en porcentaje en masa de materia grasa sobremasa del producto final, las natas se denomina-rán:

5.2.1. Nata en polvo: La que contenga un míni-mo de materia grasa de la leche del 65% y unmáximo de agua del 5%.

5.2.2. Nata delgada o ligera en polvo: La quecontenga un mínimo de materia grasa de la lechedel 50% y menos del 65%, así como un conteni-do máximo de agua del 5%.

6. FACTORES ESENCIALES DECOMPOSICION Y CALIDAD

6.1. Ingredientes esenciales.Nata de vaca, oveja, cabra o sus mezclas.

6.2. Características fisicoquímicas:6.2.1. Organolépticas: La nata en polvo dis-

puesta para su venta deberá presentar lassiguientes características:

Consistencia pulverulenta. Color blanco amarillento.6.2.2. Intrínsecas:Contenido mínimo de materia grasa de la

leche, 50%.La naturaleza del extracto seco de la fracción

no grasa de la nata en polvo, descontando el

correspondiente al de los aditivos añadidos, seráidéntica a la del extracto seco magro de la lechedesnatada en polvo.

La acidez máxima, expresada en gramos deácido láctico por 100 gramos, vendrá dada por lafórmula 1,874-0,0163 G, en la que G representa elporcentaje de grasa.

Impurezas macroscópicas: Ausencia.Las características fisicoquímicas de la grasa

estarán comprendidas entre los siguientes valo-res:

a) Para la nata en polvo de vaca:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4540 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 1 a 4.Indice de Kirchner: De 19 a 27.b) Para la nata en polvo de cabra:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4520 a

1,4545.Indice de Reichert: De 21 a 28.Indice de Polenske: De 5 a 9.Indice de Kirchner: De 14 a 21.c) Para la nata en polvo de oveja:Indice de refracción a 40ºC: De 1,4530 a

1,4557.Indice de Reichert: De 26 a 32.Indice de Polenske: De 5 a 8.Indice de Kirchner: De 19 a 27.Tanto para la nata en polvo de vaca como para

las de cabra y oveja el límite mínimo de colesterolde los esteroles será del 98% de la fracción este-rólica del insaponificable determinados por cro-matografía gaseosa.

8. NORMA MICROBIOLOGICA YCONTAMINANTES

8.1. Norma microbiológica.Las siguientes norma microbiológica, relativa a

la higiene alimentaria de este productos, ha sidosancionada por la Subsecretaría de Sanidad, delMinisterio de Sanidad y Consumo.

En virtud del artículo 14 del Real Decreto3302/78, de 22 de diciembre, dicha Subsecreta-ría podrá, atendiendo a motivaciones de saludpública, modificar en cualquier momento la pre-sente Norma mediante la Resolución correspon-diente.

Norma microbiológica aplicable a la nata enpolvo:

Recuento de colonias aerobias mesófilas 31± 1ºC: Máximo 1.105 colonias/g.

Enterobacteriaceae totales: Máximo 1.101

colonias/g.Eschericchia coli: Ausencia/g.St. aureus enterotoxigénico: Máximo 1.101

colonias/g.Salmonella-Shigella: Ausencia/25 g.

124

Otros gérmenes patógenos: Ausencia.Prueba de la fosfatasa: Negativa.

8.2. Contaminantes.Las tolerancias de productos contaminantes y

sustancias tóxicas no deberán sobrepasar lascontenidas en la legislación vigente, y en sudefecto, las contenidas en las normas internacio-nales aceptadas por el Estado español.

NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados,9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12.Etiquetado y Rotulación, 13. País de origen y 14.Responsabilidades, publicados en este mismoB.O.E., no se han incluido en esta recopilaciónpor carecer de interés analítico.

125

M

Relación de reactivosy productos auxiliaresque se utilizan en losmétodos analíticos,Leche y ProductosLácteos

NOTA: Algunos de los reactivos recomendados enlos métodos analíticos previamente descritos hanmodificado su código y mejorado su calidad. Ade-más se han producido nuevas incorporaciones.Por favor, consulte este anexo antes de efectuarsu pedido. Es la versión actualizada de la ofertade productos suministrables en Mayo de 1999.

REACTIVOS Y PRODUCTOS AUXILIARES QUE HAN CAMBIADO DE CÓDIGO

ANTERIOR ACTUAL

172222 Acido Bórico 4% RE 282222 Acido Bórico solución 4% RV171010 Acido Súlfurico 90-91% según Gerber RE 121010 Acido Súlfurico 90-91% según Gerber PA253309 Acrilamida DC 373309 Acrilamida PB171865 Alcohol iso-Amílico según Gerber mezcla

de isómeros RE 121079 3-Metil-1-Butanol según Gerber PA171096 Almidón soluble RE 121096 Almidón de Patata soluble PA131129 Amoníaco 25% (en NH3) PA 121129 Amoníaco 25% (en NH3)171165 Azul de Bromofenol RE-ACS 131165 Azul de Bromofenol PA-ACS171168 Azul de Bromotimol solución 0,04% RE 281168 Azul de Bromotimol solución 0,04% RV251274 Colesterol DC 371274 Colesterol PB131086 Etanol absoluto PA 121086 Etanol absoluto PA131085 Etanol 96% v/v PA 121085 Etanol 96% v/v PA171327 Fenolftaleína solución 1% RE 281327 Fenolftaleína solución 1% RV132062 n-Heptano PA 122062 n-Heptano172430 Indicador mixto (Rojo de Metilo-Azul 282430 Indicador mixto (Rojo de Metilo-Azul

de Metileno) RV de Metileno) RV132006 n-Pentano PA 122006 n-Pentano PA171498 Potasio Dicromato solución 5% p/v RE 281498 Potasio Dicromato solución 5% p/v RV131512 di-Potasio Hidrógeno Fosfato anhidro PA 121512 di-Potasio Hidrógeno Fosfato anhidro PA131509 Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA 121509 Potasio di-Hidrógeno Fosfato PA131515 Potasio Hidróxido 85% lentejas PA 121515 Potasio Hidróxido 85% lentejas PA171617 Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS 131617 Rojo de Metilo (C.I. 13020) PA-ACS171634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE 281634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RV171674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE 121674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato PA131638 Sodio Hidrógeno Carbonato PA 121638 Sodio Hidrógneo Carbonato PA132823 Sulfanilamida PA 122823 Sulfanilamida PA131788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA 121788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA

127

M

131007 ACETONA PA-ACS-ISO131881 ACETONITRILO PA-ACS131008 ACIDO ACETICO

GLACIAL PA-ACS-ISO181009 ACIDO ACETICO 1 mol/l (1N) SV

ACIDO ACETICO 2 mol/l (2N)131015 ACIDO BORICO PA-ACS-ISO282222 ACIDO BORICO solución 4% RV131020 ACIDO CLORHIDRICO

37% PA-ACS-ISO131019 ACIDO CLORHIDRICO 35% PA-ISO181023 ACIDO CLORHIDRICO

0,1 mol/l (0,1N) SV181021 ACIDO CLORHIDRICO

1 mol/l (1N) SV182108 ACIDO CLORHIDRICO

2 mol/l (2N) SV131669 ACIDO ETILENDIAMINO-

TETRAACETICO SAL DISODICA 2-hidrato PA-ACS

131032 ACIDO ORTO-FOSFORICO 85% PA-ACS-ISO

131036 ACIDO NITRICO 60% PA-ISO132175 ACIDO PERCLORICO

70% PA-ACS-ISO132838 ACIDO 5-SULFOSALICILICO

2-hidrato PA-ACS131058 ACIDO SULFURICO 96% PA-ISO121010 ACIDO SULFURICO

90-91% según Gerber PA181059 ACIDO SULFURICO

0,5 mol/l (1N) SV182105 ACIDO SULFURICO

1 mol/l (2N) SV131067 ACIDO TRICLOROACETICO PA-ACS252373 ACIDO TRICLOROACETICO

solución 20% p/v DC373309 ACRILAMIDA PB131074 AGUA PA-ACS212236 AGUA DESIONIZADA QP121079 3-METIL-1-BUTANOL

según Gerber PA121096 ALMIDON DE PATATA

SOLUBLE PA121129 AMONIACO 25% (en NH3) PA131368 AMONIO HIERRO (II)

SULFATO 6-hidrato PA-ISO131134 AMONIO MOLIBDATO

4-hidrato PA-ACS-ISO131136 di-AMONIO OXALATO

1-hidrato PA-ACS131138 AMONIO PEROXODISULFATO

PA-ACS131147 ANHIDRIDO ACETICO PA-ACS-ISO211160 ARENA DE MAR lavada,

grano fino QP211161 ARENA DE MAR lavada,

grano grueso QP

131165 AZUL DE BROMOFENOL PA-ACS281168 AZUL DE BROMOTIMOL

solución 0,04% RV254932 AZUL BRILLANTE COOMASSIE

R-250 (C.I. 42660) DCAZUL COOMASSIE G-250

251170 AZUL DE METILENO (C.I. 52015) DC

131188 BARIO HIDROXIDO 8-hidrato PA-ACS-ISO

131082 1-BUTANOL PA-ACS-ISO141206 CADMIO METAL,

láminas PRS141219 CALCIO CLORURO

ANHIDRO escoriforme PRS142400 CALCIO HIDROXIDO, polvo

(RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX142323 CLORAMINA T 3-hidrato

(RFE, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX131270 COBRE (II) SULFATO

5-hidrato PA-ACS-ISO371274 COLESTEROL PB

CUAJO DE TITULO 1/10.000A17697 2,4 - DIAMINOFENOL

DICLORHIDRATO, 98%A12207 2,6 - DIBROMOQUINONA-

4- CLORIMIDA, 98%A16044 DIGITONINA 131785 N,N-DIMETILFORMAMIDA

PA-ACS-ISO121086 ETANOL ABSOLUTO PA121085 ETANOL 96% v/v PA132770 ETER DIETILICO ESTABILIZADO

con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO131315 ETER DE PETROLEO 40-60ºC

PA-ISO134852 FENOL CRISTALIZADO

(cristales sueltos) PA-ACS144852 FENOL CRISTALIZADO

(critales sueltos) (RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX

131325 FENOLFTALEINA PA-ACS281327 FENOLFTALEINA

solución 1% RVFITOSTEROL DE ACEITE DE COLZAFITOSTEROL DE ACEITE DE SOJA

141956 FORMAMIDA PRS211335 GEL DE SILICE 3-6 mm

con indicador QP141339 GLICERINA

(RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX131340 GLICINA PA-ACS122062 n-HEPTANO PA131350 HIDRACINIO SULFATO PA-ACS141076 HIDROGENO PEROXIDO

30% p/v (100 vol.) estabillizado PRSA10817 4-HIDROXIBIFENILO, 98%

128

129

M

141358 HIERRO (III) CLORURO 6-hidrato trozos PRS

282430 INDICADOR MIXTO (ROJO DE METILO-AZUL DE METILENO) RV

251774 LIQUIDO DE LUGOL DCA11818 ACIDO LACTICO,

SAL DE LITIO, 99%141427 MERCURIO (II) OXIDO rojo PRS131091 METANOL PA-ACS-ISO

METILENBISACRILAMIDA132751 N-(1-NAFTIL) ETILENDIAMINA

DICLORHIDRATO PA-ACS252036 NEGRO AMIDO 10B

(C.I. 20470) DC122006 n-PENTANO PA211835 PIEDRA POMEZ gránulos QP131457 PIRIDINA PA-ACS181464 PLATA NITRATO

0,1 mol/l (0,1N) SV141801 PLATA SULFATO PRS281498 POTASIO CROMATO

solución 5% p/v RV131505 POTASIO HEXACIANOFERRATO (II)

3-hidrato PA-ACS-ISO131503 POTASIO

HEXACIANOFERRATO (III) PA-ACS121512 di-POTASIO HIDROGENO

FOSFATO anhidro PA121509 POTASIO DI-HIDROGENO

FOSFATO PA131481 POTASIO

HIDROGENO FTALATO PA-ISO121515 POTASIO HIDROXIDO

85% lentejas PA182146 POTASIO HIDROXIDO

0,1 mol/l (0,1N) etanólica SV131524 POTASIO NITRATO PA-ISO182114 POTASIO PERMANGANATO

0,01 mol/l (0,05N) SV131729 POTASIO SODIO TARTRATO

4-hidrato PA-ACS-ISO131532 POTASIO SULFATO PA-ACS-ISO131542 POTASIO YODURO PA-ACS-ISO131617 ROJO DE METILO

(C.I. 13020) PA-ACSROSANILINA ACETATO

281634 SODIO ACETATO 1 mol/l (1M) RVA11803 SODIO META-BORATO

TETRAHIDRATO, 98%

131644 di-SODIO -tetra -BORATO10-hidrato PA-ACS-ISO

131648 SODIO CARBONATO anhidro PA-ACS-ISO

131655 tri-SODIO CITRATO 2-hidrato PA-ACS

131659 SODIO CLORURO PA-ACS-ISO131698 SODIO DISULFITO PA-ACS121674 di-SODIO FENILFOSFATO

2-hidrato PA121638 SODIO HIDROGENO

CARBONATO PA131687 SODIO HIDROXIDO

lentejas PA-ACS-ISO181694 SODIO HIDROXIDO

0,1 mol/l (0,1N) SV183154 SODIO HIDROXIDO

0,111 mol/l (0,111N)según Dornic SV

182415 SODIO HIDROXIDO 1 mol/l (1N) indicador:FENOLFTALEINA SV

181691 SODIO HIDROXIDO 1 mol/l (1N) indicador: AZUL DE BROMOFENOL SV

182158 SODIO HIDROXIDO 2 mol/l (2N) SVSODIO HIDROXIDO sol. 5%

131701 SODIO MOLIBDATO 2-hidrato PA-ACS

131703 SODIO NITRITO PA-ACSSODIO NITROFENILFOSFATO

131716 SODIO SULFATO anhidro PA-ACS-ISO

211682 SODIO SULFURO x-hidrato QP182160 SODIO TIOSULFATO

0,05 mol/l (0,05N) SV131724 SODIO TUNGSTATO

2-hidrato PA-ACSSUERO SALINO Fisiológico

122823 SULFANILAMIDA PAA12536 N, N, N', N' - TETRAME-

TILETILENDIAMINA, 99%131940 TRIS (HIDROXIMETIL)

AMINOMETANO PA-ACS131754 UREA PA-ACS181772 YODO 0,05 mol/l (0,1N) SV131775 ZINC ACETATO 2-hidrato PA-ACS121788 ZINC SULFATO 1-hidrato PA131787 ZINC SULFATO 7-hidrato PA-ACS

130

Aditio

Aditivos y coadyuvantes tecnológicos para uso alimentario industrial

PANREAC QUIMICA, S.A., fabrica además delos reactivos para análisis PANREAC, una línea deaditivos y coadyuvantes tecnológicos para uso ali-mentario industrial, que cumplen las especifica-ciones de pureza prescritas por The Food Chemi-cals Codex 3ª ed., complementadas con las exi-gencias específicas fijadas por la legislación espa-ñola y comunitaria de la CEE.

En la relación que sigue se indica denomina-ción del producto, fórmula y número de identifica-ción. Para mayor información, solicite nuestrocatálogo ADITIO 1995.

201007 ACETONA CH3COCH3

201008 ACIDO ACETICO GLACIAL CH3COOH E-260

202342 ACIDO ADIPICO (CH2CH2COOH)2 E-355

201013 ACIDO L(+)-ASCORBICO C6H8O6 E-300

201014 ACIDO BENZOICO C6H5COOH E-210

201808 ACIDO CITRICO anhidro C6H8O7 E-330

201018 ACIDO CITRICO 1-hidrato C6H8O7.H2O E-330

201020 ACIDO CLORHIDRICO 37% HCl E-507

201019 ACIDO CLORHIDRICO 35% HCI E-507

201512 ACIDO ESTEARICO C18H36O2

(Mezcla de ácidos grasos)

201669 ACIDO ETILENDIAMINOTETRA-

ACETICO SAL di-SODICA 2-hidrato Na2H2C10H12N2O8.2H2O

201030 ACIDO FORMICO 98% HCOOH E-236

201029 ACIDO FORMICO 85% HCOOH E-236

201032 ACIDO orto-FOSFORICO 85% H3PO4 E-338

202344 ACIDO FUMARICO HOOCCHCHCOOH E-297

201034 ACIDO L(+)-LACTICO CH3CHOHCOOH E-270

202051 ACIDO DL-MALICO C4H6O5 E-296

202591 ACIDO MIRISTICO CH3(CH2)12COOH

201810 ACIDO PROPIONICO CH3CH2COOH E-280

201055 ACIDO SORBICO C6H8O2 E-200

201883 ACIDO SUCCINICO HOOCCH2CH2COOH E-363

201058 ACIDO SULFURICO 95-98% H2SO4 E-513

201065 ACIDO TANICO

201066 ACIDO L(+)-TARTARICO (CHOH)2(COOH)2 E-334

201792 AGAR E-406

201081 ALCOHOL BENCILICO C6H5CH2OH

201103 ALUMINIO POTASIO SULFATO

12-hidrato AIK(SO4)2.12H2O E-522

201130 AMONIACO 30% (en NH3) NH4OH E-527

201129 AMONIACO 25% (en NH3) NH4OH E-527

201119 AMONIO CARBONATO ~(NH4)3(CO3)2H+NH2COONH4E-503i

201121 AMONIO CLORURO NH4CI E-510

201116 AMONIO HIDROGENO CARBONATO (Amonio Bicarbonato) NH4HCO3 E-503ii

201127 di-AMONIO HIDROGENO FOSFATO (NH4)2HPO4 E-342ii

201126 AMONIO di-HIDROGENO FOSFATO NH4H2PO4 E-342i

201140 AMONIO SULFATO (NH4)2SO4 E-517

203464 L-ARGININA C6H4N4O2

204109 L-ASPARAGINA anhidra C4H8N2O3

204233 2-ter-BUTIL-4-METOXIFENOL (BHA, Butildroxianisol) C11H16O2 E-320

201211 CALCIO ACETATO x-hidrato Ca(CH3COO)2.xH2O E-263

201212 CALCIO CARBONATO precipitado CaCO3 E-170i

201213 tri-CALCIO di-CITRATO 4-hidrato Ca3(C6H5O7)2.4H2O E-333iii

201219 CALCIO CLORURO anhidro

escoriforme CaCl2 E-509

131

M

Código Producto Sinónimos Fórmula N.º de identificación

201221 CALCIO CLORURO anhidro polvo CaCl2 E-509

201215 CALCIO CLORURO 2-hidrato

escoriforme CaCl2.2H2O E-509

201232 CALCIO CLORURO 2-hidrato polvo CaCl2.2H2O E-509

201214 CALCIO CLORURO 6-hidrato CaCl2.6H2O E-509

202824 CALCIO CLORURO solución 45% p/p

(en CaCl2.2H2O) E-509

201818 CALCIO ESTEARATO ~Ca(C18H35O2)2 E-470a

201228 tri-CALCIO FOSFATO ~Ca3(PO4)2 E-341iii

201227 CALCIO HIDROGENO FOSFATO

anhidro CaHPO4 E-341ii

201226 CALCIO HIDROGENO FOSFATO

2-hidrato CaHPO4.2H2O E-341ii

201225 CALCIO bis (di-HIDROGENO

FOSFATO) 1-hidrato (Calcio Difosfato) CaH4(PO4)2.H2O E-341i

202400 CALCIO HIDROXIDO polvo Ca(OH)2 E-526

201230 CALCIO LACTATO 5-hidrato Ca(CH3CHOHCOO)2.5H2O E-327

201235 CALCIO SULFATO 2-hidrato CaSO4.2H2O E-516

201237 CARBON ACTIVO polvo

202416 CARBOXIMETILCELULOSA SAL

SODICA (baja viscosidad) E-466

203645 L-CISTINA C6H12N2O4S2 E-921

202825 2,6-Di-ter-BUTIL-4-METILFENOL (BHT, Butilhidroxitoluol) C15H24O E-321

201286 1,2 DICLOROETANO ClCH2ClCH2

201254 DICLOROMETANO estabilizado con amileno Cl2CH2

201303 ESTAÑO (II) CLORURO 2-hidrato SnCl2.2H2O E-512

201086 ETANOL absoluto CH3CH2OH

201085 ETANOL 96% v/v CH3CH2OH

202695 ETANOL 70% v/v CH3CH2OH

201318 ETILO ACETATO CH3COOC2H5

201319 ETILO S(-)-LACTATO C5H10O3

202728 D(-)-FRUCTOSA C6H12O6

201339 GLICERINA (Glicerol) C3H8O3 E-422

202329 GLICERINA 87% (Glicerol) C3H8O3 E-422

201922 GLICERINA tri-ACETATO C9H14O6 E-1518

201340 GLICINA H2NCH2COOH E-640

201341 D(+)-GLUCOSA C6H12O6

203140 D(+)-GLUCOSA 1-hidrato C6H12O6.H2O

202061 GOMA ARABIGA polvo E-414

201076 HIDROGENO PEROXIDO 30% p/v

(100 vol.) estabilizado H2O2

201362 HIERRO (II) SULFATO 7-hidrato FeSO4.7H2O

201396 MAGNESIO CLORURO 6-hidrato MgCl2.6H2O E-511

202029 MAGNESIO ESTEARATO ~Mg(C18H35O2)2 E-470b

201399 tri-MAGNESIO di-FOSFATO (Magnesio Mg3(PO4)2.5H2O

5-hidrato orto-fosfato)

132

Código Producto Sinónimos Fórmula N.º de identificación

201927 MAGNESIO HIDROGENO FOSFATO

3-hidrato MgHPO4.3H2O E-343ii

201395 MAGNESIO HIDROXI CARBONATO

5-hidrato (Magnesio Carbonato) E-504ii

201404 MAGNESIO SULFATO 7-hidrato MgSO4.7H2O E-518

201413 MANGANESO (II) SULFATO 1-hidrato MnSO4.H2O

202067 D(-)-MANITA (Manitol) C6H14O6 E-421

201091 METANOL CH3OH

203332 METILO 4-HIDROXIBENZOATO C8H8O3 E-228

201479 POTASIO ACETATO CH3COOK E-261

201487 POTASIO BROMATO KBrO3 E-924

201490 POTASIO CARBONATO K2CO3 E-501i

201492 tri-POTASIO CITRATO 1-hidrato K3C6H5O7.H2O E-332ii

201494 POTASIO CLORURO KCl E-508

201522 POTASIO DISULFITO K2S2O5 E-224

201513 tri-POTASIO FOSFATO 1,5-hidrato K3PO4. 11/2H2O E-340iii

201505 POTASIO HEXACIANOFERRATO (II)

3-hidrato (Potasio Ferrocianuro) K4Fe(CN)6.3H2O E-536

201480 POTASIO HIDROGENO CARBONATO (Potasio Bicarbonato) KHCO3 E-501ii

201512 di-POTASIO HIDROGENO FOSFATO

anhidro (di-Potasio orto- K2HPO4 E-340ii

Fosfato)

202333 di-POTASIO HIDROGENO FOSFATO

3-hidrato K2HPO4.3H2O E-340ii

201509 POTASIO di-HIDROGENO FOSFATO (mono-Potasio

orto-Fosfato) KH2PO4 E-340i

201486 POTASIO HIDROGENO TARTRATO (COO)2KH(CHOH)2 E-336i

201515 POTASIO HIDROXIDO 85% lentejas KOH E-525

201524 POTASIO NITRATO KNO3 E-252

201855 POTASIO NITRITO KNO2 E-249

201729 POTASIO SODIO TARTRATO

4-hidrato NaK(COO)2(CHOH)2.4H2O E-337

201531 POTASIO SORBATO CH3(CHCH)2COOK E-202

201533 POTASIO SULFITO K2SO3

201537 POTASIO TARTRATO 1/2-hidrato K2(COO)2(CHOH)2.1/2H2O E-336ii

201542 POTASIO YODURO KI

201545 1,2-PROPANODIOL CH2OHCHOHCH3

201090 2-PROPANOL CH3CH2CH2OH

201633 SODIO ACETATO anhidro CH3COONa E-262i

201632 SODIO ACETATO 3-hidrato CH3COONa.3H2O E-262i

203865 SODIO L(+)-ASCORBATO C6H7NaO6 E-301

201637 SODIO BENZOATO C6H5COONa E-211

201648 SODIO CARBONATO anhidro Na2CO3 E-500i

202032 SODIO CARBONATO 1-hidrato Na2CO3.H2O E-500i

201647 SODIO CARBONATO 10-hidrato Na2CO3.10H2O E-500i

201655 tri-SODIO CITRATO 2-hidrato Na3C6H5O7.2H2O E-331iii

133

M

Código Producto Sinónimos Fórmula N.º de identificación

134

201656 tri-SODIO CITRATO 51/2-hidrato Na3C6H5O7.51/2H2O E-331iii

201659 SODIO CLORURO NaCl

201698 SODIO DISULFITO Na2S2O5 E-223

202363 SODIO DODECILO SULFATO (Lauril Sulfato Sódico) C12H25NaO4S

201681 tri-SODIO FOSFATO 1-hidrato Na3PO4.H2O E-339iii

201680 tri-SODIO FOSFATO 12-hidrato Na3PO4.12H2O E-339iii

201684 SODIO POLIFOSFATO (NaPO3)6 E-452i

201665 SODIO HIDROGENO di-ACETATO (Sodio Diacetato) CH3COONaCH3COOH E-262ii

201638 SODIO HIDROGENO CARBONATO (Sodio Bicarbonato) NaHCO3 E-500ii

201679 di-SODIO HIDROGENO FOSFATO (di-Sodio

anhidro orto-Fosfato) Na2HPO4 E-339ii

201678 di-SODIO HIDROGENO FOSFATO

12-hidrato Na2HPO4.12H2O E-339ii

201965 SODIO di-HIDROGENO FOSFATO (mono-Sodio

1-hidrato orto-Fosfato) NaH2PO4.H2O E-339i

201677 SODIO di-HIDROGENO FOSFATO

2-hidrato NaH2PO4.2H2O E-339i

201687 SODIO HIDROXIDO lentejas NaOH E-524

201686 SODIO HIDROXIDO escamas NaOH E-524

201702 SODIO NITRATO NaNO3 E-251

201703 SODIO NITRITO NaNO2 E-250

201711 tetra-SODIO PIROFOSFATO anhidro (tetra-Sodio Na4P2O7 E-450iii

Difosfato)

201710 tetra-SODIO PIROFOSFATO Na4P2O7.10H2O E-450iii

10-hidrato (tetra-Sodio

Difosfato)

201684 SODIO POLIFOSFATO (NaPO3)n E-452i

201716 SODIO SULFATO anhidro Na2SO4 E-514i

201715 SODIO SULFATO 10-hidrato Na2SO4.10H2O E-514i

201717 SODIO SULFITO anhidro Na2SO3 E-221

201720 SODIO TARTRATO anhidro Na2(COO)2(CHOH)2 E-335ii

201719 SODIO TARTRATO 2-hidrato Na(COO)2(CHOH)2.2H2O E-335ii

201721 SODIO TIOSULFATO 5-hidrato Na2S2O3.5H2O

203064 D(-)-SORBITA (Sorbitol) C6H14O6 E-420i

201733 TALCO lavado E-553b

202101 TITANIO (IV) OXIDO TiO2 E-171

201786 ZINC OXIDO ZnO

201788 ZINC SULFATO 1-hidrato ZnSO4.H2O

201787 ZINC SULFATO 7-hidrato ZnSO4.7H2O

Código Producto Sinónimos Fórmula N.º de identificación

M

NOTAS

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